ES2248805T3 - Derivados nuevos de estafiloquinasa. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN METODO DE PRODUCCION DE LOS DERIVADOS DE LA INVENCION, QUE INCLUYE LAS SIGUIENTES FASES: PREPARACION DE UN FRAGMENTO DE ADN, QUE COMPRENDE AL MENOS LA PARTE DE LA SECUENCIA CODIFICADORA PARA LA ESTAFILOQUINASA QUE PROPORCIONA SU ACTIVIDAD BIOLOGICA; REALIZACION DE MUTAGENESIS ESPECIFICA PARA UN SITIO DETERMINADO IN VITRO, SOBRE DICHO FRAGMENTO DE ADN, REEMPLAZANDO UNO O MAS CODONES PARA AMINOACIDOS SILVESTRES, POR UN CODON PARA OTRO AMINOACIDO; CLONAJE DEL FRAGMENTO DE ADN MUTADO, EN UN VECTOR ADECUADO; TRANSFORMACION O TRANSFECCION DE UNA CELULA HUESPED ADECUADA CON DICHO VECTOR; Y CULTIVO DE DICHA CELULA HUESPED BAJO CONDICIONES ADECUADAS PARA EXPRESAR DICHO FRAGMENTO DE ADN. PREFERIBLEMENTE, EL FRAGMENTO DE ADN ES UN FRAGMENTO 453 BP ECORI-HINDIII, DEL PLASMIDO PMEX602SAKB; LA MUTAGENESIS ESPECIFICA DE SITIO SE REALIZA MEDIANTE UN SISTEMA DE MUTAGENESIS DIRIGIDA POR UN OLIGONUCLEOTIDO, UTILIZANDO EL PLASMIDO PMA/C Y LA CEPA DE E. COLI DEFECTIVA PARA REPARACION WK6MUTS; Y EL FRAGMENTO DE ADN MUTADO SE EXPRESA EN LA CEPA DE E. COLI WK6. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO, A COMPOSICIONES FARMACEUTICAS, QUE COMPRENDEN AL MENOS UNO DE LOS DERIVADOS DE ESTAFILOQUINASAS OBTENIDOS SEGUN LA INVENCION, JUNTO CON UN EXCIPIENTE APROPIADO, PARA EL TRATAMIENTO DE LA TROMBOSIS ARTERIAL.

Description

Derivados nuevos de estafiloquinasa.

Esta invención se refiere a derivados nuevos de estafiloquinasa con inmunogenicidad reducida, y a su utilización en el tratamiento de trombosis arterial y para la preparación de una composición farmacéutica para tratar trombosis arterial. Más en particular, se refiere a la utilización de derivados de estafiloquinasa obtenidos por ingeniería para la preparación de una composición farmacéutica para tratar infarto de miocardio.

Las complicaciones trombóticas de las enfermedades cardiovasculares son la causa principal de muerte e invalidez y, por consiguiente, la trombolisis (es decir, la disolución farmacológica del coágulo sanguíneo) podría influir favorablemente en el resultado de las enfermedades potencialmente mortales tales como infarto de miocardio, trombosis cerebrovascular y trombolismo venoso. Los agentes trombolíticos son activadores de plasminógeno que convierten plasminógeno, la proenzima inactiva del sistema fibrinolítico de la sangre, en la enzima proteolítica plasmina. La plasmina disuelve la fibrina de un coágulo sanguíneo, pero también puede degradar los componentes normales del sistema hemostático e inducir el denominado "estado lítico". Sin embargo, la fibrinolisis fisiológica está orientada hacia la fibrina como resultado de interacciones moleculares específicas entre el activador de plasminógeno de tipo tisular, fibrina, plasmina (plasminógeno) y \alpha_{2}-antiplasmina (1,2).

Actualmente, seis agentes trombolíticos están aprobados para utilización clínica o en investigación clínica en pacientes con infarto de miocardio agudo. Éstos incluyen estreptoquinasa, uroquinasa, activador de plasminógeno de tipo tisular recombinante (PA-rt) o derivados de éste, complejo activador estreptoquinasa plasminógeno anisoilado (APSAC), activador de plasminógeno de tipo uroquinasa de cadena única recombinante (rscu-PA, prouroquinasa recombinante), y estafiloquinasa recombinante (Sak) (2,3). En pacientes con infarto de miocardio agudo, se ha observado reducción del tamaño del infarto, conservación de la función ventricular y reducción de la mortalidad después de tratamiento bien con estreptoquinasa, rt-PA o APSAC (2).

Uno de los agentes trombolíticos utilizado actualmente de manera rutinaria en terapia es estreptoquinasa, una proteína de M_{r} 45.000 secretada por estreptococos \beta-hemolíticos. Sin embargo, su administración está asociada con la degradación sistémica extensiva de fibrinógeno y su eficacia en la trombolisis coronaria en pacientes con infarto de miocardio agudo es limitada, consistiendo en aproximadamente 50 por ciento de recanalización de la arteria coronaria en 90 minutos (2). Aún más, la exposición a estreptoquinasa provoca reacciones alérgicas en aproximadamente el 5 por ciento de los pacientes tratados e induce de manera consistente la formación de anticuerpos específicos que impide su utilización repetida en meses o años (4).

La estafiloquinasa, una proteína producida por determinadas cepas de Staphylococcus aureus, que desde hace más de 4 décadas se ha visto que tiene propiedades profibrinolíticas (5-7), también parece que constituye un agente trombolítico potente en pacientes con infarto de miocardio agudo (8). El gen de estafiloquinasa se ha clonado a partir de bacteriofagos sak\diameterC (9) y sak 42D (10) así como a partir del ADN genómico (sakSTAR) de una cepa de Staphylococcus aureus lisogénica (11). Éste se ha expresado bajo el control del promotor \lambdaPR y de sus propias señales de traslación en Escherichia coli y también bajo el control de su promotor y señales de traslación naturales en Bacillus subtilis o Escherichia coli, lo que resulta en la acumulación del producto génico en el espacio periplásmico o en el medio de cultivo, respectivamente (10-13).

El gen de la estafiloquinasa codifica una proteína de 163 aminoácidos, correspondiendo el aminoácido 28 al resto del extremo N-terminal de la estafiloquinasa madura de longitud completa (10,14,15). La secuencia de la proteína de la variante de tipo salvaje SakSTAR (15) está representada en la Figura 1. Sólo se encontraron cuatro diferencias en los nucleótidos de las regiones codificadoras de los genes sak\diameterC, sak42D y sakSTAR, una de las cuales constituye una mutación silenciosa (10, 14, 15).

Se han purificado varias formas moleculares de estafiloquinasa con M_{r} (16.500 a 18.000 en SDS-PAGE) y puntos isoeléctricos ligeramente diferentes (11-13). Los derivados de bajo M_{r} de la estafiloquinasa madura que se obtuvieron no tenían los aminoácidos 6 (Sak-\Delta6) ó 10 (Sak-\Delta10) del extremo NH_{2}-terminal. Después de la interacción con plasmina (plasminógeno) en un medio tamponado, la estafiloquinasa madura (Ser-Ser-Ser en el extremo NH_{2}-terminal) se convierte rápida y cuantitativamente en Sak-\Delta10 (Lys-Gly-Asp-, en el extremo N NH_{2}-terminal). Se vio que la estafiloquinasa madura y Sak-\Delta10 tienen la misma actividad fibrinolítica (11,12).

El aminoácido de la posición 26 parece tener una importancia crucial en la activación de plasminógeno por la estafiloquinasa. De hecho, la sustitución del resto Met de la posición 26 bien con Arg o Val resulta en la pérdida de la actividad funcional, mientras que la sustitución con Leu o Cys tiene poco o ningún efecto en la actividad (16). Debido a que ninguno de los intercambios únicos de aminoácidos produce cambios significativos en la estructura en disolución de las proteínas mutantes el mecanismo de este comportamiento diferencial permanece sin resolver.

En un medio plasmático, la estafiloquinasa es capaz de disolver coágulos de fibrina sin degradación asociada de fibrinógeno (17-19). Esta especificidad por fibrina de la estafiloquinasa es el resultado de una inhibición reducida por \alpha_{2}-antiplasmina del complejo plasmina.estafiloquinasa unido a fibrina, del reciclaje de la estafiloquinasa a partir del complejo plasmina. estafiloquinasa, y de evitar la conversión de plasminógeno.estafiloquinasa circulante en plasmina.estafiloquinasa por la \alpha_{2}-antiplasmina (20-22). En muchos modelos animales experimentales, la estafiloquinasa parece tener la misma potencia que la estreptoquinasa para disolver coágulos de sangre completa o de plasma, pero significativamente más potencia para disolver trombos ricos en plaquetas o retraídos (23,24).

Los resultados esperanzadores obtenidos con la estafiloquinasa en modelos animales de trombosis, han formado la base para su evaluación, a escala piloto, en pacientes con infarto de miocardio agudo (3,25). En 4 de 5 pacientes con infarto de miocardio agudo, se vio que 10 mg de estafiloquinasa recombinante (SakSTAR), administrada por vía intravenosa durante 30 min, inducía recanalización de la arteria coronaria documentada por angiografía en 40 minutos. Los niveles plasmáticos de fibrinógeno y \alpha_{2}-antiplasmina no cambiaron (niveles residuales a 40 min de 90-95% de la línea base) y no se observaron reacciones alérgicas (3). En una segunda serie de 5 pacientes con oclusión coronaria aguda, la administración intravenosa de 10 mg de estafiloquinasa (SakSTAR) durante 30 min indujo recanalización en todos los pacientes en 20 min, sin degradación asociada de fibrinógeno (25). La angiografía control a las 24 horas mostró que la recanalización persistía.

Se estudió la inmunogenicidad de estafiloquinasa (SakSATR) comparada con la de la estreptoquinasa en perros (23) y babuinos (24). En conjunto, estos datos experimentales en animales sugieren una inmunogenicidad más baja de estafiloquinasa comparada con estreptoquinasa. Sin embargo, en los 5 primeros pacientes con infarto de miocardio agudo a los que se administró una infusión intravenosa de 10 mg de estafiloquinasa durante 30 min, las titulaciones de anticuerpos neutralizantes frente a estafiloquinasa (SakSTAR) fueron más bajas en la línea base y hasta 6 días después de la infusión, pero se demostraron de manera consistente titulaciones altas (titulaciones neutralizantes de estafiloquinasa de 12-42 \mug/ml de plasma) de anticuerpos en plasma en 14-35 días (3). Estas observaciones se confirmaron completamente en el segundo ensayo piloto con 5 pacientes (25). Por lo tanto, en relación con la inmunogenicidad, las observaciones iniciales en seres humanos no fueron tan esperanzadoras como la experiencia en animales de experimentación. Por lo tanto, al igual que la estreptoquinasa, la administración de estafiloquinasa debe restringirse a una única utilización. Sin embargo, la ausencia de reactividad cruzada de anticuerpos inducidos frente a estafiloquinasa y estreptoquinasa (26,27), sugiere que la administración de ambas sustancias puede no ser mutuamente excluyente.

La inmunogenicidad intrínseca de estreptoquinasa y estafiloquinasa impide claramente su utilización sin restricciones. No sólo los pacientes con titulaciones altas preexistentes de anticuerpos serán refractarios al efecto trombolítico de estos agentes, sino que pueden producirse efectos alérgicos secundarios y anafilaxis ocasional con peligro de muerte (28). Debido a que tanto la estreptoquinasa como la estafiloquinasa son proteínas heterólogas, no es obvio que su inmunogenicidad pueda reducirse mediante ingeniería proteica. De hecho, no se han publicado intentos con éxito para generar fragmentos activos de bajo peso molecular a partir de estreptoquinasa. En la estafiloquinasa, la deleción de los 17 aminoácidos del extremo NH_{2}-terminal o de los 2 aminoácidos del extremo COOH-terminal inactiva la molécula, que además es muy sensible a la inactivación por mutagénesis específica de sitio (25,29).

Sin embargo, sorprendentemente, hemos encontrado que la variante de estafiloquinasa de tipo salvaje SakSTAR (8,15) contiene tres epítopos inmunodominantes que no se sobrelapan, dos de los cuales, al menos, pueden eliminarse mediante mutagénesis dirigida, sin inactivación de la molécula. Estas variantes de estafiloquinasa obtenidas por ingeniería son menos reactivas con anticuerpos incitados en pacientes tratados con la estafiloquinasa de tipo salvaje, y son significativamente menos inmunogénicas que la estafiloquinasa de tipo salvaje, como se demuestra en modelos de conejo y babuino y en pacientes con oclusión arterial periférica.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a derivados de estafiloquinasa que presentan una inmunogenicidad reducida comparada con la estafiloquinasa de tipo salvaje, que tienen esencialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 en la que uno o más aminoácidos en uno o más de los grupos subrayados se han reemplazado con otro aminoácido alterando de esta manera los epítopos correspondientes. Preferiblemente, los aminoácidos se reemplazan con alanina. Los derivados tienen esencialmente la secuencia de aminoácidos de la estafiloquinasa de tipo salvaje o versiones modificadas de ésta, pero al menos un epítopo inmunodominante se elimina sin destruir la actividad biológica de los derivados. Mediante la alteración de los epítopos se reduce la reactividad de los derivados con un panel de anticuerpos monoclonales dirigido a uno o más de tres grupos de epítopos I, II y II. Esto indica que el reemplazamiento de los aminoácidos del tipo salvaje con alanina reduce la antigenicidad de la estafiloquinasa.

La invención se refiere en especial al derivado de estafiloquinasa M8 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 en la que los aminoácidos Lys en la posición 74, Glu en la posición 75 y Arg en la posición 77 en el grupo 8 subrayado han sido reemplazados por alanina, alterando, por lo tanto, el epítopo correspondiente, al derivado de estafiloquinasa M3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 en la que los aminoácidos Lys en la posición 35 y Glu en la posición 38 en el grupo 3 subrayado han sido reemplazados por alanina, alterando, por lo tanto, el epítopo correspondiente, al derivado de estafiloquinasa M9 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 en la que los aminoácidos Glu en la posición 80 y Asp en la posición 82 en el grupo 9 subrayado han sido reemplazados por alanina, alterando, por lo tanto, el epítopo correspondiente, al derivado de estafiloquinasa M3.8 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 en la que los aminoácidos Lys en la posición 35, Glu en la posición 38, Lys en la posición 74, Glu en la posición 75 y Arg en la posición 77 en los grupos 3 y 8 subrayados han sido reemplazados por alanina, alterando, por lo tanto, los epítopos correspondientes y al derivado de estafiloquinasa M8.9 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 en la que los aminoácidos Lys en la posición 74, Glu en la posición 75, Arg en la posición 77, Glu en la posición 80 y Asp en la posición 82 en los grupos 8 y 9 subrayados han sido reemplazados por alanina, alterando, por lo tanto, los epítopos correspondientes. Por lo tanto, M3.8 y M8.9 son mutantes dobles que tienen dos epítopos destruidos.

La invención demuestra que los variantes de estafiloquinasa sometidos a ingeniería con inmunogenicidad reducida pueden ser en la práctica unos agentes trombolíticos alternativos a estreptoquinasa y estafiloquinasa de tipo salvaje.

La invención también se refiere a un método para producir los derivados de la invención mediante la preparación de un fragmento de ADN que comprende al menos la parte de la secuencia codificadora de la estafiloquinasa que proporciona su actividad biológica; mediante la práctica in vitro de mutagénesis dirigida del fragmento de ADN para reemplazar uno o más codones de aminoácidos de tipo salvaje por un codon de otro aminoácido; mediante la clonación del fragmento de ADN mutado en un vector adecuado; mediante la transformación o transfección de una célula anfitriona adecuada con el vector; y mediante el cultivo de la célula anfitriona en condiciones adecuadas para la expresión del fragmento de ADN. Preferiblemente, el fragmento de ADN es un fragmento EcoRI-HindIII de 453 pb del plásmido pMEX602SAK, la mutagénesis dirigida in vitro se lleva a cabo utilizando el plásmido pMa/c y la cepa de E. coli con reparación deficiente WK6MutS, y el fragmento de ADN mutado se clona en la cepa de E. coli WK6.

La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos uno de los derivados de estafiloquinasa de acuerdo con la invención junto a un excipiente adecuado, para el tratamiento de trombosis arterial. Las composiciones farmacéuticas, que contienen como ingrediente activo variantes de estafiloquinasa menos inmunogénicas, para tratar trombosis arterial en práctica humana o veterinaria pueden tomar la forma de polvos o disoluciones y pueden utilizarse para administración intravenosa o intraarterial. Dichas composiciones pueden prepararse combinando (por ejemplo, mezclando, disolviendo, etc.) el compuesto activo con excipientes de carácter neutro aceptables desde un punto de vista farmacéutico (tales como disolventes acuosos o no acuosos, estabilizantes, emulsionantes, detergentes, aditivos), y adicionalmente, si es necesario, con colorantes. La concentración del ingrediente activo en una composición terapéutica puede variar entre 0,1% y 100%, dependiendo del carácter de la enfermedad y del modo de administración. La dosificación del ingrediente activo que se va a administrar puede variar entre 0,05 mg y 1,0 mg por kg de peso corporal.

Adicionalmente, la invención se refiere a la utilización de los derivados de estafiloquinasa para el tratamiento de trombosis arterial, en especial, de infarto de miocardio, y a la utilización de derivados de estafiloquinasa para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trombosis arterial, en especial, de infarto de miocardio.

En lo anterior y en los siguiente, los términos "derivados", "mutantes" y "variantes" se utilizan indistintamente.

La presente invención se demostrará con más detalle en los ejemplos siguientes que, sin embargo, no pretenden limitar el alcance de la invención. En base a la presente invención muchas variantes y mejoras resultarán obvias para los expertos en la técnica. Por lo tanto, es probable que la mutagénesis al azar a partir del mutante combinado 3.8 y del mutante combinado 8.9 genere mutantes alternativos con una inmunogenicidad reducida y posiblemente con una actividad funcional incrementada, mientras que la mutagénesis alternativa de los grupos de epítopos neutralizantes rendirá otras variantes con una inmunogencidad reducida.

Ejemplo 1 Mapeo de epítopos de la estafiloquinasa de tipo salvaje

Se determinó la especificidad de epítopos de un panel de 17 anticuerpos monoclonales murinos producidos frente a estafiloquinasa de tipo salvaje (variante SakSTAR) mediante análisis de interacción bioespecífica en tiempo real (BIA) utilizando el instrumento BIAcore™ (Pharmacia, Biosensor AB, Uppsala, Suecia). Los anticuerpos monoclonales frente a SakSTAR se produjeron esencialmente mediante el método de Galfré y Milstein (30). Se inmunizaron ratones BALB/c con una inyección subcutánea de 10 \mug SakSTAR en adyuvante de Freund completo, que se continuó 2 semanas después con una inyección intraperitoneal de 10 \mug SakSTAR en adyuvante de Freund incompleto. Después de un intervalo de al menos 6 semanas, se administraron a los ratones intraperitonealmente 10 \mug SakSTAR en disolución salina en los días 4 y 2 antes de la fusión celular. Se aislaron células de bazo y se fusionaron con células de mieloma P3X63-Ag.8-6.5.3 (obtenidas del Dr. O. Schönherr, Organon, Oss, Holanda) de acuerdo con Fazekas de St. Groth y Scheidegger (31). Después de la selección en medio hipoxantina, aminopterina, timidina, los sobrenadantes se rastrearon para detectar producción específica de anticuerpos con un micro-ELISA no competitivo de un sitio utilizando placas de microtitulación recubiertas con estafiloquinasa. Las inmunoglobulinas unidas se detectaron con IgG de conejo anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (HP) (32). Los clones positivos se utilizaron para la producción de líquido ascítico en ratones BALB/c inducidos con pristano (33). La fracción IgG de los anticuerpos monoclonales se purificó a partir de ascites mediante cromatografía de afinidad en Proteína A-Sefarosa (34).

Esta técnica de análisis de interacción bioespecífica, basada en resonancia de plasmón superficial (SPR) permite la determinación directa de las interacciones en tiempo real sin la utilización de marcadores (35). La estafiloquinasa (SakSTAR) se inmovilizó en la superficie del Chip del Sensor CM5 utilizando el kit Amine Coupling (Pharmacia Biosensor AB), como recomienda el fabricante. Este procedimiento une los grupos amino primarios del ligando con la superficie de dextrano carboximetilado del Chip Sensor (36). La inmovilización se llevó a cabo a partir de disoluciones de proteínas a una concentración de 10 \mug/ml en 10 mM Na-acetato a pH 5,0, con un flujo de 5 \mul/min durante 6 min. Esto resultó en la unión covalente de 1.000-1.500 RU (unidades de resonancia) de los restos de estafiloquinasa (que corresponden a aproximadamente 0,07 pmoles/mm^{2}) (37). El segundo componente que interactúa (el analito: es decir, el anticuerpo monoclonal) se inyectó en disolución en el sensor. La concentración de analito libre se mantuvo constante en un flujo continuo de disolución a 20ºC por la superficie del sensor. Se inyectaron al menos cuatro concentraciones de cada analito (intervalo 0-400 nM ó 0-50 \muM) en 10 mM HEPES, 3,4 mM EDTA, 0,15 M NaCl y 0,005% Tensioactivo P20, pH 7,2, con una velocidad de flujo de 5 \mul/min durante 6 min en la fase de asociación. Después, la muestra se reemplazó por tampón, también con una velocidad de flujo de 5 \mul/min durante 6 a 30 min. Después de cada ciclo, la superficie del chip del sensor se regeneró mediante una inyección de 5 \mul de 15 mM HCl. Las constantes de la velocidad de asociación (k_{as}) y disociación (k_{dis}) se obtuvieron a partir de sensogramas como se describe con detalle en otro trabajo (38). Las constantes de equilibrio de asociación (K_{A}), calculadas como la proporción de k_{as}y k_{dis}, para la unión a la estafiloquinasa de tipo salvaje del panel de los 17 anticuerpos monoclonales estudiados, estuvo en el intervalo de 0,6 y > 25 x 10^{9} M^{-1} (valor medio 10^{10} M^{-1}) (Tabla 1).

En la tabla 1 la columna indicada con "ID" indica los diferentes derivados de estafiloquinasa. Las indicaciones "17G11", "26A2" etc. se refieren a anticuerpos monoclonales que se unen a los grupos de epítopos indicados I, II y II. En la columna "variante" se indican los aminoácidos mutados y su posición mediante el código de una letra para aminoácidos. El grupo I de epítopos es reconocido por los anticuerpos 17G11, 26A2, 30A2, 2B12 y 3G10, mientras que el grupo II de epítopos es reconocido por los anticuerpos 29C1, 18F12, 14H5, 28H4, 20D6, 32B2 y 7F10, y el grupo III de epítopos por los anticuerpos 7H11, 25E1, 40C8, 24C4 y 1A10.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a epítopos diferentes se unirán independientemente los unos de los otros, mientras que los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a epítopos muy relacionados interferirán en la unión los unos con los otros. Por lo tanto, la especificidad de epítopo de un panel de anticuerpos monoclonales se determina más fácilmente ensayando la capacidad de pares de anticuerpos monoclonales de unirse al antígeno de manera simultánea. El análisis de interacción bioespecífica en tiempo real (BIA) puede utilizarse para determinar la unión competitiva de pares de anticuerpos monoclonales a estafiloquinasa unida a la superficie del chip del sensor. El análisis se llevó a cabo como se describe en la Nota de Solicitud 101 (Pharmacia Biosensor AB). Los ensayos de unión basados en pares dividieron los 17 anticuerpos monoclonales en 3 grupos que representan 3 epítopos que no se sobrelapan del antígeno, como se ilustra en la Figura 2. La independencia de estos epítopos se confirmó mediante la demostración directa de la unión aditiva de los anticuerpos monoclonales 26A2, 28H4 y 24C4. Los anticuerpos se alinearon de acuerdo con su especificidad de epítopo como se ilustra en la Tabla 1.

Ejemplo 2 Construcción y mapeo de epítopos de variantes de estafiloquinasa "grupos-cargados-a-alanina"

En el escaneo de "grupos-cargados-a-alanina", la diana fueron grupos de aminoácidos hidrofílicos cargados. La estafiloquinasa (SakSTAR) contiene 45 aminoácidos cargados (2 His, 14 Glu, 8 Asp, 1 Arg y 20 Lys). Estos restos cargados se sometieron a mutagénesis para dar Ala en grupos de dos o tres aminoácidos, como se resume en la Figura 1. Se diseñaron un total de 21 mutantes en los que los aminoácidos cargados subrayados se reemplazaron por alanina. Los aminoácidos que se iban a reemplazar por alanina se indican con una línea vertical pequeña dentro del grupo.

Los mutantes se prepararon mediante mutagénesis dirigida y se expresaron en E. coli como se detalla más abajo. Las enzimas de restricción se obtuvieron de Pharmacia, Uppsala, Suecia o de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania). La ADN ligasa T4, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli y la fosfatasa alcalina se obtuvieron de Boehringer Mannheim. El sistema de mutagénesis dirigida a oligonucleótidos y los plásmidos pMa/c fueron proporcionados por Corvas (Gante, Bélgica) (39). El vector de expresión pMEX602SakB fue proporcionado por el Institut für Molekulare Biotechnologie, Jena, Alemania (25). El fago auxiliar M123K07 se obtuvo de Promega (Leiden, Holanda). El medio de crecimiento Luria Broth se obtuvo de Life Technologies (Merelbeke, Bélgica). El plasminógeno se purificó a partir de plasma humano como se describe en otro trabajo (40).

Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo utilizando las condiciones sugeridas por los proveedores. El ADN de plásmido se aisló utilizando un protocolo de purificación QIAGEN (proporcionado por Westburg, Leusden, Holanda). Las transformaciones de E. coli se llevaron a cabo utilizando el procedimiento del fosfato cálcico. La secuenciación de ADN se llevó a cabo utilizando el método didesoxi o de terminación de la cadena y el Láser fluorescente Automatizado A.L.F.™ (Pharmacia). La mutagénesis dirigida de los mutantes D5,K6 (M20) hasta K86,E88 (M10), se llevó a cabo utilizando el pMa/c, utilizando la cepa de E. coli con reparación deficiente WK6MutS. La propagación de los plásmidos pMa/c o derivados, la preparación de ADN de cadena única y la expresión se llevaron a cabo en E. coli WK6 (39). Los mutantes D93,K94 (M11) hasta K134,K135,K136 (M19) se construyeron en el Institut für Molekulare Biotechnologie, Jena, Alemania como se ha descrito previamente (16). El sustrato cromogénico (S2403) hidrocloruro de L-Piroglutamil-L-fenilalanil-L-lisina-P-nitroanalina se obtuvo de Chromogenix. El fibrinógeno marcado con ^{125}I se obtuvo de Amersham.

El fragmento EcoRI-HindIII de 453 pares de bases que contiene la región codificadora completa de SakSTAR se cortó del plásmido pMEX602SakB (resistente a ampicilina) y se clonó en los sitios EcoRI-HindIII del plásmido pMc5-8 (resistente a cloroanfenicol) dando lugar a pMc-STAR. Para la mutagénesis dirigida in vitro, se preparó ADN de cadena única de esta construcción mediante transformación de la construcción pMc-STAR en E. coli e inyección de un cultivo de toda la noche con el fago auxiliar M13K07. Cuatro horas después de la inyección, las células se aislaron a partir del medio mediante precipitación PEG y extracción fenol-cloroformo. Posteriormente, se hibridó pMc-STAR de cadena única con ADN de cadena única del vector pMa (EcoRI-HindIII) y el oligonucleótido sintético apropiado de 28 a 44 bases con una mutación silenciosa que crea o deleciona un sitio de restricción. Las reacciones de extensión se llevaron a cabo con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa como se ha descrito. Después de la transformación de E. coli WK6MutS y de selección en ampicilina, las colonias se crecieron en membranas de nitrocelulosa, se desnaturalizaron in situ y el ADN se hibridó durante toda la noche a temperatura ambiente utilizando los oligonucleótidos mutantes respectivos marcados radioactivamente (se utilizaron 1,5 x 10^{8} cpm de [\gamma^{32}P]-ATP para el marcaje con polinucleótido quinasa T4 de 20-30 ng de oligonucleótido). Los filtros se lavaron a 42ºC utilizando disoluciones que contienen 0,1% SDS y 2x SSC, 1x SSC, 0,2x SSC, 0,1x SSC. El ADN del plásmido se extrajo a partir de 10 ml de cultivos bacterianos de cada clon positivo y se analizó mediante digestión con enzimas de restricción. Las mutaciones deseadas se confirmaron mediante secuenciación de la secuencia codificadora completa utilizando A.L.F.™.

El fragmento HindIII-EcoRI mutado se ligó de nuevo en el vector de expresión pMEX602SakB que contiene el promotor pTaq (39). Las proteínas mutantes se produjeron intracelularmente y en forma soluble en células de E. coli WK6 transformadas con este vector. Los mutantes se purificaron a partir de extractos bacterianos sonicados utilizando cromatografía de intercambio catiónico y de interacción hidrofóbica (25).

Los mutantes SakSTAR se obtuvieron con rendimientos en el intervalo entre 10 y 80 mg/l, lo que representa unas recuperaciones de 15 a 88% del material de partida. El material purificado era puro como se muestra mediante electroforesis en geles de gradiente 10-15% no reducidos (no mostrado). El análisis de aminoácidos NH_{2}-terminal confirmó la secuencia Ser-Ser-Ser-Phe-Asp de la estafiloquinasa madura. En otro trabajo se ha publicado una caracterización bioquímica más detallada de estos mutantes de estafiloquinasa (41).

Las concentraciones de proteínas se determinaron de acuerdo con Bradford (42). Las actividades fibrinolíticas de las disoluciones SakSTAR se determinaron con un ensayo de sustrato cromogénico que se llevó a cabo en placas de microtitulación utilizando una mezcla de 80 \mul de disolución SakSTAR y 100 \mul de disolución de Glu-plasminógeno (concentración final 0,5 mM). Después de incubar durante 30 min a 37ºC, la plasmina generada se cuantificó mediante la adición de 30 \mul S2403 (concentración final 1 \muM) y determinación de la absorción a 405 nm. La actividad se expresó en unidades propias (HU) por comparación con un estándar propio (lote STAN5) al que se asignó una actividad de 100.000 HU por mg de proteína determinada por la composición de aminoácidos (11). Se llevó a cabo SDS-PAGE con el Phast System™ (Pharmacia, Uppsala, Suecia) utilizando geles con gradiente 10-15% y tinción con azul de Coomassie Brillante. La reducción de las muestras se llevó a cabo mediante calentamiento a 100ºC durante 3 min en presencia de 1% SDS y 1% ditioeritritol.

La construcción, producción y purificación de los mutantes M3.8 y M8.9 se llevó a cabo como se describe con detalle más abajo. Los oligonucleótidos utilizados para la construcción, 5'-ATAGCAATGCATTTCCTGCACTATCAAC-3' (M3), 5'-CTAATTCAACTACTGCAAACGCTGCATATGCTGTCGCATC-3' (M8), y 5'-TTTGCGCTTGGCGC
CAATGCAACTACTCTAAACTCTTTATAT-3' (M9) los sintetizó a petición Pharmacia Biotech.

Para la construcción del mutante M3.8, se utilizaron pMc-STAR de cadena única y el fragmento de EcoRI-HindIII pMa5-8 para preparar una molécula de ADN con huecos-doble, que se hibridó con el oligonucleótido sintético M3 de 28 bases (que contiene un sitio de restricción NsiI). Las reacciones de extensión se llevaron a cabo con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y ligasa como se ha descrito. Después de la transmisión de E. coli WK6MutS y de selección en ampicilina, se crecieron 81 colonias en membranas de nitrocelulosa, se desnaturalizaron in situ y el ADN se hibridó durante toda la noche a temperatura ambiente utilizando oligonucleótido M3 marcado radiactivamente (1,5 x 10^{8} cpm de [\gamma^{32}P]-ATP para el marcaje por la polinucleótido quinasa T4 de 20-30 ng de oligonucleótido). Los filtros se lavaron a 42ºC utilizando disoluciones que contienen 0,1% SDS y 2 x SSC, 1 x SSC, 0,2 x SSC, 0,1 x SSC. Se preparó ADN de un clon seleccionado de 16 positivos a partir de 150 ml de cultivos bacterianos y se analizó mediante digestión con las enzimas de restricción NsiI y PvuI. La mutación M3 (pMa-STAR3) se confirmó mediante la secuenciación de la región codificadora completa utilizando A.L.F.™. Después se preparó ADN de cadena única por transformación de pMa-STAR3 en E. coli como se ha descrito más arriba. Se hibridó pMa-STAR3 de cadena única con pMc (EcoRI-HindIII) y con el oligonucleótido sintético M8 de 40 bases que contiene un sitio de restricción NdeI, como se ha descrito más arriba. Después de la transformación de E. coli WK6MutS y de selección en cloranfenicol, se crecieron 100 colonias en membranas de nitrocelulosa y se hibridaron con oligonucleótido M8 marcado. Los clones positivos (2 de 7) se crecieron, y se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción (NsiI-HindIII y NdeI) dando lugar a un clon positivo. Después el mutante doble M3.8 se ligó de nuevo en el vector de expresión pMEX602SakB. De 12 minipreparaciones de ADN, 6 tenían el patrón de restricción correcto. Uno de estos clones (pMEXSakSTAR.M38) se secuenció y se utilizó para la preparación del mutante M3.8 bajo el control del promotor tac inducible por IPTG y dos secuencias Shine-Dalgarno en tándem.

Se incubaron 100 \mul de una suspensión de células de E. coli WK6 transformadas con el plásmido recombinante pMEXSakSTAR.M38 en 100 ml de medio LB (Gibco/BRL) que contiene 100 \mug/ml de ampicilina. Después la mezcla se incubó durante toda la noche a 37ºC mientras se agitaba a 200 rpm, lo que resultó en una densidad celular de aproximadamente 5 unidades de absorbancia a 600 nm. Se transfirieron alicuotas de 20 ml a volúmenes de 2 l (en matraces de 5 l) de medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina. Las mezclas se incubaron durante 3 horas a 37ºC mientras se agitaban antes de la adición de 200 \muM IPTG para la inducción de la expresión de M3.8, que se dejó que se produjera durante 4 horas. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4.000 rpm durante 20 min, se resuspendieron en 1/10 volumen de 0,01 M tampón fosfato, pH 6,5, y se rompieron mediante sonicación a 0ºC. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación durante 30 min a 20.000 rpm y el sobrenadante se almacenó a -20ºC hasta que se utilizó.

El pH de los lisados celulares claros (volumen 2 litros) de 20 a 30 litros de cultivos bacterianos se ajustó a 5,9, se esterilizaron por filtración a través de un filtro Sartorius de 0,22 \mum y se aplicaron a una columna 5x25 cm de SP-Sefarosa, precondicionada con 0,5 M NaOH y con 0,01 M tampón fosfato esterilizado, con una velocidad de flujo de 12 ml/min y a 4ºC con un flujo laminar. La columna se lavó con 2 a 3 litros de tampón y se eluyó con un gradiente de sal de 0 a 1 M en 500 ml y de 1 M a 2 M en 250 ml con una velocidad de flujo de 10 ml/min y a 4ºC. Las fracciones que contienen M3.8, localizadas mediante electroforesis SDS en gel, se juntaron (aproximadamente 200 ml) y se dializaron frente a 15 litros de 0,01 M tampón fosfato, pH 8,0 esterilizado, a 4ºC. El material dializado se centrifugó a 4.000 rpm durante 30 min, se esterilizó de nuevo por filtración y se aplicó a una columna 2,5 x 12 cm de Q-Sefarosa de flujo rápido, precondicionada con 0,5 M NaOH y con 0,01 M tampón fosfato, pH 8,0 esterilizado, con una velocidad de flujo de 3 ml/min a 4ºC. La columna se lavó con aproximadamente 600 ml de 0,01 M tampón fosfato, pH 8,0, con una velocidad de flujo de 8 ml/min y se eluyó con un gradiente de sal de 0 a 0,17 M en 30 ml, de 0,17 a 0,2 M en 100 ml y de 0,2 M a 1,5 M en 200 ml, con una velocidad de flujo de 4 ml/min. Las fracciones que contienen M3.8, localizadas mediante electroforesis SDS en gel, se juntaron, se ajustó la concentración de proteínas a 1 mg/ml y el material se esterilizó mediante filtración a través de un filtro Millipore de 0,22 \mum. Tres preparaciones de M3.8 rindieron 80 \pm 25 mg de proteína pura (media \pm EE) con una actividad específica de 45.000 \pm 5.200 HU/mg.

Para la construcción del mutante M8.9, se utilizaron pMc-STAR de cadena única y el fragmento pMa5-8 de EcoRI-HindIII para preparar una molécula de ADN con huecos-doble, que se hibridó con el oligonucleótido sintético de 42 bases M9 que contiene un sitio de restricción NarI. Las reacciones de extensión se llevaron a cabo con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y ligasa como se ha descrito. Después de la transformación de E. coli WK6MutS y de selección en ampicilina, las colonias se crecieron en membranas de nitrocelulosa, se desnaturalizaron in situ y el ADN se hibridó durante toda la noche a temperatura ambiente utilizando oligonucleótido M9 marcado radiactivamente (1,5 x 10^{8} cpm de [\gamma^{32}P]-ATP para el marcaje por la polinucleótido quinasa T4 de 20-30 ng de oligonucleótido). Los filtros se lavaron a 42ºC utilizando disoluciones que contienen 0,1% SDS y 2x SSC, 1x SSC, 0,2x SSC, 0,1x SSC. Se preparó el ADN de 2 clones seleccionados de 4 positivos y 1 de ellos (pMA-STAR9) se caracterizó mediante análisis de la secuencia de nucleótidos utilizando A.L.F.™. El inserto de EcoRI-HindIII de pMa-STAR9 se ligó de nuevo en el vector de expresión pMEX602SakB. Los clones (58) se rastrearon mediante hibridación in situ con oligonucleótido M9 marcado radiactivamente como sonda. Un clon, pMEXSakSTAR.M9, se caracterizó mediante análisis de secuencia de nucleótidos, y posteriormente se utilizó para la construcción del mutante M8.9.

Para construir M8.9, se introdujo la mutación 8 en M9 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 100 \mul utilizando 5 U de enzima y 1 \mug de cada uno de los cebadores siguientes: oligonucleótido II = 5'-CAGGAAACAGAATTCAGGAG, oligonucleótido III = 5'-TATATAA
TATTCGACATAGTATTCAATTTTT-3', oligonucleótido IV = 5'-TATCCCGGGCATTAGATGCGACAGCATATG
CAGCGTTTGCAGTA-3' y oligonucleótido V = 5'-CAAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC-3'. Las concentraciones de dATP, dCTP, dGTP y dTTP fueron 200 \muM. La desnaturalización se llevó a cabo durante 1 min a 94ºC, hibridación durante 2 min a 55ºC y extensión durante 1,5 min a 72ºC. Después de 30 ciclos las muestras se incubaron durante 10 min a 72ºC y se enfriaron hasta 4ºC. En una primera reacción de PCR se amplificaron 2 ng de pMEXSakSTAR.M9 utilizando los oligonucleótidos IV y V como cebadores. El amplicón de PCR se digirió con SmaI y HindIII y se purificó después de electroforesis en un gel de agarosa 1,5% utilizando un kit Prep-A-gene (Laboratorios Bio-Rad, Hercules, CA, EEUU). El fragmento resultante se clonó en los sitios SmaI-HindIII de pUC18 (Pharmacia BioTech, Uppsala, Suecia) utilizando el kit de ligación rápida de ADN (Boehringer Mannheim). Después de la transformación de células E. coli WK6, se preparó el ADN de 12 colonias y los 12 generaron un fragmento de aproximadamente 230 pares de bases cuando se digirieron con EcoRI y HindIII. Uno de estos ADN (pUC18-M89\Delta) se utilizó para la clonación de un segundo producto de PCR (véase más abajo). Se llevó a cabo una segunda reacción de PCR en 2 ng de pMEXSakSTAR.M9 utilizando los oligonucleótidos II y III como cebadores. El producto de la reacción de PCR se digirió con SspI y EcoRI y se purificó adicionalmente como se ha descrito más arriba. El fragmento resultante se ligó en los sitios SmaI-EcoRI de pUC18-M89\Delta. Después de la transformación en células E. coli WK6, se seleccionaron 6 clones para la preparación de ADN. Cinco de los 6 generaron un fragmento de aproximadamente 453 pares de bases después de digestión con EcoRI y HindIII. Este fragmento que codifica el mutante M8.9 completo se clonó en los sitios EcoRI-HindIII del vector de expresión pMEX602SakB. Después de la transformación de células E. coli WK6, se analizó el ADN de 6 colonias mediante digestión con EcoRI y HindIII generándose un fragmento de aproximadamente 453 pares de bases en todos los casos. Uno de estos ADN se caracterizó adicionalmente mediante análisis de la secuencia de nucleótidos.

Se inocularon 100 ml de medio LB (GIBCO/BRL) que contienen 100 \mug/ml ampicilina con 100 \mul de una suspensión de células E. coli WK6 transformadas con el plásmido recombinante pMEXSakSTAR.M89. El cultivo se incubó toda la noche a 37ºC mientras se agitaba a 140 rpm hasta una densidad celular de aproximadamente 5 unidades de absorbancia a 600 nm. Se utilizaron alicuotas de 4 ml para inocular cultivos de 2 litros (en matraces SL) en medio "Terrific Broth" que contiene 150 \mul/ml de ampicilina. Los cultivos se incubaron durante aproximadamente 20 horas a 30ºC y a 140 rpm, lo que resultó en una densidad celular final de aproximadamente 4 x 10^{9} células/ml. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4.000 rpm durante 20 min, se resuspendieron en 1/5 volúmenes de 0,01 tampón fosfato, pH 6,5, y se rompieron mediante sonicación a 0ºC. Después el pH se ajustó a 5,8 y los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 20.000 rpm durante 30 min. El sobrenadante se almacenó a -20ºC hasta su procesamiento posterior.

El pH de los lisados celulares claros (1.800 ml) se ajustó a 5,8 y se aplicaron a una columna de 2,5 x 20 cm de SP-Sefarosa, precondicionada con 0,5 M NaOH y 0,01 M tampón fosfato, 2,5 M NaCl fresco, pH 7,5, con una velocidad de flujo de 2 ml/min a 4ºC,. La columna se lavó con 500 \mul de tampón y se eluyó con un gradiente de sal de 0 a 1 M en 200 ml con una velocidad de flujo de 6 ml/min.

Las fracciones M8.9 juntas, identificadas con electroforesis SDS en gel, se ajustaron a 2,5 M con NaCl sólido y se sometieron a cromatografía de interacción hidrofóbica en una columna 2,5 x 20 cm de fenil-Sefarosa, precondicionada con 0,5 M NaOH y tampón 0,01 M fosfato, 2,5 M NaCl fresco, pH 7,5, con una velocidad de flujo de 2 ml/min y 4ºC. La columna se lavó con aproximadamente 500 ml de tampón y se eluyó con 0,01 M tampón fosfato, pH 6,5. Las fracciones que contienen M8.9, localizadas mediante electroforesis SDS en gel, se juntaron y se dializaron frente a 2 litros de 0,01 M tampón fosfato, pH 9,0. El material dializado se centrifugó a 4.000 rpm durante 30 min y se aplicó en una columna 1,6 x 5 cm de Q-Sefarosa de flujo rápido, precondicionada con 0,5 M NaOH y con 0,01 M tampón fosfato fresco, pH 9,0, con una velocidad de flujo de 2 ml/min y 4ºC. La columna se lavó con aproximadamente 150 ml de 0,01 M tampón fosfato, pH 9,0, y se eluyó con un gradiente de sal de 0 a 1 M NaCl en 100 ml, con una velocidad de flujo de 4 ml/min. Las fracciones que contienen M8.9, localizadas mediante electroforesis SDS en gel, se juntaron, se ajustó la concentración de proteínas a 1 mg/ml y el material se esterilizó mediante filtración a través de un filtro Millipore de 0,22 \mum. Tres preparaciones de M8.9 rindieron 73 \pm 17 mg de proteína pura con una actividad específica de 51.000 \pm 3.500 HU/mg.

Las actividades fibrinolíticas de los diferentes mutantes SakSTAR determinadas con el ensayo del sustrato cromogénico están resumidas en la tabla 1.

De los 21 mutantes, diseñados como se ilustra en la Figura 1, E99,E100 (M13) y E99,E100,E102 (M14), no se pudieron obtener en forma purificada, mientras que K11,D13,D14 (M1), E46,K50 (M4) y E65,D69 (M7) fueron inactivos. Dieciseis mutantes, resumidos en la Tabla 1, se estudiaron en detalle, junto con SakSTAR de tipo salvaje. De estos mutantes, D5,K6 (M20), K8,K10 (M21), D33,K35 (M2), K57,E58,K59 (M5), E61,E65 (M6), K86,E88 (M10), D93,K94 (M11), K96,K97,K98 (M12), E108,K109 (M15), D115,E118,H119 (M16), H119,K121 (M17), K130 (M18) y E134,K135,K136 (M19) reaccionaron con el panel de anticuerpos monoclonales de una manera similar a SakSTAR. Sin embargo, K35,E38 (M3) y E80,D82 (M9) reaccionaron poco con el grupo de anticuerpos 7H11, 25E1, 40C8, mientras que K74,E75,R77 (M8) reaccionaron poco con el grupo 26A2, 30A2, 2B12 y 3G10. La aditividad de la eliminación del epítopo se estableció con los mutantes K35,E38/K74,E75,R77 (M3.8) y K74,E75,R77/E80,D82 (M8.9) que combinaban la reactividad reducida con los anticuerpos monoclonales de las dos moléculas parentales.

Ejemplo 3 Adsorción con variantes de estafiloquinasa de tipo salvaje y "grupos-cargados-a-alanina" de anticuerpos incitados en pacientes mediante tratamiento con SakSTAR

Con el fin de obtener información sobre la especificidad de epítopo de los anticuerpos inducidos en pacientes con infarto agudo de miocardio después de tratamiento con SakSTAR, se absorbieron muestras de plasma de 16 pacientes con un exceso molar de dos veces (sobre la actividad neutralizante de la estafiloquinasa) de mutantes "grupos-cargados-a-alanina" únicos y combinados durante 10 minutos antes de la determinación de la unión residual a SakSTAR mediante análisis de interacción bioespecífica. La actividad neutralizante de estafiloquinasa en estas muestras se determinó como sigue. Se añadieron concentraciones crecientes de tipo salvaje o de la variante SakSTAR (volúmenes de 50 \mul que contienen 0,2 a 1.000 \mug/ml) a una mezcla de 300 \mul de plasma humano citrado y 50 \mul de tampón o plasma de ensayo, seguido inmediatamente de la adición de 100 \mul de una mezcla que contiene trombina (50 unidades NIH/ml) y CaCl_{2} (25 mM). El tiempo de lisis de coágulos en el plasma se evaluó y se representó frente a la concentración del resto SakSTAR. A partir de esta curva se determinó la concentración del activador de plasminógeno que producía lisis completa de coágulos en 20 min. La titulación de la actividad neutralizante se determinó como la diferencia entre los valores del plasma de ensayo y del tampón y se expresó en \mug por ml de plasma de ensayo.

Los resultados se resumen en la Tabla 2. Mientras que SakSTAR de tipo salvaje absorbió más del 90 por ciento de los anticuerpos que se unían de todas las muestras, se observó una absorción incompleta con el mutante K35,E38 (M3) en 4 pacientes, con el mutante K74,E75,R77 (M8) en 12 pacientes y con el mutante E80,D82 (M9) en 5 pacientes. La absorción con los mutantes combinados K35,E38/K74,E75,R77 (M3.8) y K74,E75,R77/E80,D82 (M8.9) eliminó menos del 90% de los anticuerpos en 13 pacientes (valor medio de 68 y 65 por ciento, respectivamente, para los 16 pacientes), mientras que, como se ha anticipado, una mezcla de las moléculas parentales de os mutantes combinados (M8 y M3 o M9) absorbió, de manera consistente, más del 90% de los anticuerpos.

Ejemplo 4 Inmunogenicidad de variantes de estafiloquinasa "grupos-cargados-a-alanina" en conejos inmunizados con estafiloquinasa de tipo salvaje (SakSTAR), con mutantes K35,E3.8 (M3), K74,E75,R77 (M8), y E80,D82 (M9) y con los mutantes combinados K35,E38/K74, E75,R77 (M3.8) y K74,E75,R77/E80,D82 (M8.9)

La inmunogenicidad comparativa de SakSTAR respecto a cada una de las variantes SakSTAR, M3, M8, M9, M3.8 y M8.9 se estudió después de una inmunización subcutánea en grupos de 4 u 8 conejos asignados a SakSTAR y en grupos de 8 conejos asignados a la variante. La inmunización se llevó a cabo mediante infusión intravenosa de 400 \mug/kg SakSTAR y de 200 a 1.000 \mug/kg de los mutantes en la semana 0 (para determinar la línea base de la capacidad de lisis de coágulos) seguida de inyección subcutánea de 400 \mug del mismo agente en adyuvante de Freund completo en la semana 2 y en adyuvante de Freund incompleto en las semanas 3 y 5. La inmunogenicidad se cuantificó en la semana 6 mediante la determinación de la actividad neutralizante de estafiloquinasa en plasma y la potencia trombolítica residual como se detalla más abajo.

Brevemente, la actividad neutralizante de estafiloquinasa en plasma se determinó mediante la adición de concentraciones crecientes de SakSTAR de tipo salvaje o mutante (volúmenes de 50 \mul que contienen 0,2 a 1.000 \mug/ml) a una mezcla de 300 \mul de plasma humano citrado y 50 \mul tampón o plasma de conejo, seguido inmediatamente de la adición de 100 \mul de una mezcla que contiene trombina (50 unidades NIH/ml) y CaCl_{2} (25 mM). El tiempo de lisis de coágulos en el plasma se evaluó y se representó frente a la concentración de SakSTAR o variante. A partir de esta curva se determinó la concentración del activador de plasminógeno que producía lisis completa de coágulos en 20 min. La titulación de la actividad neutralizante se determinó como la diferencia entre los valores del plasma de conejo y del tampón y se expresó en \mug por ml de plasma de conejo.

Las propiedades trombolíticas se estudiaron utilizando 0,3 ml coágulos de plasma de conejo pobres en plaquetas marcados con ^{125}I-fibrina, insertados en un bucle arteriovenoso extracorpóreo. Se caterizó una arteria femoral expuesta con un catéter 4 French (Portex White, Prtex, Hythe, Reino Unido) y se conectó mediante dos jeringas hipodérmicas a una vena de la oreja caterizada. El flujo sanguíneo a través del bucle extracorpóreo se mantuvo a 10 ml/min con una bomba peristáltica. Se introdujeron coágulos plasmáticos marcados con ^{125}I-fibrina en cada una de las dos jeringas insertadas en el bucle. Los coágulos plasmáticos se prepararon mezclando 0,3 ml de plasma pobre en plaquetas con una cantidad traza (aproximadamente 1,5 \muCi) de disolución de fibrinógeno humano marcado con ^{125}I (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) y 0,07 ml de una mezcla de trombina bovina (15 unidades NIH/ml) y 0,5 M CaCl_{2}, seguido de incubación durante 30 min a 37ºC. Treinta minutos después del comienzo de la infusión, se administraron 7,5 mg/kg ridogrel (inhibidor de tromboxano sintetasa y antagonista del receptor de la prostaglandina endoperóxido) (43) como un bolo intravenoso para prevenir la deposición de las plaquetas en el bucle extracorpóreo. Se administró a los animales el anticoagulante heparina (300 unidades/kg seguido de una infusión continua de 200 unidades/kg/h a lo largo del experimento) y se les asignó al azar una infusión con 400 \mug/kg de SakSTAR, (4 u 8 conejos) ó 200 a 1.000 \mug/kg de la variante SakSTAR (8 conejos). A las 6 semanas, la mitad de los conejos asignados a la variante SakSTAR se trataron de nuevo con la misma variante SakSTAR y la otra mitad con SakSTAR de tipo salvaje mientras que los conejos inmunizados con SakSTAR se trataron bien con la variante SakSTAR (si este grupo control consistía en 4 conejos) o al azar con SakSTAR de tipo salvaje o con la variante SakSTAR (si este grupo control contenía 8 conejos). Los agentes trombolíticos se administraron por vía intravenosa como un bolo 10% y una infusión 90% durante 1 h. El periodo de tiempo de la lisis de los coágulos se evaluó continuamente mediante contaje gamma externo, utilizando dos cristales de yoduro sódico/talio de 7,6x1,3 cm (Bicron, Newbury, OH) situados sobre los bucles extracorpóreos. Los cristales de centelleo se conectaron a un sistema Canberra-S100 (Canberra-Packard, Meriden, CT), y los datos se analizaron como se describe en otro trabajo (44). Al final del experimento, también se recuperaron los coágulos residuales a partir de las jeringas para determinar su contenido en radioisótopos. Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los principios guía de la American Physiological Society y el International Committee on Thrombosis and Haemostasis (45).

En la Tabla 3A se compara la inmunogenicidad de SakSTAR y de los mutantes únicos respectivos (M3, M8 y M9). Los resultados se expresan como media \pm EE.

En 8 conejos asignados al azar al mutante M3, la línea base de la actividad neutralizante fue 0,0 \pm 0,0 \mug/ml tanto frente a SakSTAR como frente a M3. La infusión intravenosa de 200 \mug/kg de M3 indujo una lisis de coágulos de 76 \pm 23 por ciento. Después, estos 8 conejos se inmunizaron con M3, suspendido en 500 \mul de adyuvante de Freund completo en la semana 2 y en 500 \mul de adyuvante de Freund incompleto en las semanas 3 y 5. En la semana 6, la actividad neutralizante plasmática se incrementó hasta 11 \pm 6,7 \mug/ml frente a SakSTAR y hasta 11 \pm 7,2 \mug/ml frente a M3. En la semana 6, la infusión de 400 \mug de SakSTAR en 4 de estos conejos, seleccionados al azar, produjo una lisis de coágulos de 18 \pm 27 por ciento mientras que la infusión de 200 \mug/kg de M3 en los otros 4 conejos indujo una lisis de 16 \pm 17 por ciento. En 4 conejos asignados a SakSTAR, la línea base de la actividad neutralizante fue 0,2 \pm 0,2 \mug/ml frente a SakSTAR y 0,0 \pm 0,0 \mug/ml frente a M3. La infusión intravenosa de 400 \mug/kg de SakSTAR produjo una línea base de lisis de 89 \pm 8,6 por ciento. Después, estos 4 conejos se inmunizaron con 400 \mug de SakSTAR suspendido bien en 500 \mug de adyuvante de Freund completo (en la semana 2) o incompleto (en las semanas 3 y 5). En la semana 6, la actividad neutralizante plasmática se incrementó hasta 35 \pm 23 \mug/ml frente a SakSTAR y hasta 19 \pm 13 \mug/ml frente a M3. La infusión intravenosa de 200 \mug/kg de SakSTAR.M3 en estos 4 conejos en la semana 6 indujo una lisis de 9,3 \pm 8,2 por ciento.

En 8 conejos asignados al mutante M8, la línea base de la actividad neutralizante en plasma fue 1,4 \pm 0,2 \mug/ml frente a SakSTAR y 0,6 \pm 0,5 \mug/ml frente a M8. La infusión intravenosa de 1.000 \mug/kg de M8 produjo una lisis de 41 \pm 13 por ciento. Después, estos conejos se inmunizaron con 400 \mug de M8 suspendido en adyuvante de Freund completo en la semana 2 y con la misma cantidad en adyuvante de Freund incompleto en las semanas 3 y 5. En la semana 6 la actividad neutralizante plasmática se incrementó hasta 3,8 \pm 1,8 \mug/ml frente a SakSTAR y hasta 5,9 \pm 2,7 \mug/ml frente a M8. La infusión de 400 \mug/kg de SakSTAR en 4 de estos conejos produjo una lisis de coágulos de 49 \pm 28 por ciento mientras que la infusión de 1.000 \mug/kg de M8 en los otros 4 conejos produjo una lisis de 24 \pm 11 por ciento. En 8 conejos asignados al grupo SakSTAR la línea base de la actividad neutralizante en plasma fue 0,9 \pm 0,6 \mug/ml frente a SakSTAR y 0,6 \pm 0,3 \mug/ml frente a M8. La infusión intravenosa de 400 \mug/kg de SakSTAR produjo una lisis de 68 \pm 18 por ciento. Después, estos conejos se inmunizaron por vía subcutánea con 400 \mug de SakSTAR suspendidos en adyuvante de Freund completo en la semana 2 y con la misma cantidad en adyuvante de Freund incompleto en las semanas 3 y 5. En la semana 6 la actividad neutralizante plasmática se incrementó hasta 59 \pm 47 \mug/ml frente a SakSTAR y hasta 22 \pm 16 \mug/ml frente a M8, mientras que la potencia trombolítica residual de 400 \mug/kg de SakSTAR había descendido hasta 7,5 \pm 2,4 por ciento y la de 1.000 \mug/kg de M8 hasta 4,1 \pm 4,8 por ciento.

En 8 conejos asignados al mutante M9, la línea base de la actividad neutralizante en plasma fue 0,2 \pm 0,05 \mug/ml frente a SakSTAR y 0,03 \pm 0,05 \mug/ml frente a M9. La infusión intravenosa de 400 \mug/kg de M9 produjo una lisis de coágulos de 72 \pm 11 por ciento. Después, estos conejos se inmunizaron con 400 \mug de M9 suspendidos en adyuvante de Freund completo en la semana 2 y con la misma cantidad en adyuvante de Freund incompleto en las semanas 3 y 5. En la semana 6, la actividad neutralizante plasmática se incrementó hasta 8,0 \pm 4,6 \mug/ml frente a SakSTAR y hasta 3,5 \pm 2,6 \mug/ml frente a M9. En la semana 6, la infusión de 400 \mug/kg de SakSTAR en 4 de estos conejos produjo una lisis de coágulos de 53 \pm 11 por ciento, mientras que la infusión de 400 \mug/kg de M9 en los otros 4 conejos produjo una lisis de 40 \pm 7,8 por ciento. En 4 conejos control asignados a SakSTAR, la línea base de la actividad neutralizante plasmática fue 0,1 \pm 0,05 \mug/ml frente a SakSTAR y 0,05 \pm 0,06 \mug/ml frente a M9. La infusión intravenosa de 400 \mug/kg de SakSTAR rindió una lisis de 78 \pm 13 por ciento. Después estos conejos se inmunizaron con 400 \mug de SakSTAR suspendidos en adyuvante de Freund completo (semana 2) e incompleto (semanas 3 y 5), respectivamente. En la semana 6 la actividad neutralizante plasmática se incrementó hasta 16 \pm 5,0 \mug/ml frente a SakSTAR y hasta 12 \pm 9,1 \mug/ml frente a M9, mientras que la potencia trombolítica de M9 había descendido hasta 24 \pm 33 por ciento.

En la Tabla 3B se compara la inmunogenicidad de SakSTAR frente a la de los mutantes dobles M3.8 y M8.9. En 8 conejos asignados al grupo M3.8, la línea base de la actividad neutralizante en plasma fue 0,6 \pm 0,3 \mug/ml frente a SakSTAR y 3,5 \pm 2,0 \mug/ml frente a M3.8. La infusión intravenosa de 1.000 \mug/kg de M3.8 produjo una lisis de 53 \pm 13 por ciento. Después, estos conejos se inmunizaron con 400 \mug de M3.8 suspendidos en adyuvante de Freund completo en la semana 2 y con la misma cantidad en adyuvante de Freund incompleto en las semanas 3 y 5. En la semana 6 la actividad neutralizante plasmática sólo se incrementó hasta 1,7 \pm 0,7 \mug/ml frente a SakSTAR y hasta 6,1 \pm 3,0 \mug/ml frente a M3.8. La infusión de 400 \mug/kg de SakSTAR en 4 de estos conejos produjo una lisis de coágulos de 77 \pm 18 por ciento mientras que la infusión de 1.000 \mug/kg de M3.8 en los otros 4 conejos produjo una lisis de 59 \pm 25 por ciento. En 8 conejos asignados al grupo SakSTAR la línea base de la actividad neutralizante en plasma fue 0,6 \pm 0,4 \mug/ml frente a SakSTAR y 2,0 \pm 2,0 \mug/ml frente a M3.8. La infusión intravenosa de 400 \mug/kg de SakSTAR produjo una lisis de 80 \pm 10 por ciento. Después estos conejos se inmunizaron por vía subcutánea con 400 \mug de SakSTAR suspendidos en adyuvante de Freund completo en la semana 2 y con la misma cantidad en adyuvante de Freund incompleto en las semanas 3 y 5. En la semana 6 la actividad neutralizante plasmática se incrementó hasta 20 \pm 15 \mug/ml frente a SakSTAR y hasta 21 \pm 22 \mug/ml frente a M3.8, mientras que la potencia trombolítica residual de 400 \mug/kg de SakSTAR había descendido hasta 8,5 \pm 5,7 por ciento y la de 1.000 \mug/kg de M3.8 hasta 30 \pm 20 por ciento.

En 8 conejos asignados al grupo M8.9, la línea base de la actividad neutralizante en plasma fue 0,3 \pm 0,2 \mug/ml frente a SakSTAR y 1,6 \pm 0,5 \mug/ml frente a M8.9. La infusión intravenosa de 800 \mug/kg de M8.9 produjo una lisis de coágulos de 39 \pm 13 por ciento en la línea base. Después, estos 8 conejos se inmunizaron con 400 \mug de M8.9 suspendidos en adyuvante de Freund completo (semana 2) o incompleto (semanas 3 y 5). En la semana 6 la actividad neutralizante plasmática sólo se incrementó hasta 2,5 \pm 1,5 \mug/ml frente a SakSTAR y hasta 4,9 \pm 1,3 \mug/ml frente a M8.9. En la semana 6, la infusión de 400 \mug/kg de SakSTAR en 4 de estos conejos produjo una lisis de coágulos de 51 \pm 35 por ciento mientras que la infusión de 800 \mug/kg de M8.9 en los otros 4 conejos produjo una lisis de 39 \pm 12 por ciento. En 4 conejos control asignados a SakSTAR la actividad neutralizante antes del tratamiento fue 0,2 \pm 0,1 \mug/ml frente a SakSTAR y 0,7 \pm 0,3 \mug/ml frente a M8.9. La infusión intravenosa de 400 \mug/kg de SakSTAR indujo una lisis de coágulos de 67 \pm 19 por ciento. Después estos 4 conejos se inmunizaron con 400 \mug de SakSTAR suspendidos en adyuvante de Freund completo (semana 2) o incompleto (semanas 3 y 5). En la semana 6 la actividad neutralizante plasmática se incrementó hasta 20 \pm 15 \mug/ml frente a SakSTAR y hasta 18 \pm 15 \mug/ml frente a M8.9, mientras que la eficacia trombolítica residual de M8.9 había descendido sólo hasta 31 \pm 30 por ciento de lisis.

Estos resultados muestran que en este estudio comparativo directo de SakSTAR y variantes seleccionadas, especialmente los mutantes dobles (M3.8 y M8.9) inducen una actividad neutralizante relacionada con anticuerpos y resistencia a lisis significativamente menores que SakSTAR.

Ejemplo 5 Inmunogenicidad comparada de SakSTAR y M3.8 en babuinos

Se estudió la inmunogenicidad comparada de SakSTAR y M3.8 en términos de inducción de anticuerpos neutralizantes y resistencia a trombolisis en administraciones repetidas en babuinos.

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los principios guía de la American Physiological Society y el International Committee on Thrombosis and Haemostasis (45). En babuinos anestesiados e intubados, se creó un circuito arteriovenoso extracorpóreo conectando, mediante un bucle de polietileno externo, una arteria tibial o braquial caterizada con una vena periférica. Una bomba peristáltica dirigió y mantuvo el flujo sanguíneo que se evaluó continuamente a través del bucle extracorpóreo, en el que se insertaron dos jeringas hipodérmicas adaptadas, conteniendo cada una de ellas un lote de coágulos de plasma fresco marcado con ^{125}I fibrina. La lisis de coágulos en el tiempo, durante la infusión de SakSTAR o de la variante M3.8, se determinó de manera continua mediante el contaje gamma externo de las jeringas. De manera alternativa, se determinó un equilibrio de recuperación del isótopo comparando la suma del contaje de la radiactividad sanguínea total al final del experimento (multiplicada por un factor 3 para corregir la distribución extravascular) más la radiactividad en los trombos recuperados, con la que estaba presente inicialmente en los coágulos.

Antes de cada experimento de trombolisis, los babuinos se premedicaron con un bolo intravenoso de ridogrel, 3 mg/kg, para prevenir la deposición de las plaquetas en el sistema extracorpóreo. A los largo de los experimentos de trombolisis, se administró heparina intravenosa, como un bolo de 300 UI/kg seguido de una infusión de 200 UI/kg.h.

Doce babuinos macho adultos (Papio hamadryas) se asignaron al azar en la línea base (semana 0) a tratamiento con 50 \mug/kg bien de SakSTAR (grupo 1) o variante M3.8 (grupo 2), se les infundió por vía intravenosa durante una hora con un bolo 10%, y se evaluó la potencia trombolítica base mediante la evaluación de la desaparición de la radiactividad de los coágulos durante 2 horas. Después, los babuinos se inmunizaron por vía subcutánea con 500 \mug bien de SakSTAR (grupo 1) o de la variante M3.8 (grupo 2), suspendidos en adyuvante de Freund completo en la semana 2 y en adyuvante de Freund incompleto en las semanas 3 y 5. En la semana 6, se cuantificó la eficacia trombolítica, mediante el modelo de trombolisis extracorpóreo, durante 4 horas: 3 de los 6 babuinos del grupo 1, tratados en la línea base y posteriormente inmunizados con SakSTAR, y 3 de los 6 babuinos del grupo 2, tratados en la línea base y posteriormente inmunizados con M3.8, se seleccionaron al azar y se les administraron en primer lugar 50 \mug/kg de SakSTAR, se les infundió por vía intravenosa durante una hora un bolo 10% y después, después de 2 horas del comienzo de la infusión con SakSTAR, el mismo régimen de M3.8 (grupos 1A y 2A, respectivamente). Los otros 6 babuinos recibieron la misma terapia pero en orden inverso: primero M3.8, después SakSTAR (grupos 1B y 2B para babuinos inmunizados previamente con SakSTAR y M3.8, respectivamente). A las 18 semanas, se evaluó la eficacia trombolítica una tercera vez mediante la evaluación de la desaparición de la radiactividad de los coágulos de fibrina, durante 3 horas: a 3 de los 6 babuinos inmunizados con SakSTAR se les administraron 250 \mug/kg de SakSTAR como un bolo intravenoso durante 2,5 min (grupo 1A) mientras que los otros 3 babuinos inmunizados con SakSTAR recibieron la misma cantidad de M3.8 (grupo 1B). De los 6 babuinos inmunizados con M3.8, 3 recibieron un bolo intravenoso de 250 \mug/kg de SakSTAR (grupo 2A) y 3 la misma cantidad de M3.8 (grupo 2B).

Se recogieron muestras de sangre en tubos citrados (concentración final 0,01 M) en la línea base, y posteriormente a diferentes tiempos para la determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), fibrinógeno, \alpha_{2}-antiplasmina (al comienzo y final de cada experimento) y de las actividades neutralizantes de SakSTAR y M3.8 (antes de la infusión trombolítica). Por lo tanto, se añadieron cantidades crecientes bien de SakSTAR o de M3.8 (volúmenes de 50 \mul que contienen 0,2 a 1.000 \mug/ml), a la mezcla de 300 \mul de plasma humano citrado y 50 \mul de tampón o plasma de ensayo de babuinos, seguido inmediatamente de la adición de 100 \mul de una mezcla de trombina (50 NIH U/ml) y CaCl_{2} (25 mM). Se determinó el tiempo de lisis plasmática de coágulos y se representó frente a la concentración de SakSTAR o M3.8. A partir de esta curva se determinó la concentración de activador de plasminógeno que producía la lisis completa de los coágulos en 20 min. La actividad neutralizante se definió como la diferencia entre los valores del plasma de ensayo y del tampón y se expresó en \mug/ml de plasma.

El fibrinógeno sistémico no se degradó, ni desapareció la \alpha_{2}-antiplasmina, lo que refleja una especificidad total para fibrina de los dos agentes.

A partir de las 6 semanas, las actividades neutralizantes de SakSTAR del grupo 1 fueron significativamente más altas que las actividades neutralizantes de M3.8 del grupo 2. El grupo 1 desarrolló actividades neutralizantes más rápidamente y significativamente más marcadas frente a SakSTAR que frente a M3.8, mientras que las actividades neutralizantes de M3.8 nunca sobrepasaron las actividades neutralizantes de SakSTAR en el grupo 2 (Tabla 4). A partir de las 8 semanas, el grupo 1 desarrolló más actividades neutralizantes tanto frente a SakSTAR como frente a M3.8 que el grupo 2 (Tabla 4).

En la línea base, la infusión intravenosa de 50 \mug/kg de SakSTAR durante 1 hora, indujo 77 \pm 2,9% de lisis de coágulos durante 2 horas en 6 babuinos (grupo 1) y 50 \mug/kg de M3.8 indujeron 83 \pm 3,6% de lisis de coágulos durante 2 horas en otros 6 babuinos (grupo 2) (media \pm EE, p = 0,2). A las 6 semanas, la eficacia lítica durante 2 horas de 50 \mug/kg de SakSTAR, infundidos por vía intravenosa durante 1 hora, descendió hasta 9,2 \pm 1,0% en 3 babuinos inmunizados con SakSTAR (grupo 1A) y hasta 8,5 \pm 3,2% en 3 babuinos inmunizados con M3.8 (grupo 2A), mientras que la eficacia lítica de 50 \mug/kg de M3.8 intravenoso durante 2 horas descendió hasta 10 \pm 6,9% en 3 babuinos inmunizados con SakSTAR (grupo 1B) y hasta 11 \pm 7,4% en 3 babuinos inmunizados con M3.8 (grupo 2B; p < 0,001 respecto a la lisis base correspondiente de todos los grupos; p = NS entre grupos). Dos horas después del comienzo de la primera infusión trombolítica, se infundieron por vía intravenosa 50 \mug/kg del otro agente durante 1 hora, rindiendo unas eficacias líticas residuales comparables: 7,7 \pm 1,5% y 11 \pm 5,7% de lisis de coágulos durante 2 horas con M3.8 en los grupos 1A y 2A, respectivamente, y 13 \pm 2,7% y 12 \pm 2,1% de lisis de coágulos durante 2 horas con SakSTAR en los grupos 1B y 2B, respectivamente.

A las 18 semanas, la inyección intravenosa de un bolo de 250 \mug/kg de SakSTAR rindió 39 \pm 5,3% de lisis de coágulos durante 3 horas en 3 babuinos inmunizados con SakSTAR (grupo 1A), mientras que la potencia trombolítica residual de 250 \mug/kg de M3.8 en 3 babuinos inmunizados con M3.8 (grupo 2B) fue significativamente mayor: 60 \pm 4,5% de lisis de coágulos durante 3 horas (p < 0,005). 250 \mug/kg de SakSTAR produjeron 58 \pm 9,5% de lisis de coágulos durante 3 horas en 3 babuinos inmunizados con M3.8 (grupo 2A; p = 0,1 respecto al grupo 1A), mientras que la lisis de coágulos durante 3 horas con 250 \mug/kg de M3.8 en 3 babuinos inmunizados con SakSTAR (grupo 1B) fue 39 \pm 3,6% (p = 0,0005 respecto al grupo 2B). Los análisis en conjunto, independientemente del agente administrado a las 18 semanas, mostraron una lisis residual durante 3 horas de 39 \pm 3,0% para el grupo 1, inmunizado con SakSTAR, frente a 63 \pm 5,2% para el grupo 2, inmunizado con M3.8 (p < 0,0005).

Las potencias trombolíticas se correlacionaron de manera inversa con las actividades neutralizantes correspondientes a lo largo del periodo de estudio (Spearman r = -0,83; p < 0,0001).

Por lo tanto, el mutante M3.8 es comparativamente activo y específico de fibrina pero es significativamente menos antigénico que SakSTAR de tipo salvaje en babuinos, como evidencia una menor inducción de las actividades neutralizantes en plasma y una recuperación más rápida del potencial trombolítico después de la inmunización. Estos resultados, obtenidos en primates no consanguíneos, confirman y amplían las observaciones anteriores en conejos.

Ejemplo 6 Eficacia trombolítica e inmunogenicidad comparada de M3.8 y M8.9 frente a SakSTAR en pacientes con oclusión arterial periférica

Se administraron SakSTAR (n = 8), M3.8 (n = 4) y M8.9 (n = 4) por vía intraarterial en o en el extremo proximal del trombo oclusivo como un bolo de 2 mg seguido de una infusión de 1 mg por h en pacientes con oclusión arterial documentada por angiografía de una arteria periférica o injerto bypass. Los pacientes se estudiaron después de aportar consentimiento escrito, y el protocolo fue aprobado por el Human Studies Committee de la Universidad de Leuven. Los criterios de inclusión y exclusión fueron esencialmente como se ha descrito previamente (46) excepto en que se permitió el retratamiento con el resto de estafiloquinasa recombinante en 48 horas. El tratamiento antitrombótico conjunto con heparina, aspirina y anticoagulantes orales fue como se ha descrito previamente (46).

El estado de la arteria periférica ocluida o del injerto bypass se evaluó antes, al menos 4 horas durante, y al final de la infusión intraarterial de SakSTAR tipo salvaje o de la variante. El estado angiográfico del vaso diana al final de la infusión constituyó el punto final principal del estudio. La administración del agente trombolítico se terminó cuando se consiguió una apertura adecuada del vaso, cuando las complicaciones requirieron su terminación o cuando dos angiogramas consecutivos no demostraron progresión en la lisis de los coágulos. La recanalización se definió como la lisis de coágulos suficiente para restaurar el flujo anterógrado enérgico a lo largo del segmento previamente ocluido. Los procedimientos intravasculares complementarios como angioplastía transluminal percutánea (PTA) se permitieron cuando los investigadores juzgaron que el trombo estaba suficientemente lisado o que no se esperaba más trombolisis.

La presión sanguínea y el ritmo cardíaco se evaluaron antes, durante y después de la infusión de SakSTAR, M3.8 o M8.9. Se recogieron muestras de sangre antes, al final de, y 6 horas después del proceso angiográfico. Las determinaciones incluyeron contaje sanguíneo periférico, tiempo de protrombina (PT), aPTT, fibrinógeno, \alpha_{2}-antiplasmina, plasminógeno y ensayos bioquímicos de la función hepática y renal. Se determinaron las actividades neutralizantes de SakSTAR, M3.8 y M8.9 e IgG e IgM anti-SakSTAR, anti-M3.8 y anti-M8.9 en muestras de sangre obtenidas durante la hospitalización y después del alta. El seguimiento clínico se centró en la recurrencia de la trombosis y en efectos adversos tales como reacciones alérgicas y hemorragias importantes (es decir, necesidad de transfusión sanguínea o control quirúrgico, descenso del hematocrito de > 10%, o hemorragia intracraneal).

Grupos de 4 a 8 pacientes (41 a 73 años) con PAO documentada por angiografía, con una duración estimada de 1 a 120 días y una longitud de 8 a 50 cm, se trataron con M3.8, M8.9 o SakSTAR. Un paciente (WAL) al que se administró SakSTAR de tipo salvaje desarrolló una reacción anafilactoide en los 5 min después de la administración del bolo de 2 mg. La infusión se interrumpió inmediatamente y la presión sanguínea volvió a ser normal en los 20 min durante la infusión de expansores plasmáticos. Este paciente no se incluyó en el cálculo de la media \pm EE de las Tablas 5 a 7. Un paciente (LAN) al que se administró M8.9 desarrolló reoclusión después de 30 horas, que se trató con 6,5 mg de la variante. Este paciente desarrolló una actividad neutralizante de M8.9 de 7,8 \mug/ml y 270 \mug/ml de IgG específica anti-M8.9 después de 2-3 semanas.

Las características relevantes de la línea base de los pacientes individuales se muestran en la Tabla 5. La mayoría de PAO eran a nivel femoropopliteal. Todas eran debidas a trombosis in situ. Se incluyeron dos oclusiones de injertos y 2 prótesis endovasculares ilíacas. Nueve pacientes presentaron claudicación incapacitante, 2 dolor isquémico en reposo crónico, 4 isquemia subaguda y 1 isquemia aguda.

La Tabla 6 resume los resultados individuales del tratamiento y el resultado. La infusión intra-arterial, a una dosis de 5,5 a 13 mg durante 3,5 a 11 horas, indujo recanalización completa en 13 pacientes, recanalización parcial en 1 paciente y ninguna mejora en 1 paciente. Los procedimientos endovasculares complementarios (principalmente PTA) se llevaron a cabo en 12 y cirugía complementaria inmediatamente después de la trombolisis en 1 paciente. La recurrencia de trombosis después del final del procedimiento angiográfico ocurrió en 4 pacientes: el primer paciente fue retratado con éxito después de 30 horas con 6,5 mg de M8.9, el segundo se sometió a injerto bypass aorta-ilíaca, el tercer paciente se recanalizó con éxito después de 20 horas con 40 mg rt-PA y el trombo se aspiró por vía transluminal en el cuarto paciente. No se presentaron complicaciones hemorrágicas o se limitaron a la formación de hematomas leves a moderados en los sitios de punción angiográfica excepto un paciente que desarrolló un hematoma en el músculo cuadriceps derecho. Otras complicaciones relacionadas con las manipulaciones endovasculares incluyeron embolización distal y disección arterial que necesitaron la parada prematura de la infusión trombolítica en un paciente. Se vio que una oclusión superficial de la arteria femoral era resistente a 8,0 mg de SakSTAR infundidos durante 6,0 horas y posteriormente se trató con éxito con PTA (Tabla 6).

Los niveles circulantes de fibrinógeno, plasminógeno y \alpha_{2}-antiplasmina permanecieron sin cambios durante la infusión de los restos SakSTAR (Tabla 7), lo que refleja la especificidad absoluta por fibrina de estos agentes a las dosis utilizadas. Se produjo digestión sustancial de fibrina in vivo como evidencia la elevación de los niveles del dímero D. La terapia intra-arterial con heparina prolongó la aPTT (Tabla 7).

La actividad neutralizante relacionada con anticuerpos de SakSTAR, M3.8 y M8.9 y la IgG específica anti-SakSTAR, M3.8 y M8.9, fueron bajas en la línea base y durante la primera semana después de la infusión (Tabla 8). A partir de la segunda semana los niveles de la actividad neutralizante incrementaron hasta valores medios de 2,9 \mug y 3,3 \mug de variante SakSTAR neutralizada por ml de plasma en los pacientes tratados con M3.8 y M8.9, respectivamente, lo que es significativamente menor que el valor medio de 9,1 \mug de SakSTAR de tipo salvaje neutralizado por ml en los pacientes tratados con SakSTAR (p = 0,03 para las variantes respecto al tipo salvaje mediante el ensayo de suma de rangos de Mann-Whitney). Los niveles de IgG específica de SakSTAR incrementaron hasta valores medios de 51 y 31 \mug/ml en pacientes tratados con M3.8 y M8.9, respectivamente, lo que es significativamente menor que el valor medio de 240 \mug/ml en los pacientes tratados con SakSTAR (p = 0,01 para las variantes respecto al tipo salvaje mediante el ensayo de suma de rangos de Mann-Whitney).

Por lo tanto, en pacientes con oclusión arterial periférica las dosis administradas de 5,5 a 13 mg de compuesto, M3.8 y M8.9 indujeron significativamente menos anticuerpos neutralizantes e IgG específica anti-estafiloquinasa que SakSTAR. Estas variantes demuestran que es posible la reducción de la respuesta humoral frente a estafiloquinasa recombinante mediante ingeniería de proteínas.

Leyendas de las figuras

Fig 1. Secuencia de proteínas de estafiloquinasa de tipo salvaje, SakSTAR. La numeración comienza con el aminoácido del extremo NH_{2}-terminal de la estafiloquinasa madura de longitud completa. Se indican las variantes "grupos-cargados a alanina" que se estudiaron.

Fig 2. Representación esquemática de la especificidad de epítopos de un panel de 17 anticuerpos monoclonales murinos producidos frente a SakSTAR.

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Referencias

1. Collen D: On the regulation and control of fibrinolysis. Edward Kowalski Memorial Lecture. Thromb Haemostas 43: 77-79, 1980.

2. Collen D, Lijnen HR: Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombolysis. Blood 78: 3114-3124, 1991.

3. Collen D, Van de Wert F: Coronary thrombolysis with recombinant staphylokinase in patients with evolving myocardial infarction. Circulation 87: 1850-1853, 1993.

4. Vanderschueren S, Collen D: Immunogeniciteit van streptokinase en implicaties voor gebruik. Tijdschr Geneesk 50: 1639-1644, 1994.

5. Lack CH: Staphylokinase: an activator of plasma protease. Nature 161: 559, 1948.

6. Lewis JH, Ferguson JH: A proteolytic enzyme system of the blood. III. Activation of dog serum profibrinolysin by staphylokinase. Am J Physiol 166: 594, 1951.

7. Winkler KC, DeWaart J, Grootsen C, Zegers BJM, Tallier NF, Vertegt CD: Lysogenic conversion of staphylococci to loss of beta-toxin. J Gen Microbiol 39: 321, 1965.

8. Collen D, Lijnen HR: Staphylokinase, a fibrin-specific plasminogen activator with therapeutic potential? Blood 84: 680-686, 1994.

9. Sako T, Sawaki S, Sakurai T, Ito S, Yoshizawa Y, Kondo I: Cloning and expression of the staphylokinase gene of Staphylococcus aureus in Escherichia coli. Molec Gen Genet 190: 271-277, 1983.

10. Behnke D, Gerlach D: Cloning and expression in Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Streptococcus sanguis of a gene for staphylokinase - a bacterial plasminogen activator. Molec Gen Genet 210: 528-534, 1987.

11. Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR: Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokinase. Fibrinolysis 6: 203-213, 1992.

12. Sako T: Overproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization. Eur J Biochem 149: 557-563, 1985.

13. Gerlach D, Kraft R, Behnke D: Purification and characterization of the bacterial plasminogen activator staphylokinase secreted by a recombinant bacillus subtilis. Zbl Bakt Mikr Hyg 269: 314,-322 1988.

14. Sako T, Tsuchida N: Nucleotide sequence of the staphylokinase gene from Staphylococcus aureus. Nucleic Acids Res 11: 7679-7693, 1983.

15. Collen D, Zhao ZA, Holvoet P, Marynen P: Primary structure and gene structure of staphylokinase. Fibrinolysis 6: 226-231, 1992.

16. Schlott B, Hartmann M, Gührs KH, Birch-Hirschfeld E, Gase A, Vetterman S, Collen D, Lijnen HR: Functional properties of recombinant staphylokinase variants obtained by site-specific mutagenesis of methionine-26. Biochim Biophys Acta 1204: 235-242, 1994.

17. Sakai M, Watanuki M, Matsuo O: Mechanism of fibrin-specific fibrinolysis by staphylokinase: participation of \alpha_{2}-plasmin inhibitor. Biochem Biophys Res Comm 162: 830-837, 1989.

18. Matsuo O, Okada K, Fukao H, Tomioka Y, Ueshima S, Watanuki M, Sakai M: Thrombolytic properties of staphylokinase. Blood 76: 925-929, 1990.

19. Lijnen HR, Van Hoef B, De Cock F, Okada K, Ueshima S, Matsuo O, Collen D: On the mechanism of fibrin-specific plasminogen activation by staphylokinase. J Biol Chem 266: 11826-11832, 1991.

20. Lijnen HR, Van Hoef B, Matsuo O, Collen D: On the molecular interactions between plasminogen-staphylokinase, \alpha_{2}-antiplasmin and fibrin. Biochim Biophys Acta 1118: 144-148, 1992.

21. Silence K, Collen D, Lijnen HR: Interaction between staphylokinase, plasmin(ogen) and \alpha_{2}-antiplasmin. Recycling of staphylokinase after neutralization of the plasmin-staphylokinase complex by \alpha_{2}-antiplasmin. J Biol Chem 268: 9811-9816, 1993.

22. Silence K, Collen D, Lijnen HR: Regulation by \alpha_{2}-antiplasmin and fibrin of the activation of plasminogen with recombinant staphylokinase in plasma. Blood 82: 1175-1183, 1993.

23. Collen D, De Cock F, Vanlinthout I, Declerck PJ, Lijnen HR, Stassen JM: Comparative thrombolytic and immunogenic properties of staphylokinase and streptokinase. Fibrinolysis 6: 232-242, 1992.

24. Collen D, De Cock F, Stassen JM: Comparative immunogenicity and thrombolytic properties toward arterial and venous thrombi of streptokinase and recombinant staphylokinase in baboons. Circulation 87: 996-1006, 1993.

25. Schlott B, Hartmann M, Gührs KH, Birch-Hirschfeid E, Pohl HD, Vanderschueren S, Van de Werf F, Michoel A, Collen D, Behnke D: High yield production and purification of recombinant staphylokinase for thrombolytic therapy. Bio/technology 12: 185-189, 1994.

26. Declerck PJ, Vanderschueren S, Billiet J, Moreau H, Collen D: Prevalence and induction of circulating antibodies against recombinant staphylokinase. Thromb Haemostas 71: 129-133, 1994.

27. Vanderschueren SMF, Stassen JM, Collen D: On the immunogenicity of recombinant staphylokinase in patients and in animal models. Thromb Haemostas 72: 297-301, 1994.

28. White H: Thrombolytic treatment for recurrent myocardial infarction. Br Med J 302: 429-430, 1991.

29. Gase A, Hartmann M, Gührs KH, Rocker A, Collen D, Behnke D, Schlott B: Functional significance of NH_{2}-and COOH-terminal regions of staphylokinase in plasminogen activation. Submitted.

30. Galfré G, Milstein C: Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol 73: 3-46, 1981.

31. de St. Groth SF, Scheidegger D: Production of monoclonal antibodies: strategies and tactics. J Immunol Methods 35: 1-21, 1980.

32. Nakane PK, Kawaoi A: Peroxidase-labeled antibody. A new method for conjugation. J Histochem Cytochem 22: 1084-1091, 1974.

33. Anderson N, Potter M: Induction of plasma cell tumours in Balb-c mice with 2, 6, 10, 14 tetramethylpentadecane (pristane). Nature 222: 994-995, 1969.

34. Ey PL, Prowse SJ, Jenkin CR: Isolation of pure IgG_{1}, IgG_{2a} and IgG_{2b} immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose. Immunochemistry 15: 429-436, 1978.

35. Jönsson U, Malmqvist M: Real time biospecific interaction analysis. The integration of surface plasmon resonance detection, general biospecific interface chemistry and microfluidics into one analytical system. Adv Biosensors 2: 291-336, 1992.

36. Johnsson B, Löfas S, Lindquist G: Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Anal Biochem 198: 268-277, 1991.

37. BIAcore system manual, 5-2, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden.

38. Karlsson R, Michaelsson A, Mattsson L: Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system. J Immunol Methods 145: 229-240, 1991.

39. Stanssens P, Opsomer C, McKeown Y, Kramer W, Zabeau M, Friz MJ: Efficient oligonucleotide-directed construction of mutations in expression vectors by the gapped duplex DNA method using aitemating selectable markers. Nucleic Acids Res 17: 4441-4454, 1989.

40. Deutsch DG, Mertz ET: Plasminogen: purification from human plasma by affinity chromatography. Science 170: 1095-1096, 1970.

41. Silence K, Hartmann M, Gührs KH, Gase A, Schlott B, Collen D, Lijnen HR: Structure-function relationships in staphylokinase as revealed by "clustered-charge-to-alanine" mutagenesis. J Biol Chem (in press).

42. Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248, 1976.

43. De Clerck F, Beetens J, de Chaffoy de Courcelles D, Freyne E, Janssen PA: R68070: thromboxane A2 synthetase inhibition and thromboxane A2/prostaglandin endoperoxide receptor blockade combined in one molecule. I. Biochemical profile in vitro. Thromb Haemost 61: 35-42, 1989.

44. Stassen JM, Vanlinthout I, Lijnen HR, Collen D: A hamster pulmonary embolism model for the evaluation of the thrombolytic and pharmacokinetic properties of thrombolytic agents. Fibrinolysis 4 (Suppl 2): 15-21, 1990.

45. Giles AR: Guidelines for the use of animals in biomedical research. Thromb Haemost 58: 1078-1084, 1987.

46. Vanderschueren S, Stockx L, Wilms G, Lacroix H, Verhaeghe R, Vermylen J, Collen D: Thrombolytic therapy of peripheral arterial occlusion with recombinant staphylokinase. Circulation 92: 2050-2057, 1995.

47. Vanderschueren S, Barrios L, Kerdsinchai P, Van den Heuvel P, Hermans L, Vrolix M, De Man F, Benit E, Muyldermans L, Collen D, Van de Werf F: A randomized trial of recombinant staphylokinase versus alteplase for coronary artery patency in acute myocardial infarction. Circulation 92: 2044-2049, 1995.

Claims (11)

1. Derivados de estafiloquinasa que muestran una inmunogenicidad reducida comparada con la de la estafiloquinasa de tipo salvaje que tienen esencialmente la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 1 en la que uno o más aminoácidos de uno o más de los grupos subrayados han sido reemplazados por otro aminoácido destruyendo de esta manera el (los) epítopo(s) correspondiente(s).

2. Derivados de estafiloquinasa según la reivindicación 1, que tienen esencialmente la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 1, en la que uno o más aminoácidos de uno o más de los grupos subrayados han sido reemplazados por alanina destruyendo de esta manera el (los) epítopo(s) correspondiente(s).

3. El derivado de estafiloquinasa M8 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 1, en la que los aminoácidos Lys en la posición 74, Glu en la posición 75 y Arg en la posición 77 en el grupo subrayado 8 han sido reemplazados por alanina alterando de esta manera el epítopo correspondiente.

4. El derivado de estafiloquinasa M3 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 1, en la que los aminoácidos Lys en la posición 35 y Glu en la posición 38 en el grupo subrayado 3 han sido reemplazados por alanina alterando de esta manera el epítopo correspondiente.

5. El derivado de estafiloquinasa M9 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 1, en la que los aminoácidos Glu en la posición 80 y Asp en la posición 82 en el grupo subrayado 9 han sido reemplazados por alanina alterando de esta manera el epítopo correspondiente.

6. El derivado de estafiloquinasa M3.8 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 1, en la que los aminoácidos Lys en la posición 35, Glu en la posición 38, Lys en la posición 74, Glu en la posición 75 y Arg en la posición 77 en los grupos subrayados 3 y 8 han sido reemplazados por alanina alterando de esta manera el epítopo correspondiente.

7. El derivado de estafiloquinasa M8.9 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 1, en la que los aminoácidos Lys en la posición 74, Glu en la posición 75, Arg en la posición 77, Glu en la posición 80 y Asp en la posición 82 en los grupos subrayados 8 y 9 han sido reemplazados por alanina alterando de esta manera el epítopo correspondiente.

8. Composición farmacéutica que comprende al menos uno de los derivados de estafiloquinasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 junto a un excipiente adecuado.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8 para tratar trombosis arterial.

10. Derivados de estafiloquinasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para utilizarse en el tratamiento de trombosis arterial.

11. Utilización de derivados de estafiloquinasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trombosis arterial.