PL184348B1 - Nowe pochodne stafylokinazy, sposób ich wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie pochodnych - Google Patents
Nowe pochodne stafylokinazy, sposób ich wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie pochodnychInfo
- Publication number
- PL184348B1 PL184348B1 PL96321181A PL32118196A PL184348B1 PL 184348 B1 PL184348 B1 PL 184348B1 PL 96321181 A PL96321181 A PL 96321181A PL 32118196 A PL32118196 A PL 32118196A PL 184348 B1 PL184348 B1 PL 184348B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- staphylokinase
- sakstar
- alanine
- amino acid
- amino acids
- Prior art date
Links
- 101710145796 Staphylokinase Proteins 0.000 title claims abstract description 87
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 40
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 102100027731 Endogenous retrovirus group K member 16 Rec protein Human genes 0.000 claims description 75
- 101000580913 Homo sapiens Endogenous retrovirus group K member 16 Rec protein Proteins 0.000 claims description 75
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 10
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims 2
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 claims 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 claims 1
- 101000693530 Staphylococcus aureus Staphylokinase Proteins 0.000 description 153
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 47
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 44
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 42
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 32
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 29
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 28
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 24
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 20
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 13
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 13
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 11
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 10
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 10
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 206010022562 Intermittent claudication Diseases 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 8
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 8
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 208000024980 claudication Diseases 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 6
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 4
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 4
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 4
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 4
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 4
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 description 3
- 241001416181 Axis axis Species 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 3
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- 206010002329 Aneurysm Diseases 0.000 description 2
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- -1 pristan activated BALB Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- GLLPUTYLZIKEGF-HAVVHWLPSA-N ridogrel Chemical compound C=1C=CC(C(F)(F)F)=CC=1C(=N/OCCCCC(=O)O)\C1=CC=CN=C1 GLLPUTYLZIKEGF-HAVVHWLPSA-N 0.000 description 2
- 229950006674 ridogrel Drugs 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- SYIFFFHSXBNPMC-UWJYBYFXSA-N Ala-Ser-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N SYIFFFHSXBNPMC-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710125089 Bindin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010008531 Chills Diseases 0.000 description 1
- 208000001778 Coronary Occlusion Diseases 0.000 description 1
- 206010011086 Coronary artery occlusion Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 206010015958 Eye pain Diseases 0.000 description 1
- PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N Glu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OCJRHJZKGGSPRW-IUCAKERBSA-N Glu-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O OCJRHJZKGGSPRW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LSYFGBRDBIQYAQ-FHWLQOOXSA-N Glu-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LSYFGBRDBIQYAQ-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N Glu-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- CVFOYJJOZYYEPE-KBPBESRZSA-N Gly-Lys-Tyr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CVFOYJJOZYYEPE-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- BCSGDNGNHKBRRJ-ULQDDVLXSA-N His-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N BCSGDNGNHKBRRJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N Leu-Ser-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQCVMVCVPFYXHZ-SRVKXCTJSA-N Lys-Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN ZQCVMVCVPFYXHZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NCTDKZKNBDZDOL-GARJFASQSA-N Lys-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O NCTDKZKNBDZDOL-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- IMAKMJCBYCSMHM-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IMAKMJCBYCSMHM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QZONCCHVHCOBSK-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O QZONCCHVHCOBSK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N Lys-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- SQXZLVXQXWILKW-KKUMJFAQSA-N Lys-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SQXZLVXQXWILKW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VWFHWJGVLVZVIS-QXEWZRGKSA-N Met-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VWFHWJGVLVZVIS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100293593 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nar-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282515 Papio hamadryas Species 0.000 description 1
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061340 Peripheral embolism Diseases 0.000 description 1
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- WIVCOAKLPICYGY-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N WIVCOAKLPICYGY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N Phe-Pro Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- KLSOMAFWRISSNI-OSUNSFLBSA-N Pro-Ile-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KLSOMAFWRISSNI-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N Pro-Thr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- YHUBAXGAAYULJY-ULQDDVLXSA-N Pro-Tyr-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YHUBAXGAAYULJY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010038563 Reocclusion Diseases 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical group OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000194023 Streptococcus sanguinis Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- 229940111979 Thromboxane synthase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- OJCISMMNNUNNJA-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OJCISMMNNUNNJA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- YODDULVCGFQRFZ-ZKWXMUAHSA-N Val-Asp-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YODDULVCGFQRFZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- RKIGNDAHUOOIMJ-BQFCYCMXSA-N Val-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 RKIGNDAHUOOIMJ-BQFCYCMXSA-N 0.000 description 1
- ZXYPHBKIZLAQTL-QXEWZRGKSA-N Val-Pro-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N ZXYPHBKIZLAQTL-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N Val-Thr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 208000002223 abdominal aortic aneurysm Diseases 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000011374 additional therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003318 alteplase Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 208000007474 aortic aneurysm Diseases 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000009141 biological interaction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000002302 brachial artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 210000002816 gill Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021156 intermittent vascular claudication Diseases 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940099990 ogen Drugs 0.000 description 1
- 229940127216 oral anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000011240 pooled analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003137 popliteal artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000019 pro-fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010076197 prostaglandin endoperoxide receptor Proteins 0.000 description 1
- 201000005825 prostate adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011268 retreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108010073863 saruplase Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000004149 tartrazine Substances 0.000 description 1
- 229910052716 thallium Inorganic materials 0.000 description 1
- BKVIYDNLLOSFOA-UHFFFAOYSA-N thallium Chemical compound [Tl] BKVIYDNLLOSFOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003768 thromboxane synthase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000002465 tibial artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1 . Pochodne stafylokinazy wykazujace zmniejszona immunogennosc w porównaniu ze stafylokinaza typu dzikiego posiadajace sekwencje aminokwasowa jak przedstawiono na fi- gurze 1, w której jeden lub wiecej aminokwasów w jednym lub wiecej podkreslonym prze- dziale jest zastapionych przez alanine, niszczac w ten sposób odpowiedni(e) epitop(y). PL PL PL PL PL
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy nowych pochodnych stafylokinazy ze zmniejszoną immunogennością, ich wytwarzania i zastosowania w leczeniu zakrzepicy tętniczej i kompozycji farmaceutycznej do leczenia zakrzepicy tętniczej. Bardziej szczegółowo dotyczy zastosowania rekombinowanych pochodnych stafylokinazy do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej do leczenia zawału serca.
Powikłania zakrzepowe chorób układu sercowo-naczyniowego są główną przyczyną śmierci i inwalidztwa, więc konsekwentnie leczenie trombolityczne (tj. farmakologiczne rozpuszczenie skrzepliny) może korzystnie wpłynąć na wyniki leczenia takich zagrażających życiu chorób jak: zawał serca, zatorowość ośrodkowego układu nerwowego i zakrzepica żylna. Czynniki trombolityczne są aktywatorami plazminogenu, powodującymi konwersję plazminogenu, nieaktywnego proenzymu układu fibrynolitycznego krwi, do plazminy, enzymu proteolitycznego. Plazmina rozpuszcza fibrynę w skrzeplinie, lecz również powoduje degradację prawidłowych komponentów układu homeostazy i indukuje tzw. „stan lityczny”. Fizjologiczna fibrynoliza jest ukierunkowana na fibrynę, jest to wynik swoistych cząsteczkowych interakcji między tkankowym aktywatorem plazminogenu, fibryną, plazminą/plazminogenem i o^-antypla^niiną (1, 2).
Obecnie dopuszczonych do stosowania klinicznego u pacjentów z ostrym zawałem serca, lub w trakcie badań klinicznych jest sześć związków trombolitycznych. Obejmują one streptokinazę, urokinazę, rekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu lub jego pochodne, kompleks aktywatora strepto-kinazowego plazminogenu (APSAC), rekombinowany urokinazowy (jednołańcuchowy) aktywator plazminogenu (rscu-PA, rekombinowana prourokinaza) i rekombinowana stafylokinaza (Sak) (2,3). U pacjentów z zawałem serca zmniejszenie obszaru zawału, ochrona funkcji komór i zmniejszenie śmiertelności było obserwowane po leczeniu zarówno streptokinazą, rt-PA ,jak i APSAC (2).
Jednym ze stosowanych obecnie rutynowo w leczeniu związków trombolitycznych jest streptokinaza, białko o masie cząsteczkowej 45000 wydzielane przez streptokoki β-hemolizujące. Niemniej jej podanie wiąże się ze znacznym spadkiem poziomu fibrynogenu całkowitego i jego aktywność trombolityczna w naczyniach wieńcowych u pacjentów z rozwijającym się
184 348 zawałem serca jest ograniczona, obliczana na około 50% rekanalizacji tętnicy wieńcowej w ciągu 90 min. (2). Ponadto ekspozycja na streptokinazę wywołuje reakcje alergiczne u około 5% leczonych pacjentów i z reguły wywołuje powstanie swoistych przeciwciał, które uniemożliwiająjej powtórne zastosowanie w przeciągu miesięcy lub lat (4).
Stafylokinaza, białko produkowane przez określone szczepy gronkowca złocistego (Stafylococcus aureus), którego właściwości profibrynolityczne wykazywane są od ponad 4 dekad (5-7), jak się również wydaje może stać się potencjalnym związkiem trombolityczym u pacjentów z ostrym zawałem serca (8). Gen stafylokinazy został sklonowany z bakteriofagów sak0c (9) i sak42D (10) tak samo jak z genomowego DNA (sakSTAR) lizogennych szczepów gronkowca złocistego (11). Był ekspresjonowany pod kontrolą promotora X PR i jego własnego sygnału translacyjnego w Escherichia coli, jak również pod kontroląjego naturalnego promotora i sygnału translacyjnego w Bacillus subtilis lub w Escherichia coli, powodując gromadzenie się produktu tego genu odpowiednio w przestrzeni periplazmatycznej albo w pożywce hodowlanej (10-13).
Gen stafylokinazy koduje białko składające się z 163 aminokwasów, z aminokwasem 28 odpowiadającym N-końcowej reszcie dojrzałej stafylokinazy pełnej długości (10, 14, 15). Sekwencja białkowa odmiany typu dzikiego SakSTAR (15) jest przedstawiona na figurze 1. Znaleziono w regionach kodujących jedynie 4 nukleotydy różniące geny sak0c, sak42D i SakSTAR, jeden z nich tworzy niemą mutację (10, 14, 15).
Wiele postaci cząsteczkowych stafylokinazy zostało oczyszczonych z nieco innąMr (16,500 do 18,000 w SDS-PAGE) i punktami izoelektrycznymi (11-13). Pochodne dojrzałej o niższej Mr zostało otrzymane jako pozbawione 6 (Sak-A6) i 10 (Sak-Δ 10) N-końcowych aminokwasów. Podczas oddziaływania z plazminą(ogenem) w środowisku buforowym, dojrzała stafylo kinaza (N-końcowe Ser-Ser-Ser) jest szybko i ilościowo konwertowana do Sak-ΔΚ) (N-końcowe Lys-Gly-Asp-). Wykazano, że dojrzała stafylokinaza i Sak-ΔΚ) posiadają tą samą aktywność fibrynolityczną (11, 12).
Kluczową wagę dla aktywacji plazminogenu przez stafylokinazę posiada aminokwas w pozycji 26. Istotnie, wymiana unikalnej reszty Met w pozycji 26 czy to na Arg czy Val powoduje utratę funkcjonalnej aktywności, podczas gdy wymiana na Leu czy Cys wykazuje mały wpływ lub nie ma wpływu na aktywność. Ponieważ żadna z wymian pojedynczych aminokwasów nie powoduje znaczących zmian w strukturze roztworu zmutowanych białek, mechanizm tych odmiennych zachowań aktywności pozostaje nieznany.
W środowisku osocza stafylokinaza jest zdolna do rozpuszczenia skrzepu fibryny bez jednoczesnej degradacji fibrynogenu (17-19). Ta swoistość stafylokinazy w stosunku do fibrynyjest wynikiem zmniejszonego blokowania przez 02-antyplazminę kompleksu plazmina-stafylokinaza związanego z fibryną, odzyskanie stafylokinazy z kompleksu plazmina-stafylokinaza następuje po zablokowaniu przez c^-antyplazminę, 02-antyplazmina zapobiega konwersji krążącego plazminogenu stafylokinaza do plazminy stafylokinazy (20-22). W wielu eksperymentalnych modelach zwierzęcych stafylokinaza jest porównywalna do streptokinazy w rozpuszczaniu pełnej krwi lub skrzepów osocza, ale znacznie bardziej skuteczna w rozpuszczaniu skrzepów bogatych w płytki lub skrzepów obkurczonych.
Zachęcające wyniki uzyskane ze stafylokinazą w zwierzęcych modelach zakrzepicy, są podstawą do rozwoju tego zagadnienia na skalę badań pilotowych, u pacjentów ze świeżym zawałem serca (3,25). U 4 z 5 pacjentów ze świeżym zawałem serca podanie 10 mg stafylokinazy rekombinowanej dożylnie w ciągu 30 min. spowodowało udowodnioną angiograficznie rekanalizację w ciągu 40 minut. Poziomy fibrynogenu i c^-antyplazminy w osoczu były niezmienione (poziomy końcowe wynosiły 90-95% poziomów wyjściowych) i nie obserwowano reakcji alergicznych. W drugiej serii 5 pacjentów z ostrym zamknięciem naczynia wieńcowego, dożylne podanie 10 mg stafylokinazy (SakSTAR) przez 30 min spowodowało rekanalizację u wszystkich pacjentów w ciągu 20 min., bez towarzyszącej degradacji fibrynogenu. Kontrolna angiografia w 24 godzinie wykazała, że rekanalizacja była trwała.
Immunogenność stafylokinazy (SakSTAR) w porównaniu ze streptokinaząbyła badana na psach i orangutanach. W sumie te dane eksperymentalne sugerują, że immunogenność stafyloki184 348 nazyjest niższa niż streptokinazy. Jakkolwiek, u 5 pierwszych pacjentów z ostrym zawałem serca po podaniu dożylnym 30 minutowego wlewu 10 mg stafylokinazy przez 30 min. Miana przeciwciał neutralizujących przeciwko stafylokinazie (SakSTAR) były niskie na początku i przez 6 dni po wlewie, to wysokie miana przeciwciał (miano neutralizujące stafylokinazę wynosi 12-42 pg/ml osocza) zgodnie występowały 14-35 dnia. Te obserwacje zostały w pełni potwierdzone w drugim badaniu pilotowym na 5 pacjentach. Tak więc w stosunku do immunogenności wstępne obserwacje u ludzi nie są tak zachęcające jak na modelach zwierzęcych. Tak więc podobnie jak podanie streptokinazy, podanie stafylokinazy będzie ograniczone do pojedynczego użycia. Jednak, ze względu na brak krzyżowej reaktywności w indukowaniu powstawania przeciwciał przeciwko streptokinazie i stafylokinazie sugeruje się, że podawanie obydwu substancji nie będzie wzajemnie wykluczające.
Wewnętrzna immunogenność streptokinazy i stafylokinazy w jasny sposób przeszkadza w ich nieograniczonym użyciu. Nie tylko pacjenci z wcześniej istniejącym wysokim poziomem przeciwciał będą oporni na efekt trombolityczny tych związków, ale mogą występować uboczne efekty alergiczne i okazjonalne zagrażające życiu odczyny anafilaktyczne (28). Ponieważ zarówno streptokinazajak i stafylokinaza sąbiałkami heterologicznymi nie jest oczywiste, że ich immunogenność może zostać zmniejszona metodami rekombinacji białek. Istotnie nie odnotowano zakończonych sukcesem prób wytworzenia fragmentów streptokinazy o niskiej masie cząsteczkowej. W stafylokinazie delecja N-końcowych 17 aminokwasów lub C-końcowych 2 aminokwasów inaktywuje cząsteczkę, która dodatkowo jest bardzo wrażliwa na inaktywację przez kierowaną mutagenezę (25, 29).
Niemniej jednak znaleźliśmy, co było zaskoczeniem, że wariant SakSTAR stafylokinazy typu dzikiego (8,15) zawiera trzy nie nakładające się epitopy immunodominuj ace i przynajmniej dwa z nich mogą być usunięte poprzez kierowaną mutagenezę bez inaktywacji cząsteczki. Te rekombinowane warianty stafylokinazy są mniej reaktywne z przeciwciałami wywołanymi u pacjenta leczonego stafylokinazątypu dzikiego i są one mniej immunogenne niż stafylokinaza typu dzikiego, co wykazano na królikach i orangutanach jak również u pacjentów z ob\vodowym zamknięciem tętnic.
Tak więc przedmiotem niniejszego wynalazku jest wykazanie, że pochodne stafylokinazy wykazujązmniejszonąimmunogenność w porównaniu ze stafylokinazątypu dzikiego. Pochodne stafylokinazy posiadają zasadniczo sekwencję stafylokinazy typu dzikiego lub jej zmodyfikowaną wersję, przynajmniej jeden z epitopów immunodominujacych został usunięty bez zniszczenia aktywności biologicznej tych pochodnych. W wykonaniu wynalazku pochodne posiadajązasadniczo sekwencję takąjak pokazano na figurze 1, w której jeden lub więcej aminokwasów w jednym lub więcej podkreślonym przedziale został zamieniony przez inny aminokwas co zmieniło odpowiednie) epitop(y). Korzystnie aminokwasy wymieniono na alaninę. Przez zmianę epitopu(ów) jest zmniejszona reaktywność pochodnych z panelem przeciwciał monoklonalnych kierowanych do jednego lub więcej przedziałów epitopu I, II lub III. Wskazuje to, że wymiana aminokwasów typu dzikiego na alaninę powoduje zmniejszenie antygenowości stafylokinazy.
Szczególnie wynalazek dotyczy pochodnej stafylokinazy M8 posiadającej sekwencję aminokwasowąj ak na figurze 1, w której aminokwasy Lys w pozycj i 74, Glu w pozycj i 75 i Arg w pozycji 77 w podkreślonym przedziale 8 są wymienione na alaninę co zmienia odpowiedni epitop; pochodnej stafylokinazy M3 posiadającej sekwencję aminokwasową jak na figurze 1, w której aminokwasy Lys w pozycji 35, Glu w pozycji 38 w podkreślonym przedziale 3 są wymienione na alaninę co zmienia odpowiedni epitop; pochodnej stafylokinazy M9 posiadającej sekwencję aminokwasową jak na figurze 1, w której aminokwasy Glu w pozycji 80 i Asp w pozycji 82 w podkreślonym przedziale 9 są wymienione na alaninę co zmienia odpowiedni epitop; pochodnej stafylokinazy M3.8 posiadającej sekwencję aminokwasowąjak na figurze 1, w której aminokwasy Lys w pozycji 35, Glu w pozycji 38, Lys w pozycji 74, Glu w pozycji 75 i Arg w pozycji 77 w podkreślonym przedziale 3 i 8 są wymienione na alaninę co zmienia odpowiedni epitop; pochodnej stafylokinazy M8.9 posiadającej sekwencję aminokwasową jak na figurze 1, w której aminokwasy Lys w pozycji 74, Glu w pozycji 75, Arg w pozycji 77, Glu w pozycji 80 i Asp w po6
184 348 zycji 82 w podkreślonym przedziale 8 i 9 są wymienione na alaninę co zmienia odpowiedni epitop. Tak więc M3.8 i M8.9 są podwójnymi mutantami posiadającymi dwa zniszczone epitopy.
Wynalazek wykazuje, że rekombinowane warianty stafylokinazy ze zmniejszoną immunogennością mogą być praktyczną alternatywą związku trombolitycznego dla streptokinazy i stafylokinazy typu dzikiego.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania pochodnych według wynalazku przez przygotowanie fragmentu DNA zawierającego przynajmniej część sekwencji kodującej stafylokinazę odpowiedzialnej za jej aktywność biologiczną; przeprowadzenia in vitro kierowanej mutagenezy fragmentu DNA przez wymianę jednego lub więcej kodonów aminokwasów typu dzikiego na kodon innego aminokwasu; klonowania zmutowanego fragmentu DNA w odpowiednim wektorze; transformowania lub transfekowania wektorem odpowiedniej komórki gospodarza; hodowania komórki gospodarza w warunkach odpowiednich do ekspresji fragmentu DNA. Korzystnie fragmentem DNA jest fragment 453 bp EcoRIHind plazmidu pMEX602SAK, kierowaną mutagenezę in vitro przeprowadzono w systemie mutagenezy kierowanej oligonukleotydem przy użyciu plazmidu pMa/c i szczepu WK6Muts E. coli niezdolnego do naprawy, zmutowany fragment DNA klonowano w szczepie WK6 E. coli.
Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej obejmującej przynajmniej jedną z pochodnych stafylokinazy według wynalazku łącznie z odpowiedniazaróbką do leczenia zakrzepicy tętniczej. Kompozycje farmaceutyczne zawierające jako aktywne składniki mniej immunogenne warianty stafylokinazy do leczenia zakrzepicy tętniczej w praktyce lekarskiej i weterynaryjnej mogą występować w postaci proszków lub roztworów i mogąbyć używane do podawania dożylnego lub dotętniczego. Takie kompozycje mogą być wytwarzane przez połączenie (np. mieszanie, rozpuszczanie itd.) aktywnych związków z farmaceutycznie dopuszczalną, neutralną zaróbką (taką, jak rozpuszczalniki wodne i niewodne, stabilizatory, emulgatory, detergenty, dodatki) i następnie jeśli jest to konieczne z barwnikami. Stężenie aktywnego składnika w kompozycji terapeutycznej może się wahać szeroko między 0,1% a 100% zależnie od charakteru schorzenia i sposobu podawania. Następnie dawka podawanego aktywnego składnika może być różna i waha się między 0,05 a 1,0 mg na kg wagi ciała.
Dalej wynalazek dotyczy zastosowania pochodnych stafylokinazy w leczeniu zakrzepicy tętniczej, szczególnie zawału serca i zastosowania pochodnych stafylokinazy w wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznej do leczenia zakrzepicy tętniczej, szczególnie zawału serca.
Powyżej i poniżej terminy „pochodne”, „mutanty” i „warianty” będą używane wymiennie.
Niniejszy wynalazek wykaże bardziej szczegółowo w następujących przykładach, że nie jest zamiarem ograniczanie zasięgu wynalazku.
W oparciu o niniejszy wynalazek wiele wariantów i ulepszeń stanie się oczywiste dla fachowców. Tak więc jest możliwa przypadkowa mutageneza rozpoczynająca się od kombinacji mutanta 3.8 i od kombinacji mutanta 8.9, która może spowodować powstanie alternatywnych mutantów ze zmniejszoną immunogenności^ i zwiększoną aktywnością, podczas gdy alternatywna mutageneza przedziału epitopu neutralizującego może dostarczyć innych wariantów ze zmniejszoną mutagennością.
Przykład 1. Mapowanie epitopu stafylokinazy typu dzikiego.
Swoistość epitopową panelu 17 mysich przeciwciał monoklonalnych wywołanych przeciwko stafylokinazie typu dzikiego (odmiana sakSTAR) określono przez analizę oddziaływań biologicznych w czasie rzeczywistym (BIA) stosując urządzenie BIA-core™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Szwecja). Przeciwciała monoklonalne przeciwko SakSTAR wytworzono zasadniczo metodą Galfre i Milsteina (30). Myszy BALB/c immunizowano przez podskórne wstrzyknięcie 10 pg SakSTAR w kompletnym adiuwancie Freunda, a następnie w dwa tygodnie później przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 10 pg SakSTAR w niekompletnym adiuwancie Freunda. Po odstępie czasu co najmniej 6 tygodni, myszom podano dawkę przypominającądootrzewnowolO pg SakSTAR w roztworze soli w 4 i 2 dniu przed fuzją komórek. Splenocyty izolowano i poddawano fuzji z komórkami szpiczaka P3X63-Ag.8-6.5.3 (otrzymanymi od Dr O. Schoenherr’a, Organon, Oss, Holandia) według metody Fazekas de St. Groth i Scheidegger (31).
184 348
Po selekcji na pożywce z hipoksantyną, aminopteryną i tymidyną, nadsącze badano przesiewowo na wytwarzanie swoistych przeciwciał niekompetytywnym testem micro-ELISA stosując płytki do mikromiareczkowania opłaszczone stafylokinazą. Związane immunoglobuliny wykrywano króliczym przeciwciałem przeciwko mysim Ig sprzęgniętym z peroksydazą chrzanową (HP) (32). Klony pozytywne zastosowano do wytwarzania płynu wysiękowego u myszy BALB/c aktywowanych pristanem. Frakcję IgG mysich przeciwciał monoklanalnych oczyszczono przez chromatografię powinowactwa na Sepharozie-białku A.
Ta technika analizy bioswoistych oddziaływań, oparta na powierzchniowym rezonansie plazmowym (SPR), umożliwia bezpośredni pomiar oddziaływań w czasie rzeczywistym, bez stosowania znaczników (35). Stafylokinazę (SakSTAR) unieruchomiono na powierzchni układu scalonego Sensor Chip CM5 stosując zestaw Aminę Coupling (Pharmacia Biosensor AB), według zaleceń producenta. Ta procedura wiązała pierwszorzędowe grupy aminowe ligandu z powierzcłhuąkarboksymetylowanego dekstranu układu wykrywającego (36). Unieruchomienie wykonano stosując roztwory białka w stężeniu 10 pg/ml w 10 mM octanie sodu w pH 5,0, przy przepływie 5 pl/minutę w ciągu 6 minut. Spowodowało to związanie kowalencyjne 1000-1500 RU (jednostek rezonansowych) cząsteczek stafylokinazy (odpowiadających około 0,07 pmolom/mm2) (37). Drugi składnik oddziaływania (substancja badana, tj. przeciwciało monoklonalne) wstrzyknięto do roztworu nad czujnikiem. Stężenie wolnej substancji badanej utrzymywano na stałym poziomie podczas ciągłego przepływu roztworu przy 20°C nad powierzchnią czujnika. Co najmniej cztery stężenia każdej substancji badanej (zakres 0-400 nM albo 0-50 pM) w 10 mM HEPES, 3,4 mM EDTA, 0,15 M NaCl i 0,005% surfaktancie P20, pH 7,2, wstrzyknięto przy przepływie 5 pl/minutę w ciągu 6 minut w fazie wiązania. Następnie próbkę zastępowano buforem, również przy przepływie 5 pl/minutę w ciągu 6-30 minut. Po każdym cyklu, powierzchnię czujnika regenerowano przez wstrzyknięcie 5 pl 15 mM HCl. Stosunek stałej wiązania (ka) do stałej dysocjacji (kdjss) otrzymano z sensorogramów jak to opisano szczegółowo gdzie indziej (38). Równowagę stałej wiązania (KA) obliczono jako stosunek kas do kdiss, dla wiązania stafylokinazy typu dzikiego z panelem 17 badanych przeciwciał monoklonalnych, w zakresie od 0,6 do 25 x 109 M'1 (wartość mediany 1010 M'1) (tabela 1).
W tabeli 1 kolumna zaznaczona jako „ID” oznacza różne pochodne stafylokinazy. Oznaczenia „17G11”, „26A2” itd. oznaczają przeciwciała monoklonalne wiążące się ze wskazanymi przedziałami epitopów I, II i III. W kolumnie „odmiana” zaznaczono zmutowane aminokwasy i ich pozycje w jednoliterowym kodzie aminokwasów. Przedział I epitopu rozpoznawany jest przez przeciwciała 17G11, 26A2, 30A2, 2B12 i 3G10, przedział II epitopu jest rozpoznawany przez przeciwciała 29C1,18F12,14H5,28H4,20D6,32B2 i 7F10, zaś przedział epitopu III przez przeciwciała 7H11, 25E1, 40C8, 24C4 i 1A10.
Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko oddzielnym epitopom będą się wiązały niezależnie od siebie, podczas gdy przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko epitopom blisko spokrewnionym będą zakłócały swoje wiązanie. Stąd, swoistość epitopowa panelu przeciwciał monoklonalnych jest określana najłatwiej przez badanie zdolności par przeciwciał monoklonalnych do równoczesnego wiązania antygenu. Analiza bioswoistego oddziaływania w czasie rzeczywistym (BIA) może być zastosowana do mierzenia wiązania kompetycyjnego par przeciwciał monoklonalnych ze stafylokinazą związaną z powierzchnią układu wykrywającego. Analizę przeprowadzono jak to opisano w „Application Note 101” (Pharmacia Biosensor AB). Sparowane badania wiązań podzieliły 17 przeciwciał na 3 grupy stanowiące 3 nie nakładające się epitopy na antygenie, jak to pokazano na Fig. 2. Niezależność tych epitopów potwierdzono przez pośrednie wykazanie addycyjnego wiązania przeciwciał monoklonalnych 26A2, 28H4 i 24C4. Przeciwciała uszeregowano według ich swoistości epitopowej jak to pokazano w tabeli 1.
Przykład 2. Konstruowanie i mapowanie epitopu odmian stafylokinazy „charged-cluster-to-alanine”.
Podczas przeczesywania metodą „charged-cluster-to-alanine” obiektem były przedziały naładowanych hydrofilowo aminokwasów. Stafylokinaza (SakSTAR) zawiera 45 naładowanych
184 348 aminokwasów (2 His, 14 Glu, 8 Asp, 1 Arg i 20 Lys). Te naładowane reszty mutagenizowano do Ala w przedziałach po dwa-trzy aminokwasy, jak to pokazano na fig. 1. Ogółem zaznaczono 21 mutantów, w których podkreślone naładowane aminokwasy zastąpiono alaniną. Aminokwasy zastępowane przez alaninę zaznaczono małą pionową linią w obrębie przedziału.
Mutanty wytworzono przez ukierunkowanąmutagenezę i ekspresjonowano w E. coli, jak to wyszczególniono poniżej. Enzymy restrykcyjne zakupiono w Pharmacia, Uppsala, Szwecja albo w Boehringer Mannheim (Mannheim, Niemcy). Ligazę DNA T4, fragment Klenowa polimerazy DNA I E. coli i fosfatazę alkaliczną zakupiono w Boehringer Mannheim. Układ mutagenezy kierowanej oligonukleotydem oraz plazmidy pMa/c uzyskano dzięki uprzejmości Corvas (Ghent, Belgia) (39). Wektor ekspresyjny pMEX602SakB został uprzejmie udostępniony przez Institut fur Molekulare Biotechnologie, Jena, Niemcy (25). Fagapomocniczego M123K07 zakupiono w Promega (Leiden, Holandia). Pożywkę Luria Broth zakupiono w Life Technologies (Merelbeke, Belgia). Plazminogen oczyszczono z ludzkiego osoczajak to opisano gdzie indziej - (40).
Reakcje enzymatyczne wykonano stosując warunki sugerowane przez dostawców. Plazmidowy DNA wyizolowano stosując protokół oczyszczania Qiagen (dostarczony przez Westburg, Leus-den, Holandia). Transformacje E. coli wykonano stosując procedurę z fosforanem wapnia. Sekwencjonowanie DNA wykonano stosując metodę reakcji przerywania łańcucha didezoksynukleotydami i urządzenie Automatic Laser Fluorescent A.L.F.™ (Pharmacia). Ukierunkowaną mutagenezę dla mutantów D5, K6 (M20) do K86,E88 (M10), wykonano stosując pMa/c, z użyciem niezdolnego do naprawy szczepu WK6MutS E. coli. Namnażanie plazmidów pMa/c albo pochodnych, wytwarzanie jednoniciowego DNA i ekspresję przeprowadzano w WK6 E. coli (39). Mutanty d93/K94 (Mil) do K134, K135, K136 (M19) skonstruowano w Institut fur Molekulare Biotechnologie Jena, Niemcy, jak to opisano uprzednio (16). Substrat chromogenny (S2403) chlorowodorek L-piroglutamylo-L-fenyloalanylo-L-lizynylo-P-nitroaniliny zakupiono w Chromogenix. Fibrynogen znakowany 1233 zakupiono w Amersnam.
Fragment EcoRI-HindUI wielkości 453 par zasad, zawierający cały region kodujący SakSTAR wycięto z plazmidu pMEX602SakB (oporności na ampicylinę) i klonowano w miejsce EcoRI-Hindlll plazmidu pMc5-8 (oporności na chloramfenikol), otrzymując' pMc-STAR. Do ukierunkowanej mutagenezy in vitro, jednoniciowy DNA tego konstruktu wytworzono przez transformację konstruktu pMc-STAR do E. coli i zakażenie całonocnej hodowli fagiem pomocniczym M13K07. Cztery godziny po zakażeniu, komórki izolowano z pożywki przez precypitację PEG i ekstrakcję fenolem-chloroformem. Następnie, jednoniciowy pMc-STAR hybrydyzowano z jednoniciowym wektorem pMa (FcoRl-Hindlll) z odpowiednim syntetycznym oligonukleotydem o 28-44 parach zasad, z mutacjami niemymi tworzącymi albo usuwającymi miejsce restrykcyjne. Reakcje wydłużania przeprowadzono przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA jak to opisano. Po transformacji E. coli WK6MutS i selekcji na ampicylinie, hodowano kolonie na membranach nitrocelulozowych, denaturowano in situ i hybrydyzowano DNA przez noc w temperaturze pokojowej z odpowiednim zmutowanym znakowanym radioaktywnie oligonukleotydem (1,5 x 108 cpm [y32P]-ATP zastosowano do znakowania kinazą polinukleotydową T4 20-30 ng oligonukleotydu). Filtry płukano w 42°C stosując roztwór zawierający 0,1 % SDS i 2 x SSC, 1 x SSC, 0,2 x SSC i 0,1 x SSC. DNA plazmidowy ekstrahowano z 10 ml hodowli bakterii każdego klonu pozytywnego i analizowano trawieniem enzymem restrykcyjnym. Pożądane mutacje potwierdzano przez sekwencjonowanie kompletnej sekwencji kodującej przy użyciu A.L.F.™.
Zmutowany fragment Hindlll-EcoRI ligowano z powrotem do wektora ekspresyjnego pMEX602SakB, zawierającego promotor pTaq (39). Zmutowane białka wytwarzano w postaci wewnątrzkomórkowej i rozpuszczalnej w E. coli WK6 transformowanych tym wektorem. Mutanty oczyszczano z sonikowanych ekstraktów bakteryjnych stosując chromatografię kationowymienną i oddziaływań hydrofobowych (25).
Mutanty SakSTAR uzyskano w ilościach rzędu 10 do 80 mg/l, co stanowiło od 15 do 88% materiału wyjściowego. Oczyszczony materiał był czysty, co potwierdzono przez elektroforezę na nie redukujących żelach o gradiencie 10-15% (nie pokazano). Analiza aminokwasów NH2-końco184 348 wych potwierdziła sekwencję Ser-Ser-Ser-Phe-Asp dojrzałego białka. Bardziej szczegółową charakteryzację biochemiczną tych mutantów stafylokinazy opisano gdzie indziej (41),
Stężenia białka określono metodą Bradforda (42). Aktywności fibrynolityczne roztworów SakSTAR określono w teście z substratem chromogennym przeprowadzonym w płytkach do mikro-miareczkowania z użyciem mieszaniny 80 μΐ roztworu SakSTAR i 100 gl roztworu Glu-plazminogenu (stężenie końcowe 0,5 mM). Po inkubacji przez 30 minut w 37°C, powstałąplazminę oznaczano ilościowo przez dodanie 30 gl S2403 (stężenie końcowe 1 μΜ) i pomiar absorbcji przy 405 nm. Aktywność wyrażano w jednostkach arbitralnych (HU) przez porównanie ze standardem wewnętrznym (seria STAN5), którego aktywność określono na 100000 HU/mg białka, jak to określono składem aminokwasowym (11). SDS-PAGE wykonano przy użyciu Phast System™ (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) stosując żele o gradiencie 10-15% i barwienie błękitem brylantowym Coomassie. Redukcję próbek wykonano przez ogrzanie w 100°C przez 3 minuty w obecności 1% SDS i 1% ditiotreitołu.
Konstrukcję, wytwarzanie i oczyszczanie mutantów M3.8 i M3.9 przeprowadzono, jak to opisano szczegółowo poniżej. Oligonukleotydy, zastosowane do konstruowania,
5'-ATAGCAAIOCArnTX3rGCACrATCAAC-3'(M3),
5'-CTAATTCAACn7\CAOCAAACGCT(XkArATGC'TGTC(jCATC-3' (M8) i
5'-TTTGCGCTTGGCGCCAATGCAACTACTCTAAACTCTTTATAT-3'(M9) zostały wykonane na zamówienie przez Pharmacia Biotech.
Do konstruowania mutanta M3.8, jednoniciowy pMc-STAR i fragment EcoRI-Hindlll pMa5-8 zastosowano do wytwarzania przerywanej dwuniciowej cząsteczki DNA, którą hybrydyzowano z syntetycznym oligonukleotydem M3 długości 28 zasad (zawierającym miejsce restrykcyjne Nsil). Reakcje wydłużania przeprowadzono przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA i ligazy, jak to opisano. Po przeniesieniu E. coli WK6MutS i selekcji na ampicylinie, 81 kolonii hodowano na membranach nitrocelulozowych, denaturowano in situ i hybrydyzowano DNA ze znakowanym radioaktywnie oligonukleotydem M3 (1,5x108 cpm [y^PJ-ATP zastosowano do znakowania kinazą polinukleotydową T4 20-30 ng oligonukleotydu). Filtry płukano w 42°C stosując roztwór zawierający 0,1% SDS i 2 x SSC, 1 x SSC, 0,2 x SSC i 0,1 x SSC. DNA z wyselekcjonowanego 1 klonu spośród 16 pozytywnych wytworzono ze 150 ml hodowli bakterii i analizowano trawieniem enzymem restrykcyjnym Nsil i Pvul. Mutację M3 (pMa-STAR3) potwierdzono przez sekwencjonowanie kompletnego regionu kodującego przy użyciu A.L.F.™.
Następnie jednoniciowy DNA wytworzono przez transformowanie pMa-STAR3 do E. coli, jak to opisano wyżej. Jednoniciowy pMa-STAR3 hybrydyzowano z pMc (EcoRI-Hindlll) i syntetycznym oligonukleotydem M8 długości 40 zasad, który zawierał miejsce restrykcyjne Ndel, jak opisano wyżej. Po transformacji E. coli WK6MutS i selekcji na chloramfenikolu, 100 kolonii pozytywnych hodowano na membranach nitrocelulozowych i hybrydyzowano ze znakowanym oligonukleotydem M8. Klony pozytywne (2 spośród 7) hodowano i analizowano trawieniem enzymami restrykcyjnymi (Nsil-Hindlll i Ndel) uzyskując jeden klon pozytywny. Podwójny mutant M3.8 ligowano z powrotem do wektora ekspresyjnego pMEX602SakB. Spośród 12 preparatów DNA, 6 wykazywało prawidłowy wzorzec restrykcyjny. Jeden z tych klonów (pMEXSakStar.M38) sekwencjonowano i zastosowano do wytwarzania zmutowanego M3.8 pod kontrolą promotora tac indukowalnego IPTG i dwóch sekwencji Shine-Dalgamo położonych tandemowo.
100 gl zawiesiny komórek E. coli WK6 transformowanych rekombinowanym plazmidem pMEXSakStar.M38 inkubowano w 100 ml pożywki LB (Gibco/BRL) zawierającej 100 gg/ml ampicyliny. Mieszaninę inkubowano przez noc w 37°C z wytrząsaniem przy 200 rpm, co dało gęstość komórkową rzędu 5 jednostek absorbcji przy 600 nm. Porcje po 20 ml przeniesiono do objętości po 2 litry (w 5-litrowych butelkach) pożywki LB zawierającej 100 gg/ml ampicyliny. Mieszaniny inkubowano przez 3 godziny w 37°C z wytrząsaniem, po czym dodano 200 gM IPTG w celu indukcji ekspresji M3.8, po czym pozostawiono na 4 godziny. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 4000 rpm przez 20 minut, zawieszono w 1/10 objętości 0,01 M buforu fosforanowego, pH 6,5 i zniszczono przez sonikację w 0°C. Resztki komórkowe usunięto przez
184 348 odwirowanie przez 30 minut przy 20000 rpm, zaś dadsącz przechowywano w -20°C do momentu zastosowania.
Połączone klarowne lizaty komórek (objętości 2 litrów) z 20-30 litrów hodowli bakterii doprowadzono do pH 5,9, sterylizowano przez flltrowadio przez filtr bartorius 0,22 pm i wprowadzono do kolumny 5 x 25 cd z bepCoroso bP, uwarunkowaną uprzednio 0,5 M NaOH i sterylizowanym 0,01 M buforem fosforanowym, przy przepływie 12 ml/minutę i 4°C, przy przepływie loDinaDyD. Kolumnę płukano 2-3 litrami buforu i elunwano grodionteD soli od 0 do 1 M w 500 ml i od 1 M do 2 M w 250 ml przy przepływie 10 ml/minutę w 4°C. Frakcje zawićrające M3.8, wykrytym przez bDb-PAGE, połączono (około 200 ml) i dializowano wobec 15 litrów sterylnego 0,01 M buforu fosforanowego, pH 8,0 w 4°C. Dializowany materiał odwirowano przy 4000 rpm przez 30 minut, ponownie sterylizowano przez filtrację i wprowadzono do kolumny 2,5 x 12 cm z bopharopy-Q, uwarunkowanej uprzednio 0,5 MNoOh i sterylizowanym 0,01 M buforem fosforanowym, pH 8,0 przy przepływie 3 ml/minutę w 4°C. Kolumnę płukano około 600 ml 0,01 M buforu nosnoradnwegn, pH 8,0 przy przepływie 8 ml/minutę i eluowαdo gradientem soli od 0 do 0,17 M w 30 ml, od 0,17 M do 0,2 M w 100 ml i od 0,2 M do 1,5 M w 200 ml, przy przepływie 4 ml/minutę. Frakcje zawierające M3.8, wykrytym przez bDb-PAGE, połączono, stężenie białka doprowadzono do 1 mg/ml po czym sterylizowano materiał przez filtrowanie przez filtr 0,22 pm Millipore. Trzy preparaty M3.8 dały 80 ± 25 mg czystego białka (średnia ± odchylenie standardowe aktywności właściwej 45000 ± 5200 HU/mg.
Do konstruowania mutanta M8.9, jeddodiciowy pMc-bTAR i fragment EcoRI-Hindlll pMa5-8 zastosowano do wytwarzania przerywanej dwudiciowej cząsteczki DNA, którąhybrydyzowadn z syntetycznym oligoeukleotydeD M9 długości 42 zasad, powiorającyD miejsce restrykcyjne Narl. Reakcje wydłużania przeprowadzono przy użyciu fragmentu KIćcowo pnliDerapy DNA i ligazy, jak to opisano. Po transformacji E. coli WK6Mutb i selekcji na ampicylinie, kolonie Codowodn na membranach nitrocelulnznwych, denaturowano in situ i hybrydypowunn DNA ze znakowanym rαdinoktywdie nlignnuklentydeD M9 (1,5 x 108 cpm [y32P]-ATP zastosowano do znakowania kinazą polinukleotydową T4 20-30 ng olignduklootydu). Filtry płukano w 42°C stosując roztwór zawierający 0,1% bDb i 2 x bbC, 1 x bbC, 0,2 x bbC i 0,1 x bbC. Wytworzono DNA z 2 wyselekcjonowanych kloców spośród 4 pozytywnych (pMa-btańt) i analizowano przez seknencjoenwadie kompletnego regionu kodującego z użyciem A.L.F™. Wstawkę EcoRI-Hiedlll z pMa-bTAR9 powtórnie ligowano do wektora ekspresyjnego pMEX602bakB. Kloty (58) przesiewano przez hybrydyzację in situ ze znakowanym radioaktywnie oligonuklootydeD M9 jako sondą. Jeden z klonów, pMEXbakbTAR.M9, charakteryzowano przez analizę sekwencji eukleotydowej i zastosowano do konstruowania mutanta M8.9.
W celu skonstruowania M8.9, wprowadzono mutację 8 do M9, przez reakcję łańcuchową pnliDerozy (PCR). PCR wykonano w objętości całkowitej 100 pl stosując 5 U enzymu i 1 pg każdego z poniższych starterów:
nllgnnuklentyd II - 5'-CAGGAAACAGAATTCAGGAG-3', olignnukleotyd III - 5' -TATATAATAATCGACATAGTATTCAATTTTT-3', ollgnnukleotyd IV -5'-TATCCCGGGCATCAGATGCGACAGCATATGCAGCGTTTGC
AGTA-3'i nligonuklootyd V - 5'-CAAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC-3'.
btężeeia dATP, dCTP, dGTP i dTTP wynosiły 200 pM. Dodaturację przeprowadzano przez minutę w 94°C, przyłączacie przez 2 minuty w 55°C i wydłużacie przez 1,5 minuty w 72°C. Po 30 cyklach próbki inkubowaco przez 10 minut w 72°C i schładzano do 4°C. W pierwszej reakcji PCR amplifikowano 2 cg pMEXbak-bTAR.M9 przy użyciu oligonukteotydu IV i V jako starterów. Aoplikoc PCR trawiono bmal i Hicdlll i oczyszczano po elektroforezie ca 1,5% żelu ogαrozonyD stosując zestaw Prep-A-Gene (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, UbA). Powstały fragment klocowano w miejsce SouI-HIcSI!! pUC18 (Pharmacia Biotech, Uppsala, bzwocja) stosując zestaw do szybkiej ligacji DNA (Boehricger MuccCoId). Po tracsfnrDacji komórek E. coli WK6, wytworzono DNa z 12 kolonii, z których wszystkie dawały fragment wielkości około 230 par zasad, po trawieniu EcoRI i Hiedlll. Jeden z tych DNA (pUC18-M89A) zastosowano do klocowania
184 348 drugiego produktu PCR (patrz niżej). Drugą reakcję PCR wykonano na 2 ng pMEXSakSTAR.M9, stosując oligonukleotyd II i III jako startery. Produkt reakcji PCR trawiono Sspl i EcoRI i dalej oczyszczano jak to opisano wyżej. Powstały fragment poddano ligacji w miejsce Smal-EcoRI pUCl 8-M89z\. Po transformacji w komórkach E. coli WK6, 6 klonów wyselekcjonowano do preparowania DNA. 5 spośród 6 wytworzonych klonów dawało fragment wielkości około 453 par zasad po trawieniu EcoRI i Hindlll. Fragment ten kodujący całego mutanta M8.9 klonowano w miejsce EcoRI-Hindlll wektora ekspresyjnego pMEX602SakB. Po transformacji komórek E. coli WK6, DNA z 6 kolonii analizowano przez trawienie EcoRI i Hindlll tworząc we wszystkich przypadkach fragment wielkości około 453 par zasad. Jeden z tych DNA dalej charakteryzowano analizą sekwencji nukleotydowej.
100 ml pożywki LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny inokulowano 100 pl zawiesiny E. coli WK6 transformowanych rekombinowanym plazmidem pMEXSakSTAR.M89. Hodowlę inkubowano przez noc w 37°C z wytrząsaniem przy 140 rpm, co dało gęstość komórkową rzędu 5 jednostek absorbcji przy 600 nm. Porcje po 4 ml przeniesiono do objętości po 2 litry (w karbowanych butelkach SL) pożywki „Terrific Broth” zawierającej 150 pg/ml ampicyliny. Hodowle inkubowano przez 20 godzin w 30°C z wytrząsaniem 140 rpm, co dało gęstość komórkową rzędu 4 xl09 komórek/ml. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 4000 rpm przez 20 minut, zawieszono w 1/5 objętości 0,01 M buforu fosforanowego, pH 6,5 i zniszczono przez sonikację w 0°C. Resztki komórkowe usunięto przez odwirowanie przez 30 minut przy 20000 rpm, zaś nadsącz przechowywano w -20°C do momentu zastosowania.
Połączone klarowne lizaty komórek (objętości 1800 mililitrów) doprowadzono do pH 5,9 i wprowadzono do kolumny 2,5 x 20 cm z Sepharose SP, uwarunkowaną uprzednio 0,5 M NaOH i świeżym 0,01 M buforem fosforanowym, 2,5 M NaCl pH 7,5, przy przepływie 2 ml/minutę i 4°C. Kolumnę płukano 500 pl buforu i eluowano gradientem soli od 0 do 1 M w 200 ml przy przepływie 6 ml/minutę.
Połączone frakcje zawierające M8.9, wykrytym przez SDS-PAGE, doprowadzono do 2,5 M NaCl w postaci stałej i poddano chromatografii oddziaływania hydrofobowego na kolumnie 2,5x20 cm fenylo-Sepharose, uwarunkowanej uprzednio 0,5 M NaOH i sterylizowanym 0,01 M buforem fosforanowym, pH 8,0 przy przepływie 3 ml/minutę w 4°C dializowano wobec 15 litrów sterylnego 0,01 M buforu fosforanowego, 2,5 M NaCl, pH 7,5 przy przepływie 2 ml/min, w 4°C. Kolumnę płukano około 500 ml i eluowano 0,01 M buforu fosforanowego, pH 6,5. Frakcje zawierające M8.9, wykrytym przez SDS-PAGE, połączono i dializowano wobec 2 litrów 0,01 M buforu fosforanowego, pH 9,0. Dializowany materiał odwirowano przy 4000 rpm przez 30 minut i wprowadzono do kolumny 1,6 x 5 cm z Sepharozy-Q, uwarunkowanej uprzednio 0,5 M NaOH i sterylizowanym 0,01 M buforem fosforanowym, pH 9,0 przy przepływie 2 ml/minutę w 4°C. Kolumnę płakano około 150 ml 0,01 M buforu fosforanowego, pH 9,0 i eluowano gradientem soli od 0 do 1 M w 100 ml, przy przepływie 4 ml/minutę. Frakcje zawierające M8.9, wykrytym przez SDS-PAGE:, połączono, stężenie białka doprowadzono do 1 mg/ml po czym sterylizowano materiał przez filtrowanie przez filtr 0,22 pm Millipore. Trzy preparaty M8.9 dały 73 ± 17 mg czystego białka o aktywności właściwej 51000 ± 3500 HU/mg.
Aktywności fibrynolityczne różnych mutantów SakSTAR oznaczono w teście z substratem chromogennym, jak to podsumowano w tabeli 1.
Spośród 21 mutantów, oznaczonych jak to pokazano na fig. 1, E99, E100 (M13) i E99, E100, E102 (M14) nie mogły być otrzymane w oczyszczonej postaci, podczas gdy K11, D13, D14 (M1), E46, K50 (M4) i E65, D69 (M7) były nieaktywne.
Szesnaście mutantów podsumowanych na tabeli 1 badano szczegółowo, wraz z SakSTAR typu dzikiego. Spośród tych mutantów D5, K6 (M20), K8, K10 (M21), D33, K35 (M2), K57, E58, K59 (M5), E61, E65 (M6), K86, E88 (M100, D93, K94 (M11), K96, K97, K98 (M12), E108, K109 (M15), D115, E118, H119 (M16), H119, K121 (M17), K130 (M18) i E134, K135, K136 (M19) reagowały z panelem przeciwciał monoklonalnych w sposób podobny do SakSTAR. Jednakże, K35, E38 (M3) i E80, d82 (M9) reagowały słabo z przedziałem przeciwciał 7H11, 25E1, 40C8, podczas gdy K74, E75, R77 (M8) reagowało słabo z przedziałem 26A2,
184 348
30a2, 2B12 i 3G10. Addytywność eliminacji epitopów ustalono przy użyciu mutantów K35, E38, K74, E75, R77 (M3.8) co łączyło zmniejszoną reaktywność z przeciwciałami monoklonalnymi dla obu cząsteczek macierzystych.
Przykład 3. Adsorbcja przeciwciałami wywołanymi u pacjentów traktowaniem SakSTAR stafylokinazy typu dzikiego i odmian „charged-cluster-to-alanine”.
W celu uzyskania informacji o swoistości epitopowej przeciwciał wywołanych u pacjentów z ostrym zawałem mięśnia serca, po leczeniu SakSTAR, próbki osocza 16 pacjentów adsorbowano w dwu-molamym nadmiarze (w odniesieniu do aktywności neutralizującej stafylokinazę) z pojedynczymi albo połączonymi mutantami „charged-cluster-to-alanine” przez 10 minut, po czym określano resztkowe wiązanie z SakSTAR przez analizę oddziaływań bioswoistych. Aktywność neutralizującą stafylokinazę w tych próbkach określano w poniższy sposób. Rosnące stężenia SakSTAR typu dzikiego albo jej odmian (objętości 50 fil zawierające od 0,2 do 1000 pg/ml) dodawano do mieszaniny 300 pl cytrynianowanego osocza ludzkiego i 50 pl buforu albo osocza badanego, po czym natychmiast dodawano 100 pl mieszaniny zawierającej trombinę (50 jednostek NIH/ml) i CaCl2 (25 mM). Mierzono czas rozkładu skrzepu osocza i wykreślano w stosunku do stężenia cząsteczek SakSTAR. Z tej krzywej określano stężenie aktywatora plazminogenu, które powodowało całkowitą lizę skrzepu w ciągu 20 minut. Miano neutralizujące określono jako różnicę pomiędzy wartościami osocza badanego i buforu i wyrażano w pg na ml próbki osocza.
Wyniki zebrano w tabeli 2. Podczas gdy SakSTAR adsorbowała ponad 90% przeciwciał wiążących ze wszystkich próbek, obserwowano niecałkowite wiązanie w przypadku mutantów K35, E38 (M3) u 4 pacjentów, K74, E75, R77 (M8) u 12 pacjentów i E80, D28 (M9) u 5 pacjentów. Adsorbcja z mutantami skojarzonymi K35, E38, k74, E75, R77 (M3.8) i K75, E75, R77, E80, D82 (M8.9) usuwała poniżej 90% przeciwciału 13 pacjentów (wartość mediany, odpowiednio, 68 i 65% spośród 16 pacjentów), podczas gdy, jak oczekiwano, mieszanina cząsteczek macierzystych mutantów skojarzonych (M8 i M3 albo M9) w powtarzalny sposób adsorbowała w nadmiarze 90% przeciwciał.
Przykład 4. Immunogenność odmian stafylokinazy „charged-cluster-to-alanine” u królików immunizowanych stafylokinazą typu dzikiego (SakSTAR), mutantów K35, E38 (M3), K74, E75, R77 (M8) i E80, D82 (M9) oraz mutantów skojarzonych K35, E38, K74, E75, R77 (M3.8) i K74, E75, R77, E80, D82 (M8.9).
Badano immunogenność porównawczą SakSTAR wobec każdego z mutantów SakSTAR M3, M8, M9, M3.8 i M8.9, po podskórnej immunizacji w grupach po 4 albo 8 królików otrzymujących SakSTAR albo po 8 królików otrzymujących każdą z odmian. Immunizację przeprowadzono przez wstrzyknięcie dożylne 400 pg/kg SakSTAR i 200 do 1000 pg/kg mutantów w tygodniu 0 (w celu określenia poziomu podstawowego zdolności lizy skrzepu) a następnie wstrzyknięcie podskórne 400 pg tego samego czynnika w tygodniu 2 oraz w kompletnym adiuwancie Freunda w tygodniach 3 i 5. Immunogenność mierzono w tygodniu 6 przez określenie aktywności neutralizującej stafylokinazę w osoczu i resztkową zdolność trombolitycznąjak to opisano niżej.
Pokrótce, aktywność neutralizującą stafylokinazę w osoczu określano przez dodanie rosnących stężeń SakSTAR typu dzikiego albo mutantów (objętości 50 pl zawierające od 0,2 do 1000 pg/ml) do mieszaniny 300 pl cytrynianowanego osocza ludzkiego i 50 pl bufora albo osocza królika, po czym dodawano natychmiast 100 pl mieszaniny zawierającej trombinę (50 jednostek NIH/ml) i CaCl2 (25 mM). Mierzono czas rozkładu skrzepu osocza i wykreślano w stosunku do stężenia cząsteczek SakSTAR. Z tej krzywej określano stężenie aktywatora plazminogenu, które powodowało całkowitą lizę skrzepu w ciągu 20 minut. Miano neutralizujące określono jako różnicę pomiędzy wartościami osocza badanego i buforu i wyrażano w pg na ml próbki osocza.
Właściwości trombolityczne badano z użyciem 0,3 ml ubogopłytkowych skrzepów osocza królików znakowanych 125I-fibryną, wprowadzonych do wyłonionych poza organizm pętli tętniczo-żylnych. Wyłonioną tętnicę udową cewnikowano cewnikiem French 4 (Portex White, Portex, Hythe, UK) i połączono przez dwie strzykawki z cewnikowaną żyłą brzegową ucha. Przepływ krwi przez pętlę pozaustrojową utrzymywano na poziomie 10 ml/minutę pompą pery184 348 staltyczną. Skrzepy osocza znakowane 125I wytworzono w każdej ze strzykawek włączonych do pętli. Skrzepy osocza wytworzono przez zmieszanie 0,3 ml ubogopłytkowego osocza ze śladową ilością(około 1,5 pCi) roztworu fibrynogenu ludzkiego znakowanego n5I (Amersham, Buckinghamshire, UK) i 0,07 ml mieszaniny trombiny bydlęcej (15 jednostek NIH/ml) i 0,5 M CaCh i inkubowano przez 30 minut w 37°C. 30 minut przed rozpoczęciem wstrzyknięcia podano 7,5 mg/kg ridogrelu (kombinacja inhibitora syntazy tromboksanu i antagonisty receptora endonadtlenku prostaglandyny) (43) w bolusie dożylnym w celu zapobieżenia odkładania płytek w pętli pozaustrojowej. Zwierzętom podano antykoagulant w postaci heparyny (300 jednostek/kg a następnie wlew ciągły 200 jednostek/kg/godzinę w czasie trwania doświadczenia) i losowo wyznaczono do grup otrzymujących 400 pg/kg SakSTAR (4 albo 8 królików) albo od 200 do 1000 pg/kg odmiany SakSTAR (8 królików). W tygodniu 6, połowę królików przydzielonych do grupy otrzymującej SakSTAR ponownie leczono tą samą odmianą SakSTAR, zaś drugą połowę SakSTAR typu dzikiego, podczas gdy króliki immunizowane SakSTAR leczono albo odmianą SakSTAR (jeżeli grupa składała się z 4 królików) albo rozdzielano je losowo do grupy otrzymującej odmianę SakSTAR albo SakSTAR typu dzikiego (jeżeli grupa kontrolna składała się z 8 królików). Czynnik trombolityczny podawano dożylnie 10% w postaci bolusa i 90% w postaci wlewu ciągłego w ciągu godziny. Przebieg w czasie lizy skrzepu śledzono ciągle przez zewnętrzny pomiar gamma, z użyciem kryształów jodku sodu/talu 3 x 0,5 cals (Bicron, Newbury, OH) umieszczonych nad pętlą pozaustrojową. Kryształy scyntylacyjne połączono z dedykowanym układem Canberra-S100 (Canberra-Packard, Meriden, CT) i analizowano dane jak to opisano gdzie indziej (44). Na zakończenie doświadczenia pobrano resztkowe skrzepy ze strzykawek, w celu określenia ich zawartości izotopu. Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono w oparciu o wytyczne American Physiological Society oraz International Committee on Thrombosis and Haemostasis (45).
Immunogenność SakSTAR oraz odpowiednich pojedynczych mutantów (M3, M8 i M9) porównano w tabeli 3A. Wyniki wyrażono jako średnią ± SD.
U 8 królików przydzielonych do grup otrzymujących zmutowaną M3 podstawowa aktywność neutralizująca wynosiła 0,0 ±0,6 pg/ml, zarówno wobec SakSTAR jak i wobec M3. Dożylna infuzja 200 pg/ml M3 wywołała 76 ± 23 procent lizy skrzepu. Te 8 królików było następnie immunizowanych M3, zwieszonym w 500 pl kompletnego adiuwantu Freunda w tygodniu 2 oraz w 500 pl niekompletnego adiuwantu Freunda w tygodniach 3 i 5. W tygodniu 6, aktywność neutralizująca osocza zwiększyła się do 11 ± 6,7 pg/ml wobec SakSTAR i 11 ± 7,2 pg/ml wobec M3. W tygodniu 6, wstrzyknięcie 400 pg SakSTAR 4 spośród tych królików, wybranym losowo, spowodowało 18 ± 27 procentową lizę skrzepu, podczas gdy wstrzyknięcie 200 pg/ml M3 4 innym królikom spowodowało 16 ± 17 procentową lizę. U 4 królików przydzielonych do grupy otrzymującej SakSTAR, podstawowy poziom aktywności neutralizacji wynosił 0,2 ± 0,2 pg/ml wobec SakSTAR i 0,0 ± 0,0 pg/ml wobec M3. Dożylna infuzja 400 pg/kg SakSTAR spowodowała 89 ± 8,6 procentową lizę podstawową. Te 4 króliki immunizowano następnie 400 pg SakSTAR zawieszonymi w 500 pg kompletnego (tydzień 2) albo niekompletnego (tydzień 3 i 5) adiuwantu Freunda.W tygodniu 6 aktywność neutralizująca osocza zwiększyła się do 35 ± 23 pg/ml wobec SakSTAR i 19 ± 13 pg/ml wobec M3. Dożylna infuzja 200 pg/kg SakSTAR.M3 u tych królików w tygodniu 6 wywołało 9,3 ± 8,2 procentową lizę.
U 8 królików przydzielonych do grup otrzymujących zmutowaną M8 podstawowa aktywność neutralizująca wynosiła 1,4 ± 0,2 pg/ml wobec SakSTAR oraz 0,6 ± 0,5 pg/ml wobec M8. Dożylna infuzja 1000 pg/ml M8 wywołała 41 ± 13 procent lizy skrzepu. Te 8 królików było następnie immunizowanych 400 pg M8, zwieszonym w 500 pl kompletnego adiuwantu Freunda w tygodniu 2 oraz w 500 pl niekompletnego adiuwantu Freunda w tygodniach 3 i 5. W tygodniu 6, aktywność neutralizująca osocza zwiększyła się do 3,8 ± 1,8 pg/ml wobec SakSTAR i 5,9 ± 2,7 pg/ml wobec M8. W tygodniu 6, wstrzyknięcie 400 pg SakSTAR 4 spośród tych królików, wybranym losowo, spowodowało 49 ± 28 procentową lizę skrzepu, podczas gdy wstrzyknięcie 1000 pg/ml M8 4 innym królikom spowodowało 24 ±11 procentową lizę. U 8 królików przydzielonych do grupy otrzymującej SakSTAR, podstawowy poziom aktywności neutralizacji wynosił 0,9 ±
184 348
0,6 pg/ml wobec SakSTAR i 0,6 ± 0,3 pg/ml wobec M8. Dożylna infuzja 400 pg/kg SakSTAR spowodowała 68 ± 18 procentowąlizę podstawową. Te króliki immunizowano następnie 400 pg SakSTAR zawieszonymi w 500 pg kompletnego (tydzień 2) albo niekompletnego (tydzień 3 i 5) adiuwantu Freunda. W tygodniu 6 aktywność neutralizująca osocza zwiększyła się do 59 ±47 pg/ml wobec SakSTAR i 22 ±16 pg/ml wobec M8, podczas gdy resztkowa zdolność trombolityczna 400 pg/ml SakSTAR zmniejszyła się do 7,5 ± 2,4 procent i 1000 [tg/kg M8 do 4,1 ± 4,8 procent.
U 8 królików przydzielonych do grup otrzymujących zmutowanąM9 podstawowa aktywność neutralizująca wynosiła 0,2 ± 0,05 pg/ml wobec SakSTAR oraz 0,03 ± 0,05 wobec M9. Dożylna infuzja 400 pg/ml M9 wywołała 72 ±11 procent lizy skrzepu. Te 8 królików było następnie immunizowanych 400 pg/kg M9, zwieszonym w 500 pl kompletnego adiuwantu Freunda w tygodniu 2 oraz w 500 pl niekompletnego adiuwantu Freunda w tygodniach 3 i 5. W tygodniu 6, aktywność neuttallzująca osoccz zwiększyyas Sę do 8,0 ±4,6 pg/ml wobec SakSTAR i 3,5 ± 2,6 pg/ml wobec M9. W tygodniu 6, wstrzyknięcie 400 pg SakSTAR 4 spośród tych królików, wybranym losowo, spowodowało 53 ±11 procentową lizę skrzepu, podczas gdy wstrzyknięcie 400 pg/ml M9 4 innym królikom spowodowało 40 ± 7,8 procentową lizę. U 4 królików przydzielonych do grupy otrzymującej SakSTAR, podstawowy poziom aktywności neutralizacji wynosił 0,1 ± 0,05 pg/ml wobec SakSTAR i 0,05 ± 0,06 pg/ml wobec M9. Dożylna infuzja 400 pg/kg SakSTAR spowodowała 78 ±13 procentową lizę podstawową. Te 4 króliki żmmueizowaec następnie 400 pg SakSTAR zawieszonymi w 500 pg kompletnego (tydzień 2) albo niekompletnego (tydzień 3 i 5) adiuwantu Freunda. W tygodniu 6 aktywność neutralizująca osocza zwiększyła się do 16 ±5,0 pg/ml wobec SakSTAR i 12 ±9,1 pg/ml wobec M9, zaś resztkowa zdolność trombolityczna M9 zmniejszyła się do 24 ± 33 procent.
Immunogenność SakSTAR wobec podwójnych mutantów M3.8 i M8.9 porównano w tabeli 3B. U 8 ksólikkw przydzieloceya do gnrp o zmutowanąM3.8 poodSawowa aatywność neutralizująca wynosiła 0,6 ± 0,3 pg/ml wobec SakSTAR i 3,5 ± 2,0 wobec M3.8. Dożylna infuzja 1000 pg/ml M3.8 wywołała 53 ±13 procent lizy skrzepu. Te 8 królików było następnie immunizowanych M3.8, zwieszonym w 500 pl kompletnego adiuwantu Freunda w tygodniu 2 oraz w 500 fil niekompletnego adiuwantu Freunda w tygodniach 3 i 5. W tygodniu 6, aktywność neutralizująca osocza wynosiła tylko 1,7 ± 0,7 pg/ml wobec SakSTAR i 6,1 ± 3,0 fg/ml wobec M3.8. Wstrzyknięcie 400 pg SakSTAR 4 spośród tych królików, wybranym losowo, spowodowało 77 ±18 procentową lizę skrzepu, podczas gdy wstrzyknięcie 1000 pg/ml M3.8 4 innym królikom spowodowało 59 ± 25 proceetcwąlizę. U 8 królików przydzielonych do grupy otrzymującej SakSTAR, podstawowy poziom aktywności neutralizacji wynosił 0,6 ± 0,4 pg/ml wobec SakSTAR i 2,0 ± 2,0 pg/ml wobec M3.8. Dożylna infuzja 400 pg/kg SakSTAR spowodowała 80 ±10 procentową lizę podstawową. Te króliki immunizowaec następnie 400 pg SakSTAR zawieszonymi w 500 pg kompletnego (tydzień 2) albo niekompletnego (tydzień 3 i 5) adiuwantu Freunda. W tygodniu 6 aktywność neutralizująca osocza zwiększyła się do 20 ± 15 pg/ml wobec SakSTAR i 21 ±22 pg/ml wobec M3.8 podczas gdy resztkowa zdolność trombobtycyea 400 pg/kg SakSTAR zmniejszyła się do 8,5 ±5,7 procent i 1000 pg/kg M3.8 do 30 ± 29 procent.
U 8 królików przydzielonych do grup otrzymujących zmutowanąM8.9 podstawowa aktywność neutralizująca wynosiła 0,3 ± 0,2 pg/ml wobec SakSTAR i 1,6 ± 0,5 pg/ml wobec M8.9. Dożylna infuzja 800 pg/ml M8.9 wywołała 39 ±13 procent lizy skrzepu w porównaniu z poziomem podstawowym. Te 8 królików było następnie immunizowanych M8.9, zwieszonym w 500 pl kompletnego adiuwantu Freunda w tygodniu 2 oraz w 500 pl niekompletnego adiuwantu Freunda w tygodniach 3 i 5. W tygodniu 6, aktywność neutralizująca osocza zwiększyła się do 2,5 ±
1,5 pg/ml wobec SakSTAR i 4,9 ± 1,3 pg/ml wobec M8.9. W tygodniu 6, wstrzyknięcie 400 pg SakSTAR 4 spośród tych królików, wybranym losowo, spowodowało 51 ± 35 procentową lizę skrzepu, podczas gdy wstrzyknięcie 800 pg/ml M8.9 4 innym królikom spowodowało 39 ±12 procentową lizę. U 4 królików przydzielonych do grupy otrzymującej SakSTAR, podstawowy poziom aktywności neutralizacji wynosił 0,2 ± 0,1 pg/ml wobec SakSTAR i 0,7 ± 0,3 pg/ml wobec M8.9. Dożylna infuzja 400 pg/kg SakSTAR spowodowała 67 ±19 orocentowąlizę podsta184 348 wową. Te 4 króliki immunizowano następnie 400 gg SakSTAR zawieszonymi w 500 gg kompletnego (tydzień 2) albo niekompletnego (tydzień 3 i 5) adiuwantu Freunda. W tygodniu 6 aktywność neutralizująca osocza zwiększyła się do 20 ± 15 gg/ml wobec SakSTAR i 18 ± 15 gg/ml wobec M8.9, podczas gdy resztkowa zdolność trombolityczna M8.9 zmniejszyła się tylko do 31 ± 30 procent lizy.
Wyniki te pokazują, że w tym bezpośrednim badaniu porównawczym SakSTAR i wybranych odmian, zwłaszcza podwójnych mutantów (M3.8 i M8.9) wywohyąone znacznie mniejszą aktywność neutralizującą spowodowaną przeciwciałami oraz oporność na lizę w porównaniu z SakSTAR.
Przykład 5. Porównawcza immunogenność SakSTAR i M3.8 u orangutanów.
Porównawcząimmunogenność SakSTAR i M3.8 w sensie wywoływania przeciwciał neutralizujących i oporności na trombolizę przy powtarzanym podawaniu badano na orangutanach.
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono w oparciu o wytyczne American Physiological Society oraz International Committee on Thrombosis and Haemostasis (45). U znieczulonych i zaintubowanych orangutanów wytworzono pętlę tętniczo-żyIną poza organizmem, przez połączenie przez pozaustrojową pętlę z polietylenu, cewnikowanej tętnicy piszczelowej albo ramiennej z żyłą obwodową. Pompa perystaltyczna utrzymywała ciągły przepływ krwi przez pętlę pozaustrojową, w którą włączono dwie strzykawki, z których każda zawierała jeden świeży skrzep 0,3 ml pulowanego osocza orangutanów znakowanego 125I-fibryną. Przebieg lizy skrzepu w czasie, podczas wstrzyknięcia SakSTAR albo odmiany M3.8, śledzono w sposób ciągły przez pomiar gamma nad strzykawkami. Alternatywnie, określano równowagę powrotu izotopu, przez porównanie sumy całkowitej radioaktywności na koniec doświadczenia (pomnożone przez 3 w celu skorygowania rozmieszczenia pozanaczyniowego) plus radioaktywność w pobranych skrzepach, z początkową radioaktywnością skrzepów.
Przed każdym doświadczeniem nad trombolizą orangutany premedykowano dożylnym bolusem ridogrelu, 3 mg/kg, dla zapobieżenia depozycji płytek w systemie zewnątrzustrojowym. Przez cały czas doświadczenia nad trombolizą podawano dożylnie heparynę we wlewie 200 IU/kg/godz. poprzedzoną bolusem 300 IU/kg.
dorosłych samców orangutanów (Papio hamadryas) randomizowano na początku (tydzień 0) do leczenia 50 (ig/kg SakSTAR (grupa 1) lub odmianąM3.8 (grupa 2) podawanymi dożylnie przez 1 godz. z 10% bolusem na początku. Zdolność trombolityczną oceniano monitorując przez 2 godz. znikanie radioaktywności ze skrzepów. Orangutany były następnie immunizowane w 2 tygodniu podskórnym podaniem 500 gg albo SakSTAR (grupa 1), albo odmiany M3.8 (grupa 2) zawieszonej w kompletnym adjuwancie Freunda, a w 3 i 5 tygodniu podaniem zawieszonej w niekompletnym adjuwancie Freunda. W 6 tygodniu skuteczność trombolityczną mierzono ilościowo, w pozaustroj owym modelu trombolizy, przez 4 godziny: 3 z 6 orangutanów grupy 1 leczonych na początku i następnie immunizowanych SakSTAR i 3 z 6 orangutanów grupy 2 leczonych na początku i następnie immunizowanych M3.8 randomizowano i podawano w 10% bolus i dożylny wlew przez 1 godz. początkowo 50 gg/kg SakSTAR, a po 2 godzinach od początku wlewu SakSTAR w ten sam sposób M3.8 (odpowiednio grupa 1A i 2A). Pozostałe 6 orangutanów otrzymało takąsamąterapię, lecz w odwrotnej kolejności: najpierw M3.8, a następnie SakSTAR (odpowiednio grupa 1B i 2B dla orangutanów immunizowanych wcześniej SakSTAR i M3.8). W 18 tygodniu skuteczność trombolityczną oceniano po raz trzeci przez monitorowanie znikania radioaktywności ze skrzepów fibrynowych w czasie 3 godz.: 3 z 6 orangutanów immunizowanych wcześniej SakSTAR podawano w 2,5 min., w dożylnym bolusie 250 gg/kg SakSTAR (grupa 1A) podczas gdy 3 innym orangutanom immunizowanym SakSTAR podano tą samą ilość M3.8 (grupa 1B). Z 6 orangutanów immunizowanych M3.8, 3 podano dożylny bolus 250 gg/kg SakSTAR (grupa 2A), a trzem tą samą ilość M3.8 (grupa 2B) .
Próbki krwi zbierano na początku do cytrynianowanych probówek (końcowe stężenie 0,01 M) i w kilku kolejnych punktach czasowych dla zmierzenia czasu kaolinowo-kefalinowego (aPTT), fibrynogenu, azantyplazminy (na początku i na końcu każdego doświadczenia) i aktywności neutralizującej SakSTAR i M3.8 (przed trombolizą). Następnie rosnące ilości zarówno SakSTAR jak
184 348 i M3.8 (objętości 50 μl zawierające 0,2 do 1000 pg/ml) dodawano do mieszaniny 300 μl cytrynianowanego ludzkiego osocza i 50 μΐ buforu lub osocza badanego orangutana, następnie natychmiast dodawano 100 μl mieszaniny trombiny (50 jednostek NIH/ml) i CaCb (25 mM). Czas lizy skrzepu osocza mierzono i wykreślano poziomy stężeń SakSTAR i M3.8. Z tej krzywej określano stężenie aktywatora plazminogenu powodującego w 20 minut całkowitą lizę skrzepu. Aktywność neutralizującą określano jako różnicę pomiędzy wartościami testowanego osocza i bufom i wyrażano ją w μg/ml osocza.
Fibrynogen układowy nie był degradowany jak również nie zanikała O2-antyplazmina, co odzwierciedlało całkowitą swoistość wobec fibryny obu czynników.
Począwszy od 6 tygodnia, aktywności neutralizujące SakSTAR grupy 1 były znacząco wyższe niż aktywności neutralizujące M3.8 w grupie 2. Grupa 1 rozwinęła aktywności neutralizujące szybciej i silniej wobec SakSTAR niż wobec M3.8, podczas gdy aktywności neutralizujące M3.8 nigdy nie przewyższyły aktywności neutralizujących SakSTAR w grupie 2 (tabela 4). Począwszy od 8 tygodnia grupa 1 rozwinęła znacznie silniejsze aktywności neutralizujące zarówno wobec SakSTAR jak i M3.8 w porównaniu z grupą drugą (tabela 4).
Na poziomie podstawowym 50 μg/kg SakSTAR wstrzyknięte dożylnie w ciągu godziny wywoływało 77 ± 2,9% lizy skrzepu w ciągu 2 godzin u 6 orangutanów (grupa 1), zaś 50 pg/kg M3.8 wywołało 83 ± 3,6% lizy skrzepu w ciągu 2 godzin u 6 innych orangutanów (grupa 2) (średnia ± SEM, p = 0,2).
W 6 tygodniu skuteczność lityczna 50 pg/kg SakSTAR w ciągu 2 godzin wstrzykniętych dożylnie w ciągu 1 godziny zmniejszała się do 9,2 ± 1% u 3 orangutanów immunizowanych SakSTAR (grupa 1A) i do 8,5 ± 3,2% u 3 orangutanów immunizowanych M3.8 (grupa 2A), podczas gdy skuteczność lityczna 50 pg/kg M3.8 dożylnie w ciągu 2 godzin obniżała się do 10 ± 6,9% u 3 orangutanów immunizowanych SakSTAR (grupa 1B) i do 11 ± 7,4% u 3 orangutanów immunizowanych M3.8 (grupa 2B;p <0,001 w stosunku do odpowiedniej lizy podstawowej dla obu grup; p = NS między grupami). 2 godziny po rozpoczęciu pierwszej infuzji trombolitycznej 50 pg/kg innego czynnika podawano dożylnie w ciągu 1 godziny, uzyskując porównywalną resztkową skuteczność lityczną, odpowiednio, 7,7 ± 1,5% i 11 ± 5,7% lizy skrzepu w ciągu 2 godzin przy użyciu M3.8 w grupach 1A i 2A i, odpowiednio, 13 ± 2,7%% i 12 ± 2,1 % lizy skrzepu w ciągu 2 godzin przy użyciu SakSTAR w grupach 1B i 2B.
W 18 tygodniu, dożylne wstrzyknięcie bolusa 250 pg/kg SakSTAR dawało 39 ± 5,3% lizy skrzepu w ciągu 3 godzin u 3 orangutanów immunizowanych SakSTAR (grupa 1A), podczas gdy resztkowa zdolność trombolityczna 250 pg/kg M3.8 u 3 orangutanów immunizowanych M3.8 (grupa 2B) była znacząco wyższa: 68 ± 4,55 lizy skrzepu w ciągu 3 godzin (p<0,005). 250 pg/kg SakSTAR powodowało 58 ± 9,5% lizy skrzepu w ciągu 3 godzin u 3 orangutanów M3.8 (grupa 2A; p = 0,1 w stosunku do grupy 1 A), podczas gdy liza skrzepu w ciągu 3 godzin przy użyciu 250 pg/kg M3.8 u 3 orangutanów immunizowanych SakSTAR (grupa 1B) wynosiła 39 ± 3,6% (p = 0,0005 w stosunku do grupy 2B). Spulowana analiza, niezależnie od czynnika podawanego w 18 tygodniu wykazała resztkową lizę w ciągu 3 godzin 39 ± 3% dla grupy 1 immunizowanej SakSTAR w stosunku do 63 ± 5,2%) dla grupy 2 immunizowanej M3.8 (p<0,0005).
Zdolności trombolityczne odwrotnie korelowały z odpowiednimi aktywnościami neutralizującymi w ciągu badania (Spearman r = -0,83; p<0,0001).
Tak więc, mutant M3.8 jest porównywalnie aktywny i swoisty wobec fibryny, ale istotnie mniej antygenowy niż SakSTAR typu dzikiego dla orangutanów, jak dowiedziono przez słabszą indukcję aktywności neutralizującej w osoczu, oraz szybszy nawrót zdolności trombolitycznej po immunizacji. Wyniki te, uzyskane na niewsobnych naczelnych potwierdzają i kontynuują obserwacje na królikach.
Przykład 6. Porównawcza skuteczność trombolityczna i immunogenność M3.8 i M8.9 w stosunku do SakSTAR u pacjentów z obwodowym zamknięciem tętnic.
SakSTAR (n = 8), M3.8 (n = 4) i M8.9 (n = 4) podawano dotętniczo do końca bliższego lub dalszego skrzepu zamykającego, jako bolus 2 mg, a następnie we wlewie 1 mg/godz., pacjentom z udokumentowanym angiograficznie zamknięciem tętnicy odwodowej albo przeszczepem omi184 348 jającym. Pacjenci byli badani po uzyskaniu zgody, zaś protokół był zatwierdzony przez Human Studies Committee of the University of Leuven. Kryteria włączenia i wykluczenia były zasadniczo takie jak to opisano poprzednio (46), z takim wyjątkiem, że dopuszczone było powtórne leczenie rekombinowaiKistafydokina/ąw ciągu 48 godz. Skojarzone leczenie przeciwzakrzepowe przy użyciu heparyny, aspiryny i doustnych leków przeciwzakrzepowych było jak to opisano uprzednio (46).
Stan kliniczny zamkniętej tętnicy obwodowej albo przeszczepu omijającego badano kilkakrotnie przed, przynajmniej co 4 godziny podczas i na zakończenie dotętniczego wlewu SakSTAR typu dzikiego albo jej odmiany. Stan angiograficzny badanego naczynia na zakończenie wlewu stanowił główny punkt końcowy badania. Podawanie czynnika trombolitycznego przerywano, gdy uzyskano odpowiedni stan naczynia, gdy wymagały tego powikłania albo gdy dwa kolejne angiogramy nie wykazały postępu lizy skrzepu. Rekanalizację definiowano jako lizę skrzepu wystarczającą do przywrócenia przepływu przez uprzednio zamknięty segment. Dopuszczalne były uzupełniające procedury wewnątrznaczyniowe takie jak przezskórna angioplastyka śródnaczyniowa (PTA), gdy badacze ocenili, że skrzep był wystarczająco rozłożony albo gdy nie oczekiwano dalszej trombolizy.
Ciśnienie krwi i częstość pracy serca monitorowano przed, w trakcie i po wlewie SakSTAR, M3.8 albo M8.9. Próbki krwi pobierano przed, na zakończenie i 6 godzin po procedurze angiograficznej. Pomiary obejmowały morfologię krwi obwodowej, czas protrombinowy (PT), aPTT, fibrynogen, O^-antyplazminę, plazminogen i badania biochemiczne czynności wątroby i nerek. W próbkach krwi pobranych podczas hospitalizacji i po wypisie badano aktywności neutralizujące SakSTAR, M3.8 i M8.9 oraz IgG i IgM przeciwko SakSTAR , M3.8 i M8.9. Dalszy kliniczny przebieg badano skupiając się na nawrocie zakrzepicy i efektach niepożądanych takich jak reakcje alergiczne i duże krwawienia (tj. wymagające transfuzji krwi albo interwencji chirurgicznej, spadku hematokrytu >10%, albo krwawieniach śródczaszkowych).
Grupy od 4 do 8 pacjentów (41 do 73 lat) z angiograficznie udokumentowanym PAO, z czasem trwania określonym na od 1 do 120 dni i długością od 8 do 50 cm, leczono M3.8, M8.9 albo SakSTAR. Jeden z pacjentów (WAL), któremu podano SakSTAR typu dzikiego rozwinął reakcję anafilaktycznąw ciągu 5 minut po podaniu 2 mg bolusa. Wlew natychmiast przerwano, zaś ciśnienie krwi powróciło do wartości normalnych w ciągu 20 min. po rozpoczęciu wlewu płynów uzupełniających. Pacjenta tego nie włączono do obliczania średniej ± SEM w tabelach od 5 do 7. U jednego z pacjentów (LAN), któremu podano M8.9 wystąpiła reokluzja po 30 godz., którą leczono 6,5 mg odmiany SakSTAR. Pacjent ten rozwinął aktywność neutralizującą rzędu 7,8 pg/ml M8.9 i 270 pg/ml przeciwciał IgG swoistych wobec M8.9 po 2-3 tygodniach.
Istotną charakterystykę wyjściową poszczególnych pacjentów pokazano na tabeli 5. Większość PAO występowała na poziomie udowo-kolanowym. Wszystkie wywołane były miejscową zakrzepicą. Włączono również dwa przeszczepy i dwa stenty biodrowe. 9 pacjentów miało objawy chromania przestankowego, 2 - przewlekły niedokrwienny ból spoczynkowy, 4 - podostre i 1 - ostre niedokrwienie.
Tabela 6 podsumowuje poszczególne wyniki leczenia. Wlew dotętniczy w dawce od 5,5 do 13 mg w ciąąn 3,5 do 11 ggdzin, lwwofeł calkowitąrrkanallzaaję u 13 pacjentów, czzściową rekanalizację u 1 pacjenta i brak poprawy u 1 pacjenta. Uzupełniające procedury wewnątrznaczyniowe (głównie PTA), wykonano u 12 pacjentów, zaś uzupełniające zabiegi chirurgiczne bezpośrednio po trombolizie u 1 pacjenta. Nawrót zakrzepicy po zakończeniu procedur angiograficznych wystąpił u 4 pacjentów: 1 pacjent był powtórnie leczony z powodzeniem po 30 godzinach przy użyciu 6,5 mg M8.9,2 pacjent został poddany przeszczepowi omijającemu aortalno-biodrowemu, u 3 pacjenta uzyskano pomyślną re0analizczeę po 20 godz. przy użyciu 40 mg r-tPA, zaś u 4 skrzep zaaspirowcno śródnazzyniowo. Powikłania krwotoczne nie występowały albo ograniczały się do tworzenia łagodnych do umiarkowanych krwiaków w miejscach nakłuć do angiografii, z wyjątkiem jednego pacjenta, u którego wystąpił krwiak w prawym mięśniu czworogłowym. Inne powikłania związane a zabiegami śródnaczyniowymi obejmowały zatorowość obwodową, rozwarstwienie ściany tętnicy, ujednego z pacjentów co spowodowało przedwczesne przerwanie wlewu trombolityczne18
184 348 go. Jedno z zamknięć tętnicy powierzchownej uda okazało się być oporne na 8 mg SakSTAR podane w ciągu 6 godz. i było następnie pomyślnie leczone PTA (tabela 6).
Poziomy krążącego fibrynogenu, plazminogenu i o^-antyplazminy pozostawały niezmienione podczas wlewu cząsteczek SakSTAR (tabela 7), co odzwierciedlało całkowitą swoistość wobec fibryny tych czynników w zastosowanych dawkach. Występowało istotne trawienie fibryny in vivo, o czym świadczyły podwyższone poziomy dimerów D. Dotętnicze leczenie heparyną wydłużało aPTT (tabela 7).
Zależna od przeciwciał aktywność neutralizująca SakSTAR, M3.8 i M8.9 oraz IgG swoiste wobec SakSTAR, M3.8 i M8.9 były niskie na początku i podczas 1 tygodnia po wlewie (tabela 8). Począwszy od 2 tygodnia poziom aktywności neutralizującej wzrósł do wartości mediany, do 2,9 pg i 3,3 pg odmiany SakSTAR neutralizowanej przez 1 ml osocza pacjentów leczonych odpowiednio M3.8 i M8.9, co było wartością znacznie niższą niż wartość mediany 9,1 pg SakSTAR typu dzikiego neutralizowanej przez 1 ml osocza pacjentów leczonych SakSTAR (p = 0,03 dla odmiany w stosunku do typu dzikiego, według testu Mann-Whitne/a). Poziomy IgG swoistych wobec SakSTAR wzrastały do wartości mediany 51 i 31 pg/ml osocza u pacjentów leczonych odpowiednio, M3.9 i M8.9, co było wartością istotnie niższą niż wartość mediany 240 pg/ml u pacjentów leczonych SakSTAR (p=0,01 dla odmiany w stosunku do typu dzikiego, test Mann-Whitney’a).
Tak więc u pacjentów z zamknięciem tętnic obwodowych, podanie dawki od 5,5 do 13 pg M3.8 i M8.9 wywoływało znacznie mniej przeciwciał neutralizujących i swoistych wobec stafylokinazy niż podanie SakSTAR. Odmiany te dostarczająpotwierdzenia koncepcji, że możliwe jest zmniejszenie odpowiedzi humoralnej przeciwko rekombinowanej stafylokinazie dzięki technikom inżynierii białka.
Opis figur
Figura 1. Sekwencja białkowa stafylokinazy typu dzikiego, SakSTAR. Numeracja rozpoczyna się od aminokwasu NH2-końcowego dojrzałej stafylokinazy pełnej długości. Zaznaczone są badane odmiany „charged-cluster-to-alanine”.
Figura 2. Schemat swoistości epitopowej panelu 17 mysich przeciwciał monoklonalnych wywołanych przeciwko SakSTAR.
184 348
Tabela I. Stan równowagi dla wiązania mysich monoklonalnych przeciwciał ze stalylokinazątypu dzikiego i jej mutatami typu „charge cluster to alaninę-'
| Przedział epitopu 111 | <5 | 0IVI | 2.0 | 3,8 | 0.75 | 3,0 | 2.6 | - | WC | X | CM | 0,13 | X | 0,30 |
| 24C4 | 6.3 | 4,5 | 00 | X | X | O | 5,9 | > 6,6 | O Λ | Os | r- | CC | ||
| 40C8 | sO | 0,8 | - | 3,8 | 0,15 | CM Τ’ θ' | CM | CM | 0,05 | 00 o | 2,4 | CM | ||
| 25EI | = | 3.9 | - | X | 0,05 | O- | sO X | WC | 0,07 | rt X | - | Γ- | ||
| 7H11 | 9Ό | cc | 0,93 | 1 | 0,02 | 0,36 | 0.51 | 0,33 | 0,03 | 0,09 | rt | 0,58 | ||
| Przedział epitopu 11 | Ι/Ί | 7F10 | - | rt X | O, | cc X | sO X Λ | 0,52 _ | 4,6 | r- | O0 | 4,4 | 0,88 | 0,41 |
| CM CM cc | 1 ! > 14 | o | 00 | o | CM X Λ | sO X | CM X Λ | > 16 | >20 | •ZT | Os | SO | ||
| 20D6 | X | 0,4 | vr | 0,60 | 0,018 | O( | 2,6 | 4.7 | vc X | CM oo | 22 | CN | ||
| 28114 | > 18 | Γ- | 26 | Ol CC | 8,5 | ο- Χ | 6,6 | >21 | >20 | Γ- X | 01 < | Os | ||
| 14115 | >25 | CC CM | sO | rt CM | O | rt | 91 < | >25 | >25 | 4,9 | - | X | ||
| 18F12 | > 18 | CM | 22 | Ol | sO | SO | 11 < | >20 | Γγ X | 5,7 | 00 | 91 < | ||
| 290 | >9,2 | - | OC | Γ- ΟΟ | 00 | X | >4,5 | > 12 | OO | Os_ X | CM CM | 8,6 | ||
| Przedział epitopu 1 | 3- | 3G10 | VT CC | Γ- X | Ό | Os | oc X | r- CM | Os 04 | 0.24 | 28 | sO^ X | CM | 06 |
| 2B12 | Os | CM X | Os Ol | rt | > 14 | CC X | CM | rt o | CM | sO | O cc | Γ- CC | ||
| 30A2 | X | CM | X | rt | ο- Χ | 6,0 | 8,8 | 0.22 | O | C- X | CC | cc CM | ||
| 26A2 | r- | C4 | sO | Os | - | Γ- oo | > 10 | CN o | CC | rt | Os | rt | ||
| 17G11 | 6,4 | CC | 0C | X | 00 | rt | oc X | >23 | VT | cn X | oo | oor X | ||
| Odczyno- wość właściwa (x 103/mg) | CC | 130 | 150 | 24 | 125 | Γ- Os | rt os | 80 | O | 130 | cc Γ- | Γ- os | 47 | |
| Odmia- na | CM | SakStar | sO X O | O 5 oo | D33, K35 | X 00 cc r-, ω | r- oc σ' T ITi z ω z | E61. E65 | K74. E75, R77 | E80, D82 | X 00 oo oc S^ ω | D93, K94 | X X oo Os Os Os ii! 2. -2 | |
| ID | - | M20 | M21 | MI2 | cc | M5 | sO | 00 Σ | 61ΛΙ | M10 | MII | M12 |
184 348 ciąg daszyz' tabeli 1
| Ό | on | OO | CM | Tt o | 0,08 | 0,01 | |
| o | ON | O CM | όλ Pc | NO | On | 0,01 | |
| Tt | cm | σγ cm | 0,44 | 0,94 | 0,05 | 0,15 | |
| o\ \O | Tt CM | - | 0,19 | - | 0,04 | 0,09 | |
| 0,43 | O | CMr | CM o | 0,06 | 0,003 | ||
| WC | CM | CM | 0,52 | 0,19 | 0,04 | rC o | |
| CM | CC θ' | CM | WC o | > 12 | 00 NO | o. PC | |
| PC | NO | cc | Tt | 0,02 i | 0,17 | ||
| CM | PC CM | ON CM | OO^ tj- | > 15 | Γ- nO | NO cm | |
| WC | ON ON | Tt | >25 | CM no | O cm | ||
| 00 CM | cc | we CM | uc no | > 18 | 00^ we | On | |
| O CM | rc θ' | 00 | o | we NO Λ | ’/C oo | Γ- cc | |
| Tt | we | Γ- ΟΟ | ON CM | Tt | we CM | 0,07 | 0,04 |
| ON | CM | Ό CM | </C | we CM | 0.09 | 0,08 | |
| CM r-7 | Tt cc | - | 1 | Γ- NO | 0,09 | 0,03 | |
| we | i 32 | Tt CM | CM | CM | 1 0,05 i | 0,034 | |
| nO | we cm | O OO | PC | CM CM | 0,71 | ON | |
| cc | 170 | CM PC | 130 | O | Tt C- | we Tt | we |
| CM | oo' Ch o o X X | D115. E118, 11119 | 11119, KI2I | K130 | E134. K135, K136 | , oo r wePCTtweCpc X r- r- cX X X 2d | Tt we r- o r- r- r- oo oo st ω at si Q |
| - | Μ15 | M16 | M17 | 00 i | M19 | 00 cc 2 | M8.9 |
184 348
Tabela 2 Absorbcja przeciwcia( wywołanych przez leczenie stafylokinazą typu dzikiego (SakSTAR( u pacjentów z osrrym zawałem serca, z typem dzikim i wariantami stafylokinzzy typu „clustered charge to alanine”
| Procenh przeciwdaZ abs()rbowanyca z | Ck OO Σ | Ol >»0 | kD Ό | 04 Tt | + | 67 | Tf iZk | 85 | Ol 04 | 62 | 4- | kD | ro Γ- | Γ— kD | 78 | + | O kD | III + 1 | 67 ±20 | •ΖΊ kD |
| M3.8 | 00 kD | O | . 38 | -b | ΖΊ | Ό kO | + | 20 | Tt kD | Γ- ΟΟ | Tt kO | »r> r- | 89 | O 00 | + | Ch kD | -b | 68 ±21 | 00 kD | |
| 8ΙΛ1 + 61Λ1 | + | + | + | 4- | + | + | + | o | ||||||||||||
| 00 Σ + Σ | 4- | + | + | 4- | + | + | + | o | ||||||||||||
| Ch Σ | + | Tt kD | + | + | 84 | 00 00 | + | 56 | <ZT 00 | + | + | + | + | 4- | -b | + | = | 83 ± 12 | (*·, Ch | |
| 00 2 | ΓΟ kD | Ch ITl | Ch Tt | r- TT | T* kO | + | ΓΟ Ol | <Z4 r- | -b | Tt kD | 00 Γ— | oo r— | fO 00 | -b | Ch kD | - | 7(±20 | Ol Γ— | ||
| r*~, 2 | + | 82, | Ί- | + | + | Ch 00 | 4- | 75 | «Ζ4 00 | 4- | -b | -b | + | 4- | + | + | = | OO 41 O Ck | kD Ok | |
| SakStar | + | -b | + | + | + | + | + | + | -b | -b | + | -b | -b | -b | -b | o | 95 ± 1 | «Ο Ck | ||
| Dawka (gg/ml) | kO ΓΊ | Ol | «0 r- | - | 45 | 00 | r- Tt | izy | 33 | r— Tt | 35 | Ό oo | •ΖΊ r- | Ch | O kD | Epitop średma±SEM mediana | 37 ±26 | 34 | ||
| o o | DANC | FLUS | 9) & > | LU ω Q | VERM | CC di X1 > | G0DT | FLUY | c □s cc > | O CC > | DEDO | O U X CA X CA X < | u o > | SWIN J |
Absorbera powyżej 90% byaa wykazywana jako +. Przed/aaty epitopu jak w tabeii 1
184 348
184 348
SP 'ob <
Ό
O ου fi ° .h gfi.
ob >» ε o .2 £ N 2 O tzi fi. O O θα •o o
Ob >> ε o
O ź n 52 O ω fi.T3 o a.
c
Ό o
Ob >, fc © 2 * n 52 O cn O-T3 o fi.
N fi o
fi ζΛ ζ; W o > Ό
O *o. O
O ts F u ©
CU oc 2 -H 5
OJ >-. •ςΛ W CT «Λ S' Ł> N
J N g. £
184 348
-σ ο
01} oh
Ο
Ο
Οί) οϋ
CL ca ’ο1 >,
Ε | 2 £ Ν 2 Ο <Λ ο--σ ο Cu
Ό
Ο
Οβ >>
ε 2 2 5 ’ν Ο ts) 0.0 Ο ο.
Ο ο
ΟΧ) >»
C ο 2 £ Ν 5
Ο C/5 ο-ο ο
ο.
Ο
Ο
Οί) ε δ ο >
’ν 2 Ο co 0.0 Ο
ο.
Ν = § δ; &εΧ υ ε ο C0
ο.
<υ
Ν ~©Q
Ό
Ο οβ
Ο ο >,
1!
S
ο.
Ό
Ο X Ο£ ε § .2 § Sο.
ο ο
01)
Ο >, ο. >
Ε § ο >
Ν ε· u ε >,
C «α $
ο .2 <ζ> § Η c ε
Ο' <υ § ω -o c
ο. 5 -c 8 ο ο ο ο -§ 8 >·»
-ο 2?
Μ
Σ Έ □J Ν £
Ή οη ct >>
'ίΛ ς>
& 7 ca ό Ο aż
184 348 ε
e/j
Σΐ
OC
Οί <
X
CO
CZ «3
CO !>'
C =3
O
C 'o
-(Λ
O c
$ >
O
OJJ o
X) rt
CO o
X
CO
X
| 20 | X X 44 X X | 51 ±7.4 | 0.02 | 40±4,7 | Os X 44 rf CO | 0,03 | ||
| 18 i v | Os 44 rt | CN X 44 CN O< | <0,0005 | CN 44 O\ rt | Γ- 44 00 X | «zs © © | ||
| X | «cs X 44 oo | 14±2,2 | CN © | νγ 44 X X | r- © 44 oo rt | X © | ||
| rt | oo X 44 X CN | rt X 44 «ΖΊ | rt © O © | C*1 X 44 OO X | CN X 44 CN X~ | 00 © O θ' | ||
| CN | X^ X 44 cc C*S | r-~ X 44 CN CN | Γ- Ο © © | CN X 44 | •Cł ©' 44 c*s X | CN © | ||
| O | O 44 rt *n | X 44 C«“i fO | © © | r- X 44 © CN | CN Ϊ | C*S © © ©~ | ||
| 00 | γ*ί CN £ o | ΐ Ό | Os © © θ' | LO rf 44 Ό CN | 22±7,1 | cn ©” | ||
| 6 i.v. | 44 C*S »O | O X 44 O ro | rt © © | 2O±17 | © x ą | x_ © | ||
| 5 s.c. | X X 44 Ώ | CN O 44 00 © | X © θ' | c*s rf 44 rt | CN X 44 00 06' | X ©Λ o | ||
| 3 s.c. | X X X | O © 44 © ©' | Os X 44 rt X | rt X 44 rt rf | © | |||
| 2 s.c. | γ- ο 44 ΠΊ | rto © 44 c*s © | 0 | 0© X 44 Ώ X | C-) X 44 r- x | cn © | ||
| > o | CN O © 44 m © | ©> © 44 ©, © | 1 | 0,3±0,0 | © © © | i | ||
| Grupa 1 Immunizacaa SakSTAR (n=6 | Aktywnoćć neutralizaccjπa SakSTAR | Aktywności ncutralizacyjnel M3 8 | Grupa 2 lmιnunizacaa M3.8 (n=6) | Aktywnośa neutralizacj-jna SakSTAR | Aktywności neutral(zacyjπej M3.8 | |||
| Droga podawania | © | CL· |
cd c
o
-σ
S ćo i
F*-* Ł>
s £ K?5 X
C. o ·- o. -£n 1 o . tj o ~ f/1
N ° U Ό $ > O . _' Q'£ 5 .a
Ό C C 3 ε
£ on.E c >?
ω v co £ 44 £ «'‘Si ·§ 8 u a i— N (Z) tzi
184 348
T a b e I a 5. okCientOw z obwodowym zamknicciei·!! tętnis leazonyc8 M3.8, M8 9 lub aαSSTAR
| Ozykccwaea dlugośu zamknięcia | Ch | O | o | O CN | V» | 21±8 | VJ | K) | ι/Ί | 15±0 | O K) | (N | 00 | S | ||||
| Oszacowany wiek zamknięcia (dni) | oo | o | «Ο CN | Γ- | - | KO | 3· | - | en -H in 00 | - | O KO | >120 | CN | |||||
| Miejsce zamknięcia | r- | prawa środkowa tętmaa udowa powierzchowna | lewa środkowa tętmaa udowa powierzchowna | prawa środkowa tętrnca udowa powierzchowna | praws środkowa lętmaa udowa powiet^z chowna | prawa tętrnca udowa wspólna (stent) | lewy przeszcepp tętmyy ooOkolaeowcj | prawa tętmaa udowa wspó^a (stent) | prawa środkowa tętmaa udowa powierz- chowna | prawy przeszc^ uOowo-oodSclanowy | prawa środkowa tętnika udowa ocwietz- chowna | prawa tętrnca ocOSolkeowα | prawa środkowa tętrnca udowa powierz- chowna | |||||
| Palenie | Ό | + | + | 1 | + | 4- | + | + | 1 | • | -t- | + | ||||||
| Wywrad chorobosy | Ι/Ί | nadciśnienie. choroba wieńcowa | przeszc^ nerki | przesz^:^ αorta-obic tętrnec udowe, am. pu^ia przedoztooia | obustśoeyy sten. tętmc biodrowych | lewy orzeszceop ooOSolaeowopodSoIano8 wy | zawal serca. sten. prawej tęt^ncys' wspólnej | hiperlioidemιa. eαOaićeieeie. choroba wieńcowa. umiarkowana eiewydoleoćć ^cekk | Oazeszccop udowo-pś>dlkoIenow8' prawy (pourazowy) | tętrnkk aotyy brzusznej | podejrzenee chośoyy wicńcowąj j | ekdaićnicnίe. choroba wieńcowa | ||||||
| Rozpoznanie Slieiayne | TT | chromanie L, | chromanie | chromanie | eicOokrwienyy ból socazy'ekowy | chromanie | podostee niedoLs wienie | 1 chromanie | podotree eiedok.8 wienie 1----------- | 1 ostee niedokrwienie i | eieOokrwienyy ból zooczyeScwy | chromanie | ahtcmkeie | |||||
| Wiek | m | κθ | O P- | kO | CN | rf £ Ό | Tl- | «ΖΤ | ITT | Vł Γ- | r- -H ir> ir> | Ok KO | Γ- KO | r-2 kO | ||||
| j Pleć | <N | Σ | tZ | 2 | 2 | Σ | Σ | Σ | Σ | Σ | Σ | Σ | CT | |||||
| 2 22 c υ o ' o. N | - | oo m Σ < | STO | VLA | O o I | MER _1 | Ω C/3 -H .2 'c T3 <u u *CZ) | 00 Σ ω | HEC | OTT _i | LAN | BRO | Ω C/3 -H CC c T3 K u ‘(Λ | C. SakSTAR | < ;z 7 | DRI | r·' c o | * < 3: |
184 348
| Os | o | OO | OO | Γ- | 00 tr? -H |
| OO | CO | o Os | r— | o | 00 5 rt |
| r~- | prawa tętnica podkolanowa | lewa środkowa tętrnca udowa pow ierz- I chowna i | lewa środkowa tętnćaa udowa powierzchowna | prawa środkowa tętrnca udowa powierzchowna J | |
| o | 1 | 1 | |||
| ΙΖΊ | przeszczep udowo-podkolanwwy lewy. | tętniak prawej tętnccy podkolanowej | hieerllpldzmίa | rak gruczołowy prostaty | nadciśnienie, hlpzrlieldemla | |
| Tf | podottee niedokrwienie | chromanie | podosree niedokrwienie | chromanie | |
| rs | CM so | rr Γ- | sO | Os sO | 63±4 |
| CM | Σ | ić | Σ | •z | |
| - | SMO | VEL | POT | STA | O CZ) -H .5 c Ό ω u *CZ) |
184 348
Tabela 6. Leczeme i u pacjeritózv z zamkm^ciem naczyń obwodowymi leczonymi M3.8. M8 9 lub SakSTAR
| Komplikajje podczaz zabiegów angiograficznych | kO | dreszcee (bez gorączki) | obwodowa zatorowośZ po PTA. usumęla podczaz ciągłego wlewu SakSTAR. M3.8, wymioty | rozdziełenie ściany tętnicy, etaemeająju mewleNia gorączka | U '2 | powtórne zamkniękie leczone erzeszaeejιem αorta-obie tętni- ce biodrowe | 0 ’c | obwodowa zatorowość po PTA. leczom aspiracją, powtórne zarnknięciu po 30 godz.,. powtórnie leczone 6,5 mg Sak- STAR M8.9 (przzz 4,5 godz ) i PTA | 30 mg rt-AA podawane w ciągu 20 godz (*) | kraikk prawego uda | ostee nledt)ew\Ίeniu przeciwną. stopy seow'odownne materialem zatorowym (cholestcroL z tętniak.! aorty brzuszneji do tętnic obwodowymi lewjj eończyzy doineJ (4 dzień) me eoddająee się leczeniu 110 mg rt-PA | |||||
| Terapia dodatkowa | Tl | ί PTA | PTA | |- |pta | przeszceep udowo-piszczelowy | PTA + stent | 0 c | PTA + stent | ϋρ^.ιβ blaszek (αrtCerectonima( + stent | PTA przeszczepu. αseiraeju blaszkk (tęnica strzałkowa) | PTA; wyciękιe tętniaka aorty brzusznę. ( 9 dnia) | |||||
| Czaz trwania wecwu czynnika trombolitycznego (godziny) | Tf | (O r-f | © OO | «/Ί Tt | r— | 00 © Ή 00 kO | © oo | © OO | oo | 0 od | 8,0±0,2 | © | «ri | |||
| Calkowńja dawka czynnika trombolitvcznego (mg) | fO | 0 Ch | O | >/O kD | Ό Ch | © -H 00 od | 0 | 0 | - | 0 | © -H © | (N | i/A Γ-' | |||
| Rckanalizacja po trombolizje | OJ | całkowita | 1 całkowita i | częściowa | całkowita | całkowita | całkowita | całkowita | całkowita | całkowita | całkowita | |||||
| Zwązek/ID pacjenta | - | A. M3.8 | STO | VLA | OOH | MER | Średnia±SEM | |B. M8 9 | HEC | OTT | LAN | O at CQ | ŚredniaiSEM | C. SakSTAR | < Z tz | cć |
184 348
| ο | Ογ^ίοΚ po ιπίφου wklucic żylnegOc wstrząc anafilaOtyczny w cÓEguc 5 min. od podarnc bolusa, po którym po wyrównanie ciśmemc wystąpiło arzemjjąjzee niedokrwienn lewej tętnżyc środkowej mózgu | ponownc zamOnięcie stentc po 6 tygodniach | O | ostre ponownc zam0nięcic (1 Ozień)l sOutecznc aspiracja zatoru | Ογ^-Ίο! w mίkJjce wOIucic żylnego | ||
| U. | PTA | stent | PTA | PTA | |||
| Tt | 6.0 | 6.0 | 3,5 | 6,0 | © 7 00 | ||
| <*) | 8,0 | O fS | UN | 5,5 | 8,0 | © 5 00 | |
| Γ4 | 4Ż 03 | JZ 03 u. X) | całkowita i | | całkowita | całkowita | całkowita | |
| - | GOD | * ♦ < > | SMO | VEL | 0 Cl | STA | Średma ±SD |
CN
OC <
ο30
184 348
T a b e i j 7, Parameryy krzepnięcm przed i po podaniu M3.8, M8.9 lub SakSTAR u eacjestójv z zamknicciem naczyń obwodowych
| aPTT (s) | O fi. | Os rt | >180 | OO | CM Γ— | os CM -H s© os | o | »© | ' 62 | t© r- | «/© s© | o »© -H i© s© | rt © © | Γ© 1© | OO rt | sC rt | CM C© | Os Os | © | u© </) | 44 | 65±10 | CM O © | |||
| -a u N u. fi. | W© c© | s© r© | r© r© | O rt | © ΐ s© f© | o (© | CM <© | Os CM | CM SO | © 00 i f© | Os <© | © C© | r— f© | P- r© | f© r© | Os CM | C© r© | c~ CM | 'O 41 f© f© | |||||||
| D-dimeb ng/ml) | O O- | O O «© sO | O O O ci | O o o r© | o © r© rt | O t— Os -H O O © rf | SC O o | o o SC rt | © © CM | O O OO | O O cm | 2,400±750 | rf O © | © © Γ- Os | © © CJ r© CM | <z> © SD rt | © © Os l© | >12,500 | © © cm | © © Γ- rt | © © V© rt | O © CM Ή © © Γ- ΟΟ | CM © © | |||
| -fi CJ N ι- Ο. | O O c© V | o o CM | O CM rt | O OO 00 | 700±210 | O OO 00 | O OS CM | o o V | o <© | 400±170 | © © V | © r— rt | © © V | o © | © © V | © V© SC | © © V | © © V | Γ- ΟΟ -Η © r© CM | |||||||
| p cf- cd c Έ 9 a. >> § <3 | O fi. | Os OO | O | O | o | 100±5,0 | CM O | f© os | O Os | o o | CM Os | © CM -H rt Os | SD o | © 00 | © © | r© Os | r© Os | c© Os | 00 00 | 00 | © CM | νΐ -Η rt Os | V© © | |||
| “O OJ N u. fi. | Γ- ΟΟ | Γ— Os | o o | o | © irf * Os | C- OS | Os 00 | OS Os | C- Os | © CM Os | Γ- ΟΟ | 00 00 | r© Os | ©~ © | © © | SC os | © © | © | © s© Os | |||||||
| 1 Plazmn-iogno (%) | O fi. | OO | O | CM Os | o CM | © OS -H O o | «© © | os | CM 00 | 00 OS | Γ© Γ— | © 1© -H SD 00 | © © | © OS | ·© 00 | SC Os | rt 00 | rt OS | so Γ— | '/© u© | © CM | »© Γ- -H 00 00 | Γ© © | |||
| fi OJ N u. fi. | OS OO | O O | sC Os | o CM | 100±7,0 | rt os | CM OO | MJ Os | t© Γ— | 87±5,0 | OS | 00 OO | CM Os | S © | © © | os | O^ | © | os CM -H Os | |||||||
| Fibrynogren (g/l) | O fi. | o rt | ©, «©” | O oc | rt <© | os © Ή so l© | CM θ' | s© rf | so r© | sO rf | o, rf | CM i CM | CM © | cm | oo, f© | © rt | Γ— c© | cm rt | rt cm | 00 cm | f© | f© © -H CM f© | Γ© © | |||
| -fi OJ ΓΜ fi. | os, r© | ©, Tt | o oo | I© rt | © | CM rf | rn | i© r© | r© | CM © -H C; *© | ©r CM | rf r© | sC Γ© | ą c© | »n rt | ©, cm | r© | W© CM | f© Γ© | |||||||
| Związek | -fi | OO r© Σ < | p cz> | < > | o c | s ω <z> -H .5 ’e Ό u •CZ) | + fi. | Os 00 Σ ca | U ω X | Γ o | < | O oc ca | ω cz) -H 2 Έ o 4> u. •CZ) | 4- 0- | C SakSTAR | < z iZ | 5 a | a o o | * < £ | o Σ CZ) | ω > | 5 | < H C/0 | s Ul <Z) -H 2 c Ό O U •CZ) | + fi. |
p dlu sparowanego testu T-Studenta. Diu obliczenia średnice., < i byłj' pomin^tc mu wlącznoo do oblcczej śrzdnicy ± SI
184 348
N •Ό
Tabela 8. Aktywności eoιιtraliztjJyez i specyficzee IgG w surowiyy pacjentów leyponych M3.8z M3.9 lub SakSTAR (95.12.14) I Aktywność ceutΓahzujyua (pg/ol) I Specyficene przeciwciała IgG pg/o ε o .2 £ N 2 O ts> CL -o o Cl ε o .2 £ ’n «3 O czi CL TJ O c
Q o
-o u
HZ) O s &
Z? 3* N
Cl
CQ
| 001 | OO Tt | |
| 130 | WC r~- | |
| 150 | cc NO | |
| 1 | CC | |
| cc | r~ o | |
| ‘/C CM | ’zc O | |
| O wc | o ó | |
| O Tt | WC o' | |
| 0Ό | ||
| 0Ό | O o | |
| B.1. M3.8 | sto | < > |
184 348
Ciąg dalszy tabeli
| CS | Tt | CN s© | • | 210 | O O CN | UN CN | © | 1,300 | 480 | 130 | 3,0 | CN s© | 140 | fi- | fi- | CS | •ZN S© | © | 310 | 5.8 | |||||||
| - | UN CS | 100 | CS Tf | © | 210 | CN er? | UN fi- | 1,800 | 400 1 | 96 | © cs | CN s© | 130 | 150 | co UN | CS os | •ZN | 58 | © UN | Os fi- | 220 | OO UN | |||||
| o | CN | c- S© | Os CN | 170 | 220 | CN cs | 200 | 00Ζ.Ί | 500 | © 00 | fi- s© | 27 | 96 | 210 | 00 00 | s© Tt | CN | 55 | fi- cs | CS Os | 320 | 6,25 | |||||
| CN | CN CN | 3,0 | 2.8 | CS UN | CN CS | 1 | UN fi- | OS UN | fi- Tt | CN oo | CN | CS | 26 | s© | CS | 00 | 7.7 | •ZN es | CN es | 63 | 44 | 1 | |||||
| OO | 3,0 | O | •ZN | fi— CS | CS | CS UN | 8,3 | CN | cN Os | CN Tt | •ZN CN | © Tt | CS Tt | 6,6 | CN | 2,3 | ‘ZN fi- | CS Tt | s© | 5,8 | - | 4,0 | |||||
| Γ— | 2,0 | o. | © cs | © | ©^ | CS | 40 | CS CS | © UN | 0,0 | 1 3.0 | 2,0 | © Cn | 2,0 | O | © es | 3,0 | 3,0 | UN fi- | 0,0 | |||||||
| %O | UN CS | ; 6,0 i | 6,0 | © UN | © Os | 6,0 | - | fi- Tt | 27 | © | 0,0 | 6,0 | © cs | 3,0 | UN cn | 0,0 | © es | Tt cs | © un | 6,0 | © Os | © | |||||
| «Ν | 0,0 | CN cn | 3,0 | 4,0 | 0‘8 | 5,0 | CS | UN UN | UN CN | 2,0 | 0,0 | © •ZN | 2.5 | © Tt | 3,5 | 0,5 | 0,5 | 0,8 | 2,0 | 0,5 | 6,5 | © | |||||
| Tj- | •ZN © | 0,3 | 0,0 | 2.5 | 0,0 | 0,0 | 0Ό | 0,5 | 0,5 | 0,0 | 0.0 | 0.5 | 0,0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0‘0 | 0,5 | 0Ό | 1 | |||||||
| cn | O θ' | 0,0 | 0,0 | 0Ό | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0.5 | UN © | 0,0 | [ 0*0 | 0‘0 | 0,0 | 0,5 | 0,0 | © | 0,0 | 0.0 | 0,0 | 0,0 | O © | |||||
| CS | |||||||||||||||||||||||||||
| - | 1100 | mer | B.2 M8.9 | I-I EC | OTT | LAN (*) | BRO | B3 SakSTAR | KNA | DRI | GOD | * * < £ | Σ | VEL | POT | STA | C. M8.9 | C.l. M3.8 | STO | VLA | H00 | MER | C.2. M8.9 | HEC | OTT | LAN (♦) | BRU |
184 348
| CM | fC sO | l 1,300 | 460 | MC CM | CO X | O rt | Os CM | ||
| - | cc sO | 1.500 | 400 | OO | sO | Γ | 100 | I 250 ; f 1 | |
| ο | 00 cc | 096 | 790 | o | X | MC | ’/C Γ- | 200 i 1 | |
| ο | sO X | 00 X | 00 rc | 7,8 | CC X | O X | OO X | CM | |
| 00 | X | rt | r- | o | r- | X | |||
| οο | X | 00 | X | X | CM | ||||
| Γ | r- | •n rj- | CM CM | MC X | o o | o X | o X | ||
| CM | O | CM | o | o | o | o | o | ||
| sO | CM | X | o | CM | X | X | |||
| V» | sO | 100 | 34 | MC rt | o o | 00 | rc X | o X | |
| rt | O | o | MC | O | o | o | O | o | |
| X | O | O | o | o | o | o | |||
| o | o | <o | O | o | o | o | o | ||
| o | o | o | o | o | o | ||||
| CM | |||||||||
| - | C.3. SakSTAR | WAL (**) | |||||||
| KNA | DR1 | GOD | SMR | VEL | ί- ο e_ | STA |
Ο '{Λ
J3
Ο
J0
Ο
Ο.
<υ c
Λ g
Ν ι—
CL
Ν •σ ο
©X) ο
ο
C ο
C34
184 348
LITERATURA
1. Collen D: On the regulation and control of fibrinolysis. Edward Kowalski Memorial Lecture. Thromb Haemostas 43: 77-79, 1980.
2. Collen D, Lijnen HR: Basic and clinical aspe^s of fibrinolysis and thrombolysis. Blood 78:3114-3124, 1991.
3. Collen D, Van de Werf F: Coronary thrombolysis with recombinant staehzlokinasj in patients with evolving muyocardial infarction. Circulation 87: 1850-1853, 1993.
4. VandjrscCujren S, Collen D: Immunogeniciteit van streptokinase en implicaties voor gebmik. TijdscCr Geneesk 50: 1639-1644, 1994.
5. Lack CH: Staehzlokinasj: an activator of plasma protease. Nature 161: 559, 1948.
6. Lewis JH, Ferguson JH: A erotjolztic enzyme system of the blood. III. Activation of dog serum erofibrinolzsin by staphylokinase. Am. J. Physiol 166: 594, 1951.
7. Winkler KC, DeWaart J, Grootsen C, Zegers BJM, Tellier NF, Vertegt CD: Lysogenic conversion of snapCylococci to loss of beta-toxin. J. Gen. Microbiol. 39: 321, 1965.
8. Collen D, Lijnen HR: Stαehylokinαse, a fibrin-specific plasminogen activator with therapeutic potential ? Blood 84: 680-686,1994.
9. Sako T, Sawaki S, Sakurai T, Ito S, Yoshizawa Y, Kondo I: Cloning and espression of the staphzlokinase gene of Staphylococcus aureus in Escherichia coli. Molec. Gen. Genet. 190: 271-277, 1983.
10. Bjhnee D, Gerlach D: Cloning and exeression in Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Streptococcus sanguis of a gene for staphylokinase - a bacterial plasminogen activator. Molec. Gen. Genet. 210: 528-534, 1987.
11. Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR: Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokinasj. Fibrinolysis 6: 203-213, 1992.
12. Sako T: oyerproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its cCaracteriaation. Eur. J. Biochem. 149: 557-563, 1985.
13. Gerlach D, Kraft R, BeCnee D: Purification and characterization of the bacterial plasminogen activator staehylokinase secreted by a recombinant bacillus subtilis. Zbl. Bakt. Mika. Hyg. 269: 314,-322 1988.
14. Sako T, Tsuchida N: Nucleotide seguence of the staeCzlokinasj gene from Staphylococcus aureus. Nucleic Acids Res. 11: 7679-7693, 1983.
15. Collen D, Zhao ZA, Holvoet P, Marynen P: Primary structure and gene structure of staphylokinasj. Fibrinolysis 6: 226-231, 1992.
16. Schlott B, Hartmann M, Guhrs KH, Birch-Hirschfeld E, Gase A, Vetterman S, Collen D, Lijnen HR: Functional properties of recombinant staphzlokinase variants obtained by sitesejcific mutagenesis of methioninj-26. Biochim. Biophys. Acta 1204: 235-242, 1994.
17. Sakai M, Watanuki M, Matsuo O: Mechanism of fibrin-specific fibrinolysis by staeCzlokinase: earticipation ofj-plasmin inClbltot. Biochem. BIopCzs. Res. Comm. 162:830-837,1989.
18. Matsuo O, Okada K, Fukao H, Tomioka Y, UjsCima S, Watanuki M,. Sakai M: Thrombolytic propenies of stapCzlokinase. Blood 76: 925-929, 1990.
19. Lijnen HR, Van Hoef B, De Cock F, Okada K, Ueshima S, Matsuo O, Collen D: On the mechanism of flbrin-sejclfic plasminogen activation by staeCzloeinasj. J. Biol. Chem. 266: 11826-11832. 1991.
20. Lijnen HR, Van Hoef B, Matsuo O, Collen D: On the molecular interactions between elasminogjn-staphzloklnase, Oj-antiplasmin and fibrin. Biochim. BIopCzs. Acta 1118: 144-148, 1992.
21. Silence K, Collen D, Lijnen HR: Interaction between stapCzlokinasj, plasminogen) and c^-antiplasmin. Recycling of stapCyloklnase after neutralization of the plasmln-staeCzlokinase complex by c2-antiplasmin. J. Biol. Chem. 268: 9811-9816, 1993.
22. Silence K, Collen D, Lijnen HR: Regulation by c^-antiplasmin and fibrin of the activation of plasminogen with recombinant stapCzlokinasj in plasma. Blood 82: 1175-1183. 1993.
184 348
23. Collen D, De Cock F, Vanlinthout I, Dealerck PJ, Lijnen HR, Stassen JM: Comparative tbrcmbclytia and iminunogenic propeaties of staohylokinasc and streptokinase. Fibrieclysis 6: 232-242, 1992.
24. Collen D, De Cock F, Stassen JM: Ccmparatżvc ieununcgcnicity and thrombolytic orcperties toward arterial and vencus thrombi of stacptokiease and acaombinaet staphylckżnase in bab^ns. 87: 996-1006, 1993.
25. Sahlott B, Hartmann M, Guhrs KH, Birch-Hirschfeid E, Pohl HD, Vanderschucace S, Van de WerfF, Michoel A, Collen D, Behekc D: High yield orcduatice and ourtficatioe of recombinant staphylokinase for thrcmbclytic therapy. Bio/technology 12; 185-189, 1994.
26. Dealerck PJ, Vandersahueren S, Billiet J, Moreau H, Collen D: Paevalcnac and induction of circulating aetibodies against stkphylckinase. Thromb Haemostas 71:
129-133, 1994.
27. Vanderschueren SMF, Stassen JM, Collen D: On the immueogenicżty of staohylokiease in patieets and in animal models. Thromb Haemostas 72: 297-301, 1994.
28. White H: Thrombolytia treatment for myocardial ^ιπ^ι. Br. Med. J. 302:
429-430, 1991.
29. Gase A, Hartmann M, Guhrs KH, Rocker A, Collen D, Behnke D, Schlott B: Fueational significance of NH2 and COOM-terminal regions of staphylokinase in plasminogce activaticn. aubmitte0.
30. Galfre G, Milsteie C: Preparation of monoalceal antibodies: strategies and procedures. Methods . Enzymol. 73: 3-46, 1981.
31. de St. Groth SF, Scheidegger D: Producticn of monoclcnal aetibodies: strategies and taatias. J Immunol Methods 35: 1-21, 1980.
32. NaSaee PK, Kawam A: Pcrcxidasc-labelcd aetibcdy. A new method for conjugation. J. Histoahem. Cytochem. 22: 1084-1091, 1974.
33. Anderson N, Potter M: Inductioe of plasma cell tumours in Balb-c mice with 2,6,10,14 tetramethyloentadeaaee (oristaee). Nature 222: 994-995, 1969.
34. Ey PL, Prowse SJ, Jenkin CR: Isclaticn of pure IgGr IgG^ and IgG2b żmmueoglobulies from mouse serum using protein A-Seoharosc. Immunochemistry 15: 429-436, 1978.
35. ónssce U, Malmqvist M: Real time bżosoecifia analysis. The żetegration of surfaae plasmon deteatioe, general biospecific interface ahemistry and miarcflui0ias into one analytical system. Adv. Biosensors 2: 291-336, 1992.
36. Johnss^ B, Lofas S, Lindquist G: Immuncbilizatice of proteins to a caaboxymethyldextrae-mcdificd gold surfaae for bżcspeaific analysis in surfaae plasmon resonance sensors. Anal Biochem 198: 268-277, 1991.
37. BIAirne system manual, 5-2, Pharmacia Bicsensor AB, Uppsala, SwcOci.
38. Kar^son R, Mżahaclssce A, Mkttssce L: Kinetic aealysis of monoclonal antibody-aetigen ieteractioes with a new biozcesor based αιΙ-Ο^Ι system. J. Immununol. Methods 145: 229-240, 1991.
39. Staessees P, Opsomer C, MaReown Y, Kramer W, Zabeau M, Friz MJ: Eficient cligceualectide-direated coestauation of mutatices in exorezsice vectoas by the gαooed duplex DNA method using altereatieg seleatable markers. Nucleic Aaids Res. 17: 4441-4454, 1989.
40. Deutsah DG, Mertz ET: Plasmżeogen: ourification from human plasma by affmity ahacmatcgraphy. Scienae 170: 1095-1096, 1970.
41. Silence K, Hartmaro M, Guhrs KH, Gase A, Schlott B, Collen D, Lijnen HR: Struature-fueatioe relαticnshios in staohylokinasc as acvealc0 by „dustej-ed-charge-to-alanine” mutagenesis. J. Biol. Chem. (in press).
42. Bradfcrd MM: A raoid and sensitive method for the guaetitαticn of microgram quaetities of protein the prinaiolc of prcteie-dye bindin/. Anal. Biochem. 72: 248, 1976.
43. De Clerck F, Beetens J, de Chaffoy de Couraelles D, Freyne E, Janssen PA: R68070: thrcmbcxanc A2 syntbetase inhibitice and thromboxaec A2/oaostaglaedin endoperoxide recep36
184 348 tor blockade cnDbidod in oce doIćcuIć. I. Βΐ^^οΐ^Ι profile in vitro. ThroDb. Haemost. 61: 35-42, 1989.
44. btusson JM, Vanlidthout I, Lijeen HR, Collen D: A Cumstor pulmnnury eDbolism model for the evaluatiod of the tCrnDbnlytic and pCurDuyokΐnetic prope^les of tCroDbnlytic agects. Fibrinolysis 4 (buppl 2): 15-21, 1990.
45. Giles AR: Guΐdelinos for the use of aeiDals in binDedicul roseurcC. Thromb Haemost 58: 1078-1084, 1987.
46. Vundersyhueren b, Stockx L, Wilms G, Lacroix H, VerhuegCe R, Vermylee J, Collen D: TCrnDbnlytic therapy of perlpCorul arterial occlusioc with Ή^οΝη^ stupCylokinuse. Circulatioc 92: 2050-2057. 1995.
47. Vandorschueree b, Barrios L, KordsincCuΐ P, Van doe Heuvel P, Hormaes L, Vrolix M, De Mac F, Benit E, Muyldermans L, Collen D, Vae de Werf F: A randomized trial of rocoDbinunt stupCylokinuso versus alteplase for cnrodury artery pateccy ie acute Dyocardial ΐdfurctinn. Circulatioc 92: 2044-2049, 1995.
184 348 1 14
Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp ι-1 I-1 I---1 ι
21 1
28
Ala Ser Tyr Phe .Glu. Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn
42
Val Thr Gly Val Asp Ser Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro l___ι I___i
3
56
His Tyr Val GJu Phe Pro lle L><6 Pro Gly ,Thr Thr Leu Thr
Lys Glu Lys lle Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu ι l J I _ __I I___
Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp c_i- _j I_I
Asp Ala
Pro Ser
Ala Lys lle Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys
Lys Lys J 11
Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro ile Thr Glu Lys Gly
112
Phe Val l33—1
113
Val Pro Asp Leu Ser Glu His lle Lys Asn Pro Gly i___i_li_□
126
Phe Asn
127
136
Leu lle Thr {Lys[ Val Val lle GHj Lys Lys
Claims (13)
- Zastrzeżenia patentowe1. Pochodne stafylokinazy wykazujące zmniejszoną immunogenność w porównaniu ze stafylokinazą typu dzikiego posiadające sekwencję aminokwasową jak przedstawiono na figurze 1, w której jeden lub więcej aminokwasów w jednym lub więcej podkreślonym przedziale jest zastąpionych przez alaninę, niszcząc w ten sposób odpowiedni(e) epitop(y).
- 2. Pochodne stafylokinazy według zastrz. 1, znamienne tym, że posiadają sekwencję aminokwasowąjak przedstawiono na figurze 1, w której jeden lub więcej aminokwasów jest zastąpionych przez alaninę zmniejszając reaktywność pochodnych z panelem przeciwciał monoklonalnych, obejmujących na przykład przeciwciała 17G11, 26A2, 30A2, 2B12 i 3G10 skierowanych przeciwko przedziałowi epitopu I.
- 3. Pochodne stafylokinazy według zastrz. 1, znamienne tym, że posiadają sekwencję aminokwasową jak przedstawiono na figurze 1, w której jeden lub więcej aminokwasów jest zastąpionych przez alaninę zmniejszając reaktywność pochodnych z panelem przeciwciał monoklonalnych obejmujących, na przykład przeciwciała 7H11,25E1,40C8,24C4 i 1A10 skierowanych przeciwko przedziałowi epitopu III.
- 4. Pochodne stafylokinazy według zastrz. 1, znamienne tym, że posiadają sekwencję aminokwasową jak przedstawiono na figurze 1, w której jeden lub więcej aminokwasów jest zastąpionych przez alaninę zmniejszając reaktywność pochodnych z panelem przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko przedziałowi epitopu I i III.
- 5. Pochodna stafylokinazy według zatrz. 1, którąjest pochodna M8 posiadająca sekwencję aminokwasową jak przedstawiono na figurze 1, w której aminokwasy Lys w pozycji 74, Glu w pozycji 75 i Arg w pozycji 77 w podkreślonym przedziale 8 są zastąpione przez alaninę zmieniając odpowiedni epitop.
- 6. Pochodna stafylokinazy według zastrz. 1, którą jest pochodna M3 posiadająca sekwencję aminokwasowąjak przedstawiono na figurze 1, w której aminokwasy Lys w pozycji 35 i Glu w pozycji 38 podkreślonym przedziale 3 są zastąpione przez alaninę zmieniając odpowiedni epitop.
- 7. Pochodna stafylokinazy według zastrz. 1, którą jest pochodna M9 posiadająca sekwencję aminokwasowąjak przedstawiono na figurze 1, w której aminokwasy Glu w pozycji 80 i Asp w pozycji 82 w podkreślonym przedziale 9 są zastąpione przez alaninę zmieniając odpowiedni epitop.
- 8. Pochodna stafylokinazy według zastrz. 1, którą jest pochodna M3.8 posiadająca sekwencję aminokwasowąjak przedstawiono na figurze 1, w której aminokwasy Lys w pozycji 35, Glu w pozycji 38, Lys w pozycji 74, Glu w pozycji 75 i Arg w pozycji 77 w podkreślonych przedziałach 3 i 8 są zastąpione przez alaninę zmieniając odpowiedni epitop.
- 9. Pochodna stafylokinazy według zastrz. 1, którąjest pochodna M8.9 posiadająca sekwencję aminokwasowąjak przedstawiono na figurze 1, w której aminokwasy Lys w pozycji 74, Glu w pozycji 75, Arg w pozycji 77, Glu w pozycji 80 i Asp w pozycji 82 w podkreślonych przedziałach 8 i 9 są zastąpione przez alaninę zmieniając odpowiedni epitop.
- 10. Sposób wytwarzania pochopnyco stafyl okinazo wykyzującyeh ąmniejszcnąimmąnogenność w porównaniu ze stafylokinazą typu dzikiego posiadających sekwencję aminokwasową jak przedstawiono na figurze 1, w której jeden lub więcej aminokwasów w jednym lub więcej podkreślonym przedziale jest zastąpionych przez alaninę, niszcząc w ten sposób odpowiedni(e) epitop(y), znamienny tym, że obejmuje etapy:o. wytwornym iragmefitu D\A obejAujbceoo przynajmmej jmęść zc^wćncji wodującej stafylokinazę zapewniającej jej aktywność biologiczną;184 348b. przeprowadzenie in vitro ukierunkowanej mutagenezy na fragmencie DNA w celu zastąpienia jednego lub więcej kodonów dla aminokwasu typu dzikiego przez kodon alaniny;c. klonowanie zmutowanego fragmentu DNA do odpowiedniego wektora;d. transformowanie lub transfekowanie odpowiedniej komórki gospodarza wektorem; ie. hodowanie komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do ekspresji fragmentuDNA.
- 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że fragmentem DNA jest fragment EcoRi-Hind III 453 bp plazmidu pMEX602SAK. ukierunkowana mutageneza in vitro jest przeprowadzona w układzie mutagenezy kierowanej oligonukleotydem z użyciem plazmidu pMa/c i szczepu E. coli WK6MutS o uszkodzonym mechanizmie naprawy', a zmutowany fragment DNA jest ekspresjonowany w E. coli szczepu WK6.
- 12. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia zakrzepicy tętnic zawierająca substancję czynnąz odpowiednią zaróbką, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera przynajmniej jedną z pochodnych stafylokinazy wykazujących zmniejszoną immunogenność w porównaniu ze stafylokinazątypu dzikiego posiadających sekwencję aminokwasową jak przedstawiono na figurze 1, w której jeden lub więcej aminokwasów w jednym lub więcej podkreślonym przedziale jest zastąpionych przez alaninę, niszcząc w ten sposób odpowiedni(e) epitop(y).
- 13. Zastosowanie pochodnych stafylokinazy wykazujących zmniejszoną immunogenność w porównaniu ze stafylokinazątypu dzikiego posiadających sekwencję aminokwasową jak przedstawiono na figurze 1, w której jeden lub więcej aminokwasów w jednym lub więcej podkreślonym przedziale jest zastąpionych przez alaninę niszcząc w ten sposób odpowiedni(e) epitop(y) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zakrzepicy tętnic.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95200023A EP0721982A1 (en) | 1995-01-06 | 1995-01-06 | New staphylokinase derivatives |
| US08/371,505 US5695754A (en) | 1995-01-06 | 1995-01-11 | Staphylokinase derivatives |
| EP95201531A EP0721013B1 (en) | 1995-01-06 | 1995-06-09 | New staphylokinase derivatives |
| US49909295A | 1995-07-06 | 1995-07-06 | |
| JP7299781A JPH08289790A (ja) | 1995-01-06 | 1995-11-17 | 新規なスタフィロキナーゼ誘導体 |
| PCT/EP1996/000081 WO1996021016A2 (en) | 1995-01-06 | 1996-01-03 | New staphylokinase derivatives |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL321181A1 PL321181A1 (en) | 1997-11-24 |
| PL184348B1 true PL184348B1 (pl) | 2002-10-31 |
Family
ID=27514236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96321181A PL184348B1 (pl) | 1995-01-06 | 1997-07-04 | Nowe pochodne stafylokinazy, sposób ich wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie pochodnych |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0793723B1 (pl) |
| JP (1) | JPH08289790A (pl) |
| CN (1) | CN1154729C (pl) |
| AT (1) | ATE306550T1 (pl) |
| AU (1) | AU705119B2 (pl) |
| BG (1) | BG64344B1 (pl) |
| BR (1) | BR9606724A (pl) |
| CA (1) | CA2206479A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ290685B6 (pl) |
| DE (1) | DE69635269T2 (pl) |
| EA (1) | EA000121B1 (pl) |
| EE (1) | EE9700150A (pl) |
| ES (1) | ES2248805T3 (pl) |
| FI (1) | FI972862A (pl) |
| HU (1) | HUP9802915A3 (pl) |
| NO (1) | NO973083L (pl) |
| NZ (1) | NZ298801A (pl) |
| PL (1) | PL184348B1 (pl) |
| RO (1) | RO116969B1 (pl) |
| SK (1) | SK89297A3 (pl) |
| TR (1) | TR199700600T1 (pl) |
| WO (1) | WO1996021016A2 (pl) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5951980A (en) * | 1995-01-06 | 1999-09-14 | Leuven Research & Development Vzw | Identification, production and use of new staphylokinase derivatives with reduced immunogenicity |
| EP1277762B1 (en) * | 1998-10-30 | 2008-03-26 | Novozymes A/S | Low allergenic protein variants |
| US6686164B1 (en) | 1998-10-30 | 2004-02-03 | Novozymes A/S | Low allergenic protein variants |
| CN100342007C (zh) * | 2000-01-28 | 2007-10-10 | 复旦大学 | 一种新型重组葡激酶及其制备方法 |
| US6673580B2 (en) | 2000-10-27 | 2004-01-06 | Genentech, Inc. | Identification and modification of immunodominant epitopes in polypeptides |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0621899B1 (de) * | 1991-12-30 | 1996-06-19 | Medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH | Expression signalpeptid-freier staphylokinasen |
-
1995
- 1995-11-17 JP JP7299781A patent/JPH08289790A/ja active Pending
-
1996
- 1996-01-03 WO PCT/EP1996/000081 patent/WO1996021016A2/en active IP Right Grant
- 1996-01-03 AU AU44377/96A patent/AU705119B2/en not_active Ceased
- 1996-01-03 AT AT96900577T patent/ATE306550T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-01-03 CZ CZ19972104A patent/CZ290685B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-01-03 RO RO97-01250A patent/RO116969B1/ro unknown
- 1996-01-03 ES ES96900577T patent/ES2248805T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-03 CA CA002206479A patent/CA2206479A1/en not_active Abandoned
- 1996-01-03 TR TR97/00600T patent/TR199700600T1/xx unknown
- 1996-01-03 EP EP96900577A patent/EP0793723B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-03 EE EE9700150A patent/EE9700150A/xx unknown
- 1996-01-03 CN CNB961913509A patent/CN1154729C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-03 NZ NZ298801A patent/NZ298801A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-01-03 BR BR9606724A patent/BR9606724A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-01-03 SK SK892-97A patent/SK89297A3/sk unknown
- 1996-01-03 HU HU9802915A patent/HUP9802915A3/hu unknown
- 1996-01-03 DE DE69635269T patent/DE69635269T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-03 EA EA199700073A patent/EA000121B1/ru not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-06-03 BG BG101556A patent/BG64344B1/bg unknown
- 1997-07-02 NO NO973083A patent/NO973083L/no not_active Application Discontinuation
- 1997-07-04 PL PL96321181A patent/PL184348B1/pl unknown
- 1997-07-04 FI FI972862A patent/FI972862A/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08289790A (ja) | 1996-11-05 |
| EE9700150A (et) | 1997-12-15 |
| NO973083D0 (no) | 1997-07-02 |
| EP0793723B1 (en) | 2005-10-12 |
| AU705119B2 (en) | 1999-05-13 |
| CZ290685B6 (cs) | 2002-09-11 |
| AU4437796A (en) | 1996-07-24 |
| ES2248805T3 (es) | 2006-03-16 |
| EP0793723A2 (en) | 1997-09-10 |
| HUP9802915A3 (en) | 2001-02-28 |
| CA2206479A1 (en) | 1996-07-11 |
| ATE306550T1 (de) | 2005-10-15 |
| DE69635269T2 (de) | 2006-06-14 |
| BR9606724A (pt) | 1998-01-13 |
| CN1154729C (zh) | 2004-06-23 |
| MX9705041A (es) | 1998-07-31 |
| NZ298801A (en) | 2000-01-28 |
| NO973083L (no) | 1997-08-04 |
| WO1996021016A2 (en) | 1996-07-11 |
| EA199700073A1 (ru) | 1997-12-30 |
| DE69635269D1 (de) | 2006-02-23 |
| SK89297A3 (en) | 1998-05-06 |
| TR199700600T1 (xx) | 1998-01-21 |
| CN1168156A (zh) | 1997-12-17 |
| FI972862A (fi) | 1997-09-03 |
| PL321181A1 (en) | 1997-11-24 |
| BG64344B1 (bg) | 2004-10-29 |
| RO116969B1 (ro) | 2001-08-30 |
| WO1996021016A3 (en) | 1996-09-12 |
| HUP9802915A2 (hu) | 1999-03-29 |
| CZ210497A3 (en) | 1997-11-12 |
| FI972862A0 (fi) | 1997-07-04 |
| EA000121B1 (ru) | 1998-08-27 |
| BG101556A (en) | 1998-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5759542A (en) | Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases | |
| JP5819293B2 (ja) | プラスミノーゲンおよびプラスミンの変異体 | |
| US5951980A (en) | Identification, production and use of new staphylokinase derivatives with reduced immunogenicity | |
| US6136323A (en) | Bacterial plasmin receptors as fibrinolytic agents | |
| US20090087421A1 (en) | Novel Recombinant Staphylokinase Derivatives and the Preparations and Applications thereof | |
| EP1053330B1 (en) | Identification, production and use of staphylokinase derivatives with reduced immunogenicity and/or reduced clearance | |
| PL184348B1 (pl) | Nowe pochodne stafylokinazy, sposób ich wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie pochodnych | |
| US5695754A (en) | Staphylokinase derivatives | |
| PT669394E (pt) | Variantes de uroquinase bifuncionais com propriedades fibrinoliticas melhoradas e actividade inibidora de trombina | |
| EP1200562B1 (en) | Cell lines, ligands and antibody fragments for use in pharmaceutical compositions for preventing and treating haemostasis disorders | |
| EP0721013B1 (en) | New staphylokinase derivatives | |
| EP2370574B1 (en) | Mutants of staphylokinase carrying amino and carboxy-terminal extensions for polyethylene glycol conjugation | |
| JP3399963B2 (ja) | 新規スタフィロキナーゼ誘導体 | |
| US6902733B2 (en) | Staphylokinase derivatives with polyethyleneglycol | |
| KR20130099027A (ko) | 혈전용해 및 응고억제 특성을 갖는 단백질 융합 구조물 | |
| MXPA97005041A (en) | New derivatives of estafilocin | |
| Vanderschueren et al. | Staphylokinase: Biochemistry And Pharmacodynamics | |
| AU2003248284A1 (en) | Identification, production and use of staphylokinase derivatives with reduced immunogenicity and/or reduced clearance |