CZ290685B6 - Stafylokinázové deriváty, jejich použití a farmaceutické kompozice na jejich bázi - Google Patents

Abstract

Stafylokinázové deriváty vykazující sníženou imunogenicitu ve srovnání s divokým typem stafylokinázy bez poškození jejich biologické aktivity a mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 1, ve které jedna nebo více aminokyselin v jednom nebo více podtržených shlucích byly nahrazeny alaninem a takto je eliminován nebo jsou eliminovány odpovídající epitop (y). Tyto deriváty pro použití při léčení arteriální trombózy a jejich použití pro přípravu farmaceutické kompozice se stejnou indikací.ŕ

Description

Stafylokokinázové deriváty, jejich použití a farmaceutické kompozice na jejich bázi

Oblast techniky

Vynález se týká stafylokinázových derivátů se sníženou imunogenicitou, jejich použití při léčení arteriální trombózy a pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčbu arteriální trombózy. Dále se vynález týká farmaceutické kompozice vhodné zejména pro léčbu arteriální trombóz}'.

Dosavadní stav techniky

Trombotické komplikace jsou hlavní příčinou úmrtí a tělesných handikapů a následkem toho by trombolýza (tj. farmakologické rozpuštění krevního vmetku) mohla příznivě ovlivnit celkové důsledky takových život ohrožujících chorob, jako je infarkt myokardu, cerebrovaskulámí trombóza a venózní tromboembolismus. Trombolytická činidla jsou plazminogenové aktivátory, které konvertují plazminogen, inaktivní proenzym fibrinolytického systému v krvi, na proteolytický enzym plazmin. Plazmin rozpouští fibrin z krevních vmetků. ale může také degradovat normální složky hemostatického systému a vyvolávat takzvaný „lytický stav“. Fyziologická fibrinolýza nicméně je fibrin-orientovaná jako výsledek specifických molekulárních interakcí mezi plazminogenovým aktivátorem tkáňového typu, fibrinem, plazmin(ogenem) a a₂-antiplazminem (citace 1: Collen D: On the regulation and control of fibrinolysis. Edward Kowalski Memoriál Lecture. Thromb Heamostas 43: 77-79. 1980; citace 2: Collen D, Lijnen HR: Basis and clinical aspects of fibrinolysis and thrombolvlsis. Blood 78: 3114-3124,1991.)

V současnosti je šest trombolytických činidel buď uvolněno pro klinické použití nebo je v klinických zkouškách u pacientů s akutním infarktem myokardu. Tato zahrnují streptokinázu, urokinázu, rekombinantní plazminogenový aktivátor tkáňového typu (rt-PA) nebo jeho deriváty, anisylovaný aktivátorový komplex plazminogen streptokináza („anisoyled plazminogen streptokináze activator complex - APSAC“), rekombinantní plazminogenový aktivátor jednořetězcového urokinázové typu („recombinant single chain urokináze-t} pe plazminogen activator (rscu-PA, recombinant prourokináze“) a rekombinantní stafylokinázu (Sak) (výše uvedená citace 2; citace 3: Collen D, Van de Werf F: Coronary thrombolysis with recombinant staphylokináze in patients with evolving myocardial infarction. Circulation 87: 1850-1853, 1993). U pacientů s akutním infarktem myokardu bylo po ošetření streptokinázou, rt-PA nebo APSAC (výše uvedená citace 2) pozorováno snížení velikosti infarktu, zachování ventrikulámí funkce a snížení mortality.

Jedním z trombolytických v současnosti používaných činidel je streptokináza protein (Mr 45000) sekretovaný β-hemolytickými streptokoky. Jeho podávání je nicméně spojeno s intenzivním systémovým fibrinogenovým defektem a jeho účinnost pro koronární trombolýzu u pacientů s vývinem akutního infarktu myokardu je omezena a představuje přibližně 50 procent koronární arteriální rekanalizace během 90 minut (viz výše uvedená citace 1). Dále vystavení streptokináze provokuje alergické reakce u asi 5 procent ošetřených pacientů a konzistentně indukuje tvorbu specifických protilátek, což vylučuje její opakované použití během měsíců nebo let (citace 4: Vanderschueren S, Collen D: Immunogeniciteit van streptokináze en implicaties voor gebruik. Tijdschr Geneesk 50: 1639-1644, 1994).

Stafylokináza, protein produkovaný určitými kmene Staphylococcus aureus, která byla zjištěna jako mající profibrinolytické vlastnosti před více než 4 desetiletími (citace 5: Lack CH: Staphylokináze: An activator of plazma protease, Nátuře 161: 559, 1948; citace 6: Lewis JH, Ferguson JH: A proteolytic enzyme systém of the blood. III. Activation of dog sérum profibrinolysis by staphylokináze. Am J Physiol 166: 594, 1951; citace 7: Winklear K.C, DeWaart J. Grootsen C, Zegers BJM, Tellier NF, Vertegt CD: Lysogenic conversion of staphylococci to

- 1 CZ 290685 B6 loss of beta-toxin. J. Gen Microbiol 39: 321, 1965.) se také jeví jako tvořící silné trombolytické činidlo u pacientů s akutním infarktem myokardu (citace 8: Collen D, Lijnen HR: Staphylokináze, a fibrinspecific plazminogen activator with therapeutic potential? Blood 84: 680-686, 1994). Stafyiokinázoxý gen byl klonován z bakteriofágů sak/C (citace 9: Sako T, Sawaki S, Sakurai T, Ito S, Yoshizawa Y, Rondo 1: Cloning and expressin of the staphylokináze gene of Staphylococcus aureus in Escherichia coli. Molec Gen Genet 190: 217-277, 1983.) a sak42D (citace 10: Behnke Dm Gerlach D: Cloning and expression in Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Streptococcus sanguis of a gene for staphylokináze - a bacteriasl plazminogen activator. Molec Gen Genet 210: 528-534, 1987.), jakož i zgenomické DNA (sakSTAR) lysogenního kmene Staphylococcus aureus (citace 1: Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR: Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokináze. Fibrinolysis 6: 203-213. 1992.) Byl exprimován pod kontrolou lamda PR promotoru a jeho vlastních translačních signálů v Escherichia coli a také pod kontrolou svého přirozeného promotoru a translačních signálů v Bacillus subtilis nebo Escherichia coli. Přitom došlo k akumulaci genového produktu v periplazmickém prostoru nebo v kultivačním médiu (výše uvedená citace 10; výše uvedená citace 11; citace 12: Sako T: Overproduction of staphylokináze in Escherichia coli and its charakterization. Eur J Biochem 149: 557-563, 1985; Citace 13: Gerlach D, Kraft R, Behnke D: Purification and charakterization of the bacterial plazminogen activator staphylokináze secreted by a recombinant bacillus subtilis. Zbl Bakt Mikr Hyg 269: 314-322, 1988.)

Stafýlokinázový gen kóduje protein složený z 163 aminokyselin, jehož aminokyselina 28 odpovídá NH₂-koncovému zbxtku zralé stafýlokinázy o plné délce (výše uvedená citace 10; citace 14: Sako T. Tsuchida N: Nucleotide sequence of the staphylokináze genefrom Staphylococcus aureus. Nucleic Acids Res 11: 7679-7693, 1983; Citace 15: Collen D, Zhao ZA, Hovoet P, Marynen P: Primary structure and gene structure of staphylokináze. Fibrinolysis 6: 226-231, 1992.) Proteinová sekvence varianty divokého typu Sak STAR (výše uvedená citace 15) je znázorněna na obr. 1. Pouze čtyři nukleotidové rozdíly byly nalezeny v kódujících oblastech sak/C. sak42D a sakSTAR genech, z nichž jeden tvoří tichou mutaci (výše uvedená citace 10; výše uvedená citace 14; výše uvedená citace 15).

Některé molekulární formy stafý lokinázy byly čištěny se slabě rozdílnou Mr (16500 až 18000 na SDS-PAGE) a izoelektrickými body (výše uvedená citace 11; výše uvedená citace 12; výše uvedená citace 13). Deriváty s nižší Mr zralé stafýlokinázy byly získány tak, že postrádají NH₂terminální aminokyseliny v poloze 6 (Sak-delta6) nebo 10 (Sak-deltalO). Po interakci s plazminem(ogenem) v pufrovaném prostředí se zralá stafýlokináza (NH₂-terminální Ser-SerSer) rychle a kvantitativně převede na Sak-delta 10 (NH₂-terminální Lys-Gly-Asp). U zralé stafýlokinázy a Sak-delta 10 byla zjištěna stejná fibrinolytická aktivita (výše uvedená citace 11; výše uvedená citace 12).

Aminokyselina v poloze 26 se jeví být velmi důležitou pro aktivaci plazmogenu stafylokinázou. Skutečně, substituce unikátního Met zbytku v poloze 26 buď Arg nebo Val zbytky vede ke ztrátě funkční aktivity, zatímco substituce za Leu nebo Cys má malý nebo nemá žádný vliv na aktivitu (citace 16; Schlott B, Hartmann M, Guhrs KH, Birch-Hirschfeld E, Gase A, Vetterman S, Collen D, Lijnen HR: Functional properties of recombinant staphylokináze variants obtained by site— specific mutagenesis of methionine-26. Biohim Biophys Acta 1204: 235-242, 1994.) Protože žádná z jednotlivých aminokyselinových změn nevyvolává podstatné změny ve struktuře roztoku mutantního proteinu zůstává mechanismus tohoto rozdílného chování záhadným.

V plazmovém prostředí je stafý lokináza schopna rozpustit fibrinové sraženiny bez degradace fibrinogenu (citace 17: Sakai M. Watanuki M, Matsuo O: Mechanism of fibrin-specific fitrinolysis by staphylokináze: participation of a₂-plazmin inhibitor. Biochem Biophys Res Comm 162, 830-837, 1989; citace 18: Matsuo O, Okada K. Fukao H, Tomioka Y, Ueshima S, Watanuki M, Sakai M: Thrombolytic properties of staphylokináze. Blood 76: 925-929, 1990; citace 19: Lijnen HR? Van Hoef B, De Cock F, Okada K, Ueshima S, Matsuo O, Colled D: On

-2CZ 290685 B6 the mechanism of fibrin—specific plazminogen activation by staphylokináze. J Biol Chem 266: 11826-11832, 1991.) Tato fibrinová specifičnost stafylokinázy je výsledkem snížené a₂antiplazminové inhibice plazmin.stafylokinázového komplexu připojeného k fibrinu, recyklace stafylokinázy z komplexu plazmin. stafylokináza po inhibici a₂-antiplazminem a prevence konverze cirkulující plazminogen-stafylokinázy na plazmin. stafylokinázu působením a₂antiplazminu (citace 20: Lijnen HR, Van Hoef B, Matsuo O, Colled D: On the molecular interaction between plazminogen-staphylokináze. a₂-antiplazmin and fibrin. Biochim Biophys Acta 1118: 144-14, 1992; citace 21: Silence K. Colled D, Lijnen HR: Interaction between staphylokináze, plazmin(ogen) and a₂-antiplazmin. Recycling of staphylokináze after neutrálization of the plazmin-staphylokináze complex by a₂-antiplazmin. J biol Chem 268: 9811-9816, 1993; citace 22: Silence K, Collen D, Lijnen HR: Regulation by a₂-antiplazmin and fibrin of the activation of plazminogen with recombinant staphylokináze in plazma. Blood 82: 1175-1183, 1993.) V několika pokusných zvířecích modelech se jeví být stafylokináza ekvipotentní streptokináze pro rozpuštění celokrevních nebo plazmových sraženin, ale významně potentnější pro disoluci na destičky bohatých nebo retraktovaných trombů (citace 23: Collen D, De Cock F, Vanlinthout I, Declerck PJ, Lijnen HR, Stassen JM: Comparative thrombolytic and immunogenic properties of staphylokináze and streptokináze. Fibrinolysis 6: 232-242, 1992; citace 24: Collen D, De Cock F? Stassen JM: Comparative immunogenicity and thrombolytic properties toward arterial and venous thrombi of streptokináze and recombinant staphylokináze in baboons. Circulation 87: 996-1006, 1993.)

Povzbudivé výsledky získané se stafylokinázou ve zvířecích modelech trombózy položily základ pro jejich hodnocení ve větším měřítku u pacientů s akutním infarktem myokardu (výše uvedená citace 3; citace 25: Schlott Bm Hartmann M, Giihrs KH, Birch-Hirschfeid E, Pohl, HD, Vanderschueren S, Van de Werf Fm Michoel A, Collen D, Behnke D: High yield production and purification of recombinant staphylokináze for thrombolytic therapy. Bio/technology 12: 185— 189, 1994.) U 4 z 5 pacientů s akutním infarktem myokardu podání 10 mg rekombinantní stafylokinázy (SakSTAR) intravenózně během 30 minut indukovalo angiograficky dokumentovanou koronární arteriální rekanalizaci během 40 minut. Hladiny plazmového fibrinogenu a a₂-antiplazminu byly neovlivněny (zbytkové hladiny za 40 minut činily 90 až 95 % základní hodnoty) a nebyly pozorovány alergické reakce (výše uvedená citace 3). Ve druhé sérii 5 pacientů s akutní koronární okluzí vyvolalo intervenózní podání 10 mg stafylokinázy (SakSTAR) během 30 minut rekanalizaci u všech pacientů během 20 minut bez doprovodné degradace fibrinogenu (výše uvedená citace 25). Kontrolní angiografie za 24 hodin ukázala, že rekanalizace přetrvala.

Imunogenicita stafylokinázy (SakSTAR) ve srovnání se streptokinázou byla studována u psů (výše uvedená citace 23) a paviánů (výše uvedená citace 24). Data získaná na zvířatech ve svém souhrnu naznačují nižší imunogenicitu stafylokinázy ve srovnání se streptokinázou. Nicméně u prvních 5 pacientů s akutním infarktem myokardu, kterým byla podávána intravenózní infuze 10 ng stafylokinázy během 30 minut, byly zjištěny neutralizační protilátkové titry vůči stafylokináze (SakSTAR) na nízké základní linii, a to až 6 dnů po infuzi, ale vysoké titry (stafylokinázové neutralizační titry 12 až 42 pg/ml plazmy) protilátek byly konzistentně demonstrovatelné v plazmě od 14. do 35. dne (výše uvedená citace 3). Tato pozorování byla plně potvrzena v druhém pilotním pokusu u 5 pacientů (výše uvedená citace 25). S ohledem na imunogenicitu nejsou počáteční pozorování u lidí tak povzbuzující jako u pokusných zvířat. Podobně jako u streptokinázy podání stafylokinázy by bylo omezeno na jediné použití. Nicméně nepřítomnost křížové reaktivity (citace 26: Declerck PJ, Vanderschueren S, Billiet J, Moreau H. Collen D: Prevalence and industion of circulating antibodies against recombinant staphylokináze. Thromb Haemostas 71: 129-133, 1994. Citace 27: Vanderschueren SMF, Stassen JM, Collen D: On the Immunogenicity of recombinant staphylokináze in patients and in animal models. Thromb haemost 72: 297-301,1994.) naznačuje, že podávání obou substancí by se vzájemně vylučovalo.

- j CZ 290685 B6

Vlastní imugenonicita streptokinázy a stafylokinázy jasně překáží jejich neomezenému použití. Pacienti s předem existujícími vysokými titry protilátek budou nejen náchylní k trombolytickému efektu těchto činidel, ale mohou se objevovat alergické vedlejší účinky a příležitostné život ohrožující anafylaxe (citace 28: White H: Thrombolytic treatment for recurrent myocardial infarction. Br Med J 302: 429-430, 1991.) Protože jak streptokináza, tak stafylokináza jsou heterologní proteiny, není nasnadě jsoucí, že jejich imunogenicita by mohla být snížena proteinovým inženýrstvím. Ve skutečnosti nebyly publikovány žádné zprávy o vytvoření aktivních nízkomolekulámích fragmentů ze streptokináz. U stafylokinázy delece NH₂terminálních 17 aminokyselin nebo COOH-koncových 2 aminokyselin inaktivuje molekulu, která je navíc velmi citlivá k inaktivaci místně specifickou mutagenezí (výše uvedená citace 25; citace 29: Gase A, Hartmann M, Gúhrs KH, Rocker A, Collen D, Behnke D, Schlott B: Functional significance of NH₂- and COOH-terminal regions of staphylokináze in plazminogen acitvation. Submitted.)

Určité stafylokinázové deriváty se sníženou imunogenicitou jsou popsány v WO 93/13 209.

V těchto derivátech je však odstraněna signální sekvence stafylokinázy a nebylo možno předvídat, že specifické mutace v označených shlucích aminokyselin by mohly vést k nižší imunogenicitě stafylokinázy. V WO 93/13 209 jsou také popsány allelové varianty obsahující aminokyselinové substituce v jednom z označených epitopů. V poloze 34 je glycin a v poloze 36 arginin. Snížená imunogenicita požadovaná podle dále uvedených nároků nebyla u těchto allelových variant prokázána.

V článku Gase et al., European Joumal of Biochemistry 223 (1), 303-308 (1994) jsou popsány varianty, které se také liší v poloze 43 (kromě poloh 34 a 36). Jedná se tedy o odlišné varianty, u kterých navíc rovněž nebyla prokázána snížení imungenicita.

V DD 245 444 je popsán způsob výroby rekombinatní stafylokinázy, nejsou zde však popsány její deriváty se sníženou imunogenicitou, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

Nyní bylo překvapivě nalezeno, že varianta divokého typu stafylokinázy SakSTAR (výše uvedená citace 8; výše uvedená citace 15) obsahuje tři nepřesahující se imunodominantní epitopy, z nichž alespoň dva mohou být odstraněny specificky místně řízenou mutagenezí bez inaktivace molekuly. Tyto upravené stafylokinázové varianty jsou méně reaktivní s protilátkami vytvořenými u pacientů ošetřených původním divokým typem stafylokinázy a jsou významně méně imunogenní než stafylokináza divokého typu, jak je to demonstrováno na modelech králíků a paviánů a u pacientů s periferní arteriální okluzí.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou stafylokinázové deriváty vykazující sníženou imunogenicitu ve srovnání s divokým typem stafylokinázy bez poškození jejich biologické aktivity a mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 1, ve které jedna nebo více aminokyselin v jednom nebo více podtržených shlucích byly nahrazeny alaninem a takto je eliminován nebo jsou eliminovány odpovídající epitop(y).

Při eliminaci epitopu(ů) je reaktivita derivátů s monoklonálním protilátkovým panelem orientovaným k jednomu nebo více ze tří stafylokokových epitopových shluků I, II a III redukována. Toto naznačuje, že nahrazením aminokyselin původního typu alaninem je redukována antigenicita stafylokinázy.

Vynález se zejména týká stafylokinázového derivátu M8, majícího aminokyselinovou sekvenci, jak je znázorněna na obrázku 1, ve které aminokyseliny Lys v poloze 74, Glu v poloze 75 a Arg v poloze 77 v podtrženém shluku 8 byly nahrazeny alaninem a takto byl změněn odpovídající epitop, stafylokinázového derivátu M3 majícího aminokyselinovou sekvenci, jak je znázorněna

-4CZ 290685 B6 na obrázku 1, ve které aminokyseliny Lys kv poloze 35 a Glu v poloze 38 v podtrženém shluku 3 byly nahrazeny alaninem a takto byl změněn odpovídající epitop, stafylokinázového derivátu M9 majícího aminokyselinovou sekvenci, jak je znázorněna na obrázku 1, ve které aminokyseliny Glu v poloze 80 a Asp v poloze 82 v podtrženém shluku 9 byly nahrazeny alaninem za změny 5 odpovídajícího epitopu, stafylokinázového derivátu M3.8 majícího aminokyselinovou sekvenci, jak je znázorněna na obrázku 1, ve které Lys v poloze 35, Glu v poloze 38, Lys v poloze 74. Glu v poloze 75 a Arg v poloze 77 v podtrženém shluku 3 a 8 byly nahrazeny alaninem za změny odpovídajících epitopů, stafylokinázového derivátu M8.9 majícího aminokyselinovou sekvenci, jak je znázorněna na obr. 1, ve které aminokyseliny Lys v poloze 74, Glu v poloze 75. Arg ío v poloze 77, Glu v poloze 80 a Asp v poloze 82 v podtržených shlucích 8 a 9 byly nahrazeny alaninem za změny odpovídajících epitopů. M3.8 a M8:9 jsou tedy dvojité mutanty. vykazující eliminaci dvou epitopů.

Vynález demonstruje, že upravené varianty stafylokinázy se sníženou imunogenicitou mohou být 15 prakticky alternativními trombolytickými činidly za streptokinázu nebo divoký typ statylokinázy.

Deriváty podle vynálezu je možno získat přípravou DNA fragmentu, obsahujícího alespoň část kódující sekvence stafylokinázy, která zajišťuje její biologickou aktivitu; provedení in vitro místně řízené mutageneze na DNA fragmentu k nahrazení jednoho nebo více kodonů pro 20 aminokyseliny divokého typu kodonem pro jinou aminokyselinu; klonováním mutovaného DNA fragmentu ve vhodném vektoru; transformováním nebo transfekováním vhodné hostitelské buňky tímto vektorem; a kultivací hostitelské buňky za podmínek vhodných pro expresi tohoto DNA fragmentu. Výhodně je tímto DNA fragmentem 45Y3 bp EcoR-HindlII fragment plazmidu pMEX602SAK, in vitro místně řízená mutageneze se provádí prostřednictvím oligonukleotidem2? řízeného systému mutageneze za použití plazmidu pMa/c na opravu deficietního E. coli kmene kWK6MutS, přičemž mutanový DNA fragment se klonuje v E. coli kmenu WK6.

Vynález se týká fragmentických kompozic, obsahujících alespoň jeden ze stafylokinázových derivátů podle vynálezu spolu s vhodnou přísadou (excipientem) pro léčení arteriální trombózy. 30 Farmaceutické kompozice, obsahující méně imunogenické stafylokinázové varianty jako aktivní činidlo, pro léčení arteriální trombózy v humánní nebo veterinární praxi, mohou mít formu prášků nebo roztoků a mohou být použity pro intravenózní nebo intraarteriální podání. Takové kompozice mohou být připraveny smísením (například promísením, rozpuštěním atd.) aktivní sloučeniny s farmaceuticky přijatelnými přísadami neutrálního charakteru (jako jsou vodné nebo 35 nevodné roztoky, stabilizátory, emulgátory, detergenty, aditiva) a dále, je-li to nezbytné, s barvivý. Koncentrace aktivní složky v terapeutické kompozici se může široce měnit mezi 0,1 a 100 % v závislosti na charakteru choroby a způsobu podání. Dále se může podávaná dávka měnit mezi 0,05 mg a 1,0 mg na kg tělesné hmotnosti.

Vynález se dále také týká použití stafylokinázových derivátů pro léčení arteriální trombózy, zejména infarktu myokardu, a použití stafylokinázových derivátů při přípravě farmaceutické kompozice pro léčení arteriální trombózy, zejména infarktu myokardu.

Dále i výše jsou výrazy „deriváty“, „mutanty“ a „varianty“ používány zaměnitelně.

Předložený vynález bude demonstrován podrobněji v následujících příkladech, které nejsou však míněny jako omezující pro rozsah vynálezu. Na základě předloženého vynálezu budou zřejmé některé varianty a zlepšení. Tak statistická mutageneze, vycházející z kombinačního mutantu 3.8 a z kombinačního mutantu 8,0 pravděpodobně poskytne alternativní mutanty s redukovanou 50 imunogenicitou a s možným zvýšením funkční aktivity, zatímco alternativní mutageneze ve shlucích neutralizujících epitop poskytne ještě jiné varianty s redukovanou imunogenicitou.

-5CZ 290685 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Mapování epitopu stafylokinázy divokého (původního) typu

Epitopová specifita panelu 17 myších monoklonálních protilátek působících proti původnímu typu stafylokinázy (varianta SakSTAR) byla stanovena biospecifickou interakční analýzou (BIA) v reálném čase za použití zařízení BIAcore™ (Pharmacia. Biosensor AB, Uppsala, Švédsko). Monoklonální protilátky proti Sak STAR byly produkovány v podstatě metodou podle Galfré-ho a Milsteina (citace 30: Galfré G, Milstein C: Preparation of monoclonal antibodie: strategie and procedures. Methods Enzymol 73: 3-46, 1981). BALB/c myši byly imunizovány subkutánní injekcí 10 pg SakSTAR v kompletním Freundově adjuvans, po které následovala o 2 týdny později intraperitoneální injekce 10 pg SakSTAR v nekompletním Freundově adjuvans. Po intervalu alespoň 6 týdnů byly myši přeočkovány (booster) intraperitoneálně s 10 pg SakSTAR v roztoku chloridu sodného ve dnech 4 a 2 před buněčnou fúzí. Slezinové buňky byly izolovány a fúzovány s P3X63AG.8-6.5.3 myelomovými buňkami (získány od Dr. O. Schonherra, Organon, Oss, Holandsko) podle Fasekase se St. Groth a Schneideggera (citace 31: de St. Groth SF, Scheidegger D: Production of monoclonal antibodies: strategies and tactics. J Immunol Methods 35: 1-21, 1980). Po selekci v hypoxanthinu, aminopterinu. thymidinovém mediu byly supematanty screenovány na specifickou produkci protilátek s jednou-místně nekompletitivní zkouškou mikro-ELISA za použití mikrotitrových ploten potažených stafylokinázou. Vazby imunoglobulinů byly detekovány konjugátem křenová peroxidáza (HP)—králičí anti-myší IgG (citace 32: Nakane PK, Kawaoi A: Peroxidase-labeled antibody. A new method for conjugation. J. Histochem Cytochem 22: 1084-1091, 1974). Pozitivní klony byly použily pro produkci ascitické kapaliny v pristen-primované BALB-/c myši (citace 33: Anderson N, Potter M: Induction of plazma cell tumours in Balb-c mice with 2. 6, 10, 14 tetramethylpentadecane (přistane). Nátuře 222: 994-995, 1969.). IgG frakce monoklonálních protilátek byly purifikovány z ascitů afinitní chromatografií na Protein A-Sepharose (citace 34: Ey PL, Prowse SJ, Jenkin CR: Isolation of pure IgG], IgG_2a and IgG₂b imunoblobulins from mouše sérum using protein ASepharose. Immunochemistry 15: 429^436, 1978.)

Tato biospecifická interakční analytická technika, založená na povrchové plazminové rezonanci (SPR), umožňuje přímé měření interakcí v reálním čase bez použití znační (citace 35: Jonsson U. Malmqvist M: Reál time bispecific interaction analysis. The integration of surface plazmon resonance detection, generál biospecific interface chemistry and microfluidics into one analytical systém. Adw Biosensors 2: 291-336, 1992.) Stafylokináza (SakStar) byla imobilizována na povrchu Sensor Chip CM5 za použití kitu Amine Coupling kit (Pharmacia Biosensor AB) podle dopouručení výrobce. Tento postup spojuje primární aminokyselinové skupiny v ligandů ke karboxymethylovanému dextrovanému povrchu Sensor Chip (citace Y36: Johnsson B, Lofas S, Lindquist G: Immubilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plazmon resonance sensors. Anal Biochem 198: 268277, 1991.) Imobilizace byla provedena z proteinových roztoků o koncentraci 10 pg/ml v 10 mM Na-acetátu při pH 5,0, při průtoku 5 μΐ/min během 6 minut. Přitom dojde ke kovalentnímu připojení 1000 až 1500 RU (rezonančních jednotek) stafylokinázových skupin (odpovídajících přibližně 0,07 pmol/mm²) (citace 37: BIAcore systém manual, 5-2, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweeden.) Druhá interakční složka (analyt: tj. monoklonální protilátka) byla injektována do roztoku přes senzor. Koncentrace volného analysu byla udržována konstantní pomocí kontinuálního toku roztoku při 20 °C okolo povrchu senzorů. Alespoň čtyři různé koncentrace každého analytu (rozmezí 0 až 400 nM nebo 0 až 50 μΜ) v 10 mM HEPES, 3,4 mM EDTA, 0,15 NaCI a 0,005 % Surfactantu P20, pH 7,2 byly injektovány při průtokové rychlosti 5 μΐ/min během 6 minut do asociační fáze. Potom byl vzorek nahrazen pufrem také při průtokové rychlosti 5 μΐ/min během 6 až 30 min. Po každém cyklu byl povrch senzorového čipu

-6CZ 290685 B6 regenerován vstříknutím 5 μΐ 15 mM HC1. Asociační (k_ass) a disociační (k^s) rychlostní konstanty byly odvozeny ze senzorgramů, jak je dále podrobněji popsáno jinde (citace 38: Karlsson R, Michaelsson A, Mettsson L: Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactons with a new biosensos based analytical systém. J Immunol Methods 145: 229-240, 1991.) Rovnovážné asociační konstanty (K_a), vypočtené jako poměr k_ass a k_dj_SS. pro vazbu studovaných 17 monoklonálních protilátek ke starylokináze divokého typu ležely v rozmezí 0,5 až > 25 x 10⁹ M’¹ (střední hodnoty ΙΟ¹⁰ M^_1) (tabulka 1).

V tabulce 1 sloupec označený ,,1D“ znamená různé stafylokinázové deriváty. Označení ..17G1 1“, „26A2“ atd. se vztahuje k monoklonálním protilátkám, vázajícím se k označeným epitopovým shlukům I, II a III.Epitopový svazek I je rozpoznáván protilátkami 17GT11,26A2, 30A2. 2B12 a 3G10, zatímco epitopový svazek II je rozpoznáván protilátkami 29C1. 18F12, 14H5, 28H4, 20D6, 32B2 a 7F10 a epitopový svazek III protilátkami 7H11,25E1, 40C8, 24C4 a 1A10.

Monoklonální protilátky zaměřené proti jednotlivým epitopům se budou vázat nezávisle na sobě, zatímco monoklonální protilátky zaměřené proti těsně příbuzným epitopům budou vzájemně interferovat s vlastními vazbami. Proto epitopová specifita panelových monoklonálních protilátek je nejsnadněji stanovitelná testováním schopnosti párů monoklonálních protilátek vázat se současně k antigenu. Biospecifická interakční analýza v reálném čase (BIA) může být použita k měření kompetitivní vazby párů monoklonálních protilátek ke stafylokináze připojená k povrchu senzorového čipu. Analýza se provádí, jak je popsáno vApplication Notě 101 (Pharmacia Biosensor AB). Párové vazebné testy rozdělují 17 monoklonálních protilátek do 3 skupin, představujících 3 nepřekrývající se epitopy na antigenu, jak ilustruje obr. 2. Nezávislost těchto epitopů byla potvrzena přímou demonstrací aditivní vazby monoklonálních protilátek 26A2, 28H4 a 24C4. Protilátky byly seřazeny podle své epitopové specifity, jak je to ilustrováno v tabulce 1.

Příklad 2

Konstrukce a epitopové mapování „nabitých-shluků-k-alaninu“ variant stafylokinázy

Při skanování „nabitých-shluků-k-alaninu“ byly zamřeny shluky hydrofilních nabitých aminokyselin Stafylokináza (SakSTAR) obsahuje 45 nabitých aminokyselin (2 His, 14 Glu, 8 Asp, 1 Arg a 20 Lys). Tyto nabité zbytky byly mutagenizovány na Ala ve svazcích dvou nebo tří aminokyselin, jak je shrnuto na obr. 1. Bylo sestrojeno celkem 21 mutantů, ve kterých byly podtržené aminokyseliny nahrazeny alaninem. Aminokyseliny, které mají být nahrazeny alaninem, jsou označeny malou vertikální čarou ve shluku.

Mutanty byly připraveny místně orientovanou mutagenezí a exprimovány v E. coli, jak je podrobně uvedeno dále. Restrikční enzymy byly zakoupeny od firmy Pharmacia, Uppsala, Švédsko nebo Boehringer Mannheim (Mannheim, Německo). T4 DNA ligáza, Klenowův fragment z E, coli DNA polymerázy I a alkalická fosfatáza byly získány od Boehringer Mannheim. Oligonukleotidem řízený mutagenezní systém a pMa/c plazmidy byly laskavě poskytnuty Corvasem (Ghent, Belgie) (citace 39: Stanssens P, Opsomer C, McKeown Y, Kramer W, Zabeau M, Friz MH: Efficient oligonucleotidedirected construction of mutations in expression vectors byl the gapped duplex DNA method using altemating selectable markers. Nucleic Acids Res 17: 4441-4454, 1989.) Expresní vektro pMEX602akB byl laskavě poskytnut ústavem Institut fur Molekulare Biotechnologie, Jena, Německo (výše uvedená citace 25). M123KO7 helper fág byl zakoupen od Promega (Leiden, Holansko). Luria Broth růstové médium bylo zakoupeno od life Technologies (Merelbeke, Belgie). Plazminogen byl čištěn z lidské plazmy, jak je popsáno jinde (citace 40: Deutsch DG, Mertz ET: Plazminogen: purification from human plazma by affinity chromatography. Science 170: 1095-1096, 1970.)

-7CZ 290685 B6

Enzymové reakce byly prováděny za použití podmínek doporučených dodavatelem. Plazmidová DNA byla izolována za použití QIAGEN-purifikačního protokolu (poskytnutý od Westburg, Leusden Holandsko). Transformace E. coli byly provedeny za použití postupu s fosforečnanem vápenatým. DNA sekvenování bylo provedeno za použití metody dideoxy řetězcové terminační reakce a zařízení Automated Laser fluorescent A. L.F.™ (Pharmacia). Místně orientovaná mutageneze pro mutanty D5,K6 (M20) do K86,E88 (M10) byla provedena za použití pMa/c za použití reparačně deficientního E. coli kmene WKMutS. Propagace plazmidů pMa/c nebo derivátů, příprava jednořetězcové DNA a exprese byly provedeni v E. coli WK.6 (výše uvedená citace 39). Mutanty D93, K94 (Ml 1) až K134, K.135, K136 (M19) byly konstruovány v institut fůr Molekulare Biotechnologie Jena, Německo, jak bylo popsáno dříve (výše uvedená citace 16). Chromatogenní substrát (S2403) L-pyroglutamyl-L-fenylalanyl-L-lysin-P-nitroanalinhydrochlorid byl získán od Chromogenix. ^I23I značený fibrinogen byl zakoupen od firmy Amersham.

453-páry bází obsahující EcoRI-HindlII fragment, obsahující celou kódující oblast pro SakSTAR, byl štěpen plazmidem pMEX602SakB (ampicilin rezistentní) a klonován do EcoRIHindlII míst pMc5-8 plazmidů (chloramfenikoln rezistentní) za poskytnutí pMc-STAR. Pro in vitro místně orientovanou mutagenezi byla připravena jednořetězcová DNA tohoto konstruktu transformací pMc-STAR konstruktu v E. coli vstříknutím helper fágu M13KO7 do noční kultury. Čtyři hodiny po injekci byly buňky izolovány z média PEG-srážením a extrakcí směsí fenolchloroform. Následně byla jednořetězcová pMc-STAR hybridizována sjednořetězcovou pMa(EcoRI-HindlII) vektorovou DNA a vhodným 28 až 48 bázovým syntetickým oligonukleotidem s tichou mutací za vytvoření nebo delece restrikčního místa. Prodlužování reakce byly provedeny s Klenowovým fragmentem DNA polymerázy, jak bylo popsáno. Po tranformaci E. coli WKóMutS selekci na ampicilin byly kolonie pěstovány na nitrocelulózových membránách, denaturovány in sítu a DNA byla hybridizována přes noc při teplotě místnosti za použití odpovídajících radioaktivně značených mutantních oligonukleotidů (1,5 x 10⁸ cmp [gama32-P]-ATP za použití T4 polynikleotid kinázového značení 20 až 30 ng oligonukleotidu). Filtry byly provedeny při 42 °C za použití roztoků, obsahujících 0,1 % SDS a 2 % SSC, lx SSC, 0,2x SSC, 0,lx SSC. Plazmidová DNA byla extrahována z 10 ml bakteriálních kultur každého pozitivního klonu a analyzována štěpením restrikčními enzymy. Požadované mutace byly potvrzeny sekvencováním kompletní kódující sekvence za použití A.L.F.^(R).

Mutovaný HindlII-EcoRi fragment byl pak ligován do pMEX602SakB expresního vektoru, obsahujícího pTaq promotor (výše uvedená citace 39). Mutantní proteiny byly produkovány intracelulámě a v rozpustné formě v E. coli WK6 buňkách transformovaných tímto vektorem. Mutanty byl pufirikovány z ultrazvukem zpracovaných bakteriálních extraktů za použití kationtovýměnné a hydrofobní interakční chromatografie (výše uvedená citace 25).

SakSTAR mutanty byly získány s výtěžky v rozmezí mezi 10 a 80 mg/1, což představuje regeneraci 15 až 88% výchozího materiálu. Purifikovaný materiál byl čistý, jak ukazuje elektroforéza na neredukovaných 10 až 15% gradientových gelech (neuvedena). NH₂-koncová aminokyselinová analýza potvrzuje Ser-Ser-Ser-Phe-Asp sekvenci zralé stafylokinázy. Podrobnější biochemická charakterizace těchto stafylokinázových mutantů je uvedena jinde (citace 41:Silence K. Hartman M, Giihrs KH, Gase A, Schlott B, Collen D, Lijnen HR: Structure-function relationships in staphylokináze as revealed by „clustered-charge-to-alanine“ mutagenesis. J Biol Chem (in press).

Proteinové koncentrace byly stanoveny podle Bradforda (citace 42: Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248, 1976.) Fibrinolytické aktivity SakSTAR roztoků byly stanoveny testem s chromogenním substrátem provedeným na mikrotitrových plotnách za použití směsi 80 μΐ Sak STAR roztoku a 100 μΐ Glu-plazminogenového roztoku (konečná koncentrace 0,5 mM). Po 30 min inkubace při 37 °C byl generovaný plazmid kvantifikován přídavkem 30 μΐ S2403 (konečná koncentrace 1 μΜ) a měřením absorpce při 405 nm. Aktivity byly vyjádřeny v relativních jednotkách (home units - HU) porovnáním se standardem „v domě“

-8CZ 290685 B6 (in-house standard) (lot STAN5), kterému byla přidělena aktivita 100 000 HU na mg proteinu, stanoveno podle složení aminokyselin (výše uvedená citace 11). SDS-PAGE byla provedena s Phast Systém^(R) (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) za použití 10 až 15% gradientových gelů a vybarvení pomocí barviva Coomasie Brilliang blue. Redukce vzorků byla prováděna zahříváním na 100 °C po 3 min za přítomnosti 1% SDS a 1 % dithioerytthritoiu.

Konstrukce, produkce a purifikace mutantů M3.8 a M8.9 byly provedeny, jak je popsáno podrobněji dále. Oligonukleotidy použité pro konstrukci, 5-ATAGCAATGCATTTCCTGCACTATCAC-3' (M3).

5-CTAATTCAACTACTGCAAACGCTGCATATGCTGTCGCATC-3' (M8) a 5-TTTGCGYCTTGGCGCCAATGCAACTACTCTAAACTCTTTATAT-3' (M9) byly zakoupeny jako syntetizované produkty od Pharmacia Biotech.

Při konstrukci mutantu M3.8 byly použity jednořetězcová pMc-STAR a EcoRi-HindlII fragment pMa5-8 pro přípravu gap-duplexní DNA molekuly, která byla hybridizována se 28 bázovým syntetickým oligonukleotidem M3 (obsahujícím Nsil restrikční místo). Prodlužování reakce byly prováděny s Klenowovým fragmentem DNA polymerázy a ligázou, jak popsáno výše. Po transmisi E.coli WK6MutS a selekci na ampicilin, bylo pěstováno 81 kolonií na nitrocelulózových membránách, denaturováno in šitu a DNA byla hybridizována přes noc při teplotě místnosti za použití radioaktivně značeného M3 oligonukleotidu (1,5 χ 10⁸ cpm [gama^j2p]-ATP pro T4 polynukleotidkinázu (značeno 20 až 30 ng oligonukleotidu). Filtry byly promyly při 42 °C za použití roztoků, obsahujících 0,1 % SDS a 2 x SSC, 1 x SSC, 0,2 x SSC, 0,1 x SSC. DNA jednoho vybraného klonu ze 16 pozitivních klonů byla připravena ze 150 ml bakteriálních kultur a analyzována štěpením restrikčním enzymy Nsil a Pvul. M3 mutace (pMaSTAR) byla potvrzena sekvencováním kompletní kódující oblasti za použití A.L.F.^(R). Jednořetězcová DNA byla připravena transformací pMa-STAR3 v E. coli, jak je popsáno výše. Jednořetězcový pMa-STAR3 byl hybridizován s pMc (EcoRI-HindlII) a se 40bázovým syntetickým oligonileotidem M8, který obsahuje Ndel restrikční místo, jak je popsáno výše, o transformaci E. coli WK6MutS a selekci na chloramfenikol bylo 100 kolonií pěstováno na nitrocelulózových membránách a hybridizováno se značeným M8 oligonukleotidem. Pozitivní klony (2 ze 7) byly dále kultivovány a analyzovány štěpením restrikčními enzymy (NsI-HindlII a Ndel) za získání jednoho pozitivního klonu. Dvojitý' mutant M3.8 byl pak ligován zpět do pMEX602SakB expresního vektoru. Ze 12 minipreparací DNA mělo 6 správnou restrikční sestavu. Jeden z těchto klonů (pMEXSakSTAR.M3.8) byl sekvencován a použit pro přípravu mutantu M3.8 pod kontrolou IPTG indukovatelného tac promotoru a dvou Shine-Dalgemo sekvencí v tandemu.

100μ1 suspenze E. coli WK6 buněk transformovaných rekombinančním plazmidem pMEXSakSTAR-M38 bylo indukováno ve 100 ml LB média (Gibco/BRL), obsahujícího 100 μΐ/ml ampicilinu. Směs byla inkubována přes noc při 37 °C za třepání při 200 ot.min'¹, což vedlo k buněčné hustotě přibližně 5 absorbančních jednotek při 600 nm. Podíly 20 ml byly přeneseny do 21 objemů (v 51 nádobách) LB média, obsahujícího 100 μg/ml ampicilinu. Směsi byly inkubovány 3 hodiny při 37 °C za třepání před přípravkem 200 μΜ IPTG pro vyvolání M3.8 exprese, která byla ponechána probíhat 4 hodiny. Buňky byly peletovány odstředěním při 4 000 ot.min'¹ 20 min, resuspendovány v 1/10 objemu 0,01M fosfátového pufru, pH 6,5 a rozrušeny zpracováním s ultrazvukem (sonifikací) při 0 °C. Buněčné zlomky byly odstraněny odtřeďováním po 30 min při 20 000 ot.min'¹ a supematant byl uchováván při -20 °C do použití.

Spojené čištěné buněčné lyzáty (objem 2 litry) ze 20 až 30 litrů bakteriálních kultur byly upraveny na pH 5,9, sterilizovány filtrací přes 0,22 pm Sartorius filtr a aplikovány na 5x25 cm kolonu SP-Sepharosy předem kondicionovaného s 0,5m NaOH a sterilizovaným 0,01M fosfátovým pufrem, při průtokové rychlosti 12 ml/min a při 4 °C v laminárním toku. Kolona byla promyta 2 až 3 litry pufru a eluována solným grafientem od 0 do 1 M během 500 ml a od 1 M do 2M během 250 ml při průtokové rychlosti 10 ml/min a při 4 °C. Frakce, obsahující M3.8,

-9CZ 290685 B6 lokalizovaný SDS gelovou elektroforézou, byly spojeny (přibližně 200 ml) a dialyzovány při 15 litrům sterilizovaného 0,01M fosfátového pufru, pH 8,0, při 4 °C. Dialyzovaný materiál byl odstřeďován při 4 000 ot.min'¹ po 30 min, sterilizován opět filtrací a nanesen na 2.5 x 12 cm kolonu Q-Sepharosy s rychlým tokem, předem kondicionované s 0,5M NaOH a se sterilizovaným 0,01M fosfátovým pufrem, pH 8,0, při průtokové rychlosti 3 ml/min při 4°C. Kolona byla promyta s přibližně 600 ml 0,01M fosfátového pufru, pH 8,0, při průtokové rychlosti 8 ml/min a eluována se solným grafientem od 0 do 0,17M během 30 ml, od 0,17 do 0.2M během 100 ml a od 0,2M do 1,5M během 200 ml, při průtokové rychlosti 4 ml/min. Frakce, obsahující M3.8 byly spojeny, proteinová koncentrace byla upravena na 1 mg/ml a materiál byl sterilizován filtrací přes 0,022 μηι Millipore filtr. Tyto preparace M3.8 poskytly 80 ± 25 mg čistého proteinu (průměr ± SD) se specifickou aktivitou 45 000 ± 5 200 HU/mg.

Pro konstrukci mutantu M8.9 byly jednořetězcový pMc-STAR a EcoRI-HindlII fragment pMa5-8 použity pro přípravu gap-duplexní DAN molekuly, která byla hybridizována se 42bázovým syntetickým oligonukletidem M9, obsahujícím Narl restrikční místo. Prodlužovací reakce byly provedeny s Klenowovým fragmentem DNA polymerázy a ligovány, jak popsáno. Po transformaci E. coli WKóMutS a selekci na ampicilin byly kolonie pěstovány na nitrocelulózových membránách, denaturovány in šitu a DNA byla hybridizována přes noc při teplotě místnosti za použití radioaktivně značeného M9 oligonukleotidů (1,5 x 10^s cpm [gana^?'P]-ATP pro T4 polynukleotid kinázu (značeno 20 až 30 ng oligonukleotidů). Filtry byly promyty při 42 °C za použití roztoků, obsahujících 0,1 % SDS a 2x SSC, lx SSC, 0,2x SSC, O.lx SSC. DNA ze dvou selektovaných klonů ze 4 pozitivních klonů byla připravena a jedna z nich (pMASTARS) byla charakterizována nukleotidovou sekvenční analýzou za použití A.L.F.'^R|. EcoRIHindlll inzert z pMA-STAR9 byl pak ligován zpět do pMEX602SakB expresního vektoru. Klony (58) byly zkoumány in šitu hybridizací s radiaktivně značeným M9 oligonikleotidem jako probou. Jeden klon, pMEXSaSTAT.M9 byl charakterizován nukleotidovou sekvenční analýzou a následně použit pro konstrukci mutantu M8.9.

Pro konstruování M8.9 byla zavedena mutace 8 do M9 polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). PCR byla provedena v celkovém objemu 100 μΐ za použití 5U enzymu a 1 pg každého z následujících primerů:

oligonukleotidů II = 5-CAGGAAACAGAATTCAGGAG, oligonukleotidů III = 5-TATATAATATTCGLACATAGTATTCAATTTTT-3', oligonukleotidů IV = 5-TATCCCGGGCATTAGATGCGACAGCATATGCAGCGTTTGCAGTA-3' a oligonukleotidů V = 5'-CAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC-3'.

Koncentrace dATP, dCTP, dGTP a dTTP byly 200 2M. Denaturace byla prováděna 1 min při 94 °C, tepelné zpracování po 2 min při 55 °C a prodlužování 1,5 min při 72 °C. Po 30 cyklech byly vzorky inkubovány 10 min při 72 °C a ochlazeny na 4 °C. V první PCR reakci byly 2 ng pMEXSakSTAR.M9 amplifikovány za použití oligonukleotidů IV a B jako primerů. PCR amplikon byl štěpen se Sňal a HindlII a purifikován po elektroforéze v 1,5% agarózovém gelu za použití Preg-A-gene kitu (Bio-Rad Laboratories, Jercules, CA, USA). Výsledný fragment byl klonován do Smal-HindlII míst pUC18 (Pharmacia BioTech, Uppsala, Švédsko) za použití kitu pro rychlou ligaci DNA (Boehringer Mannheim). Po transformaci v E. coli WK 6 byla připravena DNA ze 12 kolonií a všech těchto 12 DNA generovalo fragment přibližně 230 bázových párů dlouhý, při štěpení EcoRI a HindlII. Jedna z těchto DNA (pUC18-M89) byla použita pro klonování druhého PCR produktu (viz dále). Druhá PCR reakce byla provedena na 2 ng pMEXSakSTAR.M9 za použití oligonukleotidů II a III jako primerů. PCR reakční produkt byl štěpen SspI a EcoRI a dále purifikován, jak popsáno výše. Výsledný fragment byl ligován do Smal-EcoRI míst pUC 18-M89. Po transformaci v E.coli WK5 buňkách bylo vybráno 6 klonů pro přípravu DNA. Pět ze 6 generovalo fragment přibližně 453 párů bází dlouhý, po štěpení EcoRI a HindlII. Tento fragment kódující celý mutant M8.9 byl klonován do EcoRI-HindlII míst expresního vektoru pMEXS602SakB. Po transformaci E.coli WK6 buněk byla DNA ze 6 kolonií

-10CZ 290685 B6 analyzována štěpením s EcoRI a HindlII za generování fragmentu přibližně o délce 453 párů bází ve všech příkladech. Jedna z těchto DNA byla dále charakterizována oligonukleotidovou sekvenční analýzou.

100 ml LB média (GIBCO/BRL), obsahujícího 100 pg/ml ampicilinu, bylo inokulováno 100 pl suspenze E.coli WK6 buněk transformovaných rekombinantním plazmidem pMEXSaK.STAR.M89. Kultura byla inkubována přes noc při 37 °C za třepání při 140 ot.min’¹ na buněčnou hustotu přibližně 5 absorbančních jednotek při 600 nm. Podíly 4 ml byly použity k inokulování 21itrových kultur (v SL uzavřených lahvích) v „Terrific Broth“ médiu, obsahujícím 150pl/ml ampicilinu. Kultury byly inkubovány po asi 20 h při 30 °C a při 140 ot.min'¹, za poskytnutí konečné buněčné hustoty přibližně 4.10⁹ buněk/ml. Buňky byly peletovány odstřeďováním při 2 000 ot.min’¹ po 20 min, resuspendovány v 1/5 objemu 0,01M fosfátového pufru, pH 6,5 a rozrušeny sonifikací při 0 °C. pH pak bylo upraveno na 5,8 a buněčné zlomky byly odstraněny odstřeďováním při 20 000 ot.min'¹ po 30 min. Supernatant byl uchováván při 20 °C před dalším použitím.

Spojené čištěné buněčné lyzáty (1800 ml) byly upraveny na pH 5,8 a naneseny na 2,5 x 20 cm kolonu SP-Sepharosy, předem zpracované s 0,5M NaOH a čerstvým 0,01M fosfátem, 2,5M NaCl pufrem, pH 7,5, při průtokové rychlosti 2 ml/min při 4 °C. Kolona byla promyta 500 pl pufru a eluována se solným gradientem od 0 do 1 M ve 200 ml při průtokové rychlosti 6 ml/min.

Spojené M8.9 frakce, identifikované pomocí SDS gelové elektroforézy, byly upraveny na 2,5M pevným NaCl a podrobeny hydrofobní interakční chromatografií na 2,5x20 cm koloně fenylSepharosy, předem zpracované s 0,5M NaOH a čerstvým 0,01M fosfátem, 2,5M NaCl pufrem pH 7,5, při průtokové rychlosti 2 ml/min při 4 °C. Kolona byla promyta přibližně 500 ml pufru a eluována s 0,01N fosfátovým pufrem, pH 6,5. M8.9, obsahující frakce, lokalizované SNS gelovou elektroforézou, byly spojeny a dialyzovány proti 2 litrům 0,01M fosfátového pufru, pH 9,0. Dialyzovaný materiál byl odstřeďován při 4000 ot.min'¹ po 30 min a nanesen na 1,6 x 5 cm kolonu Q-Sepharosy fast flow, předem zpracované s 0,5M NaOH a s čerstvým 0,01N fosfátovým pufrem, pH 9,0, při průtokové rychlosti 2 ml/min a 4 °C. Kolona byla promyta přibližně 150 ml 0,01M fosfátového pufru, pH 9,0 a eluována solným gradientem od 0 do 1 M NC1 během 100 ml při průtokové rychlosti 4 ml/min. Frakce, obsahující M8.9, lokalizovaný SDS gelovou elektroforézou, byly spojeny, proteinová koncentrace byla upravena na 1 mg/ml a materiál byl sterilizován přes 0,22 μΜ Milipore filtr. Tři preeparace M8.9 poskytly 73 ± 17 mg čistého proteinu se specifickou aktivitou 51 000 ± 3 500 HU/mg.

Fibrinolytické aktivity různých SakSTAR mutantů stanovené testem s chromatogenním substrátem jsou shrnuty v tabulce 1.

Z 21 mutantů označených, jak ilustrováno na obr. 1, E99, E10 (M13) a E99, E10, E102 (M14), nemohly být získány v purifikované formě, zatímco Kl 1, D13, D14 (Ml), E46, K50 (M4) a E65, D69 (M7) byly inaktivní. Šestnáct mutantů shrnutých v tabulce 1 bylo studováno podrobně, společně s původním typem SakSTAR. Z nich mutanty D5, K6 (M20), K8, K10 (M21), D33,K35 (M2), K57,E58,K59 (M5), E61,E65 (M6), K86,K88 (M10), D93,K94 (Mil), K96,K97,K98 (M12), E108,K109 (M15), Dl 15,El 18,H119 (M16), H119, K121 (M17), K130 (M18) a E134,K135,K136 (M19) reagují s monoklonálním protilátkovým panelem podrobně jako SakSTAR. Avšak K35,K38 (M3) a E80, D82 (M9) reagují špatně s protilátkovým shlukem 7H11, 25E1,4OC8, zatímco K74,E75,R77 (M8) reaguje špatně se shlukem 26A2, 30A2, 2B12 a 3G10. Aditiva editované eliminace byla zjištěna s mutanty K35,E38/K74, E75,R77 (M3.8) a K74,E75,R77/E80,D82 (M8.9), které kombinují redukovanou reaktivitu s monoklonálními protilátkami obou rodičovských molekul.

-11CZ 290685 B6

Příklad 3

Adsorpce protilátek k variantám stafylokinázy divokého typu a typu „nabitý-shluk-k-alaninu“, elicitovaným v pacientem při léčení za použití SakSTAR

Za účelem získání informace o epitopové specifitě indukovaných protilátek elicitovaných v pacientech s akutním infarktem myokardu po léčení se SaksSTAR, byla vzorky plazmy ze 16 pacientů absorbovány ve dvojnásobném molárním přebytku (vzhledem k aktivitě neutralizující stafylokinázu) jednoduchého a kombinovaného mutantu „nabitý-shluk-k-alaninu“ po 10 minut před stanovením zbytkové vazby k SakSTAR biospecifickou interakční analýzou. Stafyokinázu neutralizující aktivita v těchto vzorcích byla stanovena následovně. Zvýšené koncentrace původního typu nebo varianty SakSTAR (50 μΐ objemy, obsahující 0,2 až 1000 pg/ml) byly přidány ke směsi 300 μΐ citrátované lidské plazmy a 50 μΐ pufru nebo testované plazmy, s okamžitě následujícím přídavkem 100 μΐ směsi, obsahující trombin (50 N1H jednotek/ml) a CaCL (25 mM). Byla měřena doba lýze plazmové sraženiny a vynesena proti koncentraci SakSTAR skupiny. Z této křivky byla stanovena koncentrace plazminogenového aktivátoru, která produkuje kompletní lýzi sraženiny za 20 min. Titr neutralizační aktivity byl stanoven jako rozdíl mezi hodnotami testované plazmy a pufru a byl vyjádřen v μg na ml testované plazmy.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2. Zatímco původní typ SakSTAR absorbuje více než 90 procent vazebných protilátek ze všech vzorků, nekompletní absorpce byla pozorována s mutantem K35,E38 (M3) u 4 pacientů, s mutantem K74,E75,R77 (M8) u 12 pacientů a s mutantem E80, D82 (M9) u 5 pacientů. Absorpce s kombinací mutantů K35,E38/K74,E75,R77 (M3.8) a K74,E75,R77/E80,D82 (M8.9) odstraňuje méně než 90% protilátek u 13 pacientů (průměrná hodnota 68 a 65 procent pro 16 pacientů), zatímco, jak bylo očekáváno, směs rodičovských molekul kombinace mutantů (M8 a M3 nebo M9) konzistentně absorbuje v přebytku 90 procent protilátek.

Příklad 4

Imunogenicita „nabitý-shluk k alaninu“ variant stafylokinázy v králících imunizovaných s původním typem y (SakSTAR), s mutanty K35, E38 (M3), K74,E75,R77 (M8) a E80,D82 (M9) a s kombinovanými mutanty K35,E38/K74,E75,R77 (M3.8) a K74,E75,R77/E80,D82 (M8.9)

Srovnávací imunogenicita SakSTAR variant, M3, M8, M9, M3.8 a M8.9 byla studována po subkutánní imunizaci ve skupinách 4 nebo 8 králíků vzhledem k SakSTAR a ve skupinách 8 králíků vzhledem k variantě. Imunizace byla provedena intravenózní infuzí 400 pg/kg SakSTAR a 200 až 1000 pg/kg mutantů v týdnu 0 (pro stanovení základní linie kapacity lýze sraženiny) s následující subkutánní injekcí 400 pg stejného činidla v kompletním Freundově adjuvans ve 2. týdnu a v nekompletním Freundově adjuvans ve 3. a 5. týdnu. Imunogenicita byla kvantifikována 6 týdnů stanovením stafylokinázu neutralizující aktivity v plazmě a zbytkové trombolytické potence, jako je podrobně uvedené dále.

Stručně, stafylokinázu neutralizující aktivita v plazmě byla stanovena přídavkem zvyšujících se koncentrací původního typu nebo mutantu SakSTAR (50pg objemy, obsahující 0,2 až 100 pg/ml) ke směsi 300 21 citrátované lidské plazmy a 50 pl pufru nebo králičí plazmy, ihned následovaného přídavkem μΐ směsi, obsahující trombin (50 NIH jednotek/ml) a CaCl₂ (25 mM). Byla měřena doba lýze plazmové sraženiny a vynesena proti koncentraci SakSTAR nebo varianty. Z této křivky byla stanovena koncentrace plazminogenového aktivátoru, která produkuje kompletní lýzi za 20 min. Titr neutralizační aktivity byl stanoven jako rozdíl mezi hodnotami králičí plazmy a pufru a byl vyjádřen v pg na ml králičí plazmy.

-12CZ 290685 B6

Trombolytické vlastnosti byly studovány za použití 0,3 ml ^,25I-fibrinem značených sraženin na destičky chudé králičí plazmy, inzertovaných do extrakorporální arteriovenózní smyčky. Exponovaná femorální arterie byla pak katetrizována 4 French katetry (Portex White, Portex, Hythe, UK) a připojena přes dvě injekční stříkačky ke katetrizované ušní véně. Krevní tok přes extrakorporální smyčku byl udržován na lOml/min peristaltickým čerpadlem. ^l2:,I-fibrinem značené plazmové sraženiny byly zavedeny do každé ze dvou stříkaček zapojených do smyčky. Plazmové sraženiny byly připraveny smísením 0,3 ml plazmy chudé na destičky se stopovým množstvím (přibližně 1,5 pCi) roztoku ¹²’I-značeného lidského fibrinogenu (Amersham, Buckinghamshire, UK) a 0,07 ml směsi hovězího trombinu (15 NIH jednotek jednotek/ml) a 0,5 M CaCl₂, s následující inkubací po 30 min při 37 °C. Třicet minut před začátkem infuze bylo podáno 7,5 mg/kg ridogrelu (kombinovaný inhibitor tromboxan syntézy a antagonista prostaglandin endoperoxid receptorú) (citace 43: De Clarck F. Beetens J, de Chaffoy de Courcelles D, Freyne E, Janssen PA: R68070: thromboxane A2 synthetase inhibition and thromboxane A2/prostaglandin endoperoxide receptor blockade combined in one molecule. 1. Biochemical profile in vitro. Thromb Haemost 61: 35-42, 1989.) jako intravenózní bolus pro zabránění tomu, aby se destičky usazovaly na extrakorporální smyčce. Zvířata byla antikoagulována s heparinem (300 jednotek/kg s kontinuální infuzí 200 jednotek/kg/h během pokusu) a náhodně připojených k infuzi se 400 pg/kg SakSTAR, (4 nebo 8 králíků) nebo 200 až 1000 pg/kg SakSTAR varianty (8 králíků). Po 6 týdnech polovina králíků s SakSTAR variantou byla opět ošetřena se stejnou SakSTAR variantou a druhá polovina s původním typem SakSTAR, zatímco králíci imunizovaní se SakSTAR byli buď ošetřeni se SakSTAR variantou (jestliže kontrolní skupina obsahuje 4 králíky) nebo náhodně buď s původním typem SakSTAR nebo se SakSTAR variantou (jestliže tato kontrolní skupina obsahuje 8 králíků). Trombolytická činidla byla podávána intravenózně jako 10% bolus a 90% infuze během 1 h. Byl sledován časový průběh lýze sraženiny vnějším počítáním gama rozpadů za použití dvou 3x0,5 palcových krystalů jodid sodný/thalium (Bicron, Newbuy, OH) umístěných nad extrakorporální smyčkou. Scintilační krystaly byly připojeny k systému Canberra-SlOO (Canbera-Packard, Meriden, CT) a data byla analyzována jak je popsáno jinde (citace 44: Stassen JM, Vanlithout I, Lijnen HR, Collen D: A hamster pulmonary embolism model for the evaluation of the thrombolytic and pharmacokinetic properties of thrombolytic agents. Fibrinolysis 4 (Suppl 2): 15-21, 1990.) Na konci pokusu byly zbylé sraženiny také získány ze stříkaček pro stanovení jejich obsahu radioizotopu. Provedené pokusy na zvířatech odpovídají zásadám Američan Physiological Society a Intemational Committee on Thrombosis and Heamostasis (citace 45: Giles AR: Guidelines for the use of animals in biomedical research. Thromb Haemost 58: 1078-1084, 1987.)

Imunogenicita SakSTAR a jednotlivých odpovídajících mutantů (M3, M8 a M9) je porovnána v tabulkách 3A. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SD.

V 8 králících náhodně přidělených k mutantu M3 byla základní neutralizační aktivita 0,0 ± 0,0 pg/1 jako proti SakSTAR, tak proti M3. Intravenózní infuze 200 pg/kg M3 vyvolává 76 ± 23 procent lýze sraženiny .Tito králíci pak byli imunizovány s M3, suspendovaným v 500 pl kompletního Freundova adjuvans ve 2. týdnu a v 500 pl nekompletního Freundova adjuvans ve 3. a 5. týdnu. V 6. týdnu byla plazmová neutralizační aktivita zvýšena na 11 ± 6,7 pg/ml proti SakSTAR a 11 ± 7,2 pg/ml proti M3. V 6. týdnu infuze 400 pg SakSTAR ve 40 z těchto králíků vybraných náhodně produkuje 18 ± 27 procent lýze sraženiny, zatímco infuze 200 pg/kg M3 ve 4 jiných králících indukuje 16 ± 17 procent láze. Ve 4 králících určených SakSTAR byla základní linie neutralizační aktivity 0,2+ 0,2 pg/ml proti SakSTAR a 0,0 ± 0,0 pg/ml proti M3. Intravenózní infuze 400 pg/kg SakSTAR produkuje 89 ± 8,6 procent lýze základní linie. Tito 4 králíci byli pak imunizováni se 400 pg SakSTAR suspendovaného buď v 500 pg kompletního (ve 2. týdnu) nebo nekompletního (3. a 5. týden) Freudova adjuvans. V 6. týdnu byla plazmová neutralizační aktivita zvýšena na 35 ± 23 pg/ml proti SakSTAR a na 19 ± 13 pg/ml proti M3. Intravenózní infuze 200n pg/kg SakSTAR. M3 v němž 4 králících v 6. týdnu indukuje 9,3 ± 8,2 procent lýze.

-13CZ 290685 B6

V osmi králících určených pro mutant M8 byla základní neutralizační aktivita v plazmě 1.4 ± 0,2 pg/ml proti SakSTAR a 0,6 ± μ/ml proti M8. Intravenózní infuze 1000 pg/kg M8 produkuje 41 ± 13 procent lýze. Tito králíci byli pak imunizováni se 400 pg M8 suspendovaného v kompletním Freundově adjuvans ve 2. týdnu se stejným množstvím v kompletním Freundově adjuvans ve 3. a 5. týdnu. V 6. týdnu byla plazmová neutralizační aktivita zvýšena na 3,8 ± 1,8 pg/ml proti SakSTAR a na 5,9 ± 2,7 pg/ml proti M8. Infuze 400 g/kg SakSTAR v těchto 4 králích produkuje 49 ± 28 procent lýze sraženiny, zatímco infuze 1000 pg/kg M8 ve 4 jiných králících produkuje 24 ± 11 procent lýze. V 8 králících určených pro SakSTAR skupinu byla základní neutralizační aktivita v plazmě 0,9 ± 0,6 pg/ml proti SakSTAR a 0,6 + 0,3 pg/ml proti M8. Intravenózní infuze 400 pg/kg SakSTAR produkuje 68 ± 18 procent lýze. Tito králíci byli pak imunizováni subkutánně se 400 pg SakSTAR suspendovaného v kompletním Freundově adjuvans ve 2. týdnu a se stejným množstvím v nekompletním Freundově adjuvans ve 3. a 5. týdnu. V 6. týdnu byla plazmová neutralizační aktivita zvýšena na 59 ± 47 pg/ml proti SakSTAR a na 22 ± 16 pg/ml proti M8, zatímco zbytková trombolytická potence 400 pg/kg SakSTAR byla snížena na 7,5 ± 2,4 procenta a 1000 pg/kg M8 na 4,1 ± 4,8 procent.

V 8 králících určených pro mutant M9 byla základní neutralizační aktivita v plazmě 0,2 ± 0,05 pg/ml proti SakSTAR a 0,03 ± 0,05 pg/ml proti M9. Intravenózní infuze 400 pg/kg M9 produkuje 72 ± 11 procentní lýzi sraženiny. Tito králíci byli pak imunizováni se 400 pg M9 suspendovaného v kompletním Freundově adjuvans ve 2. týdnu a se stejným množstvím v nekompletním Freundově adjuvans ve 3. a 5. týdnu. V 6. týdnu byla plazmová neutralizační aktivita zvýšena na 8,0 ± 4,6 pg/ml proti SakSTAR a na 3,5 ± 2,6 pg/ml proti M9. V 6. týdnu produkuje infuze 400 pg/kg SakSTAR ve 4 z těchto králíků 53 ± 11 procent lýze sraženiny, zatímco infuze 400 pg/kg M9 ve 4 jiných králících produkuje 40 ± 7,8 procent lýze. Ve 4 kontrolních králících určených pro SakSTAR byla základní neutralizační aktivita v plazmě 0,1 ± 0,05 pg/ml SakSTAR a 0,05 ± 0,06 pg/ml proti M9. Intravenózní infuze 400 pg/kg SakSTAR poskytne 78+ 13 procent lýze. Tito králíci byli pak imunizováni 400 pg SakSTAR suspendovaného v kompletním Freundově adjuvans (2. týden) a v nekompletním Freundově adjuvans (3. a 5. týden). V 6. týdnu byla plazmová neutralizační aktivita zvýšena na 16 ± 5,0 pg/ml proti SakSTAR a na 12 ± 9,1 pg/ml proti M9, zatímco trombolytická potence M9 byla snížena na 24 ± 33 procent.

Imunogenicita SakSTAR versus dvojité mutanty M3.8 a M8.9 je porovnána v tabulce 38. V 8 králících určených proti M3.8 skupinu byla základní neutralizační aktivita v plazmě 0,6 ± 0,3 pg/ml proti SakSTAR a 3,5 ± 2,0 pg/ml proti M3.8. Intravenózní infuze 1000 pg/kg M3.8 produkuje 53 ± 13 procent lýze. Tito králíci byli pak imunizováni se 400 pg M3.8 suspendovaného v kompletním Freundově adjuvans ve 2. týdnu a se stejným množstvím v nekompletním Freundově adjuvands ve 3. a 4. týdnu. V 6. týdnu byla plazmová neutralizační aktivita zvýšena pouze na 1,7 ± 0,7 pg/ml proti SakSTAR a na 6,1 ± 3,0 pg/ml proti M.3.8. Infuze 400 pg/kg SakSTAR ve 4 z těchto králíků produkuje 77 ± 18 procent láze sraženiny, zatímco infuze 100 pg/kg M.8 ve 4 jiných králících produkuje 59 ± 25 procentní lýzi. V 8 králících určených pro SakSTAR skupinu byla základní plazmová neutralizační aktivita 0,6 ± 0,4 pg/ml proti SakSTAR a 2,0 ± 0,4 pg/ml proti SakSTAR a 2,0 ± 2,0 pg/ml proti M3.8. Intravenózní infuze 400 pg/kg SakSTAR produkuje 80 ± 10 procent lýze. Tito králíci byli pak imunizováni subkutánně se 400 pg SakSTAR suspendovaného v kompletním Freundově adjuvans ve 2. týdnu a se stejným množstvím v nekompletním Freundově adjuvans ve 3. a 5. týdnu. V 6. týdnu byla plazmová neutralizační aktivita zvýšena na 20 ± 15 pg/ml proti M3.8, zatímco zbytková trombolytická potence 400 pg/kg SakSTAR byla zvýšena na 8,5 ± 5,8 procent a 1000 ± pg/kg M3.8 na 30 ± 29 procent.

V 8 králících určených pro M3.8 skupinu byla základní plazmová neutralizační aktivita 0,3 ± 0,2 pg/ml proti SakSTAR a 1,6 ± 0,5 pg/ml proti M8.9. Intravenózní infuze 800 pg/kg M8.9

-14CZ 290685 B6 produkuje 39 ± 13 procent lýze sraženiny při základní hladině. Těchto 8 králíků bylo pak imunizováno se 400 pg M8.9 suspendovaného v kompletním Freundově adjuvans (2. týden) nebo v nekompletním Freundově adjuvans (3. a 5. týden). V 6. týdnu byla plazmová neutralizační aktivita pouze zvýšena na 2,5 ± 1,5 pg/ml proti SakSTAR a na 4,0 ± 1,3 pg/ml proti M8.9. V 6. týdnu infuze 400 pg/kg SakSTAR ve 4 z těchto králíků produkuje 51 ± 35 procent lýze sraženiny, zatímco infuze 800 pg/kg M8.9 ve 4 jiných králících produkuje 39 ± 12 procent lýze. Ve 4 kontrolních králících určených pro SakSTAR byla neutralizační aktivita před ošetřením 0,2 ±0,1 pg/ml proti SakSTAR a 0,7 ± 0,3 pg/ml proti M8.9. Intravenózní infuze 400 pg/kg SakSTAR vyvolává 67 ± 19 procent lýze sraženiny. Tito 4 králíci pak byli imunizováni 400 pg SakSTAR suspendovaného v kompletním Freundově adjuvans (2. týden) nebo v nekompletním Freundově adjuvans (3. a 5. týden). V 6. týdnu byla plazmová neutralizační aktivita zvýšena na 20 ± 15 pg/ml proti SakSTAR a na 18 ± 15 pg/ml proti M8.9, zatímco trombolytická účinnost M8.9 byla snížena na 31 ± 30 procent lýze sraženiny.

Tyto výsledky ukazují, že v této přímé porovnávací studii SakSTAR a vybraných variant zejména dvojité mutanty (M3.8 a M8.9) indukují výrazně méně s protilátkou spojené neutralizační aktivity a rezistenci k lýzi než SakSTAR.

Příklad 5

Porovnávací imunogenicity SakSTAR a M3.8 na paviánech

Porovnání imunogenicity SakSTAR a M3.8, pokud jde o indukci neutralizačních protilátek a nezabírání při trombolýze při opakovaném podáním byla studována na paviánech.

Pokusy na zvířatech byly provedeny podle prováděcích předpisů Američan Physiological Society a Intemational Committee on Thrombosis and Haemostasis (výše uvedená citace 45). U anestezovaných a intubovaných paviánů byl vytvořen extrakorporální arteriovenózní oběh spojením přes vnější polyethylenovou smyčku, katetrizované tibiální nebo branchiální arterie k periferní véně. Peristaltické čerpadlo řídí a udržuje kontinuálně sledovaný krevní tok extakorporální smyčkou, do které byly zapojeny dvě injekční stříkačky, obsahující každá čerstvých 0,3 ml ¹²⁵I fibrinem značené sraženiny povolované plazmy paviánů. Kontinuálně byl sledován časový průběh lýze sraženiny během infuze SakSTAR nebo varianty M3.8, pomocí vnějšího gama počítače nad stříkačkami. Alternativně byla rovnováha získána izotopu stanovena porovnáním součtu hodnoty celkové krevní radioaktivity na konci pokusu (násobeno faktorem 3 pro zohlednění extravaskulámí distribuce) plus radioaktivity v získaném trombu, s hodnotou, která byla původně přítomna ve sraženinách.

Před každým trombolyzovým experimentem byli paviáni premedikováni intravenózním bolusem ridogrelu, 3 mg/kg, pro zabránění ukládání destiček v extrakorporálním sytému. Během trombolytických experimentů byl podáván intravenózně heparin jako 300 IU/kg bolus následovaný 200 IU/kg.h infuzí.

Dvanáct dospělých samců paviánů (Papio hamadryas) bylo náhodně umístěno při základní hodnotě (týden 0) pro ošetření s 50 pg/kg buď SakSTAR (skupina 1) nebo variantou M3.8 (skupina 2), podávaných infuzí intravenózně během jedné hodiny jako 10% bolus a základní trombolytická potence byla hodnocena sledováním vymizení radioaktivity se sražením za 2 hodiny. Paviáni byli imunizováni subkutánně s 500 pg buď SakSTAR (skupina 1) nebo varianty M3.8 (skupina 2), suspendovanými v kompletním Freundově adjuvans ve 2. týdnu a v nekompletním Freundově adjuvans ve 3. a 5. týdnu. V 6. týdnu byla trombolytická účinnost kvantifikována pomocí modelu extrakorporální trombolýzy během 4 hodin: 3 ze 6 paviánů ze skupiny 1, ošetřených při základní hodnotě a subkutánně imunizovaných se SakSTAR a 3 ze 6 paviánů se skupiny 2, ošetření při základní hodnotě a následně imunizovaní sM3.8, byli

-15CZ 290685 B6 náhodně vybráni a podáváno jim nejprve 50 pg/kg SakSTAR, infundovaného intravenózně během jedné hodiny s 10% bolusem a pak, po 2 hodinách od začátku SakSTAR-infuze, se stejným režimem M3.8 (skupina IA a 2A). Jiných 6 paviánů dostávalo stejnou terapii, ale v obráceném pořadí: nejprve M3.8, pak SakSTAR (skupiny 1B a 2B pro paviány předem imunizované se SakSTAR a M3.8). V 18. týdnu byla hodnocena trombolytická aktivita potřetí sledováním vymizení radioaktivity z fibrinových sraženin, během 3 hodin: 3 ze 6 paviánů imunizovaných se SakSTAR dostali 250 μg/kg SakSTAR jako intravenózní bolus během 2,5 min (skupina IA), zatímco 3 další paviáni imunizovaní ze SakSTAR dostali stejné množství M3.8 (skupina 1B). Ze 6 paviánů imunizovaných sM3.8 dostali 3 intravenózní bolus 250 pg/kg SakSTAR (skupina 2A) a 3 stejné množství M3.8 (skupina 2B).

Krevní vzorky byly odebrány do citrátových zkumavek (konečná koncentrace 0,01 M) při základní hodnotě a v několika časových bodech potom pro měření aktivované parciální tromboplastinové doby (activated partial thromboplastic time - aPTTT), fibrinogenu, a₂antioplazminu (na počátku a na konci každého pokusu) a SakSTAR- a M3.8-neutralizačních aktivit (před trombolytickou infuzí). Proto byla zvyšující se množství buď sakSTAR nebo M3.8 (50 μΐ objemy, obsahující 0,2 až 100 pg/ml) přidáno ke směsi 300 μΙ citrátované lidské plazmy a 50 pl pufru nebo testované plazmy paviánů, s ihned následujícím přídavkem 100 μΐ směsi trombinu (50 N1H U/ml) a CaCI₂ (25 mM). Byla měřena doba lýze plazmové sraženiny a vy nesena proti koncentraci SakSTAR nebo M3.8. Z této křivky byla stanovena koncentrace plazminogenového aktivátoru, která produkuje kompletní lýzi sraženiny za 20 min. Neutralizační aktivita byla definována jako rozdíl mezi hodnotami testované plazmy a pufru a byla vyjádřena v pg/ml plazmy.

Syntetický fibrinogen nebyl degradován, ani nebyl vytěsněn a₂-antiplazmin, což odráží celkovou fibrin-specifitu obou činidel.

Od 6. týdne byly SakSTAR-neutralizační aktivity skupiny 1 významně vyšší než M3.8neutralizační skupiny 2. Skupina 1 vyvíjí neutralizační aktivity rychleji a výrazně významněji proti SakSTAR než proti M3.8, zatímco M3.8-neutralizační aktivity nikdy nepřekračují SakSTAR-neutralizační aktivity ve skupině 2 (tabulka 4). Od 8. týden skupina 1 vyvíjí významně více neutralizačních aktivit jak proti SakSTAR, tak proti M3.8, než skupina 2 (tabulka 4).

Při základní hodnotě indukuje 50 pg/kg SakSTAR infukdovaného intravenózně během 1 hodiny 77 ± 2,9 % lýze sraženiny během 2 hodin u 6 paviánů (skupina 1) a 50 pg/kg M3.8 indukuje 83 ± 3,6 lýze sraženiny během 2 hodin u 6 jiných paviánů (skupina 2) (průměr ± SEM, p = 0,2). Po 6 týdnech lytická účinnost 50 pg/kg SakSTAR během 2 hodin infundovaného intravenózně během 1 hodiny, klesá na 9,2 ± 1,0 % u 3 paviánů imunizovaných se SakSTAR (skupina IA) a na 8,5 ± 3,2 % u 3 pavián imunizovaných s M3.8 (skupina A2), zatímco lytická účinnost 50 pg/kg intravenózního M3.8 během 2 hodin se snižuje na 10 ± 6,9% u 3 paviánů imunizovaných se SakSTAR (skupina 1B) a na 11 ± 7,4% u 3 paviánů imunizovaných sM3.8 (skupina 2B); p < 0,001 versus odpovídající základní lýze pro všechny skupiny; p = NS mezi skupinami). Dvě hodiny po začátku první trombolytické infuze bylo 50 pg/kg jiného činidla infundováno intravenózně během 1 hodiny, za získání srovnatelných zbytkových lytických účinností: 7,7 ± 1,5 % a 11 ± 5,7 % lýze sraženiny během 2 hodin s M3.8 ve skupinách IA a 2A, a 13 ± 2,7 a 12 ± 2,1 % lýze sraženiny během 2 hodin se SakSTAR ve skupinách 1B a 2B.

Za 18 týdnů intravenózní bolusová injekce 250 pg/kg SakSTAR poskytuje 39 ±5,3% láze sraženiny během 3 hodin u 3 paviánů imunizovaných se SakSTAR (skupina IA), zatímco zbytková trombolytická potence 250 pg/kg M3.8 u 3 paviánů imunizovaných sM3.8 (skupina 2B) byla významně větší: 68 ± 4,5 % lýze sraženiny během 3 hodin (p < 0,005). 250 pg/kg SakSTAR produkuje 58 ± 0,5 % sraženiny během 3 hodin u 3 paviánů imunizovaných s M3.8

-16CZ 290685 B6 (skupina 2A; p = 0,2 vs skupina 1 A), zatímco lýze sraženiny během 3 hodin se 250 pg/kg M3.8 u 3 paviánů imunizovaných SakSTAR (skupina IB) byla 39 ± 3,6 % (p = 0,005 vs skupina 2B). Povolovaná analýza, vzhledem k činidlu podanému 18. týden, ukazuje zbytkovou lýzi během 3 hodin 39 ± 3,9 % pro skupinu 1 imunizovanou se SakSTAR, versus 63 ± 5,2 % pro skupinu 2 imunizovanou s M3.8 (p < 0,0005).

Trombolytické potence korelují nepřímo úměrně s odpovídajícími neutralizačními aktivitami během doby studie (Spearman r = -0,83; p < 0,0001).

Mutant M3.8 je tedy srovnatelně aktivní a fibrinspecifický, ale významně méně antigenní než původní typ SakSTAR u paviánů, jak je zřejmé z menší indukce neutralizačních aktivit v plazmě a rychlejší regenerace trombolytického potenciálu pro imunizaci. Tyto výsledky, získané u outbredních primátů, potvrzují a navazují na výše uvedená pozorování u králíků.

Příklad 6

Srovnání trombolytické účinnosti a imunogenicity M3.8 a M8.9 versus SakSTAR u pacientů s periferní arteriální okluzí

SakSTAR (n = 8), M3.8 (n = 4) a M8.9 (n =4) byly podány intraarteiálně na nebo do proximálního konce okluzního trombu jako bolus 2 mg následovaný infuzí 1 mg za h u pacientů s angiograficky dokumentovanou arteriální okluzí periferní arterie nebo bypassových transplantátem. Pacienti byli studováni po vyslovení souhlasu a protokol byl proveden podle Human Studies Committee of the University of Leuven. Kritéria inluze a exkluze byla v podstatě stejná, jako jsou kritérie popsaná dříve (citace 46: Vanderschueren S, Stockx L, Wilms G, Lacroix H Verhaeghe R, Vermylen J, Collen D: Thrombolytic therapy of peripheral arterial occlusion with recombinant staphylokináze. Circulation 92: 2050-2057, 1995.) s tím rozdílem, že následovalo přeléčení se skupinou rekombinantní stafýlokinázy během 48 h. Konjuktivní antitrombotické ošetření heparinem, aspirinem a orálními antikoagulanty bylo provedeno, jak popsáno dříve (výše uvedená citace 46).

Stav průchodnosti okludované periferní arterie nebo bypassového transplantátu byl postupně hodnocen před alespoň každé 4 hodiny během a na konci intraarteriální infuze původního typu nebo varianty SakSTAR. Stav angiografické průchodnosti cílové cévy na konci infuze představuje hlavní konečný bod studie. Podání trombolytického činidla bylo ukončeno, když bylo dosaženo odpovídající průchodnosti cévy, když komplikace si vyžádaly přerušení nebo, když dva po sobě jdoucí angiogramy selhaly pro demonstrování progrese lýze sraženiny. Rekanalizace byl definována jako lýze sraženiny dostačující k obnově živého anterográlního toku dříve okludovaným segmentem. Komplementární intravaskulámí postupy, jako je perkutánní transluminální angioplastika (PTA), byly provedeny, když posuzovatel hodnotil, že trombus byl dostatečně lyžován, nebo že se neočekává další trombolýza.

Krevní tlak a srdeční tep byly sledovány před, během a po infuzi SakSTAR, M3.8 nebo M8.9. Krevní vzorky byly odebírány před, na konci a 6 hodin po angiografické proceduře. Měření zahrnují množství periferní krve, protrombinovou dobu (PT), aPTT, fibrinogen, a2-antiplazmin, plazminogen a biochemické testy jatemí a renální funkce. SakSTAR - neutralizační, M3.8neutralizační a M8.9-neutralizační aktivity a anti-SakSTAR, anti-M3.8 a anti-M8.9 IgG a IgM byly postupně stanoveny na krevních vzorcích odebraných během hospitalizace a po propuštění. Klinická sledování byla zaměřena na znovu se vyskytnutí trombózy a na nežádoucí příhody, jako jsou alergické reakce a hlavně krvácení (tj. nutnost krevní transfuze nebo chirurgické kontroly, pokles hematokritu > 10 % nebo intrakraniální krvácení).

-17CZ 29068S B6

Skupiny 4 až 8 pacientů (41 až 73 let) s angiograficky dokumentovanou PAO, s dobou hodnocení až 120 dnů a délkou 8 až 50 cm, byly ošetřeny s M3.8, M8.9 nebo SakSTAR. Jeden pacient (WAL), který dostal původní stav SakSTAR vyvinul anafýlaktoidní reakci během 5 min po podání 2 mg bolusu. Infúze byla ihned přerušena a krevní tlak vrácen na normál během 20 minut během infúze plazmových expanderů. Tento pacient nebyl zahrnut do výpočtu průměr ± SEM v tabulkách 5 až 7. Jeden pacient (LAN) dostal M8.9 a vyvinul reokluzi po 30 h, kdy byl ošetřen 6,5 mg varianty. Tento pacient vyvíjí, 17,8 pg/ml M8.9 neutralizační aktivitu a 270 pg/ml specifickou anti-M8.9 IgG po 2 až 3 týdny.

Relevantní základní charakteristiky jednotlivých pacientů jsou uvedeny v tabulce 5. Většina PAO byla na femoropopliteální úrovni. Všechny byly způsobeny in šitu trombózou. Byly zahrnuty dva transplantáty a 2 iliakální stent okluze. Devět pacientů bylo přítomno s nekapacitační klaudikací, s chronickou ischemickou zbytkovou bolestí, 4 se subkutánní a 1 s akutní ischemií.

Tabulka 6 shrnuje individuální výsledky ošetření a výsledky. Intraarteriální infúze v dávce 5,5 až 13 mg během 3,5 až 11 h vyvolává kompletní rekanalizaci u 13 pacientů, parciální rekanalizaci u 1 pacienta a žádné zlepšení u 1 pacienta. Komplementární andovaskulámí postupy (hlavně PTA) byly provedeny u 12 a komplementární chirurgický zákrok ihned po trombolýze u 1 pacienta. Znovu výskyt trombózy po skončení angiografické procedury se objevil u 4 pacientů: první pacient byl úspěšně znovu ošetřen po 30 h se 6,5 mg M8.9, druhý podstoupil aortabi—iliakální bypassovou transplantaci, třetí pacient byl úspěšně rekanalizován po 20 h se 40 mg rt-PA a trombus byl odsát transluminámě u čtvrtého pacienta. Nebyly přítomny komplikace s krvácením nebo byly omezeny na střední až mírnou tvorbu hematomu v místech angiografické punktury s výjimkou jednoho pacienta, který vyvinul hematom v prvém čtyřhlavém svalu. Jiné komplikace spojené s endovaskulámími manipulacemi zahrnují distální embolizaci a arteriální disekci ukončily nezbytně trombolytickou infuzi u jednoho pacienta. Jedna superficiální femorální arteriální okluze se jevila být rezistentní k 8,0 mg SakSTAR infundovaného během 6,0 h a byla následně užita úspěšně při PTA (tabulka 6).

Hladiny cirkulujícího fibrinogenu, plazminogenu a a2-antiplaminu zůstávají nezměněny během infúze SakSTAR skupin (tabulka 7), což odráží absolutní fibrinovou specifitu těchto činidel v použitých dávkách. Podstatné in vivo štěpení fibrinu se objevuje jak je zřejmé při zvýšení hladin D-dimeru. Intraarteriální heparinová terapie prodlužuje aPTT (tabulka 7).

S protilátkou spojená SakSTAR-, M3.8- a M8.9-neutralizační aktivita a anti-SakSTAR-, M3.8a M8.9-specifickém IgG, byly nízké při základní hodnotě a během prvního týdne po infuzi (tabulka 8). Od druhého týdne se hladiny neutralizační aktivity zvyšují na střední hodnoty 2,9 pg a 3,3 pg SakSTAR variant neutralizovaných na ml plazmy v pacientech ošetřených sM3.8 a M8.9, což je významně nižší než střední hodnota 9,1 pg/původního typu SakSTAR neutralizovaného na ml v pacientech ošetřených se SakSTAR (p = 0,03 pro varianty vs původní typ podle „Mann-Whitney rank sum test“). Hladiny SakSTAR-specifického IgG se zvyšují an střední hodnoty 51 až 31 pg/ml plazmy v pacientech ošetřených s M3.8 a M8.9, což je významně nižší než průměrná hodnota 240 pg/ml v pacientech ošetřených se SakSTAR (p = 0,01 pro varianty vs původní typ podle „Mann-Whitney rank sum test“).

U pacientů s periferní arteriální okluzí dostávajících dávky 5,5 až 13 mg sloučeniny, indukují M3.8 a M8.9 významně méně neutralizačních protilátek a specifických antistafýlokinázového IgG než SakSTAR. Tyto varianty poskytují důkaz konceptu, že redukce humorální odpovědi proti rekombinantní stafýlokináze proteinovým inženýrstvím je proveditelná.

-18CZ 290685 B6

Popis obrázků na připojených vvkresech

Obr. 1 - Proteinová sekvence původní typu stafylokinázy, SakSTAR. Číslování začíná sNH₂5 koncovou aminokyselinou zralé plné délky stafylokinázy. studované varianty s alaninovou mutací v nabitém shluku jsou označeny.

Obr. 2 - Schématická reprezentace epitopové specifity panelu 17 myších monoklonálních protilátek vypěstovaných proti SakSTAR.

Tabulka 1: Rovnovážné asociační konstanty K_AxlO⁹M’’) pro vazbu myších monoklonálních protilátek k původnímu typu stafylokinázy a k jejímu mutantu s alaninovou mutací v nabitém shluku

-19CZ 290685 B6

Η

<

CM

*

§

o t“F

XO cF

·«· ·*·

vx

rx

CM

«*» cF

cm”

o rx cF

O

ta

J

©» o o”

δ

Η

V

Η

υ

O

X

V CM

cx *F

*1 v

©o

vF

\F

o_

Cx vF

*F Λ

cF v

r*

rx

e

SX

o CM

X©^ rF

X©

cx

o c

Α

©Ο

ΙΑ f

V

VL

s*

-ř·

©9. rF

vx 3*

CM X. o

CM

<M_

vx O o~

©0 cF

v rF

CM *»

V

cm

cx. CM

*r_

•y o cF

vx o c“

wx c

0

Μ

.CU •0 •Η Λ,

ω «η CM

C\ rF

-

vF

δ o

r^.

X©_ xr“

VX

δ o

v vF

—

r*

C\ <T

v CM

cF

=

-!T O o

$ o

φ

—

X Γ*

x© cF

**L

rx cx θ'*

t

s cT

x© rx o“

ín cF

rx rx_

0,03

0(09

v_

©9 X*X cF

rx ΜΓ cF

e_

CM,

CM O

x© C eT

0(003

ο

X©

CM vx cF

U. Γ*

*·

V cT

G>_ M

n, VX

Λ

X©_ ν’

r^_

C£

v. v”

«Ο 09 ď

v o

CM_ •w

pi·

CM Ό. O

cx cT

Γχ_

v o cF

rx 6

CM

CM

CQ

v

CM

<Μ ΓΧ

Λ

α

CO

O

CX Λ

x©. vF

Λ

xo *w Λ

CM Λ

VX

cx

X©

«*4 CM

rx cF

CM M

*L O

CM Λ

as. xď

o cn

χ©

M

Μ

Ο

o

CM o cF

Η X

Ο CM

cx cm“

3-

n.

X© tí*

O cF

CM.

X© cm

F

rF

<M. ©9

rJ CM

CM

rF

\S

rF

v

o

rr

Α η >1

X ©9 CM

©0 Λ

r-

Ό CM

CM cx

vx 00

r* xF

Ό

CM A

O CM A

r**

O A

o

CM

rX CM

Cx CM

©9* *F

XA Λ

xo

CM

>

VX

CU 0 4J

X V *>«

νχ CM Λ

a

Ό

v CM

o

MF

Ό Λ

vx A

vx CM A

CN. mF

=

F

Ό.

Z\ sF

v

XA CM Λ

CM sF

Q CM

α φ

£<

CL οο

©o

N

CM

νχ

X©

xo

—

CM

<<

©0

XO

©9

Q

VX

VX

«9

©ΰ

CX

CM

Λ

A

v

xrx

Λ

CM

CM

xd

Λ

vF

*>«

υ οχ CM

CM CX Λ

=

©F

©F

«*

r^“

vx *· v Λ

CM A

©0

®L vx

CM CM

xc^ ©F

O CM

*1.

99

O

xn_ mF Λ

©0

ρχ C*X

Ο

Ο rx

VX rx

νχ

cx

r-

cx

V CM.

©0

x©.

V

o

—

r-

Cx

^s»

r* o

ξ

C?x

CM

CM

CM

v

CM

CX

vJ

X

CM

CM

o

c

Η

η

3 2

ca CM

cx

CM cx

Οχ CM

tř

•v Λ

n r·

CM

•ξ.

C4

xo

O rx

P* ΓΊ

e\

CM

Ό CM

vx

v-» CM

cx o o

©d O Q

α

CM

I

< Ο rx

ΜΓ

CM

vF

V

Γ* V»

o mF

©o, ©F

CM CM O

O

r* rF

rx

rx CM

CM r^·

rT

M

r^. xď*

8 cF

m c c

CM

•Η ft

< xo CM

r-

XO

cx

r^_

O

CM

rx

Cx

«.

<M

V

<M

8

v Q

Φ

©0

Λ

·*

V

vx

n

CM

CM

O

o

o

rx

r*

V *F

rx.

©0

cF

00

o. V*

Wi cT

CM A

v%

CM S“

CO

©9 CM*

vx cm

©F

rx

s

r* o

CN

X© y

Ξ ξ

vx r*x ♦ rx

«9 rx W vx

©0 a.

vx xo Ctí

» w

<M ca O o

©0 ca Ctí so

v 2 rX

cx X x©

O 5 09

ω wx

vx

©9

rx

rx

vx

X©

r-·

©9

CX

cx

Q

Q

u

X

tu

>!

Ctí

Q

se

tu

o

-20CZ 290685 B6

Tabulka 2: Absorpce protilátek elicitovaných při ošetření pacientů s akutním infarktem myokardu původním typem stafylokinázy a mutantním typem s alaninovou mutací v nabitém shluku

Absorpce > 90 procent je vyjádřena jako Epitopovéshluky jsou jako v tabulce 1.

-21CZ 290685 B6

Tabulka 3A: Imunogenicita SakSTAR, M3, M8 a M9 u králíků

O cf

»

CN

I

I

e5

4J >

KO

O

c KJ v

N ♦H id u 4J

C

X •0

N

ΰ

A0

N c

ee ď

Ul

CX

Σ

t s c ví

CN O

-22CZ 290685 B6

Tabulka 3B:

Imunogenicita SakSTAR, M3.8 a M3.9 a králíků 'a c

V

e rt X

I »

•c c

a

C\ od

Výsledky představuji průmSr + SO z počtu pokusů uvedeného v závorkách.

Statisticky významné rozdíly byly stanoveny Studentovým t-testera pro párové a nepárové hodnoty nebo Mann-Whitney rank testem podle potřeby.

-23CZ 290685 B6

Tabulka 4: Časový' průběh SakSTAR- a M3.8-neutralizačních aktivit (v pg/ml)

TJ cl

o

ť

«k

v

H

-24CZ 290685 B6

Tabulka 5:

Charakteristika pacientů s okluzí periferních arterií léčených za použití M3.8, M8.9 nebo SakSTAR

Sloučenina Pohlaví Věk Klinický Relevantní Kouření Místo okluze Předpokládané Předpokládaná

Pacient projev anannéza stáří okluze délka okluze (dny)

O o o in rjrl ΓΜ o m r* φ ΓΜ

		P		P
CO fa		β		β
co		□		φ
X		P		-μ	X
CX		<A	<	w	c
Ό C			&		Ό
o *u					Φ
•U 0)	< <	<	•Φ		►M
Ρ ·μ	Cle fa	H	>	H	p
ta jj	tň CO	U	®	u	(0
ui			X
‘5	'0 <	Ίβ		MG	MG
> Md	> >	>	&		>
φ >	4 0	id		10	n <
14 Φ	μ μ	μ	P	P	p fa
clx	CL CL	CL	HO	CL	Q«CO

©O © <Λ n +i ΙΛ

O H CM CM

X ·—* Λ

O Γ*

1	X	X
O	C		c
μ X	Ό		Ό
o c	Φ		Φ
β x	»P		^•P			A
Φ Ί0	P		*< »	<	< <	fa
X Φ	u		cl m	cu	Cle fa	co
P					co CO
>»X	MG		Md *<d	MG		Nd
> x a			> >		’«Nd	>
0 α·Φ	(0		id id <	0	> >	<d
k O-P	P	fa	k Mh	μ	φ Φ	P
Λ Pe*<0	CLCO	0« cl co	Ol	X X	CL

£

<0

Φ 0 <4

CL 0 P

η

o

X

X

tíx

K0

Η-Ι

c

P

x μ

C

0 C

X

c

·*

Φ

P C

3

P «0

X

>1

1

3

CLX

μ

X Φ

P£

x >

X

e

p

X

>ι*φ p

P

χ μ

g

0 X

<0 x

c

X

ÍC

CL

c μ «

id

0 CA

§

α o

0 o

X

X

p

X

ο

S

X HA X

μ

o

> (A

P X

X

0 <

0

X

u

£

> Ό

μ

X *

U £

X P

c

P £L

o

μ

O

♦o x

C

X P

0

X 0

X Q

X

μ

φ

φ

P

Φ cx

Φ

CL Ό

* P

CLH

β < Q

X *0

CL

Ρ·

u

O

X X c

P

O P

u

0 U

0 P

O U X x U

Q.S

0

S

0 X ·

A

X XJ

<0

CL Λ

4X0

CL 0

O

0

x B

£

χχ X

U

μ μ φ

Φ X

X

β <H

O h

£ 0

CL U

E 5

X Jm Μ χΛμ co

*·

χ o »p

P O X

0

P P

0 C *

O

Q. 0 C

*

Φ

a-μ fift

c

X >»X Ό X

O P

Φ

P

Ό *H

Φ

ρ

frj

X β Φ

c

X 6

g Φ

0 X N

o

0

X O

Ν

0 μ χ

C P « X Φ

AJ

CL

0 O

e c c

0

6

cl μ

C

X 0

w

o X x u

P

O P

0X0

M CL

0 0 0

0

a

X 0

Φ

μ s

P

M CL£ rt

U

0 CL X

X X G

>1 *4 P

X

><x X

Ρ

Φ £ Ρ

0 « O P

Λ

0 <0

P X

P >1 N μ

μ o

μ φ

Ρ U 0

0

o β p p

P

0 ·> CL «

>

0 ->

> a

P P 0 0

*> P

0 c

φ X

μ χ c

p·

k D.

O X > φ *4

0

P.Q Ό

0 >0

0 Μ V £L

0

Q»0

αβ

0 C *0

£»

• h O E

£X 0 μ c

P

>1< 0

P P

C O O> 0 0 ΛΑ

0

c

S0

μ ο

1 A

«0 P 10 0

Q X X HO X

P,£ Q X

CL HO

X

0 £ 0

£tJ

R <« £

μ

P

C < 0 X

u

0

η μ c

Φ

Φ

U Ο Ό

Φ Φ

« Q Φ

0

0

X Q000

Φ

0

*» *μ

o o

O £ X

□

X o

X

£ X O O

X

οχ

Ο

« 0 ρ

5 S

0 6

s

ς « S

C 0

0

6 0 0

c

0

0 C

0 0

χ£ α

X 44

X X Φ

X

PXX

P X

*T“I

sd 0 X X

P

X

X Ρ X X

χ ο

X X

X > £

X

p ex

P s

X β

> £ X X

P

E

X Ρ βχ

0 μ ρ

*5 2

•g o υ

•s

•*2*3

X 0

C 0

O ϋ Ό Ό

X

v

X Μ

0 *Ρ

μ ο ρ

S Ό u

P

« A P

0 £

μ £

Ό 0 P P

0 £

Ρ 0 £ Ρ

0 £ Ό

id <d

0 X X

10

£ ϋ (tí

£ O

P 0

X X 0 0

£

o

0 £

υ 0

6 0 0

X X

X X

X

P 01 X

P 0

X 0

X XX

tá

to X P

0 X

X X

X X N

X

«XX

0 x

0X

X N XX

«XX «XX

Μ Β £

φ g XX ο

r> o

0 CM

r*

ν μ u ό

X

X

X 40

n

X

X

σ» r* r*

n

V χ

X Φ

Ό r>

in λ

o

Μ»

in to

r»

tn

10 V0 10

\o

r* \ο

40

Γ> ρ ·« ρ

Ό

bO

40 μ 0 ρ

« φ μ ρ μ

XX £

X fa

X X

X

X X

X

X

X XX

X

Ch X

ρ X Λ X Q Ν

« 2 8. Η

X

X

X ο >

M 0

H

Μ X 0 £

10

ω νι χ φ

+l

X

χ μ μ c

X 0

X 0 CP

X 0 φ φ C ρ &Ρ ρ

fté

Q«

Ό Q « C

o o

ř4 5

o

Ό O 0 £

ω <

41 h a j

o

>3 Η

<

Ό ο ρ μ β 0 β 0 0 Φ

2 B

Ή *5

• M

Η X

Λ

x o2

X

Μ Ο

Εμ

'ňfl χ

X X

Ρ 0

®x

O >q

n

P 0

0 2

O ΟΪ

CO

>CL

C0

PO 8 fl U

0 A

X

(0 £

to

«£ 0

A CL

fa A

n

υ

to CL *

-25CZ 290685 B6

Tabulka 6: Léčení a výsledky u pacientů s okluzí periferních arterií léčených M3.8, M8.9 nebo SakSTAR

Komplikace antiografické procedury

Sloučenina Trcmbolytická Celková dávka

Pacient «kanalizace trombolytického činidla (mg)

Doba trvání Další terapie trombolytické infuze (h)

A. H3.8 STO VLA H00 HER	úplná úplná částečná úplná	9,0 10 6.5 9.5	7,0 8,0 4.5 7.5	PTA PTA PTA femorotibiální štěp	třesavka (bez horečky) distální embolizace po PTA, rozpuštěno během nepřetržité infuze SakSTAR.N38, zvracení arteriální disekce, mírná transientní horečka žádné
Střední hodnota+SBN	8,8+0,3	6,8+0,8
B. H8.9
HEC	úplná	10	8,0	PTA+stent	reokluze po 8 dnech, léčená
OTT	úplná	10	8,0	žádná	aortobiiliakálním štěpem
LAN	úplná	11	8,5	PTA+stent	distální embolizace po PTA
BRO	úplná	10	8,0	odsátí plaku+stent	léčená odsátím, po 30 hodinách reokluze léčená 6,5 mg SakSTAR.H89 (během 4,5 hodiny) a PTA t 30 mg rt-PA podáno během 20 hodin
Střední hodnota+SBN		10+0,3	8,0+0,2
C. SakSTAR
KNA	úplná	12	10	PTA štěpu, odsátí	henaton na pravém stehnu
DRI	úplná	7,5	5,5	trombu (fibulární arterie) PTA, aneurysmekto-	akutní ischemie heterolaterálního
GOD	žádná	8,0	6,0	nie abdominální aorty PTA	chodidla vyvolaná embolizací od abdominálního aneurysaatu aorty do arterií distální levé dolní nohy (4. den) nereagující na 100 mg rt-PA hematcm v místě vpichu do žíly
HAL ‘	—	(2,0)	—		anafylaktický šok během 5 minut po
SNO	úplná	7,5	6,0	stent	podáni bolu, následně po 45 min a po normalizací krevního tlaku transientní ischemie oblasti levé střední mozkové arterie po 6 týdnech reokluze stentu
VEL	úplná	5,5	3,5	PTA	žádné
POT	úplná	1,3	11	—	akutní reokluze (1. den), úspěšné
STA	úplná	8,0	6,0	PTA	transltminální odsátí trombu hematom v místě vpichu do žíly
Střední hodnota+SEM		8,8+1,0	6,9+1,0

PTA = perkutánní t^nsluminální angioplastika, *z důvodu omezené dostupnosti SakSTAR.X89 se v terapii pokračovalo za použití rt-PA, Nezahrnuto do výpočtu střední hodnoty+SEX.

-26CZ 290685 B6

Tabulka 7:

Koagulační parametry před s periferní arteriální okluzi

O Cs °° T ©o — O< Ό SO vs p* po podání M3.8, M3.9 nebo SakSTAR u pacientů

Sloučenina pacient Fibrinogen Plasrainogen a_antiplasmin (%) D-dlmer aPTT (g/1) (%) (ng/ml) (s)

Ό O >k a

X M cl

Ό Φ >k

Ch o CL a> >k

CL ••5 >k TL

8.

Ό <D >k

CL

VS so cn m

8B vn δ

SO 04 n cm V —’ cs2 cn cn

3?

cn

O 04 cn m

Cs

XO s af cn ©c sr o cn cn

CS cn ox cn cn cn os x© o s© o o· §Ct cs c ·* CT cn tt t— ΓΟΟ es ac ±1 v

es o o _ 04 OO o v> § Q

O O O;

Cs‘

X© o ó*

CM •<r o θ' <m o r·

C

3

CS

Ql c\ _Lj v*, e*

O O CO CS 00 04 cn o c> cs

Ο» cs Cs oo — 04 Cs eo οι Cs oo o O* es cs eo Cs s© cs oj +4 GN xr Cs «i

Cs

X© o

«I eo iqg ce o° o

eo o Cx

Cs ^c-~ s -v xn « vj 2

WY o° 3Ϊ «η

MS. V3.xq.cig vmv ''TIÍn •v <n

04. -^WS^OOI •sřrTrFcňl ř!

S tu •H Cl ku $ k a + e.

,0x co 2

Ή ⁺ ₌

M KU š k a c

cn £

xr ©e ©Q

8-S on

O

O _ .

s© CS CN —

wn —

A w* oc

Cs ©c cn

Ο» p*

P4 *ST M O Οζ 00 04

O w-i o cs

Cs

O v|«

CM §3 cs vs c

Ώ so Cs

O Cl v*. v% cs x: c >

WS ac co

Cs oT •H vs Cs cn a

4> «

I >1 c

Λ ^SA c

>1 >í c N £ b3 W cn rs _ n.°

C^^sSW.VSC^oíw-mO r-. m šž

V) jO <Σ > ω cn wSá > c. trj cc

V)

O •H ' <5 k CU

Q.

«1 > o 44 β a> Ό o 44 (0 •H >fr4

O O Cb

CL + s Λ

0) c

M £ O

M CL

O xj o a >1 >

O

XJ a t·

O 0

O c k Λ «5 N a> c

O k

Ch*

-27CZ 290685 B6

Tabulka 8:

Hodnoty neutralizační aktivity a specifické IgG léčených M3.8, M3.9 nebo SakSTAR (95.12.14) protilátky v plazmě pacientů

rS X 4J '«J rď τ4 V O u a o

X υ u-i

Ή u o CL O

eo r> O* *· Ό

2g*x dři·*' o 25 o o o — o *· — c\

V.

o a oo oo cn <m

νΞΞο. *>§8o.»*¹ 2SÍ ^r^_NrT r*5$oe<«2!2 c:

4J

r-ζ X Mfl

N o*c\2o c\ m n r- wty* oSoe<-oo0 n^.r· n 2 — — r— cm cm cty ch ^Xvty 00 CM « ·“·

n

CM

—· «η Q η n tn

C\ p*. CM φ r^vty v B^rty — cm —

O,c*<h cm, cx^ — cm — vty wncwnv^O

+> •H >

X

C KJ rt

N id u 4J 3 <D a

©,^ο o ř- © -- tn o o »λ e vTo o-ř , O cm rty Wty g Vty v> © cn _M

VCsO — «X CM V3 © ·* ·« — ^vl^wX'ⁿ « 2 r- Q <h Q ·“ v Ύ?* ř* c5 ©/•^©cn rty O cj vty co © o cm cTn — ©

U4 >

Vty Vty© © CM O CM ~

CM O CM 00 00¾ “ MřCMlftOrtyCMcty

© 00 o vďvty Cv'C o_wn o rn ν'θ O n — r* r* c^o © © o “ τ ts — cTso tM r-ΐ

OOC^. N <n v» C q_o V» o r>VMn — Ή o CM O vTcínr o vn m o *n q. , α.ς,νχνχο o O.Q, * doó cTďss cďó'coaoo

C O O Q. acTco

0.0 = = 'Ιΐ'ΠΌ.ο.οο Q o a c = s c cs c o o o o ·

-28CZ 290685 B6

Tabulka S:

Hodnoty neutralizační aktivity a specifické IgG protilátky v plazmě pacientů léčených M3.8, M3.9 nebo SakSTAR (95.12.14) - pokračování

	>1
	tí
rd	μ
e Cn	•Φ
	>4
	dn
X 4J	«Μ
rd •H	ίΌ
•U
0	C
M	Ό
CL	*>1 μ
0
Cn H	04 C
χβ	fi)
Λί	*ΰ
υ
Ud	μ
•Η O	rd
ς>
CL	η
W	r-< J4 mí Ν

Γ* Z.CM Ά 4— rO— ©	, ΞΞ» — η «θ'	s § S10 Ά° Ό 2·ν « C+V Cl
« c±vs w Ή c* —m	Oď°m Όί'-Μ'Η
« X? — Ά	»-SK	S°°2ZSX)a8
0£OQ 0* 1Λ —	CM Ό V ·	W«MMO « N c\ c\ <*> erTví’^·
m tn v* 0» ·- CM f* *T	Ό O ~*n — v“	“♦ςχ-χΓχ© r* ·— omw-π r·

o o cm — pTtn

X) ©cT~o ooco

Cv es8|2.g u

<

(X) přeléčení po 30 h., léčení přeruSeno po podání bolu

-29CZ 290685 B6

Odkazy:

1. Collen D. On the regulation and control of fibrinolysis. Edward Kowalski Memoriál Lecture. Thromb Haemostas 43: 77-79, 1980.

2. Collen D, Lijnen HR: Basic and clinical aspects of fibrinolysis and trombolysis. Blood 78: 3114-3124, 1991.

3. Collen D, Van de Werf F: Coronary thrombolysis with recombinant staphylokináze in pacients with evolving myocardial infarction. Circulation 87: 1850-1853, 1993.

4. Vanderschueren S, Collen D: Immunogeniciteit van streptokinse en implicatiens voor gebruik. Tijdschr Geneesk 50: 1639-1644, 1994.

5. Lack CH: Staphylokináze: and activator of plazma protease. Nátuře 161: 559, 1948:

6. Lewis JH, ferguson JH: A proteolytic enzyme systém of the blood. III. Activation of dog sérum profibrinolysin by staphylokináze. Am J. Physiol 166: 594, 1951.

7. Winkler K.C, DeWaart J. Grootsen C, Zegers BJM, Tellier NF, Vertegt CD: Lysogenic conversion of staphylococci to loss of beta-toxin. J Gen Microbiol 39: 321, 1965.

8. Collen D, Lijnen HR: Staphylokináze, a fibrinspecific plazminogen activator with therapeutic potential? Blood 84: 680—686, 1994.

9. Sako T, Sawaki S, Sakurai T, Ito S, Yoshizawa Y, Rondo I: Cloning and expression of the staphylokináze gene of Staphylococcus aureus in Escherichia coli. Molec Gen Genet 190: 271-277, 1983.

10. Behnke D, Gerlach D: Cloning and expression in Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Streptococcus sanguis of a gene for staphylokináze - a bacterial plazminogen activator. Molec Gen Genet 210: 528-534, 1987.

11. Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR: Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokináze. Fibrinolysis 6: 203-213, 1992.

12. Sako T: Overproduction of staphylokináze in Escherichia coli and its characterization. Eur J. Biochem 149: 557-563,1985.

13. Gerlach D, Karaft R, Behnke D: Purification and characterization of the bacterial plazminogen activator staphylokináze secreted by a recombinant bacillus subtilis. Zbl Bakt Mikr Hyg 269: 314, -322 1988.

14. Sako T, Tsuchida N: Nucleotide sequence of the staphylokináze gene from Staphylococcus aureus. Nucleic Acids Res 11: 7679-7693, 1983.

15. Colled D, Zhao ZA, Holvoet P, Marynen P: Primary structure and gene structure of staphylokináze. Fibrinolysis 6: 226-231, 1992.

16. Schlott B, Hartmann M, Gíihrs KH, Birch-Hirschfeld E, Gase A, Vetterman S, Collen D, Lijnen HR: Functional properties of recombinant staphylokináze variants obtained by site— specific mutagenesis of methionine 26. Biochim Biophys Acta 1204: 235-242, 1994.

-30CZ 290685 B6

17. Sakai M, Watanuki M, Matsuo O: Mechanism of fibrinspecific fibrinolysis by staphylokináze: participation of cu-plazmin inhibitor. Biochem Biophys Res Comm 162: 830-837, 1989.

18. Matsuo O, Okada K, Fukao H, Tomioka Y, Yeshima S, Watanuki M, Sakai M: Thrombolytic properties of staphylokináze. Blood 76: 925-929, 1990.

19. Lijnen HR? Van Hoef B, De Cock F, Okada K, Ueshima S, Matsuo O, Collen D: on the mechanism of fibrinspecific plazminogen activation by staphylokináze. J. Biol Chem 266: 11826-11832,1991.

20. Lijnen HR, Van Hoef B, Matsuo O, Collen D: On the molecular interaction between plazminogenstaphylokináze, cb-antiplazmin and fibrin. Biochim Biophys Acta 1118: 144— 148, 1992.

21. Silence K, Collen D, Lijnen HR: Interaction between staphylokináze, plazmin(ogen) and a₂-antiplazmin. Recycling of staphylokináze after neutrálization of the plazminstaphylokináze complex by a₂-antiplazmin. J Biol Chem 268: 9811-9816, 1993.

Silence K, Collen D, Lijnen HR: Regulation by a₂-antiplazmin and fibrin of the activation of plazminogen with recombinant staphylokináze in plazma. Blood 82: 1175-1 183, 1993.

23. Collen D, De Cock F, Vanlinthout I, Declerck PJ, Lijnen HR, Stassen JM: Comparative thrombolytic and immunogenic properties of staphylokináze and streptokináze. Fibrinolysis 6: 232-242, 1992.

24. Collen D, De Cock F, Stassen JM: Comparative immunogenicity and thrombolytic propertie toward arterial and venous thrombi of streptokináze and recombinmant staphylokináze in baboons. Circulation 87: 996-1006, 1993.

25. Schloot B, Hartmann M, Giihrs K.H, Birch-Hirschfeid E, Pohl HD, Vanderschueren S, Van de Werf F, Michoel A, Collen D, Behnke D: High yield production and purification of recombinant staphylokináze for thrombolytic therapy. Bio/technology 12: 185-189, 1994.

26. Declerck PJ, Vanderschueren S, Billiet J, Moreau H, Collen D: Prevalence and induction of circulating antibodies against recombinat staphylokináze. Thromb Haemostas 71: 129-133, 1994.

27. Vanderschueren SMF, Stassen JM, Collen D: On the immunogenicity of recombinant staphylokináze in patients and in animal models. Thromb Haemostas 72: 297-301, 1994.

28. White H: Thrombolytic treatment for recurrent myocardial infarction. Br Med J 302: 429430, 1991.

29. Gase A, Hartmann M, Giihrs KH, Rocker A, Collen D, Behnke D, Schlott B: Functional significance of NH₂- and COOH-terminal regions of staphylokináze in plazminogen activation. Submitted.

30. Galfré G, Milstein C: Preparation of monoclonal antibodies: strategie and procedures. Methods Enzymol 73: 3-46, 1981.

31. de St. Groth SF, Scheidegger D: Production of monoclonal antibodies: strategies and tactics. J Immunol Methods 35: 1-21, 1980.

-31CZ 290685 B6

32. Nakane PK, Kawaoi A: Peroxidase-labeled antibody. A new method for conjugation. J. Histochem Cytochem 22: 1084-1091, 1974.

33. Anderson N, Potter M: Induction of plazma cell tumours in Balb-c mice with 2, 6, 10, 14 tetramethylpentadecane (přistane). Nátuře 222: 994-995, 1969.

34. Ey PL, Prowse SJ, Jenkin CR: Isolation of pure IgG], IgG_2a and IgG_2b immunoglobulins from mouše sérum using protein A-Sepharose. Immunochemistry 15: 429-436, 1978.

35. Jonsson U, Malmqvist M: Reál time biospecific interaction analysis. The integration of surface plazmon resonance detection, generál biospecific interface chemistry and microfluidics into one analytical systém. Adv Biosensors 2: 291-336, 1992.

36. Johnsson B, Lofas S, Lindquist G: Immobilization of proteins to a carboxymethyldextranmodified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plazmon resonance sensors. Anal Biochem 198: 268-277, 1991.

37. BIAcore systém manual, 5-2, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden.

38. Karlsson R, Michaelsson A, Mattsson L, Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interaction with a new biosensor based analytical systém. J. Immunol Methods 145: 229240,1991.

39. Stanssens P, Opsomer C, McKeown Y, Kramer W, Zabeau M, Friz MJ: Efficient oligonucleotide-directed construction of mutations in expression vertors by the gapped duplex DNA method using altemating selectable markers. Nucleic Acids Res 17: 441—4454, 1989.

40. Deutsch DG, Mertz ET: Plazminogen: purification from human plazma by affinity chromatography. Science 170: 1095-1096, 1970:

41. Silence K, Harmann M, Giihrs KH, Gase A, Schlott B, Collen D, Lijnen HR: Structurefunction relationships in staphylokináze as revealed by „clustered-charge-to-alanine“ mutagenesis. J. Biol Chem (in press).

42. Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248, 1976.

43. De Clerck F, Beetens J, de Chaffoy de Courcelles D, Freyne E, Janssen PA: R68070: thromboxane A2 synthetase inhibition and thromboxane A2/proctaglandin endoperoxide receptor blockade combined in one molecule. I. Biochemical profde in vitro. Thromb Haemonst 61: 35-42, 1989.

44. Stassen JM, Vanlinthout I, Lijnen HR, Collen D: A hamster pulmonary embolism model for the evaluation of the thrombolytic and pharmacokinetic properties of thrombolytic agents. Fibrinolysis 4 (Suppl 2) 15-21, 1990.

45. Giles AR: Guidelines for the use of animals in biomedical research. Thromb Haemost 58: 1078-1084, 1987.

46. Vanderschueren S, Stockx L, Wilms G, Lacroix H, Verhaeghe R, Vermylen J, Collen D: Thrombolytic therapy of peripheral arterial occlusion with recombinant staphylokináze. Circulation 92: 2050-2057, 1995.

-32CZ 290685 B6

47. Vanderschueren S, Barrious L, Kirdsinchai P, Van den Heuvel P, Hermans L, Vrolix M, De Man F, Benit E, Muyldermans L, Collen D, Van de Werf F: A randomized trial of recombinant staphylokináze versus alteplase for coronary artery patency in acute myocardial infarction. Circulation 92: 2044-2049, 1995.

Claims (10)

1. Stafýlokinázové deriváty vykazující sníženou imunogenicitu ve srovnání s divokým typem stafýlokinázy bez poškození jejich biologické aktivity a mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 1, ve které jedna nebo více aminokyselin v jednom nebo více podtržených

15 shlucích byly nahrazeny alaninem a takto je eliminován nebo jsou eliminovány odpovídající epitop(y).

2. Stafýlokinázové deriváty podle nároku 1 mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 1, ve které jedna nebo více aminokyselin byly nahrazeny alaninem, čímž je snížena

20 reaktivita těchto derivátů s panelem monoklonálních protilátek, zahrnujícím například protilátky 17G11, 26A2, 30A2, 2B12 a 3G10, orientovaných k stafýlokokovému epitopovému shluku I.

3. Stafýlokinázové deriváty podle nároku 1, mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 1, ve které jedna nebo více aminokyselin byly nahrazeny alaninem, čímž je snížena

25 reaktivita těchto derivátů s panelem monoklonálních protilátek, zahrnujících například protilátky

7H11,25E1, 40C8, 24C4 a 1A10, orientovaných k stafýlokokovému epitopovému shluku III:

4. Stafýlokinázové deriváty podle nároku 1 mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 1, ve které dvě nebo více aminokyselin bylo nahrazeno alaninem, čímž je snížena reaktivita

30 těchto derivátů s panely monoklonálních protilátek, orientovaných k stafylokokovým epitopovým shlukům I a III.

5. Stafýlokinázový derivát podle nároku 1, kterým je derivát M8 mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1, ve které aminokyseliny Lys v poloze 74, Glu v poloze 75 a Arg

35 v poloze 77 v podtrženém shluku 8 byly nahrazeny alaninem a takto byl změněn odpovídající epitop.

6. Stafýlokinázový derivát podle nároku 1, kterým je derivát M3, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1, ve které aminokyseliny Lys v poloze 35 a Glu v poloze 38

40 v podtrženém shluku 3 byly nahrazeny alaninem a takto byl změněn odpovídající epitop.

7. Stafýlokinázový derivát podle nároku 1, kterým je derivát M9, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1, ve které aminokyseliny Glu v poloze 80 a Asp v poloze 82 v podtrženém shluku 9 byly nahrazeny alaninem a takto byl změněn odpovídající epitop.

8. Stafýlokinázový derivát podle nároku 1, kterým je derivát M3.8, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1, ve které aminokyseliny Lys v poloze 35, Glu v poloze 38, Lys v poloze 74, Glu v poloze 75 a Arg v poloze 77 v podtržených shlucích 3 a 8 byly nahrazeny alaninem a takto byl změněn odpovídající epitop.

9. Stafýlokinázový derivát podle nároku 1, kterým je derivát M8.9, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1, ve které aminokyseliny Lys v poloze 74, Glu v poloze 75, Arg v poloze ΊΊ, Glu v poloze 80 a Asp v poloze 82 v podtržených shlucích 8 a 9 byly nahrazeny alaninem a takto byl změněn odpovídající epitop.

-33CZ 290685 B6

10. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím. že obsahuje alespoň jeden ze stafylokinázových derivátů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 spolu s vhodným excipientem.

5

11. Farmaceutická kompozice podle nároku 10 pro použití při léčení arteriální trombózy.

12. Stafylokinázové deriváty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro použití při léčení arteriální trombózy.

10 13. Použití stafylokinázových derivátů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení arteriální trombózy.