SK89297A3 - New staphylokinase derivatives - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka nových stafylokinázových derivátov so zníženou imunogenitou, ich výroby a použitia pri liečení arteriálnej trombózy a na prípravu farmaceutickej kompozície na liečbu arteriálnej trombózy. Konkrétnejšie sa týka použitia opracovaných stafylokinázových derivátov na prípravu farmaceutickej kompozície na liečbu infarktu myokardu.

Doterajší stav techniky

Trombotické komplikácie sú hlavnou príčinou úmrtí a telesných handicapov a následkom toho trombolýzy (t.j. farmakologického rozpustenia krvného embolu) a mali by výhodne zahŕňať prekonanie takých život ohrozujúcich chorôb, ako je infarkt myokardu, cerebrovaskulárna trombóza a venózny tromboembolizmus. Trombolytické činidlá sú plazminogénové aktivátory, ktoré konvertujú plazminogén, inaktívny proenzým fibrinolytického systému v krvi, na proteolytický enzým plazmín. Plazmín rozpúšťa fibrín z krvných embolov, ale môže i degradovať normálne zložky hemostatického systému a vyvolávať takzvaný lytický stav“. Fyziologická fibrinolýza je však fibrín-orientovaná ako výsledok špecifických molekulových interakcií medzi plazminogénovým aktivátorom tkanivového typu, fibrínom, plazmín (ogénom) a 0C2-^-antiplazmínom (1,2) .

náhradný list

V súčasnosti je šesť trombolytických činidiel buď uvoľnených na klinické použitie, alebo je v klinických skúškach u pacientov s akútnym infarktom myokardu. Tieto zahŕňajú streptokinázu, urokinázu, rekombinantný plazminogénový aktivátor tkanivového typu (rt-PA) alebo jeho deriváty, anizoylovaný aktivátorový komplex plazminogén-streptokináza (anisoyled plasminogen streptokinase activator complex APSAC), rekombinantný plazminogénový aktivátor jednoreťazcového urokinázového typu ('tecombinant single chain urokinase-type plasminogen activator (rscu-PA, recombinant prourokinase^) a rekombinantnú stafylokinázu (Sak) (2,3). U pacientov s akútnym infarktom myokardu, znížením veľkosti infarktu, sa pozorovala ochrana ventrikulárnej funkcie a zníženie mortality po ošetrení streptokinázou, rt-PA alebo APSAC (2).

Jedným v súčasnosti používaným trombolytickým činidlom v terapii je streptokináza, M_r 45000, proteín sekrétovaný βhemolytickými streptokokmi. Jeho podávanie je však spojené s intenzívnym systémovým fibrinogénovým defektom a jeho účinnosť pre koronárnu trombolýzu u pacientov s vývinom akútneho infarktu myokardu je obmedzená a predstavuje približne 50 percent koronárnej arteriálnej rekanalizácie v priebehu 90 minút (2). Ďalej vystavenie streptokináze provokuje alergické reakcie u približne 5 percent ošetrených pacientov a konzistentne indukuje tvorbu špecifických protilátok, ktorá vylučuje jej opakované použitie v priebehu mesiacov alebo rokov (4).

Stafylokináza, proteín produkovaný určitými kmeňmi Staphylococcus aureus, ktorá bola zistená ako majúca profibrinolytické vlastnosti pred viac ako 4 desaťročiami (5-7), náhračný list sa javí tiež ako tvoriaca potentné trombolytické činidlo u pacientov s akútnym infarktom myokardu (8). Stafylokinázový gén bol klonovaný z bakteriofágov sak/C (9) a sak42D (10), ako i z genómickej DNA (sakSTAR) lyzogénneho kmeňa Staphylococcus aureus (11). Bol exprimovaný pod kontrolou promotóra lambda PR a jeho vlastné translačné signály v Escherichia coli a tiež pod kontrolou svojho prirodzeného promotóra a translačných signálov v Bacillus subtilis alebo Escherichia coli, viedli k akumulácii génového produktu v periplazmickom priestore alebo prípadne v kultivačnom médiu (10-13).

Stafylokinázový gén kóduje proteín 163 aminokyselín s aminokyselinami 28 zodpovedajúcimi NH₂-koncovému zvyšku celej dĺžky zrelej stafylokinázy (10, 14, 15). Proteínová sekvencia variantu pôvodného typu SakSTAR (15) sa nachádza na obr. 1. Len štyri nukleotidové rozdiely sa zistili v kódujúcich oblastiach sak/C, sak42D a sakSTAR génoch, z ktorých jeden tvorí mlčiacu mutáciu (10, 14, 15).

Niektoré molekulové formy stafylokinázy boli čistené s trochu rozdielnou M_r (16500 až 18000 na SDS-PAGE) a izoelktrickými bodmi (11-13). Deriváty s menšou M_r zrelej stafylokinázy sa získali tak, že nemajú 6 (Sak-delta6) alebo 10 (Sak-deltalO) NH₂-koncových aminoskupín. Po interakcii s plazmin(ogénom) v prostredí tlmivého roztoku sa zrelá stafylokináza (NH₂-terminálna Ser-Ser-Ser) rýchlo a kvatitativne premení na Sak-delta 10 (NH₂-terminálna Lys-Gly-Asp). Zistilo sa, že zrelá stafylokináza a Sak-delta 10 majú rovnakú fibrinolytickú aktivitu (11, 12).

náhradný list

Aminokyselina v polohe 26 sa javí podstatne dôležitá pre aktiváciu plazminogénu stafylokinázou. Substitúcia unikátneho zvyšku Met v polohe 26 zvyškom Arg alebo Val vedie skutočne ku strate funkčnej aktivity, zatial čo substitúcia s Leu alebo Cys má malý alebo žiadny vplyv na aktivitu (16). Pretože žiadna z jednotlivých aminokyselinových zmien nevyvoláva podstatné zmeny v štruktúre riešenia mechanizmu mutantných proteínov, toto rozdielne správanie zostáva záhadné .

* V plazmovom prostredí je stafylokináza schopná rozpustiť fibrínové zrazeniny spojením s fibrinogénovou degradáciou (17-19). Táto fibrínová špecifickosť stafylokinázy je výsledkom zníženej inhibície a₂_-antiplazmín plazmín-stafylokináza komplexnej väzby k fibrínu, recykláciou stafylokinázy z komplexu plazmín-stafylokináza s nasledujúcou inhibíciou a₂--antiplazmínu a prevenciou konverzie cirkulujúceho plazminogénu-stafylokinázy na plazmín-stafylokinázu a₂--antiplazmí^; nom (20-22). V niektorých pokusných zvieracích modeloch sa javí stafylokináza ekvipotentná streptokináze na rozpustenie u celokrvných alebo plazmových zrazenín, ale významne potentnejšia na disolúciu na doštičky bohatých alebo retraktovaných trombov (23,24).

Povzbudivé výsledky získané so stafylokinázou vo zvieracích modeloch trombózy boli vytvorené na základe ich hodnotenia v pilótnom meradle u pacientov s akútnym infarktom myokardu (3,25). U 4 z 5 pacientov s akútnym infarktom myokardu sa zistilo, že intravenózne podávanie 10 mg rekombinantnej stafylokinázy (SakSTAJR) počas 30 minút indukuje angiograficky dokumentovanú koronárnu arteriálnu rekanalizáciu v priebehu 40 mipút. Hladiny plazmového fibrinogénu a náhradný list cc₂--antiplazmínu neboli ovplyvnené (zvyškové hladiny o 40 minút 90 až 95 % základu) a neboli pozorované alergické reakcie (3). V druhej sérii 5 pacientov s akútnou koronárnou oklúziou vyvoláva intravenózne podanie 10 mg stafylokinázy (SakSTAR) počas 30 minút rekanalizáciu u všetkých pacientov v priebehu 20 minút bez spojenia s fibrinogéncvou degradáciou (25). Kontrolná angiografia o 24 hodín ukazuje, že rekanalizácia pretrváva.

Imunogenita stafylokinázy (SakSTAR) v porovnaní so streptokinázou sa študovala u psov (23) a paviánov (24). Tieto údaje získané na zvieratách spojene naznačujú nižšiu imunogenitu stafylokinázy v porovnaní so streptokinázou. Avšak u prvých 5 pacientov s akútnym infarktom myokardu s podávanou intravenóznou infúziou 10 mg stafylokinázy počas 30 minút boli neutralizačné protilátkové titre voči stafylokináze (SakSTAR) na nízkej základnej línii a až 6 dní po infúzii, ale vysoké titre (stafylokinázu neutralizujúce titre 12 až 42 ng/ml plazmy) protilátok boli konzistentne demonštrovateľné v plazme počas 14 až 35 dňoch (3). Tieto pozorovania boli úplne potvrdené v druhom pilotnom pokuse u 5 pacientov (25). S ohladom na imunogenitu nie sú počiatočné pozorovania vzaté do úvahy u pokusných zvierat. Podobne ako u streptokinázy by mohlo byť podanie stafylokinázy

I obmedzené na jediné použitie. Avšak neprítomnosť krížovej reaktivity vyvolaných protilátok proti stafylokináze a streptokináze (26,27) naznačuje, že podanie obidvoch substancií by nemalo byť mutuálne exkluzívne.

Vlastná imunogenita streptokinázy a stafylokinázy očividne prekáža ich neobmedzenému použitiu. Pacienti s vopred existujúcimi vysokými titrami protilátok budú nielen náhradný list náchylní na trombolytický efekt týchto činidiel, ale môžu sa objavovať alergické vedľajšie účinky a príležitostné, život ohrozujúce anafylaxie (28). Pretože streptokináza i stafylokináza sú heterológnymi proteínmi, je neobvyklé, že ich imunogenita by mohla byť znížená proteínovým inžinierstvom (opracovaním). V skutočnosti neboli uvedené žiadne zmienky o generovaní aktívnych nízkomolekulových hmotnostných fragmentov zo streptokináz. Delécia NH₂-terminálnych 17 aminokyselín alebo COOH-koncových 2 aminokyselín u stafylokináz inaktivuje molekulu, ktorá je navyše velmi citlivá na inaktiváciu * miestne špecifickej mutagenézy (25, 29).

Teraz sa prekvapivo zistilo, že variant pôvodného typu stafylokinázy SakSTAR (8, 15) obsahuje tri nepresahujúce sa imunodominantné epitopy, z ktorých aspoň dva môžu byť odstránené špecificky miestne riadenou mutagenézou bez inaktivácie molekuly. Tieto opracované stafylokinázové varianty sú menej reaktívne s protilátkami elicitovanými u pacientov ošetrených pôvodným typom stafylokinázy a sú významne menej imunogénne ako stafylokinázy pôvodného typu, ako je demonštrované na modeloch králikov a paviánov a u pacientov s periférnou arteriálnou oklúziou.

Podstata vynálezu

I

Predložený vynález sa teda týka stafylokinázových derivátov preukazujúcich zníženú imunogenitu v porovnaní s pôvodným typom stafylokinázy. Deriváty majú podstatné aminokyselinové sekvencie stafylokinázy pôvodného typu alebo ich modifikované verzie, ale aspoň jeden imunodominantný epitop je eliminovaný bez narušenia biologickej aktivity derivátov. V jednom uskutočnení vynálezu majú deriváty podstatné aminonáhradný list kyselinové sekvencie, ktoré sú znázornené na obr. 1, v ktorých jedna alebo viac aminokyselín v jednom alebo viacerých zhlukoch bolo nahradených inou aminokyselinou takto meniacou príslušné epitop(y). Výhodne sú aminokyseliny nahradené alaninom. Pri zmene epitopu(ov) je reaktivita derivátov s monoklonálnym protilátkovým panelom/miereným k jednému alebo viacerým z troch epitopových zhlukov I, II a III, redukovaná. Toto naznačuje, že nahradením aminokyselín pôvodného typu alanínom sa redukuje antigenita stafylokinázy.

Vynález sa týka najmä stafylokinázových derivátov M8, ktoré majú aminokyselinové sekvencie znázornené na obrázku 1, v ktorých boli aminokyseliny Lys v polohe 74, Glu v polohe 75 a Arg v polohe 77 v podčiarknutom zhluku 8 nahradené alanínom a takto zmenený príslušný epitop, stafylokinázového derivátu M3 s aminokyselinovými sekvenciami, znázornenými na obrázku 1, v ktorých aminokyseliny Lys v polohe 35 a Glu v polohe 38 v podčiarknutom zhluku 3 boli nahradené alanínom takto meniacim príslušný epitop, stafylokinázového derivátu M9 s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Glu v polohe 80 a Asp v polohe 82 v podčiarknutom zhluku 9 boli nahradené alanínom za zmeny príslušného epitopu, stafylokinázového derivátu M3.8 s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Lys v polohe 35, Glu v polohe 38, Lys v polohe 74, Glu v polohe 75 a Arg v polohe 77 v podčiarktnutom zhluku 3 a 8 boli nahradené alanínom za zmeny príslušných epitopov, a stafylokinázového derivátu M8.9 s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Lys v polohe 74, Glu v polohe 75, Arg v polohe 77, Glu v polohe 80 a Asp v polohe 82 v podčiarknutých zväzkoch 8 a 9 náhradný list boli nahradené alanínom za zmeny prísluušných epitopov.Teda M3.8 a M8.9 sú dvojité mutanty s rozrušenými epitopmi.

Vynález demonštruje, že opracované varianty stafylokinázy s redukovanou imunogenitou môžu byť prakticky alternatívnymi trombolytickými činidlami pre streptokinázu alebo pôvodný typ stafylokinázy.

Vynález sa týka aj spôsobu produkcie derivátov podľa vynálezu prípravou fragmentu DNA, obsahujúceho aspoň časť kódujúcej sekvencie stafylokinázy, ktorá poskytuje jej biologickú aktivitu; uskutočnením in vitro miestne riadenej mutagenézy na fragmente DNA na nahradenie jedného alebo viacerých kodónov inou aminokyselinou; klonovaním mutovaného fragmentu DNA do vhodného vektora; transformovaním alebo transfektovaním vhodnej hostiteľskej bunky s vektorom; a kultiváciou hostiteľskej bunky za podmienok vhodných na expresiu fragmentu DNA. Výhodne je fragmentom DNA fragment 453 bp EccB-HindlII plazmidu pMEX602SAK, in vitro miestne riadená mutagenéza sa uskutočňuje oligonukleotidovo-riadeným mutagenézovým systémom za použitia plazmidu pMa/c a opravou deficitného E.coli kmeňa WKôMutS, a mutovaný fragment DNA sa klonuje v E.coli kmeni WK6.

Vynález sa týka aj farmaceutických kompozícií obsahujúcich aspoň jeden zo stafylokinázových derivátov podľa vynálezu spolu s vhodnou prísadou_z na liečenie arteriálnej trombózy. Farmaceutické kompozície, obsahujúce menej imunogénnych stafylokinázovy^variantgv· ako aktívne činidlo, na liečenie arteriálnej trombózy v humánnej alebo veterinárnej praxi môžu mať formu práškov alebo roztokov, alebo sa môžu použiť na intravenózne alebo intraarteriálne podanie. Také kompozície náhradný list sa môžu pripraviť kombinovaním (napríklad miešaním, rozpúšťaním atdj aktívnej zlúčeniny s farmaceutický prijateľnými prísadami neutrálneho charakteru (ako sú vodné alebo nevodné roztoky, stabilizátory, emulgátory, detergenty, aditíva) a ďalej, ak je to nevyhnutné, s farbivami. Koncentrácia aktívnej zložky v terapeutickej kompozícii sa môže meniť v širokom rozsahu medzi 0,1 a 100 % v závislosti od charakteru choroby a spôsobu podania. Ďalej sa môže podávaná dávka meniť v rozsahu 0,05 mg a 1,0 mg na kg telesnej hmotnosti.

Navyše sa vynález týka použitia stafylokinázových derivátov na liečenie arteriálnej trombózy, najmä infarktu myokardu, a použitia stafylokinázových derivátov na použitie pri príprave farmaceutickej kompozície na liečenie arteriálnej trombózy, najmä infarktu myokardu.

Ďalej i vyššie sú nasledujúce výrazy deriváty, mutanty a varianty používané zameniteľné.

Predložený vynález bude demonštrovaný podrobnejšie v nasledujúcich príkladoch, ktoré však neobmedzujú rozsah vynálezu. Na základe predloženého vynálezu budú niektoré varianty a zlepšenia odborníkom v odbore zrejmé. Tak náhodná mutagenéza, vychádzajúca z kombinácie mutanta 3.8 a z kombinácie mutanta 8.9, je pravdepodobne generujúca alternatívne mutanty s redukovanou imunogenitou a s možným zvýšením funkčnej aktivity, zatiaľ čo alternatívne mutagenézy v epitope neutralizujúcich zhlukov budú ešte iné iné varianty s redukovanou imunogenitou.

Príklady uskutočnenia vynálezu náhradný list

Príklad 1

Mapovanie epitopu stafylokinázy pôvodného typu

Epitopová špecifickosť panelu 17 myších mcnoklonálnych protilátok pôsobiacich proti pôvodnému typu stafylokinázy (variant SakSTAR) sa stanovila reálnou časovou biošpecifickou interakčnou analýzou (BIA) za použitia zariadenia BIAcore™ (Pharmacia, Biosenzor AB, Uppsala, Švédsko). Monoklonálne protilátky proti SakSTAR sa produkovali v podstate metódou podľa Galfrého a Milsteina (30). BALB/c myši sa imunizovali subkutánnou injekciou 10 gg SakSTAR v kompletnom Freundovom adjuvans, ktorá bola nasledovaná o 2 týždne neskôr intraperitoneálnou injekciou 10 μg SakSTAR v nekompletnom Freufeovom adjuvans. Po intervale aspoň 6 týždňov boli myši boostované intraperitoneálne s 10 μς SakSTAR v salinickom roztoku v dňoch 4 a 2 pred bunkovou fúziou. Slezinové bunky sa izolovali a fúzovali s P3X63-Ag.8-6.5.3 myelómovými bunkami (získané od Dr. 0. Schónherra, Organon, Oss, Holandsko) podľa Fazekasa so St. Groth a Schneideggera (31). Po selekcii v hypoxantíne, aminopteríne, tymidínovom médiu sa supernatanty screenovali na špecifickú produkciu protilátok s jednou miestne nekompetitívnou mikro-ELISA za použitia mikrotitračných platničiek potiahnutých stafylokinázou. Väzby imunoglobulínov sa detegovali chrenovou peroxidázou (HP)konjugovanou králičím anti-myšim IgG (32) . Pozitívne klony sa použili na produkciu ascitickej kvapaliny v pristan-primovanej BALB/c myši (33). Frakcie IgG monoklonálnych protilátok sa purifikovali z ascitov afinitnou chromatografiou na Protein A-Sepharose (34).

náhradný list

Táto biošpecifická interakčná analýzová technika, založená na plazmonovej rezonancii (SPR) umožňuje priame meranie interakcii v reálnom čase bez použitia označenia (35). Stafylokináza (SakSTAR) bola imobilizovaná na povrchu Sensor Chip CM5 za použitia Aminé Coupling kitu (Pharmacie Biosensor AB), ako doporučuje výrobca. Tento postup spája primárne aminokyselinové skupiny v ligande s karboxymetylátovaným dextránovým povrchom Sensor Chip (36). Imobilizácia sa uskutočnila z proteínových roztokov s koncentráciou 10 μg/ml v 10 mM Na-acetáte pri pH 5,0, pri prietoku 5 μΐ/min počas 6 min. Toto vedie ku kovalentnému pripojeniu 1000 až 1500 RU (rezonančných jednotiek) stafylokinázových skupín (zodpovedajúcich približne 0,07 pol/mm²) (37). Druhá interakčná zložka (analyt: t.j. monoklonálna protilátka) bola injektovaná do roztoku cez senzor. Koncentrácia volného analytu sa udržiavala konštantná cez konštantný tok roztoku pri 20 °C prechádzajúci senzorovým povrchom. Pri aspoň štyroch koncentráciách každého analytu (rozsah 0 až 400 nM alebo 0 až 50 μΜ) v 10 mM HEPES, 3,4 mM EDTA, 0,15 NaCl a 0,005 % Surfactantu P20, pH 7,2, sa injektovalo pri prietokovej rýchlosti 5 μΐ/min počas 6 min do asociačnej fázy. Potom sa vzorka nahradila tlmivým roztokom tiež pri prietokovej rýchlosti 5 μΐ/min počas 6 až 30 min. Po každom cykle sa povrch senzorového čipu regene^roval injekciou 5 μΐ 15 mM H()l. Asociačné (k_ass) a disociačné (k_diss) rýchlostné konštanty sa odvodili od senzogramov, ako je ďalej podrobnejšie popísané (38) . Rovnovážne asociačné konštanty (K_a) vypočítané ako pomer k_ass a K_di_SS, pre väzbu pôvodného typu stafylokinázy študovaných 17 monoklonálnych protilátok, v rozmedzí 0,6 a>25 x 10⁹ M’¹ (stredná hodnota 10¹⁰ M^-1) (tabulka 1) .

náhradný list

V tabuľke 1 stĺpec označený ID znamená rôzne stafylokinázové deriváty. Indikácia 17G11'¹ , ”26A2'' atď. sa týka monoklonálnych protilátok viažúcich sa k označeným epitopovým zhlukom I, II a III. V stĺpci 'variant mutovanej aminokyseliny a ich polohy sú označené jednopísmenovým kódom pre aminokyseliny. Epitopový zväzok I je rozoznávaný protilátkami 17G11, 26A2, 30A2, 2B12 a 3G10, zatiaľ čo epitopový zväzok II je rozoznávaný protilátkami 29C1, 18F12, 14H5, 28H4, 20D6, 32B2 a 7F10 a epitopový zväzok III látkami 7H11, 25E1, 40C8, 24C4 a 1A10.

Monôklonálne protilátky riadené proti jednotlivým epitopom sa budú nezávisle od seba viazať, zatiaľ čo monoklonálne protilátky riadené proti tesne príbuzným epitopom budú interferovať s každými inými väzbami. Preto epitopová špecifickosť panelových monoklonálnych protilátok sa dá najľahšie stanoviť testovaním schopnosti párov monoklonálnych protilátok viazať sa súčasne k antigénu. Reálna časová biošpecifická interakčná analýza (BIA) sa môže použiť na meranie kompetitívnej väzby párov monoklonálnych protilátok ku stafylokináze pripojenej k povrchu senzorového čipu. Analýza sa uskutočňuje tak, ako je popísané v Application Note 101 (Pharmacie Biosenzor AB). Párový spôsob väzbových testov rozdeľuje 17 monoklonálnych protilátok do 3 skupín, predstavujúcich 3 nepresahujúce epitopy na antigéne/ ako ilustruje obr. 2. Nezávislosť týchto epitopov bola potvrdená priamou demonštráciou aditívnej väzby monoklonálnych protilátok 26A2, 28H4 a 24C4. Protilátky sa zoradili podľa svojej epitopovej špecifiky, ako je ilustrované v tabuľke 1.

Príklad 2 náhradný list

Konštrukcia a epitopové mapovanie nabitých-zhlukov-k-alaní· nu variantov stafylokinázy

V scane nabitých-zhlukov-k-alanínu boli cielené zhlu ky hydrofilných nabitých aminokyselín. Stafylokináza (SakSTAR) obsahuje 45 nabitých aminokyselín (2 His, 14 Glu, 8 Asp, 1 Arg a 20 Lys). Tieto nabité zvyšky sa mutagenizovali na Ala vo zväzkoch dvoch alebo troch aminokyselín, ako je zhrnuté na obr. 1. Celkom 21 mutantov, v ktorých boli podčiarknuté aminokyseliny nahradené alanínom, sa označilo. Aminokyseliny, ktoré neboli nahradené alanínom, sú označené malou vertikálnou čiarou v zhluku.

Mutanty boli pripravené miestne riadenou mutagenézou a exprimované v E.coli, ako sa ďalej podrobne uvádza. Reštrik čné enzýmy boli zakúpené od Pharmacia, Uppsala, Švédsko alebo Boehringer Mannheim (Mannheim, Nemecko). T4 DNA ligáza, Klenow fragment z E. coli DNA-polymeráz I a alkalic ká fosfatáza boli získané od Boehringer Mannheim. Oligonukleotidovo riadený mutagenézny systém a plazmidy pMa/c boli láskavo poskytnuté Corvasom (Ghent, Belgicko) (39). Expresívny vektor pMEX602SakB bol láskavo poskytnutý od Inštitút fur Moleculare Biotechnológie, Jena, Nemecko (25). Fág M123KO7 helper bol zakúpený od Promega (Leiden, Holandsko). Rastové médium Luria Broth bolo zakúpené od Life Technologies (Merelbeke, Belgicko). Plazminogén bol čistený z ľudskej plazmy, ako sa popisuje inde (40).

Enzýmové reakcie sa uskutočňovali za použitia podmienok doporučených dodávateľom. Plazmidová DNA bola izolovaná za použitia QIAGEN-purifikačného protokolu (poskytnutý od Westburg, Leusden, Holandsko). Transformácie E. coli sa náhradný list uskutočnili za použitia postupu s fosforečnanom vápenatým. Sekvenovanie DNA sa uskutočnilo za použitia metódy dideoxyreťazcovej terminačnej reakcie a zariadenia Automated Laser fluorescent A:L.F.™ (Pharmacia). Miestne riadená mutagenéza pre mutanty D5,K6 (M20) do K86,E88 (M10) sa uskutočnila za použitia pMa/c za použitia opraveného deficientného E. coli kmeňa WKMutS. Propagácia plazmidov pMa/c alebo derivátov, príprava jednoreťazcovej DNA a expresia sa uskutočnili v E. coli WK6 (39) . Mutanty D93,K94 (MU) do K134, K135,K136 (M19) boli konštruované v Inštitút fiir Molekulare Biotechnológie, Jena, Nemecko, ako sa popísalo predtým (16). Chromogénny substrát (S2403) L-pyroglutamyl-L-fenylalanyl-L-lyzin-Pnitroalanin-hydrochlorid bol získaný od Chromogenix. Fibrinogén označený ¹²⁵I bol zakúpený od Amersham.

453-bázové páry obsahujúci fragment EcoRI-HindlII, obsahujúci celú kódujúcu oblasť pre SakSTAR, sa štiepil plazmidom pMEX602SakB (rezistentný na ampicilin) a klonoval ' do miest EcoRI-HindlII plazmidu pMc5-8 (rezistentný na chloramfenikol) za poskytnutia pMc-STAR. Pre in vitro miestne riadenú mutagenézu bola pripravená jednoreťazcová DNA tohto konštruktu transformáciou pMc-STAR v konštrukte v E. coli a injekciou do kultúry cez noc s fágom helper M13KO7. Štyri hodiny po injekcii sa bunky izolovali z média zrážaním PEG a extrakciou zmesou|fenol-chloroform. Následne sa jednoreťazcová pMc-STAR hybridizovala s jednoreťazcovou pMa (EcoRIHindlII) vektorovou DNA a vhodným 28- až 48-bázovým syntetickým oligonukleotidom s mlčiacou mutáciou vytvorením alebo deléciou reštrikčného miesta. Predlžovacie reakcie sa uskutočnili s Klenowovým fragmentom DNA-polymerázy, ako je popísané. Po transformácii E. coli WKôMutS selekcii na ampicilín rástli kolónie na nitrocelulózových membránach, náhradný list denaturovali sa in situ a DNA sa hybridizovla cez noc pri teplote miestnosti za použitia príslušných rádioaktívne označených mutantných oligonukleotidov (1,5 x 10⁸ cpm [gama³²-P]-ATP za použitia T4 polynukleotid kinázového označenia 20 až 30 ng oligonukleotidu). Filtre sa premyli pri 42 °C za použitia roztokov obsahujúcich 0, 1 % SDS a 2 % SSC, lx SSC, 0,2x SSC, 0,lx SSC. Plazmidová DNA sa extrahovala z 10ml bakteriálnych kultúr vytvorených každým pozitívnym klonom a analyzovala sa reštrikčným enzýmovým štiepením. Žiadané mutácie sa potvrdili sekvencovaním kompletnej kódujúcej sekvencie za použitia A.L.F.™.

Mutovaný fragment HindlII-EcoRI sa potom ligoval do expresívneho vektora pMEX602SakB, obsahujúceho promótor pTaq (39). Mutantné proteíny sa produkovali intracelulárne a v rozpustnej forme v bunkách E. coli WK6, transformovaných týmto vektorom. Mutanty sa purifikovali z bakteriálnych extraktov, spracovaných ultrazvukom, za použitia hydrofóbnej interakčnej chromatografie za výmeny katiónov (25).

Mutanty SakSTAR sa získali s výťažkami v rozmedzí 10 až 80 mg/1, čo predstavuje získanie 15 až 80 % východiskového materiálu. Purifikovaný materiál bol čistý, ako ukazuje elektroforéza na neredukovaných 10 až 15% gradientových géloch (neuvedená). Analýza NH₂-koncových aminokyselín potvrdzuje sekvenciu Ser-Ser-Ser-Phe-Asp zrelej stafylokinázy. Biochemická charakterizácia týchto stafylokinázových mutantov je uvedená podrobnejšie inde (41) .

Proteínové koncentrácie sa stanovili podlá Bradforda (42). Fibrinolytické aktivity roztokov SakSTAR sa stanovili pomocou testu s chromoqénnyp. substrátom, uskutočneného na náhradný list mikrotitračných platniach za použitia zmesi 80 μΐ roztoku SakSTAR a 100 μΐ Glu-plazminogénového roztoku (konečná koncentrácia 0,5 mM) . Po 30 min inkubácie pri 37 °C sa generovaný plazmin kvantifikoval prídavkom 30 μΐ S2403 (konečná koncentrácia 1 μΜ) a meraním absorpcie pri 405 nm. Aktivity sa vyjadrili vo vnútorných jednotkách (horne units - HU) porovnaním so štandardom v dome (in-house štandard) (lot STAN5), ktorému sa pridelila aktivita 100000 Hu na mg proteínu, stanovené podľa zloženia aminokyselín (11). SDS-PAGE sa uskutočnila s Phast SystemTM (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) za použitia Cóomasie Briliant blue. Redukcia vzoriek sa uskutočňovala zohrievaním na 100 °C počas 3 min za prítomnosti 1% SDS a 1 % ditioerytritolu.

Konštrukcia, produkcia a purifikácia mutantov M3.8 a M8.9 sa uskutočnili tak, ako je popísané podrobnejšie ďalej. Oligonukleotidy použité na konštrukciu, 5' -ATAGCAATGCATTTCCTGCACTATCAC-3' (M3).

5'-CTAATjrCAACTACTGCAAACGCTGCATATGCTGTCGCATC-3' (M8.) a ' -TTTGCGCTTGGCGCCAATGCAACTACTCTAAACTCTTTAT?xT-3 ' (M9) boli zakúpené ako syntetizované od Pharmacia Biotech.

Na konštrukciu mutantu M3?8 sa ooužili jednoretäzcová pMc-STAR a EcoRI-HindlII fragment pMa5-,8 na prípravu čiapôčkovanej-duplexnej molekuly DNA, ktorá sa hybridizovala s 28bázovým syntetickým oligonukleotidovým í£3 (obsahujúcim reštrikčné miesto Nsil). Predlžovacie reakcie sa uskutočňovali s Klenowvým fragmentom DNA-polymerázy a ligázy, ako je popísané. Po transmisii E. coli WK6MutS a selekcii na ampicilínj rástlo 81 kolónii na nitrocelulózovvch membránach, denaturovaných in situ a DNA sa hybridizovala cez noc pri teplote miestnosti za použitia rádioaktívne označeného M3 náhradný list oligonukleotidu (1,5 x 10⁸ cpm [gama³²P] -ATP za použitia T4 polynukleotid kinázového označenia 20 až 30 ng oligonukleotidu) . Filtre sa premyli pri 42 °C za použitia roztokov obsahujúcich 0,1 % SDS a 2 x SSC, lx SSC, 0,2x SSC, 0,lx SSC. DNA 1 selektovaných klonov 16 pozitívov sa pripravila zo 150ml· bakteriálnych kultúr aanalyzovala reštrikčným enzýmovým štiepením s Nsil a Pvul. Mutácia M3 (pMa-STAR) sa potvrdila sekvencovanim kompletnej kódujúcej oblasti za použitia A.L.F.™. Jednoreťazcová DNA sa pripravila transformáciou pMa-STAK.3 v £. coli, ako je popísané vyššie. Jednoretäzcový pMa-STAR3 bol hybridizovaný s pMc tEcoRl-Hindll!) a so 40-bázovým syntetickým oligonukleotidom M8. ktorý obsahuje reštrikčné miesto Ndel, ako sa popisuje vyššie. Po transformácii E.coli WK6MutS a selekcii na chloramienikol rástlo 100 kolónií na nitrocelulózovvch membránach a hybripizovalo sa označeným oligonukleotidom M8. Pozitívne klony i'2 zo 7) rástli a boli analyzované reštrikčným enzýmovým štiepením (Nsil-HindlII a Ndel) za získania jedného pozitívneho klonu. Dvojitý mutant M3.8 sa potom ligoval späť do expresívneho vektora pMEX602SakB. Z 12 miniorenarácií DNA maío správnu reštrikčnú zostavu 6. Jeden z týchto klonov (pMEXSakSTAR.M38) sa sekvencoval a použil na príoravu mutantu M3.8 pod kontrolou IPTG indukujúceho tac promótora a dvoch sekvencií Shine-Dalgarno v tande'me.

100 ul suspenzie buniek E,coli WK6, transformovaných rekombinantným plazmidom pMEXSaKSlAR,M38. sa inKUDOvaxo v 100 ml média LB (Gibco/BRL), obsahujúceho 100 μΐ/rni ampicilínu. Zmes sa inkubovala cez noc pri 37 ’C ze trepania pri 200 ot,τηίn“¹ - čo viedlo k bunkovej hustote približne 5 ab^_ sorbačných jednotiek pri 600 nm. Podiely 20 ml sa preniesli do 21 objemov (v 5-litrovýcn nádobách) média LB.. obsahujúcenáhradný list ho 100 μΐ/ml ampicilinu. Zmesi sa inkubovali 3 hodiny pri 37 °C za trepania pred prídavkom 200 μΜ IPTG kvôli vyvolaniu expresie M3.8, ktorá sa nechala prebiehať 4 hodiny. Bunky sa peletovali odstredenim pri 4000 ot.min^-1 20 min, resuspendovali v 1/10 objemu 0,01M fosfátového tlmivého roztoku, pH 6,5, a rozrušili spracovaním ultrazvukom (sonifikáciou) pri 0 ’C. Bunkové zlomkv sa odstránili odstredenim oočas 30 min pri 20000 ot.min¹ a supernatant sa uchovával ori -20 °C do použitia.

Spojené čistené bunkové lyzáty (objem 2 litre) z 20 až litrov bakteriálnych kultúr sa upravili na pH 5,9, sterilizovali filtráciou cez filter 0,22 um Sartorius a aolikovavcv li na 5x25 cm kolónu SP-Seoharose. voorea kondicionahú 0,5M NaOH a sterilizovaným 0,01M fosfátovvm tlmivým roztokom, pri prietokovej rýchlosti 12 ml/min a pri 4 °C v laminárnom toku. Kolóna sa premyla 2 až 3 litrami tlmivého roztoku a eluovala soľným qradientom od 0 do 1 M v oriebenu 500 ml a od 1 M do 2 M v priebehu 250 ml pri prietokoven rýchlosti 10 ml/min a pri 4 ’C. Frakcie obsahuiúce M3.8. lokalizovaný SôS gélovou elektroforézou, sa soojili (približne 200 ml) a dialyzovali proti 15 litrom sterilizovaného 0.01M fosfátového tlmivého roztoku, oH 8,0, ori 4 °C. Dialyzovaný materiál sa odstredil pri ,4000 ot.min^-1 počas 30 min, sterilizoval znovu filtráciou a naniesol na 2,5 x 12 cm kolónu Q-Sepharose s rýchlym tokom, vopred kondicionovanií 0,5M NaOH a sterilizovanným 0,01M fosfátovým tlmivým roztokom, pH 8,0, pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min pri 4 °C. Kolóna sa oremyla približne 600 ml 0,01M fosfátového tlmivého roztoku, pH 8,0, pri prietokovej rýchlosti 8 ml/min a eluovala so soľným qradientom 0 až 0,17m v priebehu 30 ml, 0,17 až 0,2M v priebehu 100 ml 0,2M až 1,5M v priebehu 200 ml pri prier.onáhradný list kovej rýchlosti 4 ml/min. Frakcie obsahujúce M3.8 sa spojili, proteínová koncentrácia sa upravila na 1 mg/ml a materiál sa sterilizoval filtráciou cez 0,22 pm filter Millipore. Tieto preparácie Μ3·8 poskytli 80 ± 25 mg čistého pnteínu /priemer + SD/ so špecifickou aktivitou 45OOO + 5200 HU/mg.

Na konštrukciu mutantu M8..9 sa jednoreíazcový pMc-STAR a EcoRI-HindlII fragment pMa5~8 použili na prípravu čiapôčkovanej duplexnej molekuly DNA, ktorá sa hybridizovala so 42 bázovým syntetickým oligonukleotidom Mg, obsahujúcim reštrikčné miesto Narl. Predlžovacie reakcie sa uskutočnili s Klenowovým fragmentom DNA-polymerázy a ligovali, ako je popísané. Po transformácii E.coli WKóMutS a selekcii na ampicilín rástli kolónie na nitrocelulózových membránach, denaturovali sa in situ a DNA sa hybridizovala cez noc pri teplote miestnosti za použitia rádioaktívne označeného ^nukleotidu M9 /1,5 x 10θ cpm [gama ^²Pj-ATP pre T4 polynukleotid kinázové označenie 20 až 30 ng oligonukleotidu/. Filtre sa premyli pri 42 °C za použitia roztokov obsahujúcich 0,1 % SDS a 2 x SSC, 1 x SSC, 0,2x SSC, 0,lx SSC· DNA z 2 selektovaných klonov zo 4 pozitívov sa pripravila a 1 z nich /pMA-STARS/ sa charakterizovala nukleotidovou sekvenčnou analýzou za použitia A-L-F.^¹'*. Inzert EcoRI-HindlII z pMA-STAR9 sa potom ligoval späl do expresívneho vektora pMEX6Q2SakB. Klony /58/ sa screenovali in situ hybridizáciou s rádioaktívne označeným Oligonukleotidom M9 ako vzorkou. Jeden kloň, pMEXSaSTAR»'M9 sa charakterizoval nukleotidovou sekvenčnou analýzou a následne sa použil na konštrukciu mutantu Μ8·9·

Na konštruovanie Μ8·9 sa mutácia 8 zaviedla do M9 polymerázovou reťazovou reakciou /PCR/. PCR sa uskutočnila v celkovom objeme 100 pl za použitia 5 u enzýmu a 1 pg každého z nasledujúcich primerov; oligonukleotid II = náhradný list

5'-CAC-GAAACAGAATTCAGGAG, oligonukleotidu III = ^'~ TATATAATATTCGACATAGTATTCAATTTTT-3'» oligonukleotidu IV = 5'-TATCCCGGGCATTAGATGCGACAGCATATGCAGCGTTTGCAGTA-3 ' a oligonukleotidu V = 5 '-CAAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC-3 ' ·

Koncentrácie dATP, dCTP, dGTP a dTTP boli 200 2M· Denaturácia sa uskutočňovala 1 min pri 94 °C, tepelné spracovanie 2 min pri 55 °C a predlžovanie 1,5 min pri 72 °C· Po 30 cykloch sa vzorky inkubovali 10 min pri 72 °C a ochladili na 4 °C· V prvej PCR reakcii sa 2 ng p?£EXSakSTAR«M9 amplifikovali za použitia oligonukleotidov IV a V ako primerov. A^iplikón PCR sa štiepil so Sňal a HindlII a purifikoval po elektroforéze v 1,5% agarózovom géle za použitia Preg-A-gene kitu /Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA/· Výsledný fragment sa klonoval do Smal-Hindlll miest pUClS /Pharmacia BioTech, Uppsala, Švédsko/ za použitia rýchleho ligačného kitu DNA /Boehrineger Mannheim/. Po transformácii v E· coli WKô sa pripravila DNA z 12 kolónií a všetkých 12 genruje fragment približne 230 párov báz pri štiepení s EcoRI a HindlII. Jedna z týchto DNA /PUC18M89/ sa použila na klónovanie druhej PCR produktu /vid óalej/. Druhá PCR reakcia sa uskutočnila na 2ng pMEXSakSTAR»M9 za použitia oligonukleotidov II a III ako primerov. Reakčný produkt PCR sa štiepil so SspI a EcoRI a čalej purifikoval, ako sa popisuje vyššie. Výsledný fragment sa ligoval do Smal-EcoRI miest PUC18-M89· Po transtírmácii v E· coli WK6 burzách sa vybralo 6 klonov na prípravu DNA· Pat zo 6 generuje fragment s približne 453 pármi báz po štmpení s EcoRI a HindlII. Tento fragment, kódujúci celý mutant MS·9, sa klonoval do EcoRlHindlII miest epexpresívneho vektora pMEXS6O2SakB« Po transformácii buniek E.coli WK6 sa DNA zo 6 kolónií analyzovala štiepením s EcoRI a HindlII za generovania fragaetu s približne 453 pármi báz vo všetkých prípadoch. Jedna z týchto DNA bola čalej charakterizovaná nukleotidovou sekvenčnou analýzou.

100 ml média LB /GIBCO/BRL/, obsahujúceho 100 pg/ml ampicilínu sa inukulovalo so 100 pi suspenzie buniek E·coli WK6 náhradný list transformovaných s rekombinantnym plazmidom pMEXSakSTAR»M89·

Kultúra sa inkubovala cez noc pri 37 C za trepania pri 140 ot.min¹ na bunkovú hustotu približne 5 absorbačnych jednotiek pri 600 nm. Podiely 4 ml sa použili na inokulovanie 2-litrových kultúr /v uzavretých fíašiach SL/ v médiu Terrific Broth, obsahujúcom 150 μΙ/ml ampicilínu. Kultúry sa inkubovali asi 20 h pri 30 °C a pri I40 ot.min^-1 za poskytnutia konečnej bunkovej hustoty približne 4.10^ buniek/ml. Bunky sa peletovali odstredením pri 2000 ot.min^-1 20 min, resuspendovali v 1/5 objemu 0,0131 fosfátového tlmivého roztoku, pH 6,5 a rozrušili sonifikáciou pri 0 °C. pH sa potom upravilo na 5>8 a bunkové zlomky sa odstránili odstredením pri 20000 ot.min^-1 počas 30 min. Supernatant sa uchovával pri -20 °C pred kalším použitím.

Spojené čistené bunkové lyzáty /1800 ml/ sa upravili na pH 5,8 a naniesli na 2,5 x 20 cm kolónu SP-Sepharose, vopred spracovanej s 0,5M NaOH a čerstvým 0,01M fosfátom, 2,5M NaCl tlmivým roztokom, pH 7,7» pri prietokovej rýchlosti 2 ml/min pri 4 °C. Kolóna sa premyla s 500 μΐ tlmivého roztoku a eluovala so soínym gradientom 0 až 1 M v 200 ml pri prietokovej rýchlosti 6 ml/min.

Spojené frakcie Μ8·9, identifikované pomocou SDS gélovej elektroforézy, sa upravili na 2,5 M tuhým NaCl a podrobili hyd refóbnej interakčnej chromatografii na 2,5 x 20 cm kolóne fenyl-Sepharose, vopred spracovanej s 0,5M NaOH a Čerstvým 0,01 M fosfátom, 2,5M' NaCl-tlmivým roztokom, pH 7,5, pri prietokovej rýchlosti 2 ml/min. pri 4 °c. Kolóna sa premyla približne 500 ml tlmivého roztoku a eluovala s 0,01N fosfátovým tlmivým roztokom, pH 6,5· Μ8·9< obsahujúce frakcie lokalizované SDS gé lovou elektroforézou, sa spojili a dialyzovali proti 2 litrom 0,01M fosfátového tlmivého roztoku, pH 9,0. Dialyzovaný materiál sa odstrekoval pri 4000 ot.min¹ 30 min a naniesol na 1,6 x 5 cm kolonu Q-Sepharose fast flow, vopred spracovanú s 0,5M náhradný list

NaOH a s čerstvým O,O1M fosfátovým tlmivým roztokom, pH 9,0 pri prietokovej rýchlosti 2 ml/min a 4°C. Kolóna sa premyla približne 150 ml 0,01M fosfátového tlmivého roztoku, pH 9,0, a eluovala solným gradientom 0 až 1 M NC1 v priebehu 100 ml pri prietokovej rýchlosti 4 ml/min. Frakcie obsahujúce Μ8·9, lokalizovaný JDd gólovou elektroforézou sa spojili, proteínová koncentrácia sa upravila na 1 mg/ml a materiál sa sterilizoval .. filtráciou cez 0,22 μΜ filter Millipore. Tri preparácie M8-9 poskytli 73 + 17 mg čistého proteínu so špecifickou aktivitou 51000 ± 3500 HU/mg.

Fibrinolytické aktivity rôznych SakSTAR mutantov stanovené testom s chromogénnym substrátom, sú zhrnuté v tabuľke 1,

Z 21 mutantov označených, ako je ilustrované na obr.l, E99,E1OO /Ml3/ a E99,E100,E102 /M14/, nemohli byí získané v . purifikovanej forme, zaťial čo K11,D13,D14 /Ml/, E46,K5O /M4/ a E65,D69 /M7/ boli inaktívne. ďestnásí mutantov zhrnutých v tabuíke 1 sa študovalo podrobne, spoločne s pôvodným typom oakSTAR. Z nich mutanty D5,K6 /I.Í20/, K8,K10 /M21/, ľ»33,K35 /M2/ K57,K58,K59 /M5/, E61.E65 /M6/, K86,E88 /M10/, D93,K94 /Mll/, K96,K97,K98 /Ml2/, E108,K109 /M15/, PH 5 , E118, HH9 /Mlô/, H119,K121 /M17/, K130 /M18/ a E134,K135,Κίββ /M19/ reagujú s monoklonálnym protilátkovým panelom podobne ako dakSTAR· Avšak K35>E38 /M3/ a E80,D82 /M9/ reagujú slabo s protilátkovým zhlukom 7H11, 25E1, 40C8, zatial čo K74,E75,R77 /M8/ reaguje slabo s zhlukom 26A2, 3OA2, 2B12 a 3G10. Aditivita epitopovej elimi- . nácie sa zistila s mutantami K35,E38/K74, E75,R77 /M3.8/ a K74,E75,R77/E80,P82 /Μ8·9/, ktoré kombinujú redukovanú reaktivitu s monoklonálnymi protilátkami obidvoch rodičovských molekúl.

Príklad 3

Adsorpcia s variantami protilátok pôvodného typu a nabitýzhluk-k alanínu, elicitovanými v pacientoch pri liečení so SakSTAR náhradný list

Za účelom získania informácie o epitopovej špecifite indukovaných protilátok elicitovaných v pacientoch s akútnym infarktom myokardu po liečení so SakSTAR sa vzorky plazmy zo 16 pacientov absorbovali s dvojnásobným molovym nadbytkom /vzhladom na stafylokinázu neutralizujúcu aktivitu/ jediného a nabitý-zhluk-k-alanínu mutantov 10 min pred stanovením zvyškovej väzby k SakSTAR biošpecifickou interakčnou analýzou. Stafylokinázu neutralizujúca aktivita v týchto vzorkách sa stanovila nasledovne. Zvýšené koncentrácie pôvodného typu alebo variantu SakSTAR /50 μΐ objemy obsahujúce 0,2 až 1000 pg/ml/ sa pridali k zmesi 300 pl citrátovanej ludskej plazmy a 50 pl tlmivého roztoku alebo testovanej plazmy s okamžite nasledujúcim prídavkom 100 pl zmesi, obsahujúcej trombín /50 NIH jednotiek/ ml/ a CaCl^ /25 niM/. Meral sa čas lýzy plazmovej zrazeniny a vyniesol proti koncentrácii SakSTAR skupiny, z tejto krivky sa stanovila koncentrácia plazminogénového aktivátora, ktorá produkuje kompletnú lýzu zrazeniny za 20 min. Titer neutralizačnej aktivity sa stanovil ako rozdiel medzi hodnotami testovanej plazmy a tlmivého roz.toku a vyjadril v pg na ml testovanej plazmy.

Výsledky sú širnuté v tabuíke 2· Žatia! čo pôvodný typ SakSTAR absorbuje viac ako 90 percent väzbových protilátok zo všetkých vzoriek, nekompletná absorpcia sa pozorovala s mutantom K35,E38 /M3/ ú 4 pacientov, s mutantom K74,E75,R77 /M8/ u 12 pacientov a s mutantom E80,D82 /M9/ ^u 5 pacientov. Absorpcia s kombináciou mutantov K35, E38/K74,E75,R77 /M3-8/ a K74,E75, R77/E80,D82 /M8,9/ odstraňuje menej ako 90 % protilátok u 13 pacientov /priemerná hodnota 68 a 65 percent pre 16 pacientov/, zatial čo, ako bolo očakávané, zmes rodičovských molekúl kombinácie mutantov /M8 a M3 alebo M9/ konzistentne absorbuje v nadbytku 90 percent protilátok.

náhradný list

Príklad 4 Imunogenita nabitý-zhluk k alanínu variantov stafylokinázy v králikoch imunizovaných s pôvodným typom stafylokinázy /SekSTAR/, s mutantami K35,E3-8 /M3/> K74,E75,R77 /M8/ a E80,D82 /M9/ a s kombináciou mutantov K35,E38/K74,E75,R77 /M3-8/ a K74,E75,R77/E80,D82 /M8-9/

Porovnávacia imunogenita SakSTAR variantov, M3, MS,M9, Μ3·8 a M8»9 sa študovala po sub_kutánnej imunizácii v skupinách 4 alebo 8 králikov vzhíadom na SakSTAR a v skupinách 8 králikov k variantu. Imunizácia sa .ukutočnila intravenóznou infúziou 400 Mg/kg SakSTAR a 200 až 1000 pg/kg mutantov v týždni 0 /na stanovenie základnej línie kapacity lýzy zrazeniny/ s nasledujúcou subkutánnou injekciou 400 pg rovnakého činidla v kompletnom Freundovom adjuvans v 2· týždni a v nekompletnom Freundovom adjuvans v 3. a 5· týždni. Imunogenita sa kvantifikovala 6 týždňov stanovením stafylokinázu neutralizujúcej aktivity v plazme a zvyškovej trombolytickej potencie, ako je uvedené podrobne óalej.

Stručne, stafylokinázu neutralizujúca aktivita v plazme sa stanovila prídavkom zvyšujúcich sa koncentrácií pôvodného typu alebo mutantu SakSTAR /50pl objemy obsahujúce 0,2 až 1000 pg/ml/ k zmesi 300 21 citrátovanej íudskej plazmy a 50 }il tlmivého roztoku alebo králičej plazmy, ihneó nasledovaného prídavkom 100 pl zmesi obsahujúcej trombín /50 NIH jednotiek/ml/ a CaC^ /25 mM/· Meral sa čas lýzy plazmovej zrazeniny a vyniesol proti koncentrácii SakSTAR alebo variantu, z tejto krivky sa stanovila koncentrácia plazminogénového aktivátora, ktorá produkuje kompletnú lyžu za 20 min. Titer neutralizačnéj aktivity sa stanovil ako rozdiel madzi hodnotami králičej plazmy a tlmivého roztoku a vyjadril sa v pg na ml králičej plazmy.

náhradný list

Trombolytické vlastnosti sa študovali za použitia 0,3 ml 125j_fibrínom označených zrazenín na doštičky chudobnej králičej plazmy, inzertovanych do extrakorporálnej arteriovenóznej slučky. Exponovaná femorálna artéria sa potom katetrizovala 4 katétrami French /Portex White, Portex, Hythe, UK/ a pripojila cez dve hypodermné striekačky ku katetrizovanej ušnej véne. Krvný tok cez extrakorporálnu slučku sa udržiaval na 10 ml/min peristaltickým čerpadlom. ^5j-fibrínom označené plazmové zrazeniny sa zaviedli do každej z dvoch striekačiek inzertovanych do slučky. Plazmové zrazeniny sa pripravili zmiešaním 0,3 ml plazmy chudobnej na doštičky so stopovým množstvom /približne 1,5 pCi/ roztoku ^^^I-označeného ludského fibrinogénu /Amersham, Buckinghamshire, UK/ a 0,07 ml zmesi hovädzieho trombínu /Ϊ5 NIH jednotiek/ml/ a 0,5 M CaCl^, s nasledujúcou inkubáciou počas 30 min pri 37 ’C. 30 min pred začiatkom infúzie sa poc’alo 7,5 mg/kg ridogrelu /kombinovaný inhibítor tromboxansý’Vázy a antagonista prostaglandin enôoperoxid receptora/ /43/ ako intravenózny bolus na zabránenie tomu, aby sa doštičky usadzovali na extrakorporálnej slučke. Zvieratá sa antikoagulovali heparínom /300 jednotiek/kg s kontinuálnou infúziou 200 jednotiek/kg/h počas pokusu/ a náhodne pripojených k unfúzii so 400 yUg/kg SakSTAR, /4 alebo 8 králikov/ alebo 200 až 1000 /tg/kg SakSTAR variantu /8 králikov/, po 6 týždňoch polovica králikov so SakSTAR variantom sa znovu ošetrila s rovnakým SakSTAR variantom a druhá polovica s pôvodným typom SakSTAR, zatiaí čo králiky.imunizované so SakSTAR sa ošetrili buó so SakSTAR variantom /ak kontrolná skupina obsahuje 4 králiky/, alebo náhodne buč s pôvodným typom SakSTAR, alebo so SakSTAR variantom /ak táto . . .kontrolná skupina obsahuje 8 králikov/. Trombolytické činidlá sa podávali intravenózne ako 10% bolus a 90% infúzia počas 1 h. Sledoval sa časový priebeh lyzy zrazeniny náhradný list vonkajším gama počítaním za použitia dvoch 3x0,5 palcových kryštálov jodid sodný/tálium /Bicron, Newbuy, OH/, umiestnených na extrakorporálnou slučkou. Scintilačné kryštály sa pripojili k systému Canberra-J100 /Canberra-Packard, Meriden,CT/ a údaje sa analyzovali, ako je popísané inde /44/. Na konci pokusu sa zvyšné zrazeniny tiež získali zo striekačiek na stanovenie ich obsahu rádionuklidu. Uskutočnené pokusy na zvieratách zodpovedajú zásadám Američan Physiological óociety a International Commitee on Thrombosis and Haemostasis /45/.

Imunogenita BakSTAR a jednotlivých príslušných mutantov /M3, M8 a M9/ sa porovnáva v tabulke 3A· Výsledky sú vyjadrené ako priemer + SO·

V 8 králikoch randomizovaných k mutantu B.Í3 bola základná neutralizačná aktivita 0,0 i 0,0 pg/l proti SakSTAR i proti M3· Intravenózna infúzia 200 pg/kg M3 vyvoláva 76 ,± 23 percent lýzy zrazeniny. Tieto králiky boli potom imunizované s M3, suspendovaným v 500 pi kompletného Freundovho adjuvans v 2· týždni a v 500 pl nekompletného Freundovho adjuvans v 3. a 5, týždni. V 6. týždni sa plazmová neutralizačná aktivita zvýšila na 11 + 6,7 pg/ml proti oakoTAR a II. + 7,2 pg/ml proti M3. V 6. týždni infúzie 400 pg oakSTAR v 4 z týchto králikov, vybratých náhodne, produkuje 18 + 27 percent lýzy zrazeniny, zatial čo infúzie 200 pg/kg M3 v 4 iných králikoch indukuje 16 + 17 percent lýzy. V 4 králikoch určených oakSTAR bola základná línia neutralizačnej aktivity 0,2 ± 0,2 /íg/ml proti SakSTAR a 0,0 +.0,0 pg/ml proti Μ3» Intravenózna infúzia 400 /ig/kg sakSTAR produkuje 89 +.8,6 percent lýzy základnej línie. Tieto -4 králiky sa potom imunizovali so 400 pg SakSTAR suspendovaného v 500 pg kompletného /v 2. týždni/ alebo nekompletného /3. a 5. týždeň/ náhradný list

Freundovho adjuvans. V ô· týždni sa plazmová neutralizačná aktivita zvýšila na 35 + 23 /ig/ml proti SakSTAR a na 19 i 13 pg/ml proti M3. Intravenózna infúzia 200 pg/kg JakSTAR .M3 v týchto '.4 králikoch v 6. týždni indukuje 9,3 + 8,2 percent lýzy.

V 8 králikoch určených pre mutant M8 bola základná neutralizačná aktivita v plazme 1,4 + 0,2 pg/ml proti SakSTAR a 0,6 + Mg/ml proti M8· Intravenjozna infúzia 1000 úg/kg MS produkuje 41 + 13 percent· lýzy. Tieto králiky sa potom imunizovali so 400 pg M8 suspendovaného v kompletnom Freundovom adjuvans v 2. týždni s rovnakým množstvom v kompletnom Freundovom adjuvans a s rovnakým množstvom v nekompletnom Freundovom adjuvans v 3. a 5. týždni. V 6· týždni bola plazmová neutralizačná aktivita zvýšená na 3,8 ± 1,8 pg/ml proti SakSTAR a na 5,9 ±

2.7 pg/ml proti M8. Infúzia 400 pg/kg SakSTAR v týchto^králikoch produkuje 49 + 28 percent lýzy zrazeniny, zatiaí čo infúzia 1000 pg/kg M8 v 4 iných králikoch produkuje 24 + 11 percent lýzy· V 8 králikoch určených pre SakSTAR skupinu bola základná neutralizačná aktivita v plazme 0,9 + 0,6 pg/ml proti SakSTAR a 0,6 ± 0,3 pg/ml proti M8. Intravenózna infúzia 400 pg/kg ôakoTAR produkuje 68 + 18 percent lýzy. Tieto králiky sa potom imunizovali subkutánne so 400 pg oakSTAR suspendovaného v kompletnom Freundovom adjuvans v 2· týždni a s rovnakým množstvom v nekompletnom Freundovom adjuvans v 3. týždni a 5. týždni. V 6. týždni bola plazmová neutralizačná aktivita zvýšená na 59 + 47 pg/ml proti óakSTAR a na 22 ± 16 pg/ml proti M8, žatia! čo zvyšková trocioolytická potencia 400 pg/kg SakSTAR bola znížená na 7,5 ± 2,4 percenta a 1000 pg/kg M8 na 4,1 +

4.8 percenta.

V 8 králikoch určených pre mutant M9 bola základná náhradný list neutralizačná aktivita v plazme 0,2 + 0,05 Pg/ml proti SakSTAR a 0,03 + 0,05 pg/ail proti Γ.Ί9. Intravenózna infúzia 400 pg/kg ?.'9 produkuje 72 + 11 percentnú lyžu zrazeniny. Tieto králiky sa potom imunizovali so 400 pg M9 suspendovaného v kompletnom Freundovom adjuvans v 2· týždni a s rovnakým množstvom v nekompletnom Freundovom adjuvans v 3. a 5.týždni. V 6. týždni sa plazmová neutralizačná aktivita zvýšila na 8,0 ± 4,6 pg/ml proti SakSTAR a na 3,5 + 2,6 pg/ml proti Μ9· V 6. týždni produkuje infúzia 400 pg/kg SakSTAR v 4 z týchto králikov 53 + 11 percent lýzy zrazeniny, zatiaí čo infúzia 400 pg/kg M9 v 4 iných králikoch produkuje 40 + 7>8 percent lýzyv- V 4 kontrolných králikoch určených pre SakSTAR Póla základná neutralizačná aktivita v plazme 0,1 ± 0,05 Pg/^1 SakSTAR a 0,05 -± 0,06 pg/ml proti M9· Intravenózna infúzia 400 pg/kg SakSTAR poskytne 78 + 13 percent lýzy. Tieto králiky sa potom imunizovali 400 pg SakSTAR, suspendovaného v kompletnom Freundovom adjuvans /2·týždeň/ a v nekompletnom Freundovom adjuvans /3. a 5. týždeň/. V 6. týždni bola plazmová neutralizačná aktivita zvýšená na 16 + 5,0 pg/ml proti SakSTAR a na 12 + 9,1 pg/ml proti M9, zatial čo trombolytická potencia M9 sa znížila na 24 + 33 percent.

Imunogenita SakSTAR versus dvojité mutanty M3.8 a Μ8·9 je porovnaná v tabuíke 38. V 8 králikoch určených pre skupinu M3.8 bola základná neutralizačná aktivita v plazme 0,6 ± 0,3 pg/ml proti SakSTAR a 3,5 + 2,0 pg/ml proti M3.8· Intravenózna infúzia 1000 pg/kg Μ3·8 produkuje 53 + 13 percent lýzy. Tieto králiky sa potom imunizovali so 400 pg M3.8, suspendovaného v kompletnom Freundovom adjuvans v 2· týždni a s rovnakým množstvom v nekompletnom Freundovom adjuvans v 3. a 4. týždni. V 6. týždni sa plazmová neutralizačná aktivita zvýšila len na 1,7 + 0,7 náhradný list pg/ml proti SakSTAR a na 6,1 ± 3>O pg/ml proti Μ3·8· Infúzia 400 pg/kg SakSTAR v 4 z týchto králikov produkuje 77 + 18 percent lýzy zrazeniny, zjtial čo infúzia 1000 pg/kg M3.8 v 4 iných králikoch produkuje 59 + 25 percent lýzy. V 8 králikoch určených pre oakSTAR skupinu bola základná plazmová neutralizačná aktivita 0,6 + 0,4 ug/ml proti oakSTAR a 2,0 + 0,4 pg/ml proti oakSTAR a 2,0 + 2,0 ug/ml proti Μ3·8· Intravenózna infúzia 400 pg/kg SakSTAR produkuje 80 ± 10 percentjlýzy. Tieto králiky sa potom imunizovali subkutánne so 400 pg oakSTAR suspendovaného v kompletnom Freundovom adjuvans v 2. týždni a s rovnakým množstvom v nekompletnom Freundovom adjuvans v 3. a 5. týždni. V 6· týždni sa plazmová neutralizačná aktivita zvýšila na 20 + 15 pg/ml proti M3.8, · zatiaí čo zvyšková trombolytická potencia 400 pg/kg oakSTAR sa zvýšila na 8,5 + 5,7 percent a 1000 + pg/kg M3.8 na 30 ± 29 percent.

V 8 králikoch určených pre skupinu M3.8 bola základná plazmová, neutralizačná aktivita 0,3 + 0,2 pg/ml proti oakSTAR a 1,6 + 0,5 pg/ml proti Μ8·9· Intravenózna infúzia 800 pg/kg M8.9 produkuje 39 + 13 percent 'lýzy zrazeniny pri základnej hladine. Týchto 8 králikov sa potom imunizovalo so 400 pg Μ8·9 suspendovaného v kompletnom Freundovom adjuvans /2· týždeň/ alebo v nekompletnom Freundovom adjuvans /3. a 5. týždeň/. V 6. týždni sa plazmová neutralizačná aktivita zvýšila len na 2,5 + 1,5 pg/ml proti oakSTAR a na 4,9 ± 1,3 pg/ml proti Μ8·9· V 6. týždni infúzia 400 pg/kg SakSTAR v 4 z týchto· králikov produkuje 51 + 35 percent lýzy zrazeniny, zatial čo infúzia 800 pg/kg M8.9 v 4 iných králikoch produkuje 39 + 12 percent lýzy. V 4 kontrolných králikoch určených pre SakSTAR bola neutralizačná aktivita pred ošetrením 0,2 ± 0,1 pg/ml proti SakSTAR a 0,7 ± 0,3 Pg/ml proti M8.9· Intravenózna infúzia 400 pg/kg SakSTAR náhradný list vyvoláva 67 + 19 percent lýzy zrazeniny. Tieto 4 králiky potoz boli imunizované 400 pg SakSTAR suspendovaného v kompletnom Freunjiovom adjuvans /2· týždeň/ alebo v nekompletnom Freundovom adjuvans /3. a 5. týždeň/. V 6· týždni bola plazmová neutralizačná aktivita zvýšená na 20 + 15 ug/ml proti SakSTAR a na 18 + 15 pg/ml proti Μ8·9, zatiaí čo zvyšková tronbolytická účinnosl M8-9 sa znížila na 31 + 30 percent lýzy zrazeniny.

Tieto výsledky ukazujú, že v tejto priamej porovnávacej štúdii -SakSTAR a vybraté varianty, špeciálne dvojité mutanty /M3-8 a M8.9/ indukujú výrazne menej neutralizačnej aktivity, spojenej s protilátkou, k lýze ako SakSTAR·

Príklad 5

Porovnávacia imunogenita SakSTAR a M3.8 na paviánoch

Porovnanie imunogenity SakSTAR a M3.8, pokial ide o vyvolanie neutralizácie protilátok a nezaberanie pri trombolýze pri opakovanom podaní, bolo študované na paviánoch.

Pokusy na zvieratách sa uskutočnili podlá uskutočňovacích predpisov Američan physiological Society sa International Committee on Thrombosie and Haemostasis /45/. U anestezovaných a intubovanych paviánov sa vytvoril extrakorporálny arteriovenózny obeh spojením cez vonkajšiu polyetylénovú slučku katetrizovanej tibiálnej alebo branchiálnej artérie k periférnej véne. Peristaltické čerpadlo riadi a udržiava kontinuálne sledovaný krvný tok extrakorporálnou slučkou, do ktorej boli vané 2.hypodermné striekačky, obsahujúce každá 0,3 ml čerstvej ťibrínom označenej zrazeniny poolovanej plazmy paviánov. Kontinuálne sa sledoval časový priebeh lýzy zrazeniny počas inzert náhradný list infúzie SakSTAR alebo variantu M3.8 pomocou vonkajšieho gama počítača nad striekačkami. Alternatívne sa rovnováha získania izotopu stanovila porovnaním súčtu hodnoty celkovej krvnej rádioaktivity na konci pokusu /násobené faktorom 3 pre úpravu pre extravaskulárnu distribúciu/ plus rádioaktivity v získanom trombe, s hodnotou, ktorá bola pôvodne prítomná v zrazeninách.

Pred každým trombolýzovým experimentom sa paviány premedikovali intravenóznym bolom ridogrelu, 3 mg/kg, na zabránenie ukladaniu doštičiek v extrakorporálnom systéme. Počas trombolytických experimentov sa podával intravenózne heparín ako 300 IU/kg bolu nasledovaný 200 IU/kg.h infúziou.

Dvanásť dospelých samcov paviánov /papio hamadryas/ sa náhodne umiestnilo pri základnej hodnote /týždeň 0/ na ošetrenie s 50 pg/kg SakSTAR /skupina 1/ alebo variantom M3.8 /skupina 2/, podávaných infúziou intravenózne počas jednej hodiny ako 10% bolus a základná trombolytická potencia sa hodnotila sledovaním vymiznutia rádioaktivity zo zrazenín za 2 hodiny. Paviány sa imunizovali subkutánne s 500 pg SakSTAR /skupina 1/ alebo variantom M3.8 /skupina 2/, suspendovanými v kompletnom Freundovom adjuvans v 2. týždni a v nekompletnom Freundovom adjuvans v 3. a 5. týždni. V 6 týždni sa trombolytická účinnosť kvantifikovala pomocou modelu extrakorporálnej trombolýzy počas 4 hodín: 3 zo 6 paviánov zo skupiny 1, ošetrených pri základnej hodnote a subkutánne imunizovaných so SakSTAR a 3 zo 6 paviánov zo skupiny 2, ošetrené pri základnej hodnote a následne imunizované s Μ3·δ, sa náhodne vybrali a podávalo sa im najskôr 50 pg/kg SakSTAR, irifendovaného intravenózne počas jednej hodiny s 10% bolom a potom po 2 hodinách od začiatku SakSTAR infúzie s rovnakým režimom M3.8 /skupiny 1A a 2A/· Iných náhradný list paviánov dostávalo rovnakú terapiu, ale v opačnou poradí; najskôr M3.8, potom SakSTAR /skupiny 1B a 2B pre paviány vopred imunizované so SakSTAR a Μ3·8/· V 18. týždni sa hodnotila trombolytická aktivita tretíkrát sledovaním vymizaiutia rádioaktivity z fibrínových zrazenín počas 3 hodín: 3 zo 6 paviánov imunizovaných so SakSTAR dostali 250 pg/kg SakSTAR ako intravenózny bolus počas 2,5 ^min /skupina 1A/, zatial čo 3 ďalšie paviány imunizované so SakSTAR dostali rovnaké množstvo M3.8 /skupina 1B/. Zo 6 paviánov imunizovaných s M3.8 dostali 3 intravenózny bolus 250 pg/kg SakSTAR /skupina 2A/ a 3 rovnaké množstvo Μ3·8 /skupina 2B/·

Krvné vzorky sa odobrali do citrátovaných skúmaviek /ko~.. nečná koncentrácia 0,01 M/ pri základnej hodno.te.a v. niekolkých parciálnej· časových bodoch potom na meranie aktivovanejktromboplastínovej doby /activared partial thromboplasti time ~ aPTTT/, í'ibrinogénu, oc^-antiplazmínu /na začiatku a na konci každého pokusu/ a SakSTAR“ a M3.8-neutralizačných aktivít /pred trombolytickou infúziou/. Preto boli zvyšujúce sa množstvá SakSTAR alebo M3.8 /50 pil objemy, obsahujúce 0,2 až 1000 pg/ml/ pridané k zmesi 300 pl citrátovanej íudskej plazmy a 50 pl tlmivého roztoku alebo testovanej plazmy paviánov s ihneÓ nasledujúcim prídavkom 100 pl zmesi trombínu /50 NIH U/ml/ a CaCl₂ /25 niM/. Meral sa čas lýzy plazmovej zrazeniny a vyniesol proti koncentrácii SakSTAR alebo M3.8. Z tejto krivky sa stanovila koncentrácia plazminogénového aktivátora, ktorá produkuje kompletnú lýzu zrazeniny za 20 min. Neutralizačná aktivita sa definovala ako rozdiel medzi hodnotami testovanej plazmy a tlmivého roztoku a bola vyjadrená v pg/ml plazmy.

Syntetický fibrinogén nebol degradovaný, ani nebol vytesnený cX^-antiplazmín, čo odráža celkovú fibrín-špecifitu obináhradný list dvoch Činidiel.

Od 6 týždňa boli SakSTAR-neutralizačné aktivity skupiny 1 významne vyššie ako M3.8-neutralizačné aktivity skupiny 2. Skupina 1 vyvíja neutralizačné aktivity rýchlejšie a výrazne významnejšie proti SakSTAR ako proti Μ3·8, zatiaľ čo M3.8-neutralizačné aktivity nikdy neprekračujú SakSTAR-neutralizačné aktivity v skupine 2 /tabuľka 4/· Od 8. týždňa skupina 1 vyvíja významne viac neutralizačných aktivít ako proti SakSTAR, tak aj proti M3.8 ako skupina 2 /tabuľka 4/.

Pri základnej hodnote indukuje 50 pg/kg SakSTAR infundovaného intravenózne počas 1 hodiny 77 + 2,9 % lyzy zrazeniny počas 2 hodín u 6 paviánov /skupina 1/ a 50 pg/-<g M3.8 indukuje 83 + 3,6 % lýzy zrazeniny počas 2 hodín u 6 iných paviánov, /skupina 2/ /priemer + SEM, p = 0,2/. Po 6 týždňoch klesá lytická účinnosí 50 pg/kg SakSTAR počas 2 hodín, infundovaného intravenózne počas 1 hodiny, na 9,2 + 1,0 %u 3 paviánov imunizovaných so SakSTAR /skupina 1A/ a na 8,5 ± 3,2 % u 3 paviánov imunizovaných s M3.8 /skupina 2A/, zatiaľ čo lytická účinnosľ 50 pg/kg intravenózneho M3.8 počas 2 hodín sa znižuje na 10 ± 6,9 % u 3 paviánov imunizovaných so SakSTAR /skupina 1B/ a na 11 ± 7_f4 % u 3 paviánov imunizovaných s M3.8 /skupina 2B/; p 4 0,001 versus príslušné základné lýzy pre všetky skupiny; p = NS medzi skupinami/. Eve hodiny pod začiatku prvej trombolytickej infúzie bolo 50 pg/kg iného činidla infundovaných intravenózne počas 1 hodiny za získania porovnateľných zvyškových lytických účinností : 7,7 + 1,5 % a 11 + 5,7 % lýzy zrazeniny počas 2 hodín s M3.8 v skupinách Ia a 2A, a 13 + 2,7 % a 12 + 2,1 % lyzy zrazeniny počas 2 hodín so SakSTAR v skupinách 1B a 2B.

náhradný list v . / Íl·'

O 18 týždňov poskytuje intravenoz-ä bolová injekcia 250 ;ug/kg SakSTAR 39 ± 5 >3 % lýzy zrazeniny počas 3 hodín u 3 paviánov imunizovaných so SakSTAR /skupina,1A/, zatiaí čo zvyšková trombolytická potencia 250 pg/kg M3.8 u 3 paviánov imunizovaných s M3.8 /skupina 2B/ bola významne väčšia: 68 + 4,5 % lýzy zrazeniny počas 3 hodín / p< 0,005/· 250 pg/kg SakSTAR produkuje 58 + 9,5 % lýzy zrazeniny počas 3 hodín u 3 paviánov imunizovaných s M3.8 /skupina 2Λ; p = 0,1 vs skupina 1A/, zatiaí čo lýza zrazeniny počas 3 hodín s- 250 pg/kg M3.8 u 3 paviánov imunizovaných SakSTAR /skupina 1B/ bola 39+3,6 % /p = 0,0005 vs skupina 2B/. Poolovaná analýza vzhíadom na činidlo podané 18. týždeň ukazuje zvyškovú lýzu v priebehu 3 hodín 39 + 3,0 % pre skupinu 1 imunizovanú so SakSTAR 'Versus 63 + 5,2 % pre skupinu 2 imunizovanú s M3.8 /p<0,0005/.

Trombolyticé potencie sú nepriamo úmerné v súlade s príslušnými neutralizačnými aktivitami počas štúdie /Spearman r = -0,83; P <0,0001/.

Takto je mutant M3.8 porovnatelne aktívny a fibrín-špecifický, ale významne menej antigénny ako pôvodný typ SakSTAR u paviánov, ako je zrejmé včaka menšej indukcii neutralizačných aktivít plazme a rýchlejšiemu znovuzískaniu trombolytického potenciálu po imunizácii. Tieto výsledky, získané u outbred primátov, potvrdzujú a nadväzujú na vyššie uvedené pozorovania u králikov.

Príklad 6

Porovnanie trombolytickej účinnosti a imunogenity M3.8 a Μ8·9 versus SakSTAR u pacientov s periférnou arteriálnou oklúziou

SakSTAR /n = 8/·Μ3·8 /n ?= 4/ ^; a Μ8·9 /n ^=: 4/ sa podali náhradný list intraarteriálne na alebo do proximálneho konca okluzívneho trombu ako bolus 2 mg nasledovaný infúziou 1 mg za h u pacientov s angiograficky dokumentovanou arteriálnou oklúziou periférnej artérie alebo bypassovým transplantátom. Pacienti sa študovali po vyslovení súhlasu a protokol sa realizoval podlá Human Studies Committee of University of Leuven. Kritériá oklúaie a exklúzie boli v pdstate také, ako sa popisuje predtým /46/ s tým rozdielom, že nasledovalo opätovné ošetrenie so skupinou rekombinantnej stafylokinázy počas 48 hodín. Konjuktívne antitrombotické ošetrenie s heparínom, aspirínom a orálnymi antikoagulantami sa uskutočnilo tak, ako sa popisuje predtým /46/·

Stav priechodnosti okludovanej periférnej artérie alebo bypassového transplantátu sa postupne hodnotil pred, aspoň každé 4 hodiny počas a na konci intraarteriálnej infúzie pôvodného typu alebo variantu . SakSTAR. Stav angiografickej priechodnosti cieľovej cievy na konci infúzie predstavuje hlavný konečný bod štúdie. Podanie trombolytického činidla sa ukončilo po dosiahnutí príslušnej priechodnosti cievy, keä si komplikácie vyžiadali prerušenie, alebo keô dva za sebou idúce angiogramy zlyhali pre demonštráciu progresie lýzy zrazeniny. Rekanalizácia sa definovala ako.lýza zrazeniny dostočná na obnovu živého anterograde toku predtým okludovaným segmentom. Komplementárne intravaskulárne postupy, ako je perkutánna transluminálna angioplastia /PTA/, sa uskutočnili, ke3 posudzovateľ vyhodnotil, že trombus bol dostatočne lýzovaný, alebo že sa neočakáva ôalšia trombolyza.

Krvný tlak a tep srdca sa sledoval pred, počas a po infúzii SakSTAR, M3.8 alebo M8.9· Krvné vzorky sa odoberali pred, na konci a 6 hodín po angiografickej procedúre. Merania zahŕňanáhradný list jú množstvo periférnej krvi, protombínový čas /PT/, aPTT, fibrinogén, o^-antiplazmín, plazminogén a biochemické testy pečeňovej a renálnej funkcie. SakSTAR-neutralizačná, M3.8-neutralizačná a M8.9-neutralizačná aktivita a anti-SakSTAR, anti-M3.8 a anti-M8.9 IgG a IgM sa postupne stanovili na krvných vzorkách odobratých počas hospitalizácie a po prepustení. Klinické sledovania sa zamerali na opätovné vyskytnutie sa trombózy a na nežiadúce príhody, ako sú alergické reakcie a hlavne krvácanie /t.j. nutnosť krvnej transfúzie alebo chirurgickej kontrol; pokles hematokritu > 10 % alebo intrakraniálne krvácanie/.

Skupiny 4 až 8 .pacientov /4I až 73 rokov/ s angiograficky dokumentovanou PAO, s časom hodnotenia 1 až 120 dní a dĺžkou 8 až 50 cm, sa ošetrili s M3.8, Μ8·9 alebo SakSTAR· Jeden pacient /VZAL/, ktorý dostal pôvodný typ SakSTAR vyvinul anafylaktickú reakciu počas 5 min po podaní 2 mg bolu. Infúzia sa ihneó prerušila a krvný tlak sa vrátil na normál o 20 min v priebehu infúzie plazmových expandérov. Tento apacient nebol zahrnutý do výpočtu priemer ± SEK v tabuíkách 5 až 7. Jeden pacient /LAN/ dostal Μ8·9 a vyvinul reoklúziu po 30 h, kedy bol ošetrovaný 6,5 mg variantu. Tento pacient vyvíjal 17,8 pg/ml M8»9 neutralizačnú aktivitu a 270 }ig/ml špecifickú antiM8.9 IgG počas 2 až 3 týždňov.

Relevantné základné charakteristiky jednotlivých pacientov sú uvedené v tabulke 5. Väčšina PAO bola na femoropopliteálnej úrovni. Všetky boli spôsobené in situ trombózou. Zahrnuli sa dva transplantáty a 2 ilikiálne stent okúzie. 9 pacientov bolo prítomných s nekapacitačnou klaudikáciou, 2 s chronickou ischemickou bolesťou, 4 so subkutánnou a 1 s akútnou ischémiou.

náhradný list

Tabuľka zhŕňa individuálne výsledky ošetrení a výsledky. Intraarteriálna infúzia v dávke 5,5 θζ 13 mg počas 3,5 až 11 hodín vyvoláva kompletnú rekanalizáciu u 13 pacientov, parciálnu rekanalizáciu u 1 pacienta a žiadne zlepšenie u 1 pacienta Komplementárne andovaskulárne postupy /hlavne PTA/ sa uskutočnili u 12 a komplementárny chirurgicky zákrok ihneä po trombolýze u 1 pacienta. Opätovný výskyt trombózy sa objavil u 4 pa«^ cientov: prvý pacient bol úspjsne znovu ošetrený po 30 h so 6,5 mg Μ8·9, druhý podstúpil aortabi-iliakálnu bypassovú transplantáciu, tretí pacient bol úspešne rekanalizovaný počas 20 h so 40 mg .rt-PA a trombus sa odsal transluminálne u štvrtého pacienta. Komplikácie s krvácaním neboli prítomné, alebo boli obmedzené na strednú až miernu tvorbu hematómu v miestach angiografickej punktúry, s výnimkou jedného pacienta, ktorý vyvinul hematóm v pravom štvorhlavom svale. Iné komplikácie, spojené s endovaskulárnymi manipuláciami, zahŕňajú distálnu embolizáciu a arteriálnu disekciu ukončili nevyhnutne trombolytickú infúziu u jedného pacienta. Jedna superficiálna femorálna oklúzia sa javila rezistentná k 8,0 mg SakSTAR infundovaného počas 6,0 h a bola následne použitá úspešne pri PTA /vič tabuľka 6/.

Hladiny cirkulujúceho fibrinogénu, plazminogénu a c<₂“ antiplazmínu zostávajú nezmenené počas infúzie SakSTAR skupín /tabuľka 7/, čo odráža absolútnu fibrínovú špecifitu týchto činidiel v použitých dávkach, podstatné in vivo štiepenie fibrínu sa objavuje, ako je zrejmé, pri zvýšení hladín D-diméru. Intraarteriálna heparínová terapia predlžuje aPTT /tabuľka 7/.

S protilátkou spojená SakSTAR-, Μ3·8- a M8.9-neutralizačná aktivita a anti-SakSTAR-, Μ3·8- a M8.9-§pecifické IgG boli náhradný list nízke pri základnej hodnote a počas prvého týždňa po infúzii /tabulka 8/. Od druhého týždňa sa hladiny neutralizačnej aktivity zvyšujú na stredné hodnoty 2,9 pg a 3,3 pg SakSTAR variantov neutralizovaných na ml plazmy v pacientoch ošetrených s Μ3·8 a Μ8·9, čo jeýyznamne nižšie ako stredná hodnota 9,1 pg/ pôvodného typu SakSTAR neutralizovaného na ml v pacientoch ošetrených so SakSTAR /p - 0,03 pre varianty vs pôvodný typ podlá Mann-Whitney rank sum test/. Hladiny SakSTAR-špecifického IgG sa zyvšujú na stredné hodnoty 51 až 31 pg/ml plazmy v pacientoch ošetrených s M3.8 a M8-9, čo je významne nižšia ako priemerná hodnota 240 pg/ml v pacientoch ošetrených so Sak_jSTAR /p = 0,01 pre varianty vs pôvodný typ podlá MannWhitney rahk sum test/.

U pacientov s periférnou arteriálnou oklúziou dostávajúcich dávky 5,5 až 13 mg zlúčeniny indukujú M3.8 a Μ8·9 významne menej neutralizačných protilátok a špecifického antistafylokinázóvého IgG ako SakSTAR· Tieto varianty poskytujú dôkaz koncejptu, že redukcia humorálnej odpovede proti rekombinantnej stafylokináze . proteínovým inžinierstvom je uskutočnitelná.

prehíad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 : Proteínová sekvencie pôvodného typu stafylokinázy, SakSTAR· Číslovanie začína s ΝΗ,,-koncovou aminokyselinou zrelej celej dĺžky stafýlokinázy. Nabitý-z^¹^. ^k alanínu varianty, ktoré sa študovali, sú označené.

Obr. 2 : Schematická reprezentácia epitopovej špecifity panelu 17 myších monoklonálnych protilátok zvýšených proti

SakSTAR· náhradný list

N xo tí tí o -H

C O <—I r—I OJ >> tí 'H

O CD r-H -P Λ: _W

O -P a C co -tí -P

O 3 ή ä

d) Λί tí _3 w— r-1

I -C

N Ολ

O '>» P ®Q

	CD
X-.·	C
>.	:
P
C	CO
CD
P	3
>®	P.
c	>5
O -P
„X	3
XP	Θ
C Xľ
>o	a
CD Ό
	o
O	>
o <O
CG	P.
05

ω tí >N xi o tí í> o K

Λ o P XO r-H •H •P

O tí P.

CD

W

X) CD Eh

náhradný list

s<o
'>> P.	<0
C ' ro cn	x;
o	o
> “
<o d	tí
Ρ,Ό	CC
A	>
co (5	©
	£·
o
£· r*>	o
Φ §*	«1
	x·
+3 S	a)
Φ o	Λ!
w
o #	©
•H £	P OJ
	r-í
Q. 2 XT	•H
_ Ή £	P
Xi «rt	O
o
ť C	P
S P -P Λ	Ό
4·1	-P
o v w	C
p ro-p	Φ
H «0	o
o w	ti
•H	Φ
rl j> E ai *1 m	P

Absorpcia ž percent je vyjadrená ako Epitopové zhluky sú ako v tabulke' 1 .

C3 d	u. ä	>P	O tí	ŕ*r o	o c	O —J	U3 c/·)	q		72
U >	o o	r;	CZ >	C3 >*	ej O	u; c-	VQ <	o >	5t P> P m, aj o	+1

náhradný list

Výsledky predstavujú priemer + SD z počtu pokusov uvedeného v zátvorkách.

Významné hladiny boli stanovené Stodentovým t-testom pre nepárové a párové hodnoty alebo Mann-Whitney rank sum testom podlá potreby

c. O	o c	0.003	•ä >8 Í3
C			I

	ňsi	X*» OQ	oc
*✓ <	+J		©c	V> 8	1
f-		-H	44	o	c
		cx	©c
	kO		c-í
Π
OQ

náhradný list

OJ ' -P C Φ o tí Φ £t ►*> tí •H, C Φ tSJ tí N

N '>> i—I v-> o o

T

V-J CN •H cs •n

I

Tabulka 3B: Imunigenita SakSTAR, M3.8 a M8.9 u králikov

OJ m C -xj ~ a

N •H CO H -p

CO tH tí > -P -H tí -P φ Λ' r! K ©O

-C >

Cť í CO -x n co

I

c.

xr Ó ^4 Ό Ó

CO o o ó

Ά í O

CN •s?

o

CO

eí S U

V7

XO -P

C Φ O ÍH

O

Q.

C •H c Φ N 05 tí

N

N

Ä

CO N •H CO rH P ω -H tí > -P -H tí -P Φ

C CD

c.

O *4 '>s -P 30

c.

Výsledky predstavujú priemer ± SD z počtu poku3ov uvedeného v zátvorkách. Štatisticky významné rozdiely boli stanovené Studento^n t-testom pre párované a nepárované hodnoty alebo Mann-Wtney rank sum testom poďla potreby.

náhradný list a CM

cm

CO C <—I •r4 >N

O a co ω

V) co

O

Tabuľka 4; Časový priebeh neutralizačných aktivít SakSTAR a M3.8 (v pg/ml) čas Ctýždne)_____________________

Podanie / 2 3 5 6 8 10 12 14 <J u

S q 3 S S^c‘

So

c c

« rS H v-i S

O

náhradný list

v.

d o •rH

N 'B rH A:

o

O

C i—I XD •H d

Φ -P d CO > o +> d ω •H

O CO

CL

Τ' •H P co •H d Φ -P ro d CO x: ω ra cn CD

S oo m ro x: o d φ d -p φ XD o

trx

CD Λ >H

X

CO A

Φ •rH d φ φ

P ·Η

O N d'3

Τ3 H o T

-d o

Λ

Φ<~> r» -H d

Φ •H d φ φ -P tH O N d V Ό rH

v, 04

za

H

V» VI •H v-.

r- cx

H O Ol

<-> Σ oc c-i

-H 4Z*. oc

O Λ	C
χ: .p	a <ς
	01 a
	ω
	xo
	d '0 Ό d
O Φ	Φ Ό
-P -H	f- Φ	<ς
U) N	P d	a M
Φ '3	CO -P	ω ω
•rH r—j	CO
S Λ.	'F'	XO 'CO
O	P XT	> >
	CD >	ra co
	d Cľ-	d d
	CVrH	P. CL

I d •Γ2 CD CO -H Q-> xj

V •H X P CL

OH (Λ d xo p co p ra o d p

	CO -P · CO rH · XJ •H a-H p d <n ro o Φ d d
co	-p ro o ·
•H	d d ä Ό.
esa	ra -p φ φ
d	<+Η d
φ	CD >ι·Η CL
P	d.q.o ·
d	O H Q 4->
ra	d x>1 -P 3
CL	o d d P.
>5	X Φ o G
x	O d CO CO

ro co	Ci
•Η ·Η	•H ·
o o	O XD
xo xo	XO
T-	X >
;H -H	•H NXP
X Ό	Ό · 0]
3 3	3X Φ
co ra	CO O rH
rH rH	H W O
	1·ΗΧ

no xo cm Ό o* vx vx

S Ľ. 22

• ·\ •P rH -P
d CL d	c
Φ W Φ	a
-p d -p	ω
x ro ra 2i d x.
- ·
5+3 <;	d
tj 4H	4-»
Q	CD
X	XO
>X0 >	>
® > CO	ra
Ej ω d	H
QAH a	P

c xo u:

CD d •H d Φ XJ '3 rH N oc

H

+i d CL

-P •H

a			C '
o			«4
P		<:	ω
o		Cm
d		ω	•
O		•	d
Θ		d	4-> <q
Φ	•	P?	ra Ph	a a^-
cp	<—1	0ÍL4		ω ω ¢)
	a	XO xo
'0	CD	XXD,	t> >	xo xo^.
>	d	»	a ro	> > ď
CC	co	cora	fc. d	ro ro
d	d	f-X	s>. a	HHO.
o	4->	PCL	•

FJ

CO •H d XD -P d CO

XO d XQ

Φ x c H O

• s	CD •H S
0 XD CO	XD
•H X m-t	X
CJ to 0	to
xo raxo	w
>' “H t‘	•rH ’
•H · mH	•
X 4-> X	Λ
3 3 3	<0
0 Λ co	.O
rH X rH	3
a 3 x ra	Ό	r*
— — V-\	r.	-H
V νΊ V*i	r-	íZ. v*.

Kp M Φ

rH	•
•	O CO	co X0
x	X CO-H ·	Ή toH
to	• ·Η O X	to Wto
M	Λ' Ofl 0	XD tXO X Λ
•H	κοΧΟΛ* w
	>3>.Η·Η	•H ·Η
CO	. >-<Hp	XO Λπζ>
d	N33 f	3 03
P	• 3coá	CO Xffl
'3'	X COM 0	rH 3H
Λ	tor-a X	x rase
CO	coás 3 •H CO

O O <xj — O xC C *C *O (x x2 <2

c: e

H

CO •H d XD 4-» d

CC

CO d rH XO d

C e φ <H

CD • d <—i xJ5 •H O •H <Η 'd

Φ

P.

CC

,4 φ •H d XL> -P d

CO +1 d

Φ

Θ

Φ •H •ra fn Φ CL d d 3 XD -p d XJ O O d CL o x>j é >

ω ♦H d φ d

O x:

o o

d Φ S Φ

CO +1 •H d

CL

o X

XD -P d d x ra

N Φ d náhradný list

3
a 3
-P	>>
W	A
O	>O
Q.	'3
•	P O
<P	X4
CO P’	N
p	Φ
hO
o •rH	CO
<h0	r-'· ·
rC0	xn
Φ	CO •H
Ή	P
O	-P
'CO Ai	HO
Ή	>
r—1	O
a	•—1
s	CO
o	>

C O v-» CO QQ CC

O O —

CN

CC

Φ XL> '5 r—I N

(0 H

L>

O Vh — v-i o

o’

O v*. _ vzi rt —

CN	v*.	o o
	r-’	CO CN

V”> V*k rΓ*· V“ — sc

Ή

3C

X

CO r—i

CO > O χυ co P o a

-p w o C a 3

-p in o

Ό

Γ3 Φ C Φ N 'C

Φ S x>

o

•8 •Λ

ro •H •P ω

CD	S
r~1		M
P.		ω
O
•H		+ 1
Už
C		P
CO		φ
		a
CO		φ
P		•H
r—1		P
HO		a
P
•H		-P
a		φ
3 ,		XJ
i—1		o
m		a
C
CO	•	>
P	c
-P	a	φ
1	P
CO.	-P	a
P	P
P		HU
HO	<n	-P
P		3
3	CO	P
Λ-	•rH	P
P	a	XI
Φ	CO	CO
a	P	tsa
1	φ	φ
c	-P	P
£	-<	* +

náhradný list

C5

O

- (N t/» VN vtO Ή

ΓΊ Ό

ΓΊ CC XC V» ΤΓ T£?cx Ξ c-Ί e\

Tabulka 7: Koagulácia pr.ed.a po podaní M3.8, M8.9 alebo SakSTAR

ω

C

Ή

P ľSŽ

Φ

KJ r—i tSJ v> o γί γί c

γί r“.

ΓΊ

C ο ο ct «ί S S ?=j Ό CN ΓΊ Xi

C ϋ

ο

Ο*

Ο Q

ΓΊ V χ ο 04 04 • χ·

r* r* ä ÔC cx χ

o ^c x· vi

Cx o H X*

•H fct

Q.

ο ο η ο csi Μ η m cn όι -Η ©Ο γί

q o4

ΓΊ O g 03 4d C\C\2oJr

CX

Ό o o r* cx cx rM ^4 cx w cx c4 44

Ό Cx

O x· 04 o vj *ί c\ « cx 04 “«4 o* cc xo ΧΞ xc Cl 2 x* ΓΊ X-’ xl JQ

04 —· VX ©ei O x* γί r*i r*] jtl

C cx aä +1 íd Φ S Φ •H td fX ri o o'

Q O r*

r*

CO <N C ^88SoS8|| ^v V v ν'⁰ v vi gj r* «

CO CC ·— x cx x

o c o c

- κ o o n oi r t rí v

C -r xS ©o vx 04 r*\ ΓΊ ΓΊ

r: VI J

Cx

O O c

cx

O v, vo - v Ό CX ZC CX ©o cx O* vx

CO

v. c

CX

~ « “í

04 ΓΊΙ

O 04 VJ

ΓΊ 04

+ c.

p u párovaného Študentovho testu

Na výpočet priemeru neboli, <» a^-^ vzaté do úvahy nezahrnuté na výpočet priemer + SEM náhradný list

Tabaí>a 8: Neutralizačné aktivity a špecifické IgG v plazme pacientov liečených s M3.8, Iví3,9 alebo SakSTAR- (-14.12.95) neutr.aktivit^jigÄnl) ípedfiddlgG protilátky(pgM)

Noitraliza&ikaktivita

>N			,_ § o o o o í r- n C 1/1 « <N — — CM XT
P	vn q “ — m — r*» cn	•T — CM	S «[ -r o Ξ nr — Ό	.28« r* cn c.	o 2 o 0 0 _ 0 — m w m . 2 t —» · — m 'p —
Φ
G
Ό
>N			0S0O--OOO o^ovnSívnooco — CM — CM m cm
rn-p	c —. — r* V rj ** 10	— — C\ ~ ΓΊ T C\ —	§23°	<s22n	r~ - =í cn e. ό 2 2
I ω
Ie
Ό
>N C\J '>5 -P	Ό n T 1Λ C\	CN C-S	0800,-000 m —Π 2 — — r*· — ^·<ν - cm n cs	§ 3 -S		8§8σΓ'·Γ°Ξ
N
XS l »t>	— q oa	MS «Τ ,	Γ* ΤΓ vn yj fN OO m —·	— ΓΊ O	» cm m ,	CA C\ pM. q « CM »o
cn cd —	vi n —	\3 $0 CMQ	1 n ri H	<Ν «Ί CN	r^vn^cocn — cn —
•P
rH .	<N <5 CM —.	o co _ o	vnqnrqqqosm	q r* q O	Vn Γζ CN CN	rn — q q q O cn q
X	v ó rí cm	—· cn — mt	S n v r ri νη cm ri	~ Ó ri -4	—' cm wň	w ri c\ v ri v v ύ

'CO lit '>>.ť

V Ό	q q q q r* c —· en	4 O q q nr C\ ô	vnQ»oVnqoen«	q q q q CN O CN —	q 0 q CM ~ —	cNOcNoqqqq ~ v es vi 6 rí cm n
M íl· a Ό X<1 -P	q q q q	q vn vn q	50 g r. q q ei q		q	q q q	q q q q	— r< p^. c q q q 0
vn ó ó -T?	x· -r r*’ ó		r-^	vn	Ó CM C	vd vň c\ ·	“ N- cN —.’ 0 \0 CM cn
ΙΦ c >Cm	a q 0 q	q O c q	cn 0 ό 0 q — 0		q	q q q	q q q q	cNvnvnCqqqo
CM'>5	CO Ó O CN	cm cn — C	- ® v 0 ~ v		nr	ô O cn	cn xr « vn	— 'h o cm ó vi cm v
•P 1 ’φ Ό r- >N	- M O .	O cn 0	vn vn — po q q q CM CM - . · · .	c		O vn cn	O q O	qc q C vn C
‘ '>5	* Ó Ó O	6 ó ó *	• · <n ^n <*n ť^*>	0		0 0 0	O CN O _..	c 0 0 c ó ó 0 0

•P

CO v*. vn O O O O o o o c: o o o o

náhradný list

Tabuľka 8: Neutralizačná aktivita a špecifický IgG v plazme pacientov liečených s M3.8, M8.9 alebo SakSTAR (14.12.95);- pokrač.

(⁺)opätovné ošetrenie po 30 •hod. ⁺⁺) liečenie prerušené po bolu

náhradný list

Odkazy:

1. collen D: On the regulation and control of fibrinolysis. Edward Kowalski Memoriál Lecture.. Thromb Haemostas 43: 77-79, 1980.

2. Collen D, Lijnen HR: Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombolysis. Blood 78: 3114-3124,

1991.

3. Collen D, Van de Werf F: Coronary thrombolysis with recombinant staphylokinase in patients with evolving myocardial infarction. Circulation 87: 1850-1853, 1993.

4. Vanderschueren S, Collen D: Immunogeniciteit van streptokinase en implicaties voor gebruik. Tijdschr Geneesk 50: 1639-1644, 1994.

5. ' Lack CH: .Staphylokinase: an activator of plasma protease. Náture 161: 559, 1948.

6. Lewis JH, Ferguson JH: A proteolytic enzýme systém of the blood. III. Activation of dog sérum profibrinolysin by staphylokinase. Am J Physiol 166: 594, 1951.

7. Winkler KC, DeWaart J, Grootsen C, Zegers BJM, Tellier NF, Vertegt CD: Lysogenic conversion of staphylococci to loss of beta-toxin. J Gen Microbiol 39: 321, 1965.

8. Collen D, Lijnen HR: Staphylokinase, a fibrinspecific plasminogen activator with therapeutic potential ? Blood 84: 680-686,1994.

9. Sako T, Sawaki S, Sakurai T, Ito S, Yoshizawa Y, Kondo I: Cloning and expression of the náhradný list staphylokinase gene of Staphylococcus aureus in Escherichia coli. Molec Gen Genet 190: 271-277, 1983.

10. Behnke D, Gerlach D: Cloning and expression in Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Streptococcus sanguis of a gene for staphylokinase a bacterial plasminogen activator. Molec Gen Genet 210: 528-534, 1987.

11. Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR: Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokinase. Fibrinolysis 6: 203-213,

1992.

12. Sako T: Overproduction of staphylokinase in ..Escherichia coli and its characterization. Eur J

Biochem 149: 557-563, 1985.

. 13 < · Gerlach. D, Kraft R, Behnke D: Purification and . characterization of the bacterial plasminogen activator staphylokinase secreted by a recombinant bacillus subtilis. Zbi Bakt Mikr Hyg 269: 314,--322

1988.

14. Sako T, Tsuchida N: Nucleotide sequence of the staphylokinase gene from Staphylococcus aureus. Nucleic Acids Res 11: 7679-7693, 1983.

15. Collen D, Zhao ZA, Holvoet P, Marynen P: Primary structure and gene structure of staphylokinase. Fibrinolysis 6: 226-231, 1992.

16. Schlott B, Hartmann M, Gíihrs KH, Birch-Hirschfeld E, Gase A, Vetterman S, Collen D, Lijnen HR: Functional properties of recombinant staphylokinase variants obtained by site-specific nutagenesis of methionine26. Biochim Biophys Acta 1204: 235-242, 1994.

náhradný list

17. sakai M, Watanuki M, Matsuo O: Mechanism of fibrínspecific fibrinolysis by staphylokinase: participation of a₂-plasmin inhibitor. Biochem Biophys Res Comm 162: 830-837, 1989.

18. Matsuo O, Okada K, Fukao H, Tomioka Y, Ueshima S, Watanuki M,. Sakai M: Thrombolytic properties of staphylokinase. Blood 76: 925-929, 1990.

19. Lijnen HR, Van Hoef B, De Cock F, Okada K, Ueshima

S, Matsuo 0, Collen D: On the mechanism of fibrinspecific plasminogen activation by staphylokinase. J •Biol Chem 266: 11826-11832, 1991.

20. Lijnen HR, Van Hoef B, Matsuo 0, Collen D: On the nolecular interactions between plasminogenstaphylokinase, a₂-antiplasmin and fibrin. Biochim

r. Biophys Acta 1118: 144-148, 1992.

21. Silence K, Collen D, Lijnen HR: Interactiori between staphylokinase, plasmin(ogen) and a₂-antiplasrain. Recycling of staphylokinase after neutralization of the plasmin-staphylokinase complex by a₂-antiplasmin. J Biol Chem 268: 9811-9816, 1993.

22. Silence K, Collen D, Lijnen HR: Regulation by a₂antiplasmin and fibrin of the activation of plasminogen with recombinant staphylokinase in plasma. Blood 82: 1175-1183, 1993.

23. Collen D, De Cock F, Vanlinthout I, Declerck PJ, Lijnen HR, Stassen JM: Comparative thrombolytic and immunogenic properties of staphylokinase and streptokinase. Fibrinolysis 6: 232-242, 1992.

24. Collen D, De Cock F, Stassen JM: Comparative immunogenicity and thrombolytic properties toward arterial and venous thrombi of streptokinase and náhradný list recombinant staphylokinase in baboons. Circulation 87: 996-1006, 1993.

25. Schlott B, Hartmann M, Gtihrs KH, Birch-Hirschfeid E, í

Pohl HD, Vanderschueren S, Van de Werf F, Michoel A, . : : Collen D, Behnke D: High yield production and purifiéation of recombinant staphylokinase for

,..thrombolytic therapy. Bio/technology 12: 185-189, 1994 .

26. Declerck PJ, Vanderschueren S, Billiet J, Moreau H, . . Collen D: Prevalence and induction of circulating

- .antibodies against recombinant staphylokinase.

. Thromb Haemostas 71: 129-133, 1994.

27. Vanderschueren SMF, Stassen JM, Collen D: On the .-. / . immunogenicity of recombinant staphylokinase in patients and in animal nodels. Thromb Haemostas 72: 297-301, 1994.

28. White H: Thrombolytic treatment for recurrent myocardial infarction. Br Med J 302: 429-430, 1991.

29.. Gase A, Hartmann M, Gíihrs KH, Rocker A, Collen D, Behnke D, Schlott B: Functional significance of NH₂and COOH-terminal regions of staphylokinase in plasminogen activation. Subraitted.

30. Galfré G, Milstein C: Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol 73: 3-46, 1981.

31. de St. Groth SF, Scheidegger D: Production of monoclonal antibodies: strategies and tactics. J Immunol Methods 35: 1-21, 1980.

32. Nakane PK, Kawaoi A: Peroxidase-labeled antibody. A new method for conjugation. J Histochem Cytochem 22: 1084-1091, 1974.

náhradný list

33. Anderson N, Potter M: Induction of plasma celí tumours in Balb-c mice with 2, 6, 10, 14 tetramethylpentadecane (pristane). Náture 222: 994995, 1969.

34. Ey PL, Prowse SJ, Jenkin CR: Isolation of pure IgGj, IgG_2a and IgG_2b immunoglobulins from mouse sérum using proteín A-Sepharose. Immunochemistry 15: 429-436, 1978.

35. Jonsson U, Malmgvist M: Reál tiine biospecific interaction analysis. The integration of surface plasmon resonance detection, generál biospecific interface chemistry and microfluidics into one analytical systém. Adv Biosensors 2: 291-336, 1992.

36. Johnsson B, Lofas S, Lindguist G: Immobilization of

- proteins to a carboxymethyldextran-modified gold • surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Anál Biochem 198: 268-277, 1991.

37. BIAcore systém inanual, 5-2, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden.

38. Karlsson R, Michaelsson A, Mattsson L: Kinetic analysis of nonoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical systém. J Immunol Methods 145: 229-240, 1991.

. x

39. Stanssens P, Opsomer C, McKeown Y, Kramer W, Zabeau M, Friz MJ: Efficient oligonucleotide-directed construction of mutations in expression vectors by the gapped duplex DNA method using alternating selectable markers. Nucleic Acids Res 17: 4441-4454,

1989.

náhradný list

40. Deutsch DG, Mertz ET: Plasminogen: purifícation from human plasma by affinity chromatography. Science 170: 1095-1096, 1970.

41. Silence K, Hartmann M, Gíihrs KH, Gase A, Schlott B, Collen D, Lijnen HR: Structure-function relationships in staphylokinase as revealed by clustered-charge-to-alanine mutagenesis. J Biol Chem (in press).

42. Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anál Biochem 72: 248, 1976.

43. De Clerck F, Beetens J, de Chaffoy de Courcelles D, Freyne E, Janssen PA: R68070: thromboxane A2 synthetase inhibition and thromboxane A2/prostaglandin endoperoxide receptor blockade combined in one molecule. I. Biochemical profile in vitro. Thromb Haeinost 61: 3 5-42, 1989.

44. Stassen JM, Vanlinthout I, Lijnen HR, Collen D: A hamster pulmonary embolism model for the evaluation of the thrombolytic and pharmacokinetic properties of thrombolytic agents. Fibrinolysis 4 (Suppl 2): 15-21, 1990.

45. Giles AR: Guidelines for the use of animals in biomedical research. Thromb Haemost 58: 1078-1084, 1987.

46. Vanderschueren S, Stockx L, Wilms G, Lacroix H, Verhaeghe R, Vermylen J, Collen D: Thrombolytic therapy of peripheral arterial occlusion with recombinant staphylokinase. Circulation 92: 20502057, 1995.

náhradný list

47. Vanderschueren S, Barrios L, Kerdsinchai P, Van den Heuvel P, Hermans L, Vrolix M, De Man F, Benit E, Muyldermans L, Collen D, Van de Werf F: A randomized trial of recombinant staphylokinase versus alteplase for coronary artery patency in acute myocardial infarction. Circulation 92: 2044-2049, 1995.

náhradný list

Claims (18)

1. Stafylokinázové deriváty preukazujúce zníženú imunogenitu v porovnaní s pôvodným typom stafylokinázy.

2. stafylokinázové deriváty podlá nároku 1, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu pôvodného typu stafylokinázy alebo jej modifikovaných verzií, kde ale aspoň jeden imunodominantný epitop je eliminovaný bez narušenia biologickej aktivity derivátov.

3. stafylokinázové deriváty pódia nároku 1, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 1, v ktorej jedna alebo viac aminokyselín v jednom alebo viacerých podčiarknutých zhlukoch bolo nahradených inou aminokyselinou a takto je porušený príslušný epitop(y).

4. Stafylokinázové deriváty pódia nároku 3, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 1, v ktorej jedna alebo viac aminokyselín v jednom alebo viacerých podčiarknutých zhlukoch bolo nahradených alanínom a takto je porušený príslušný epitop(y).

5. stafylokinázové deriváty pódia nároku 1, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 1, v ktorej jedna alebo viac aminokyselín bolo nahradených alanínom a takto je’ redukovaná reaktivita derivátov s panelom monoklonálnych protilátok riadených k epitopovému zhluku 1.

6. Stafylokinázové deriváty pódia nároku 1, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 1, v ktorej jedna alebo viac aminokyselín bolo nahradených alaní- náhradný list nom a takto je redukovaná reaktivita derivátov s panelom monoklonálnych .protilátok riadených k epitopovému zhluku III.

7. Stafylokinázové deriváty podlá nároku 1, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 1, v ktorej jedna alebo viac aminokyselín bolo nahradených alanínom a takto je redukovaná reaktivita derivátov s panelmi I a III monoklonálnych protilátok.

8. Stafylokinázový derivát M8, majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Lys v polohe 74, Glu v polohe 75, Arg v polohe 77 v podčiarknutom zhluku ..Q boli nahradené alanínom a takto zmenený príslušný epitop.

9. Stafylokinázový derivát M3, majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Lys v polohe 35 a Glu polohe 38 v podčiarknutom zhluku 3 boli nahradené alanínom a takto zmenený príslušný epitop.

10. Stafylokinázový derivát M9, .m^úci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Glu v polohe 80 a Asp v polohe 82 v podčiarknutom zhluku 9 boli nahradené alanínom a takto zmenený príslušný epitop.

, I

11. Stafylokinázový derivát M3·8,.majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Lys v polohe 35, Glu v polohe 38, Lys v polohe 74, Glu v polohe 75 a Arg v polohe 77 v podčiarknutých zhlukoch 3 a 8 boli nahradené alanínom a takto zmenený príslušný epitop.

12· Stafylokinázový derivát Μ8·9, majúci aminokyselinovú náhradný list sekvenciu uvedenú na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny,· Lys v polohe 74, Glu v polohe 75, Arg v polohe 77, Glu v polohe 80 a Asp v polohe 82 v podčiarknutých zhlukoch 8 a 9 boli nahradené ala/nínom a takto zmenený príslušný epitop.

13· Spôsob produkcie derivátov stafylokinázy podlá nároku. 1, vyznačujúci sa t y m , že zahŕňa stupne:

a. príprava fragmentu DNA, obsahujúceho aspoň časť kódujúcej sekvencie stafylokinázy, ktorá poskytuje jej biologickú aktivitu;

b. uskutočnenie in vitro miestne riadenej mutagenézy fragmentu DNA za účelom nahradenia jedného alebo viacerých kodónov pôvodného typu aminokyselín kodónom pre čalšiu aminokyselinu;

c. klonovanie mutovaného fragmentu DNA vo vhodnom vektore;

d. transformovanie alebo transfektovanie vhodnej hostitelskej bunky vektorom a

e. kultivácia hostitelskej bunky za podmienok vhodných na expresiu fragmentu DNA·

14. spôsob podlá nároku 13, vyznačujúci sa t y m , že fragment DNA je 453—bp EcoRI-HindlIT fragment plazmidu pMEX6O2SAK, in vitro miestne riadená mutagenéza sa uskutočňuje oligonukleotidovo riadeným mutagenézovým systémom za použitia plazmidu pMA/c a opraveného deficientného kmeňa E· coli WKóMutS, mutovaný fragment DNA je exprimovaný v kmeni E· coli WK6·

15. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň jeden zo stafylokinázových derivátov podlá nároku 1 spolu š vhodnou prísadou.

16· Farmaceutická kompozícia podlá nároku 15 na liečenie arteriálnej trombózy.

zmenený list

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Stafylokinázové deriváty preukazujúce zníženú imunogenitu. v porovnaní s pôvodným typom stafýlokinázy.

2· Stafylokinázové deriváty podlá nároku 1, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu pôvodného typu stafýlokinázy alebo jej modifikovaných verzií, kde ale aspoň jeden imunodominantný epitop je eliminovaný bez narušenia biologickej aktivity derivátov.

3. Stafylokinázové deriváty podlá nároku 1 alebo 2, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 1, v ktorej jedna alebo viac aminokyselín v jednom alebo viacerých podčiarknutých zhlukoch bolo nahradených inou aminokyselinou a takto je porušený príslušný epitop(y).

4. Stafylokinázové deriváty podlá nároku 3, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 1, v ktorej jedna alebo viac aminokyselín v jednom alebo viacerých podčiarknutých zhlukoch bolo nahradených alahínom a takto porušený príslušný epitop(y) .

5. Stafylokinázové deriváty podlá nároku 1 až 4.$ majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 1, v ktorej jedna alebo viac aminokyselín bolo nahradených alanínom a takto je redukovaná reaktivita derivátov s panelom monoklonálnych protilátok, zahŕňajúcich napríklad protilátky 17G11, 26A2, 30A2, 2B12 a 3G10, riadených k epitopovému zhlut·;· ku I.

zmenený list

6. Stafylokinázové deriváty podía ktoréhokolvek z nárokov

1 až 4, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 1, v ktorej jedna alebo viac aminokyselín bolo nahradených alanínom a takto je redukovaná reaktivita derivátov s panelom monoklonálnych protilátok, zahŕňajúcich napríklad protilátky 7H11, 25E1, 40C8, 24C4 a 1A10, riadených k epitopovému zhluku III.

7. Stafylokinázové deriváty podía ktoréhokolvek z nárokov 1 až 4, majúce v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 1, v ktorej jedna alebo viac aminokyselín bolo nahradených alanínom a takto je redukovaná reaktivita derivátov s panelmi monoklonálnych protilátok riadených k epitopovým zhlukom I a III·

8. Stafylokinázovy derivát M8, majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Lys v polohe 74, Glu v polohe 75 a Arg v polohe 77 v podčiarknutom zhluku 8 boli nahradené .alanínom a takto zmenený príslušný epitop.

9. Stafylokinázovy derivát L£3, majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Lys v polohe 35 a Glu v polohe 38 v podčiarknutom zhluku 3 boli nahradené alanínom a takto zmenený príslušný epitop.

10. Stafylokinázovy derivát M9, majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Glu v polohe 80 a Asp v polohe 82 v podčiarknutom zhluku 9 boli nahradené alanínom a takto zmenený 'príslušný epitop.

11. Stafylokinázovy derivát M3.8, majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Lys v po- zmenený list lohe 35, Glu v polohe 38, Lys v polohe 74, Glu v polohe 75 a Arg v polohe 77 v podčiarknutých zhlukoch 3 a 8 boli nahradené alanínom a takto zmenený príslušný epitop.

12· Stafylokinázový derivát Ή8·9, majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1, v ktorej aminokyseliny Lys v polohe 74, Glu v polohe 75, Arg v polohe 77. Glu v polohe 80 a Asp v polohe 82 v podčiarknutých zhlukoch 8 a 9 boli nahradené alanínom a takto zmenený príslušný epitop.

13. Spôsob produkcie derivátov stafylokinázy pódia ktoréhokolvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa stupne:

a. príprava fragmentu DNA, obsahujúceho aspoň časí kódujúcej sekvencie stafylokinázy, ktorá poskytuje jej biologickú aktivitu;

b. uskutočnenie in vitro miestne riadenej mutagenézy fragmentu DNA za účelom nahradenia jedného alebo viacerých kodónov pôvodného typu aminokyselín kodónom pre áalšiu aminokyselinu;

c. klonovanie mutovaného fragmentu DNA vo vhodnom vektore;

d. transformovanie alebo transfektovanie vhodnej hostiteískej bunky vektorom a

e. kultivácia hostiteískej bunky za podmienok vhodných na expresip fragmentu DNA·

14. Spôsob podía nároku I3, vyznačujúci satý m , že fragment DNA je 453 bp EcoRl-fíindITT fragment plazmidu pMEX602SAK,ih vitro miestne -riadená mutagenéza sa uskutočňuje oligonukleotidovo riadeným mutagenézovým systémom za. použitia plazmidu pMA/c a opraveného deficientného kmeňa E« coli WKôMutS, mutovaný fragment DNA je exprimovaný v kmeni e« coli VK6.

zmenený list

15. Farmaceutická kompozícia, obsahujúca aspoň jeden zo stafylokinázových derivátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 spolu s vhodnou prísadou.

16. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 15 na liečenie arteriálnej trombózy.

17. Stafylokinázové deriváty podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na použitie pri liečení arteriálnej trombózy.

18. Použitie stafylokinázových derivátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie arteriálnej trombózy.