CN1235914C - 含有至少一个具有生物素或生物素衍生物共价键的具有抗血栓形成活性的多糖 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有抗血栓形成活性的新型合成多糖，该多糖具有至少一个与生物素或生物素衍生物相连的共价键，本发明还涉及能够中和这些多糖的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的使用方法。
Description
本发明涉及具有至少一个连接生物素或生物素衍生物共价键，并具有肝素抗凝血和抗血栓形成药理活性的新型合成低聚糖和多糖类。
肝素，特别通过抗凝血酶III(AT III)催化对两种介入到凝血历程中的酶，即Xa因子和IIa因子(即凝血酶)的抑制。低分子量肝素(HBPM)制剂含有由4～30个单糖形成的链，对Xa因子比对凝血酶具有更强的选择性。
众所周知，对Xa因子的抑制须要通过与抗凝血酶相连的区域(A-区)把肝素固定在AT III上，还知道，对IIa因子(凝血酶)的抑制必须经过A-区将其固定在AT III上，以及通过不那么确定连接的区域(T-区)固定在凝血酶上。
合成的相当于肝素A-区的低聚糖是已知的。在比如专利EP 84999和EP 529715中，在WO 99/36428号下公布的专利申请以及出版物Bioorg.Med.Chem.1998，6，1509～1516中都对此进行了叙述。这些合成的低聚糖具有通过抗凝血酶III选择性地抑制凝血因子Xa的性能，而对凝血酶却没有任何活性。在静脉血栓形成当中它们都显示出抗凝血的活性。
在专利申请WO 98/03554和WO 99/36443中叙述了能够经过活化AT III来抑制凝血酶和Xa因子的合成低聚糖。
在这些专利申请中叙述了具有生物活性的硫酸化和烷基化的多糖衍生物。它们特别是抗凝血剂和抗血栓形成剂。特别显示出，这些硫酸化和烷基化的多糖，根据在糖苷骨架上烷基和硫酸根排列的不同，可能是强的抗血栓形成剂和抗凝血剂。更一般地看，已经发现，通过构成多糖的序列，能够精确地调整GAG型的活性，以得到具有肝素抗凝血和抗血栓形成药物性能的活性很强的化合物。与肝素相比，它们具有的优点是有确定的结构，而且不与血小板的4因子发生反应，不会产生肝素的血小板减少的作用。
但是，在人类的治疗中使用在专利申请WO 98/03554和WO99/36443以及在专利EP 529715中叙述的某些产品可能遇到困难，特别是如果这些产品具有很长的半衰期的话。在用上述产品预防或者治疗血栓形成的领域中，应该在恢复或保持血液流动性的同时避免造成出血。
实际上还知道，对于某些意外的原因，正在治疗当中的病人可能会出现出血。也可能须要对正在进行抗凝血治疗的病人进行外科的介入。另外，在某些外科手术中，可能使用大剂量的抗凝血剂，以阻止血液凝聚，而在手术结束时又必须中和这些抗凝血剂。因此，具有一种可以中和的抗凝血剂，以在任何时间终止抗凝血剂的活性是很有意义的。当然，如上所述，合成的低聚糖已知不能很容易地被已知的含有精蛋白硫酸盐的肝素解剂或HBPM所中和。
本发明涉及新型的合成多糖，其结构与在专利申请WO 98/03554和WO 99/36443以及在专利EP 529715中叙述的化合物相近：作为本发明目的的合成低聚糖的结构在如下的方面是改性的，它具有与生物素(六氢-2-氧代-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑基-4-戊酸)或者与生物素衍生物的共价键。意外地显示出生物素或生物素衍生物的引进没有改变该多糖的药物活性。实际上，作为本发明目的的新型多糖具有与现有技术的低聚糖相当的抗血栓形成活性。但是它们还具有在紧急状态下能够迅速地被专门的解剂中和的优点。这种专门的解剂是抗生物素蛋白(The Merck Index，第12版，1996，M.N.920，第151～152页)或抗生蛋白链菌素，这是两种分子量大约等于66000和60000Da的四聚蛋白质，对生物素具有很强的亲和力。
按照一般的方式，本发明涉及具有生物素或生物素衍生物的至少一个共价键的、具有抗凝血活性的合成多糖。
作为生物素衍生物，可以举出在《Pierce目录1999-2000》的第62～81页所指出的衍生物，比如6-生物素酰胺己酸，
或者6-(6-生物素酰胺基己酰氨)己酸
或者2-生物素酰胺基乙硫醇
或者如下通式的各种化合物：
本发明的目的特别是如通式(I)的多糖以及它们的可药用盐：
其中：
—波浪线表示位于吡喃糖环平面下面或者上面的键，
Po表示含有相同或不同的n个单糖单元的多糖，由其异头碳与Pe连接起来，
是具有吡喃糖结构的单糖单元的示意性的表示，这些吡喃糖选自己糖、戊糖和相应的脱氧蔗糖，这些单元由其异头碳与另一个单糖单元连接，而且这些单元的羟基被相同或不同的基团R1取代，R1如在下面所定义，
—Pe表示如下结构的五糖：
—h等于1或2；
—n是整数，可以取0～25的各个值；
—R1表示链-T-Biot、C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -；
—R2表示链-T-Biot、C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -；
—R3表示链-T-Biot、C1～C6烷氧基；
—R4表示链-T-Biot、C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，或者R4构成-O-CH2-桥，基团-CH2-连接在同一个环上带有羧基官能团的碳原子上；条件是：取代基R1、R2、R3或R4中至少一个表示基团-T-Biot；
—W表示氧原子或亚甲基；
—T表示选自下面的链中的一个：
NH，
或者
其中j和k相同或不同，是取自1～10的整数；
-Biot表示如下的基团：
如在前面所指出的，在本说明中一般要注意到，波浪线表示位于吡喃糖平面以下或者以上的键。
在Po中所含的单糖彼此可以相同或不同，糖苷间的键可以是α型或者β型的。
这些单糖有利地选自D-或L-己糖Alose、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、galose、艾杜糖、乳糖、塔罗糖(在此情况下h＝2)或者选自D-或L-戊糖核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖(在此情况下h＝2)。也可以使用其他单糖，比如脱氧蔗糖(h＝1和/或-CH2R1＝CH3)。
多糖部分Po可以由0～25个烷基化和二硫酸化或三硫酸化的单糖单元组成。
多糖部分Po也可以由0～25个烷基化和单硫酸化或二硫酸化的单糖单元组成。
多糖部分Po可以由0～25个不带电荷的和/或部分带电荷和/或带全部电荷的烷基化单糖单元组成。
带电荷的或不带电荷的单元可以沿着链分布，或者相反集合在糖的带电荷区域或不带电荷区域中。
单元之间的键是1，2；1，3；1，4；1，5；1，6-键，是α型或β型的。
在本说明中，对于L-艾杜糖醛酸，选择1C4构象，对于D-葡萄糖醛酸，选择4C1构象，但是众所周知的是，在溶液中的单糖单元的构象是波动的。
比如，L-艾杜糖醛酸的构象可以是1C4 2S0或4C1。
按照本发明的一个方面，它涉及如下通式(I.1)的多糖及其可药用盐：
其中：
表示特定的一类多糖Po，由其异头碳与对于(I)所定义的Pe连接在一起，
如对(I)所定义，
—基团R1如对(I)所定义，对于同一单糖，它们可以是相同或者不同的，
—在[]m中所含的单糖被重复m次，在[]t中所含的单糖被重复t次，在[]p中所含的单糖被重复p次，
—m是1～5的整数；t是0～24的整数；p是0～24的整数，条件是1≤m+t+p≤25，
在这些通式(I.1)的多糖中，其中取代基R1、R2、R3或R4中只有一个表示链T-Biot，T和Biot如对(I)所定义，及其可药用盐构成本发明的另一方面。
按照本发明的一个特定的方面，它涉及通式(I.2)的十六环糖及其可药用盐：
其中：
—T表示选自下面的链：
NH，
或者
其中，j和k相同或不同，是取自1～10的整数；
—Biot表示如下的基团：
—Pe表示如下结构的五糖：
其中：
—R1表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，
—R2表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，
—R3表示C1～C6烷氧基，
—R4表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，或者R4构成-O-CH2-桥，基团-CH2-与同一个环上带有羧基官能团的碳原子相连，
—W表示氧原子或亚甲基。
按照本发明的另一个方面，它涉及如下通式(I.3)的五糖及其可药用盐：
其中R1、R2、R3、R4和W如对(I)所定义。
在通式(I.3)的这些五糖中，其中取代基R1、R2、R3或R4中只有一个表示链-T-Biot，T和Biot都如对(I)所定义，及其可药用盐构成本发明的另外一个方面。
在通式(I.3)的这些多糖中，本发明的目的是如下通式(I.4)的五糖及其可药用盐：
其中：
—T表示选自下面的链：
NH，
或者
其中，j和k相同或不同，是取自1～10的整数；
—Biot表示如下的基团：
其中：
—R1表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，
—R2表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，
—R3表示C1～C6烷氧基，
—R4表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，或者R4构成-O-CH2-桥，基团-CH2-与同一个环上带有羧基官能团的碳原子相连，
—W表示氧原子或亚甲基。
按照本发明的另外的方面，它涉及如下的多糖：
—甲基(2，3，4，6-四-O-磺酸根合(sulfonato)-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-生物素酰胺基-6-脱氧-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺酸根合-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸(idopyranosyluronique))-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-吡喃葡糖苷，钠盐，
—甲基(2，3，4，6-四-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-[6-(生物素酰胺基己酰胺基)己酰胺基]-6-脱氧-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺酸根合-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐；
—甲基(2，3，4，6-四-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-[6-(6-生物素酰胺基己酰胺基)己酰胺基]-6-脱氧-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺酸根合-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐；
—甲基(2-生物素酰胺基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐
—甲基-(2-[N-(6-生物素酰胺基己酰基)]-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐；
—甲基-(2-[6-(6-生物素酰胺基己酰胺基)己酰胺基]-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐。
本发明包括呈其酸的形式或者呈其任何一种可药用盐形式的多糖。在酸的形式中，官能团-COO-和-SO3 -分别呈-COOH和-SO3H的形式。
本发明“多糖的可药用盐”意味着，一种多糖，其中一个或多个官能团-COO-和/或-SO3 -以离子的形式连接在可药用的阳离子上。按照本发明的优选盐，其阳离子选自碱金属阳离子，其阳离子更优选是Na+或K+。
上述的通式(I)化合物还包括其中一个或多个氢原子或碳原子被放射性同位素，比如氚或碳-14代替的化合物。这样的标记化合物，在生物化学试验中，作为配位体被用于代谢或药物代谢动力学的研究工作中。
原则上，制备本发明化合物的方法使用了如在以前文献中所报道而制备的二环糖或低聚糖碱的合成子。特别将参考专利或专利申请EP300,099、EP 529,715、EP 621,282和EP 649,854以及C.vanBoeckel，M.Petitou的文献Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1993，32，1671～1690。然后将这些合成子互相偶合，以提供按照本发明的多糖的完全被保护的相应化合物，该被保护的相应物随后转化成本发明化合物。
上面所提到的碱合成子之一含有特定的被保护官能团，这些官能团在以后能够引入生物素或者生物素衍生物，比如呈叠氮基形式的潜伏型胺官能团或者呈N-邻苯二酰亚胺基形式的被保扩的胺官能团。
在上面提到的偶合反应中，对其异头碳具有活性的“供体”二环糖或低聚糖与具有游基羟基的“受体”二环糖或低聚糖反应。
本发明涉及通式(I)化合物的制备方法，其特征在于，在第一步中，合成所需多糖(I)的完全被保护的相应化合物，该化合物含有被保护的区域Pe的前体，在其非还原性的一端，延续出硫酸化我糖的被保护前体Po，这些前体中的一种特别含有胺官能团，此官能团适当地被保护，以便以后引入生物素或生物素衍生物；在第二步，引入和/或曝露出带有负电荷的基团；在第三步，将胺官能团解保护，然后引入生物素或生物素衍生物。
按照上述的方法，特别是在专利申请WO 98/03554和WO 99/36443以及在上面所引用文献中叙述的方法来合成Pe。
按照本领域已知的反应，使用合成低聚糖的方法(G.J.Boon，Tetrahedron，1996，52，1095～1211、WO 98/03554和WO 99/36443)合成前体多糖部分Po，或者当糖苷键的低聚糖供体与糖苷键的低聚糖受体偶合，以得到其尾部等于两个活性片段的尾部之和的另一种低聚糖时，使用低聚糖。重复此步骤，直到得到所需的通式(I)化合物。按照本领域技术人员已知的规律，最终所需化合物电荷的种类和分布决定在合成的不同步骤中所用的化合物的种类。可以参照比如C.vanBoeckel、M.Petitou的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1993，32，1671～1690还有H.Paulsen的“低聚糖络合物的选择性化学合成进展”Angew.Chem.Int.Ed.Engl.21。155～173(1982)。
使用如下反应链，由其完全被保护的多糖前体得到本发明的化合物：
—先将醇官能团转化为O-磺基，并通过消去在制造骨架时使用的保护基将羧酸解保护；然后
—引入磺基；
—将能够引入生物素或生物素衍生物的胺官能团解保护；
—通过传统的氨基/酸偶合反应引入生物素或生物素衍生物。
当然能够使用合成低聚糖的本领域技术人员已知的不同策略来制备本发明的化合物。
上述方法是本发明优选的方法。然而，通式(I)化合物可以由在比如P.M.Collins和R.J.Ferrier所著的《单糖、其化学及其在天然产品中的作用》(John.Wiley & Sons出版社，1995)和在G.J.Boons，Tetrahedron，1996，52，1095～1121中所述的糖化学所熟知的其他方法来制备。
因此，由按照C.van Boeckel和M.Petitou的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1993，32，1671～1690中叙述的方法所制备的二糖合成子能够得到五糖Pe。
在制备化合物(I)的方法中使用的保护基是在糖化学中通常使用的保护基，比如在T.W.Greene的《有机合成中的保护基团》(JohnWiley & Sonss，New-York，1981)中所述的保护基团。
保护基团有利地选自比如乙酰基、卤代甲基、苯甲酰基、乙酰丙酰基、苄基、取代苄基、任选取代的三苯甲基、四氢吡喃基、烯丙基、戊烯基、叔丁基二甲基甲硅基(tBDMS)或三甲代甲硅烷基乙基。
活化剂基团是在糖化学中传统使用的基团，比如按照G.J.Boons，Tetrahedron，1996，52，1095～1121。这些活化剂基团选自亚胺盐(imidates)、硫葡糖苷、戊烯基葡糖苷、黄原酸根、亚磷酸根或卤化物。
涉及到生物素与低聚糖相连的方式以及生物素衍生物的种类，化学文献给出了另外一种可能性，可以使用本领域技术人员已知的保护基团。将优选使用胺官能团或者硫醇官能团，还可以使用羧酸官能团或醛官能团，它们都能够与含有活化酯类、马来酰亚胺、碘代乙酰基或伯胺基等活性基团的生物素衍生物发生反应，此反应按照在文献(参见Savage等人的《抗生物素蛋白-生物素化学：手册》Pierce Chemical公司，1992)中叙述的条件进行。
如上所述的方法能够得到呈盐形式的化合物。为了得到相应的酸，要将呈盐形式的本发明化合物与呈酸形式的阳离子型离子交换树脂接触。
然后可以用碱中和呈酸形式的本发明化合物，得到希望的盐。为了制备通式(I)化合物的盐，可以使用各种能够与通式(I)化合物一起给出可药用盐的无机碱或有机碱。优选使用如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化镁的碱。通式(I)化合物的钠盐和钙盐是优选的盐。
按照本发明的化合物作为生物化学和药物研究的对象。
这些化合物的总体抗血栓形成活性及其中和的性能在一个静脉血栓的模型中进行了研究，这个模型是如在J.-M.Herbert等人的Blood，1998，91，4197～4205中所述，给老鼠注射组织因子，然后在腔静脉中形成淤血。在此模型中，在静脉注射0.1～30mmol/kg的此化合物以后，获得60％的血栓形成抑制。以1～1000的摩尔比注射抗生物素蛋白能够明显地降低这些化合物的抗血栓形成效果，获得的降低可高于50％。同时，以上述的剂量注射抗生物素蛋白中和了这些化合物促出血的活性。同样，注射抗生物素蛋白也中和了由抗-Xa活性和/或抗IIa活性测量的低聚糖的循环活性。
因此，本发明的另一个目的是使用抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的方法，其特征在于，它可以中和本发明的多糖。可以使用抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素来制备用于中和本发明多糖的药物。
由于本发明低聚糖的生物化学和药物学上的活性，它们构成了很有意义的药物。其毒性与这样的用途完全适合。它们也很稳定，因此特别适合于构成专门药物的活性成分。
它们还可以用于各种由于凝血系统的体内稳定功能改变的疾病，特别是在心血管系统和脑血管系统疾病，比如与动脉硬化和糖尿病有关的血栓栓塞疾病，象不稳定性心绞痛、中风、血管成形术、动脉内膜切除术、放置血管内植入体后的再狭窄，或者与血栓溶解后的再栓塞、梗死、局部缺血源的痴呆、外周动脉疾病、血液透析、心房纤维性颤动有关的血栓栓塞疾病或者当使用主动脉冠状动脉架桥的血管植入体时的血栓栓塞疾病。这些化合物还可用于治疗或预防静脉源的血栓栓塞疾病，比如肺栓塞。它们可用于预防或治疗比如在外科手术、肿瘤生长或由细菌、病毒或酶激活剂所诱发的凝血错乱所观察到的血栓形成并发症。在其用于放置植入体(prothèses)时，本发明的化合物能够覆盖住植入体，如此使其与血液相容。它们特别可固定在静脉内植入体(Stents)上。在此情况下，如在EP 649,854中所述，可通过在未还原或已还原的末端引入适当的链(bras)，任选对它们进行化学改性。
当用多孔型气囊进行动脉内膜切除术时，本发明的化合物还可以用做佐剂。
本发明的化合物可用于制备治疗上述各种疾病用的药物。
因此，按照本发明的另一方面，其目的是一种药物组合物，该组合物含有按照本发明合成的多糖或者其可药用盐作为活性成分，还任选含有一种或多种适当的惰性赋形剂。
所述赋形剂按照药物的形状和希望给药的形式来选择：口服、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、透肌肉、局部或者直肠给药。
活性成分还可以以与环糊精，比如α-、β-或γ-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精或甲基-β-环糊精的络合物的形式存在。
活性成分也可以由含有它的气囊或者由送入血管的血管内扩张器释放出。活性成分的药物活性并不受到影响。
在每一个单剂中，活性成分的量都与为了得到所希望的预防或治疗效果所设想的日剂量相适应。每个单剂可含有0.1～100mg的活性成分，优选含有0.5～50mg。这样的剂量的抗凝血化合物将能够用(静脉)注射、快速灌注(bolus)或输注液注射1～1000mg剂量的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素所中和。
本发明的化合物还可以与一种或多种其他用于所希望治疗的活性成分联合使用，比如与抗血栓形成药、抗凝药、抗血小板凝结药等，如潘生丁、阿司匹林、氯苄噻啶、氯吡格雷或糖蛋白IIa/IIIa络合物拮抗剂。
下面的方法、制备例和示意式说明用于得到本发明多糖的不同中间体的合成方法。使用了如下的缩写：
Bn：苄基；Bz：苯甲酰基；CCM：薄层色谱；Ts：甲苯磺酰基；Lev：乙酰丙酰基；Et：乙基；Ph：苯基；Me：甲基；Ac：乙酰基；SE：三甲代甲硅烷基乙基；ESI：是英文“电子喷射离子化”的缩写；生物素：六氢-2-氧代-1H-噻吩并[3，4-d]-咪唑-4-戊酸；Z：苯甲酰氧羰基。
在后面，作为说明性的例子，详细地叙述了本发明化合物的合成实例。
示意式1-三糖9的合成
制备例1
2-(三甲代甲硅烷基)-乙基-4，6-O-亚苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(2)
在0℃下，在化合物1(15.8g，42.8mmol)(按照K.Jansson等人的J.Org.Chem.，1988，53，5629～5647制备)和甲基碘(20mL，319mmol)在四氢呋喃(350mL)中的溶液里每次少量加入氢化钠(18g)。在环境温度下搅拌反应混合物4hr。用甲醇分解过量的氢化钠，将反应混合物倒入冰水(1.5L)中。在用乙酸乙酯萃取后，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，用硫酸钠干燥，然后真空浓缩。用二氧化硅凝胶柱状色谱(环己烷/乙酸乙酯15/1(v/v))提纯残渣，得到16.8g化合物2。
[α]D＝-41°(c＝0.69，二氯甲烷)。
制备例2
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(3)
在化合物2(16g，40.3mmol)在四氢呋喃(600mL)的溶液里相继加入粉末状的3_分子筛(82g)、甲基橙(显色指示剂)、硼氢氰化钠(34g，526mmol)，然后滴加饱和的氯化氢乙醚溶液，直到得到玫瑰色。在过滤和用乙酸乙酯萃取后，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机相，用硫酸钠干燥，然后进行真空浓缩。在二氧化硅凝胶上进行柱状色谱提纯(甲苯/乙酸乙酯3/1(v/v))，得到12.5g化合物3。
[α]D＝-42°(c＝1.2，二氯甲烷)。
制备例3
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(2，3-二-O-苯甲酰基-4，6-O-亚苄基-α-D-吡喃葡糖基)(1→4)-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(5)
在氩气气氛下将硫葡糖苷4(16.52g，16.60mmol)(按照专利申请WO 99/36443的制备例1得到)、化合物3(6.0g，15.05mmol)和粉末状4_分子筛(16.7g)的甲苯(300mL)中的混合物搅拌1hr。然后将此混合物冷却到-20℃。在反应混合物中滴加N-碘代琥珀酰亚胺(3.9g，17.4mmol)和三氟甲磺酸(0.17mL，1.97mmol)在二氯甲烷/二噁烷1/1(v/v)混合物中的溶液。10min以后，过滤反应混合物，用二氯甲烷稀释，相继用1M的硫代硫酸钠溶液、10％的碳酸氢钠溶液和水洗涤，用硫酸钠干燥，然后进行真空浓缩。在二氧化硅凝胶柱状上进行色谱提纯(甲苯/乙酸乙酯6/1(v/v))，得到18.8g三糖5。
[α]D＝+34°(c＝1.26，二氯甲烷)。
制备例4
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(4，6-O-亚苄基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(6)
在化合物5(18.7g，14mmol)在甲醇-二噁烷1/1(v/v)混合物的溶液里加入叔丁酸钾(3.15g)。在环境温度下搅拌2hr。用Dowex_50WX4 H+树脂中和反应混合物，过滤并进行真空浓缩。用二氧化硅凝胶对残渣进行柱状色谱提纯(二氯甲烷/甲醇20/1(v/v))，得到10.0g化合物6。
[α]D＝+29°(c＝1.11，二氯甲烷)。
制备例5
2-(三甲代甲硅烷基)乙基(4，6-O-亚苄基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(7)
在氩气气氛下，于冷却到0℃的化合物6(9.93g，12.24mmol)、甲基碘(9.0mL，138mmol)在无水四氢呋喃(100mL)中的混合物里以每次少量加入氢化钠(5.2g，216mmol)。在环境温度下搅拌混合物20hr。用甲醇分解过量的氢化钠，把反应混合物倒入500mL冰水中。在用乙酸乙酯萃取后，用饱和氯化钠溶液洗涤有机相，用硫酸钠进行干燥，然后进行真空浓缩，得到11g化合物7，不经提纯用于下一步。
CCM：Rf＝0.38，二氧化硅凝胶，甲苯/乙酸乙酯3/2(v/v)。
制备例6
2-(三甲代甲硅烷基)乙基(2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(8)
把化合物7(11g)溶解于60％的醋酸(180mL)中，在80℃下搅拌1hr 30min。浓缩混合物并与甲苯一起共蒸发。在二氧化硅凝胶柱子上进行色谱提纯(甲苯/丙酮2/2(v/v))，得到8.46g化合物8。
CCM：Rf＝0.36，二氧化硅凝胶，甲苯/丙酮1/1(v/v)。
制备例7
2-(三甲代甲硅烷基)乙基(6-O-苯甲酰基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(9)
在化合物8(8.41g，10.6mmol)在二氯甲烷(110mL)中的溶液里加入1-苯甲酰氧基-1H-苯并三唑(5.36g，22.4mmol)和三乙胺(3.32mL)。在环境温度下搅拌混合物20hr，然后用二氯甲烷稀释，用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，用硫酸钠干燥，然后进行真空浓缩。在二氧化硅凝胶柱子上进行色谱提纯(环己烷/乙酸乙酯/乙醇5/0.5/0.25(v/v/v))，得到8.40g化合物9。
[α]D＝+15°(c＝2，二氯甲烷)。
示意式2-合成五糖14
制备例8
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(2，3-二-O-苯甲酰基-4，6-O-亚苄基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-O-苯甲酰基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(10)
按照在制备例3中叙述的操作模式，把化合物9转化为化合物10。
[α]D＝+42°(c＝2，二氯甲烷)。
制备例9
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(4，6-O-亚苄基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(11)
按照在制备例4中叙述的操作模式，把化合物10转化为化合物11。
CCM：Rf＝0.35，二氧化硅凝胶，二氯甲烷/甲醇10/1(v/v)。
制备例10
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(4，6-O-亚苄基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(12)
按照在制备例5中叙述的操作模式，把化合物11转化为化合物12。
CCM：Rf＝0.11，二氧化硅凝胶，环己烷/乙酸乙酯1/2(v/v)。
制备例11
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(13)
按照在制备例6中叙述的操作模式，把化合物12转化为化合物13。
CCM：Rf＝0.33，二氧化硅凝胶，环己烷/乙酸乙酯/乙醇2/0.5/0.5(v/v)。
制备例12
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(14)
按照在制备例7中叙述的操作模式，把化合物13转化为化合物14。
CCM：Rf＝0.16，二氧化硅凝胶，环己烷/乙酸乙酯/乙醇3/0.5/0.5(v/v)。
示意式3-合成七糖19
制备例13
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(2，3-二-O-苯甲酰基-4，6-O-亚苄基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-O-苯甲酰基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(15)
按照制备例3中所述的操作模式，进行化合物14与二糖4的偶合反应，得到化合物15。
[α]D＝+52°(c＝1.1，二氯甲烷)。
制备例14
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(4，6-O-亚苄基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(16)
按照制备例4中所述的操作模式，把化合物15转化为化合物16。
CCM：Rf＝0.31，二氧化硅凝胶，二氯甲烷/乙醇10/1(v/v)。
制备例15
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(4，6-O-亚苄基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]2-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(17)
按照制备例5中所述的操作模式，把化合物16转化为化合物17。
CCM：Rf＝0.46，二氧化硅凝胶，二氯甲烷/甲醇10/1(v/v)
制备例16
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(18)
按照制备例6中所述的操作模式，把化合物17转化为化合物18。
CCM：Rf＝0.42，二氧化硅凝胶，环己烷/乙酸乙酯/乙醇1/0.5/0.5(v/v/v)。
制备例17
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(6-O-苯甲酰基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(19)
按照制备例7中所述的操作模式，把化合物18转化为化合物19。
CCM：Rf＝0.25，二氧化硅凝胶，环己烷/乙酸乙酯/乙醇3/0.5/0.5(v/v/v)。
示意式4-合成九糖23
制备例18
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(2，3-二-O-苯甲酰基-4，6-O-亚苄基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-O-苯甲酰基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]2-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(20)
在氩气气氛下，将硫葡糖苷4(5.2g，5.23mmol)、七糖19(4.72g，2.75mmol)和粉末状4_分子筛在甲苯中的混合物搅拌1hr。此时在0℃下滴加N-碘代琥珀酰亚胺(1.36g，5.85mmol)和三氟甲磺酸(0.140mL，1.56mmol)在二氯甲烷/二噁烷1/1(v/v)(32mL)中的溶液。15min以后，过滤反应混合物，用二氯甲烷稀释，相继用1M的硫代硫酸钠溶液、10％的碳酸氢钠溶液和水洗涤，用硫酸钠干燥，然后进行真空浓缩。在二氧化硅凝胶柱子上将残渣进行色谱提纯(环己烷/乙酸乙酯/乙醇3/0.5/0.5(v/v/v))，得到7.13g化合物20。
[α]D＝+65°(c＝2，二氯甲烷)。
制备例19
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(4，6-O-亚苄基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]2-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(21)
按照在制备例4中所述的操作模式把化合物20转化为化合物21。
CCM：Rf＝0.27，二氧化硅凝胶，二氯甲烷/甲醇10/1(v/v)。
制备例20
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(4，6-O-亚苄基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(22)
按照在制备例5中所述的操作模式把化合物21转化为化合物22。
CCM：Rf＝0.31，二氧化硅凝胶，环己烷/乙酸乙酯/乙醇5/1/1(v/v/v)。
制备例21
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(23)
按照在制备例6中所述的操作模式把化合物22转化为化合物23。
CCM：Rf＝0.35，二氧化硅凝胶，环己烷/乙酸乙酯/乙醇2/1/1(v/v/v)。
示意式5-合成九糖29
制备例22
2-(三甲代甲硅烷基)乙基(2，3-二-O-甲基-6-O-甲苯磺酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(24)
在氩气气氛下，将化合物23(1.09g)溶解于吡啶(10mL)中，然后加入甲苯磺酰氯(1.03g)。搅拌2hr后，用二氯甲烷(100mL)稀释。相继用10％的碳酸氢钾水溶液和水洗涤有机相，干燥并蒸发至干。在二氧化硅凝胶柱子上进行色谱提纯(甲苯/丙酮2.3/2(v/v))以后，得到1.77g化合物24。
CCM：Rf＝0.5，二氧化硅凝胶，环己烷/乙酸乙酯/乙醇3/1/1(v/v/v)。
制备例23
2-(三甲代甲硅烷基)乙基(6-脱氧-2，3-二-O-甲基-6-苯二甲酰亚氨基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(25)
在含有粉末状4_分子筛的化合物24(500mg，0.23mmol)在无水N，N-二甲基甲酰胺(11mL)的溶液里加入苯邻二甲酰亚胺钾(225mg，1.38mmol)，然后加入王冠醚18-冠-6(121.5mg，0.46mmol)。在80℃下搅拌混合物4hr。在冷却以后，用二氯甲烷稀释反应混合物，在硅藻土上过滤，并浓缩。在凝胶Sephadex_LH 20(3×10cm)上将残渣进行色谱提纯(二氯甲烷/乙醇1/1(v/v))，然后用二氧化硅凝胶柱子(甲苯/乙醇11/2(v/v))进行色谱提纯，得到417.4mg化合物25。
CCM：Rf＝0.38，二氧化硅凝胶，甲苯/乙醇11/2(v/v)。
制备例24
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-脱氧-2，3-二-O-甲基-6-苯二甲酰亚氨基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-6-O-苄基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(27)
在氩气气氛下，将硫葡糖苷26(1.515g，1.546mmol)(按照专利WO 99/36443的制备例36的化合物41制备)、受体25(840mg，0.391mmol)和粉末状4_分子筛(2.15g)的混合物搅拌1hr。将反应混合物冷却到0℃，加入N-碘代琥珀酰亚胺(387mg)和三氟甲磺酸(55.4μL)在二氯甲烷/二噁烷1/1(v/v)中的溶液(7mL)。10min以后，过滤混合物，用甲苯稀释，相继用1M的硫代硫酸钠溶液、10％的碳酸氢钠溶液和水洗涤，用硫酸钠干燥，然后进行真空浓缩。在凝胶Sephadex_LH20上对残渣进行色谱提纯(二氯甲烷/乙醇1/1(v/v))，接着在二氧化硅凝胶柱子上进行色谱提纯(甲苯/丙酮5/4(v/v))，得到887mg化合物27。
[α]D＝+70°(c＝0.35，二氯甲烷)。
制备例25
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-脱氧-2，3-二-O-甲基-6-苯二甲酰亚氨基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(28)
在10％的炭载钯(750mg)存在下，在氢气压力下(5bar)，处理化合物27(750mg，0.245mmol)在醋酸(37mL)中的溶液2hr 30min。过滤后，浓缩此溶液，在二氧化硅凝胶柱子上通过色谱提纯此残渣(甲苯/乙醇6/1(v/v))，得到728mg化合物28。
CCM：Rf＝0.32，二氧化硅凝胶，甲苯/乙醇6/1(v/v)。
制备例26
2-(三甲代甲硅烷基)乙基-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-脱氧-2，3-二-O-甲基-6-苯二甲酰亚氨基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-6-O-乙酰基-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(29)
在化合物28(728mg，0.245mmol)在二氯甲烷(10mL)的溶液里加入三乙胺(51.1μL，0.368mmol)、醋酸酐(32.5L，0.344mmol)和二甲基氨基吡啶(6.0mg，0.049mmol)。搅拌1hr以后，用二氯甲烷稀释，相继用10％的碳酸氢钾溶液、水、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，用硫酸钠干燥，然后进行真空浓缩。在二氧化硅凝胶柱子上将残渣进行色谱提纯，得到0.618g化合物29。
CCM：Rf＝0.37，二氧化硅凝胶，甲苯/乙醇6/1(v/v)。
示意式6-合成低聚糖31
制备例27
(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-脱氧-2，3-二-O-甲基-6-苯二甲酰亚氨基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-6-O-乙酰基-2，3-二-O-甲基-D-吡喃葡糖苷(30)
把化合物29(579mg，0.192mmol)在三氟乙酸/二氯甲烷2/1(v/v)混合物(11.5mL)中的溶液搅拌1hr。用甲苯/乙酸正丙酯混合物2/1(v/v)(69mL)稀释，浓缩并用甲苯进行共蒸发。在二氧化硅凝胶柱子这对残渣进行色谱提纯(甲苯/乙醇5/1(v/v))，得到523mg化合物30。
CCM：Rf＝0.31，二氧化硅凝胶，甲苯/乙醇5/1(v/v)。
制备例28
(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-脱氧-2，3-二-O-甲基-6-苯二甲酰亚氨基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-6-O-乙酰基-2，3-二-O-甲基-D-吡喃葡糖三氯乙酰亚胺酸盐(trichloroacetimidate)(31)
在化合物30在二氯甲烷(3mL)的溶液里加入三氯乙腈(65.5μL，0.85mmol)和碳酸铈(88.4mg，0.27mmol)。搅拌2hr后，过滤混合物并浓缩。在二氧化硅凝胶柱子上对残渣进行色谱提纯(甲苯/乙醇6/1(v/v)+0.1％三乙胺)，得到447mg化合物31。
CCM：Rf＝0.35，二氧化硅凝胶，甲苯/乙醇6/1(v/v)。
示意式7-合成十六糖35
制备例29
甲基(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-脱氧-2，3-二-O-甲基-6-苯二甲酰亚氨基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-乙酰基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖糖醛酸苄酯)-(1→4)-(3，6-二-O-乙酰基-2-O-苄基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-碘代吡喃艾杜糖基糖醛酸苄酯)-(1→4)-2，3，6-三-O-苄基-α-D-吡喃葡糖苷(33)
在二氯甲烷/乙醚混合物1/2(v/v)(5.5mL)中溶解氨基乙酸盐31(370mg，0.121mmol)和化合物32(336mg，0.242mmol)(按照P.Westerduin等人在BioOrg.Med.Chem.，1994，2，1267得到)。在加入粉末状4_分子筛以后，把混合物冷却到-20℃，添加0.1M的三氟甲磺酸三甲基甲硅酯在二氯甲烷中的溶液(181.5μL)。25min以后，加入固体碳酸氢钠中和此混合物。在过滤和浓缩以后，在凝胶Sephadex_上对残渣进行色谱提纯，然后在二氧化硅凝胶柱子上进行色谱提纯(甲苯/丙酮6/5(v/v))，得到302mg化合物33。
[α]D＝+86°(c＝1，二氯甲烷)。
制备例30
甲基(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-脱氧-2，3-二-O-甲基-6-苯二甲酰亚氨基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-乙酰基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖糖醛酸)-(1→4)-(3，6-二-O-乙酰基-2-O-苄基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-碘代吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-α-D-吡喃葡糖苷(34)
在10％的碳载钯(104mg)存在下，在氢气压力下(4bar)，处理化合物33(104mg，0.024mmol)在醋酸(5mL)中的溶液4hr。在过滤以后，将溶液进行冷冻干燥，得到化合物34(87mg)，不经提纯用于下一步。
制备例31
甲基(α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-脱氧-2，3-二-O-甲基-6-苯二甲酰亚氨基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-α-D-吡喃葡糖苷(35)
在粉末状3_分子筛存在下，在化合物34(80mg，0.021mmol)在无水甲醇(6.9mL)中的溶液里加入1mol的甲醇钠在甲醇(140μL)中的溶液。在环境温度下经过20hr后，过滤并用醋酸中和。将溶液浓缩到一半，放入细的Sephadex_G-25柱子(3×92cm)上。在用水洗脱和冷冻干燥后，得到化合物35(66mg)。
示意式8-合成低聚糖37
制备例32
甲基-(2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-脱氧-2，3-二-O-甲基-6-苯二甲酰亚氨基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐(36)
将多元醇35(66.4mg，0.021mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(1.8mL)中。加入三氧化硫-三乙胺络合物(320mg，1.77mmol)，在55℃下搅拌混合物20hr。把溶液放在细Sephadex_G-25柱子(3×92cm)上，用0.2M的氯化钠溶液洗脱。浓缩含有产物的级分，使用同样的柱子，用水洗脱进行脱盐。在冷冻干燥后，得到83mg化合物36。
分子量：ESI法，负模式：化学分子量＝4968.92；实验分子量＝4966.52±0.16u.m.a.
制备例33
甲基-(2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-氨基-6-脱氧-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐(37)
把化合物36(83mg，0.017mmol)溶解于乙醇/水2/1(v/v)混合物中。加入水合肼(81.2μL，1.67mmol)，将混合物回流20hr。把溶液置于细Sephadex_G-25柱子(3×92cm)上用水洗脱。在浓缩含有产物的级分以后，把残渣溶解于乙醇/水2/1(v/v)(5.00mL)混合物中，用水合肼(81.2μL)按上述条件重新处理，得到71mg化合物37。
分子量：ESI法，负模式：化学分子量＝4838.32；实验分子量＝4814.6±0.70u.m.a.
示意式9-合成五糖39
制备例34
甲基(6-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸苄酯)-(1→4)-(3，6-二-O-乙酰基-2-O-苄基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸苄酯)-(1→4)-2，3，6-三-O-苄基-α-D-吡喃葡糖苷(39)
把化合物6-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-α，β-D吡喃葡糖三氯乙酰亚胺酸酯38(265mg，0.631mmol)(按照J.Basten等人在Bioorg.Med.Chem.Lett.(1992)，2(9)，901的方法得到)和化合物32(584mg，0.420mmol)(按照P.Westerduin等人在BioOrg.Med.Chem.，1994，2，1267的方法得到)溶解于二氯甲烷/乙醚1/2(v/v)(28.5mL)混合物中。在加入粉末状4_分子筛以后，把混合物冷却到-20℃，加入0.1M的三氟甲磺酸三甲基甲硅酯在二氯甲烷(94.6μL)中的溶液。10min以后，重新加入亚胺酸酯(imidate)(53.8mg)，然后加入0.1M的三氟甲磺酸三甲基甲硅酯在二氯甲烷(19.2μL)中的溶液。10min以后，加入固体碳酸氢钠中和混合物。在过滤和浓缩以后，在二氧化硅凝胶柱子上将残渣进行色谱提纯(甲苯/乙酸乙酯3/1(v/v))，得到499mg化合物39。
[α]D＝+66°(c＝1.07，二氯甲烷)。
示意式10-合成五糖44(方法1)
制备例35
甲基(6-O-乙酰基-2-氨基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(3，6-二-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-α-D-吡喃葡糖苷(40)
在10％的碳载钯(1.10g)和1M的盐酸(0.336mL)存在下，在氢气压力(10bar)下，处理化合物39(552.6mg，0.335mmol)在叔丁醇/乙酸乙酯5/1(v/v)(16mL)混合物中的溶液4hr 30min。在过滤以后，浓缩溶液，得到化合物40，不经提纯用于下一步。
制备例36
甲基(2-氨基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-α-D-吡喃葡糖苷(41)
把化合物40(324mg，0.300mmol)溶解于甲醇(8.8mL)。加入5M氢氧化钠溶液(2.2mL)，在环境温度下搅拌16hr。用Dowex_50H+树脂进行中和并且过滤。把溶液通过细Sephadex_G-25柱子，用水洗脱。浓缩含有产物的级分，得到254.2mg化合物41。在此步骤，用核磁共振证实，保护基团(苄基和乙酰基)已经去掉。
CCM：Rf＝0.26，二氧化硅凝胶，乙酸乙酯/吡啶/醋酸/水5/5/1/3(v/v/v/v)。
制备例37
甲基(2-(苄氧羰基)-氨基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-α-D-吡喃葡糖苷(42)
把化合物41(241.1mg，0.253mmol)溶解于水(12.4mL)，加入碳酸氢钠(63.7mg)，然后滴加氯甲酸苄酯(41μL)。在搅拌12hr以后，将反应混合物通过细Sephadex_G-25柱子，用水洗脱。浓缩含有产物的级分。在二氧化硅凝胶柱子上进行色谱提纯(乙酸乙酯/吡啶/醋酸/水21/17/3.6/10v/v/v/v)，得到221mg化合物42。
CCM：Rf＝0.63，二氧化硅凝胶，乙酸乙酯/吡啶/醋酸/水5/5/1/3(v/v/v/v)。
制备例38
甲基(2-(苄氧羰基)-氨基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐(43)
把多元醇42(19.6mg，0.018mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(1.62mL)。加入三氧化硫-三乙胺络合物(114mg)，在55℃下避光搅拌混合物20hr。把此溶液置于细Sephadex_G-25柱子上，用0.2M的氯化钠溶液洗脱。浓缩含有产物的级分，使用同样的柱子，用水洗脱进行脱盐。在冷冻干燥后，得到28.5mg化合物43。
[α]D＝+48°(c＝2.75，水)。
制备例39
甲基(2-氨基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐(44)
在10％的碳载钯(8.25mg)存在下，在氢气压力(5bar)下处理化合物43(27.5mg，0.015mmol)在叔丁醇(333μL)和水(500μL)的混合物中的溶液16hr。在过滤以后，浓缩此溶液，把残渣置于细Sephadex_G-25柱子(3×92cm)上。在用水洗脱和冷冻干燥以后，得到23.7mg化合物44。
[α]D＝+58°(c＝1，水)。
示意式11-合成四糖48
制备例40
甲基(4-O-乙酰丙酰(lévulinyl)-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(3，6-二-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-α-D-吡喃葡糖苷(46)
在10％的炭载钯(9.0g)存在下，在氢气压力(4bar)下处理化合物45(4.50g，3.02mmol)(按照P.Westerduin等人在BioOrg.Med.Chem.1994，2，1267的方法得到)在乙酸乙酯/叔丁醇(72mL，1/1，v/v)中的溶液6hr。在过滤和浓缩以后，把得到的化合物46不经提纯直接用于下一步。
CCM：Rf＝0.54，乙酸乙酯/吡啶/醋酸/水26/22/4.6/17v/v/v/v。
制备例41
甲基(4-O-乙酰丙酰-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸甲酯)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸甲酯)-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖苷(47)
在0℃下，在化合物46(2.57g，2.71mmol)的无水N，N-二甲基甲酰胺(35mL)溶液里加入碳酸氢钾(2.71g)，然后加入甲基碘(3.4mL)。在环境温度下搅拌16hr以后，把反应介质冷却到0℃。此时相继添加二甲基氨基吡啶(132mg)和醋酸酐(1.5mL)。将混合物搅拌16hr。在中和过量的醋酸酐以后，用乙酸乙酯进行稀释。相继用10％的碳酸氢钾溶液和水洗涤有机相，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤然后蒸发至干。在二氧化硅凝胶柱子上对残渣进行色谱提纯[环己烷/(乙酸乙酯/乙醇1/1)9/5]，得到2.51g化合物47。
CCM：Rf＝0.41，甲苯/丙酮2/1v/v。
制备例42
甲基(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸甲酯)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸甲酯)-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖苷(48)
把化合物47(2.5g，2.56mmol)溶解于甲苯/乙醇1/1 v/v混合物(500mL)中。加入醋酸肼(1.01g)。在环境温度下搅拌2hr以后，将反应介质浓缩至干。把残渣溶解于二氯甲烷中。相继用2％的碳酸氢钠溶液和水洗涤有机相，用硫酸钠干燥，过滤然后蒸发至干。在二氧化硅凝胶柱子上色谱提纯(甲苯/乙酸乙酯1/4 v/v)，得到2.01g化合物48。
CCM：Rf＝0.37，甲苯/丙酮/2/1 v/v。
示意式12-合成五糖49
制备例43
甲基(6-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸甲酯)-(1→4)-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸甲酯)-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖苷(49)
把亚胺酸酯38(1.18g，2.81mmol)(按照J.Basten等人在BioOrg.Med.Chem.Lett.(1992)，2(9)，901的方法得到)和化合物48(1.83g，1.75mmol)溶解于二氯甲烷/乙醚1/2(v/v)(126mL)的混合物中。在加入粉末状4_分子筛以后，把混合物冷却到-20℃，并添加1M的三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅酯在二氯甲烷(421μL)中的溶液。30min以后，加入新的量的亚胺酸酯(266mg)以及1M的三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅酯在二氯甲烷(168μL)中的溶液。10min以后，加入固体碳酸氢钠中和混合物并过滤。用二氯甲烷溶解，相继用2％的碳酸氢钠溶液和水进行洗涤，用硫酸钠干燥，然后进行真空浓缩。在二氧化硅凝胶柱子上对得到的残渣进行色谱提纯(二氯甲烷/乙酸乙酯4/3然后是1/1 v/v)，得到1.814g化合物49。
CCM：Rf＝0.57，甲苯/乙酸乙酯3/1 v/v。
[α]D＝+93°(c＝1.15，二氯甲烷)。
示意式13-合成五糖44(方法II)
制备例44
甲基(2-叠氮基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-α-D-吡喃葡糖苷(50)
在-5℃下，于化合物49(845.3mg)在四氢呋喃(104mL)的溶液里加入30％的双氧水(42mL)。搅拌5min以后，滴加0.7M的氢氧化锂水溶液(19.2mL)。在-5℃下搅拌反应混合物1hr，然后在0℃下搅拌4hr，最后在环境温度下搅拌16hr。用1M的盐酸溶液进行中和。
把溶液置于细Sephadex_G-25柱子上用水洗脱。把得到的含有产物的级分合并，浓缩并放置在Dowex AG 50WX4 H+柱子(50mL)上。在0℃下回收化合物并进行浓缩，得到618mg化合物50。
CCM：Rf＝0.56，乙酸乙酯/吡啶/醋酸/水26/22/4.6/17v/v/v/v。
制备例45
甲基(2-叠氮基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸酯)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸酯)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐(51)
在即将使用之前，把化合物50与N，N-二甲基甲酰胺一起共蒸馏(3×29mL)。向化合物50(612mg，0.624mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(58mL)中的溶液里加入三氧化硫-三乙胺络合物(3.84g)。
在55℃下把混合物避光搅拌16hr。把冷却到0℃的混合物滴加到碳酸氢钠(5.33g)在水(200mL)中的溶液里。在环境温度下搅拌16hr，浓缩至干。
把残渣溶解于水，把溶液置于细Sephadex_G-25柱子上，用0.2M的氯化钠溶液洗脱。浓缩含有产物的级分，使用同样的柱子用水洗脱进行脱盐。在冷冻干燥后，得到1.06g化合物51。
CCM：Rf＝0.5，乙酸乙酯/吡啶/醋酸/水3/5/1/3v/v/v/v。
制备例46
甲基(2-氨基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐(44)
此加氢进行两次，每次使用534.4mg化合物51。
在40℃下，在10％的炭载钯(160mg)存在下，在氢气压力(5bar)下处理化合物51(534.4mg)在叔丁醇(6.7mL，12.6mL/g)-水(10mL，19mL/g)混合物中的溶液4hr。在过滤以后(Millipore_LSWP 5μm过滤器)，将溶液浓缩至干，得到530mg化合物44。
CCM：Rf＝0.49，乙酸乙酯/吡啶/醋酸/水3/5/1/3v/v/v/v。
实施例1
实施例2
实施例3
实施例4
实施例5
实施例6
实施例1
甲基-(2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-生物素酰胺基-6-脱氧-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐
在化合物37(18mg，3.72μmol)在0.5％的碳酸氢钠中的溶液(1.5mL)里加入生物素的磺基琥珀酰亚胺(16.5mg)。在环境温度下搅拌16hr后，把反应混合物置于细Sephadex_G-25柱子上，用氯化钠洗脱。浓缩含有产物的级分，在同样的柱子上用水洗脱以脱盐。
在冷冻干燥后，得到15.9mg实施例1的化合物。
[α]D＝+59°(c＝0.78，水)。
分子量：ESI法，负模式：化学分子量＝5065.12；实验分子量＝5064.18±1.04u.m.a.
实施例2
甲基-(2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-[6-(生物素酰胺基)已酰胺基]-6-脱氧-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐
在化合物37(18mg，3.72μmol)在0.5％(1.5mL)的碳酸氢钠中的溶液里加入己酸6-生物素酰胺(酯)(16.5mg)。在环境温度下搅拌16hr后，把反应混合物置于细Sephadex_G-25柱子上，用氯化钠洗脱。浓缩含有产物的级分，在同样的柱子上用水洗脱以脱盐。
在冷冻干燥后，得到17.9mg实施例2的化合物。
[α]D＝+60°(c＝0.78，水)。
分子量：ESI法，负模式：化学分子量＝5178.28；实验分子量＝5176.3±0.77u.m.a.
实施例3
甲基-(2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-[6-(6-生物素酰胺基己酰胺基)己酰胺基]-6-脱氧-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺基-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐
在化合物37(17mg，3.51μmol)在0.5％(1.4ml)的碳酸氢钠中的溶液里加入6-(6-生物素酰胺基己酰胺基)己酸磺基琥珀酰亚胺(23.6mg)。
在环境温度下搅拌16hr后，把反应混合物置于细Sephadex_G-25柱子上，用氯化钠洗脱。浓缩含有产物的级分，在同样的柱子上用水洗脱以脱盐。
在冷冻干燥后，得到17.4mg实施例3的化合物。
[α]D＝+64°(c＝1.0，水)。
分子量：ESI法，负模式：化学分子量＝5291.44；实验分子量＝5292.1±0.83u.m.a.
实施例4
甲基(2-生物素酰胺基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐
在化合物44(21.2mg，0.012mmol)在0.5％的碳酸氢钠中的溶液(750μL)里加入生物素N-羟基琥珀酰亚胺(42mg)在N，N-二甲基甲酰胺(750μL)中的溶液。在环境温度下搅拌16hr后，把反应混合物置于细Sephadex_G-25柱子上。
在用水洗脱和冷冻干燥后，得到22.3mg实施例4的化合物。
[α]D＝+38°(c＝0.15，水)。
分子量：ESI法，负模式：化学分子量＝1938.48；实验分子量＝1937.48±0.11u.m.a.
实施例5
甲基(2-[N-(6-生物素酰胺基己酰基)]-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐
此反应进行两次，每次使用494.5mg化合物44。
把化合物44(494.5mg，0.289mmol)溶解于0.5％的碳酸氢钠的水溶液(116mL)。
在其中滴加6-(生物素酰胺基)己酸磺基琥珀酰亚胺(1.46mg，2.63mmol)在0.5％碳酸氢钠溶液(12mL)中的溶液。在环境温度下搅拌16hr后，加入1M的氢氧化钠水溶液并搅拌1hr。把反应混合物置于细Sephadex_G-25柱子(5×1000cm)上，用氯化钠洗脱。
合并来自两次反应的含有产物的级分。
在冷冻干燥后，得到999.2mg实施例5的化合物。
CCM：Rf＝0.42，乙酸乙酯/吡啶/醋酸/水3/5/1/3v/v/v/v。
分子量：ESI法，负模式：化学分子量＝2051.64；实验分子量＝2051.60±0.43u.m.a.
实施例6
甲基(2-[6-(6-生物素酰胺基己酰胺基)己酰胺基]-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐
把化合物44(30.1mg，17.6μmol)溶解于0.5％的碳酸氢钠的水溶液(7mL)。在其中滴加6-(6-生物素酰胺基己酰胺基)磺基琥珀酰亚胺(118mg，176μmol)在0.5％碳酸氢钠溶液(1mL)中的溶液。在环境温度下搅拌16hr后，加入1M的氢氧化钠水溶液并搅拌1hr。把反应混合物置于细Sephadex_G-25柱子(2×85cm)上，用氯化钠洗脱。
合并含有产物的级分，浓缩并在细Sephadex_G-25柱子(2×85cm)上，用水洗脱进行脱盐。
在冷冻干燥后，得到26.5mg实施例6的化合物。
分子量：ESI法，负模式：化学分子量＝2164.48；实验分子量＝2164.29±0.38u.m.a.
Claims (16)
1.如下通式的多糖及其可药用盐：
其中：
-波浪线表示位于吡喃糖环平面下面或者上面的键，
Po表示含有相同或不同的n个单糖单元的多糖，由异头碳与Pe连接起来，
是具有吡喃糖结构的单糖单元的示意性的表示，这些吡喃糖选自己糖、戊糖和相应的脱氧蔗糖，这些单元由其异头碳与另一个单糖单元连接，而且这些单元的羟基被相同或不同的基团R1取代，R1如在下面所定义，
-Pe表示如下结构的五糖：
-h等于1或2；
-n是整数，可以取0～25的各个值；
-R1表示链-T-Biot、C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -；
-R2表示链-T-Biot、C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -；
-R3表示链-T-Biot、C1～C6烷氧基；
-R4表示链-T-Biot、C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，或者R4构成-O-CH2-桥，基团-CH2-连接在在同一个环上带有羧基官能团的碳原子上；条件是：取代基R1、R2、R3或R4中至少一个表示基团-T-Biot；
-W表示氧原子或亚甲基；
-T表示选自下面的链中的一个：
NH，
或者
其中j和k相同或不同，是取自1～10的整数；
-Biot表示如下的基团：
2.如权利要求1的多糖及其可药用盐，如下通式(I.1)
其中：
表示特定的一类多糖Po，由其异头碳与(I)所定义的Pe连接，
如对(I)所定义，
-基团R1如对(I)所定义，对于同一个单糖，它们可以是相同或者不同的，
-在[]m中所含的单糖被重复m次，在[]t中所含的单糖被重复t次，在[]p中所含的单糖被重复p次，
-m是1～5的整数；t是0～24的整数；p是0～24的整数，条件是1≤m+t+p≤25。
3.如权利要求2的多糖，其特征在于，取代基R1、R2、R3或R4中只有一个表示链-T-Biot，T和Biot如对(I)所定义。
4.如权利要求1～3中任何一项的多糖及其可药用盐，其中，多糖是十六环糖，如通式(I.2)：
其中：
-T表示选自下面的链：
NH，
或者
其中，j和k相同或不同，是取自1～10的整数；
-Biot表示如下的基团：
-Pe表示如下结构的戊糖：
其中：
-R1表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，
-R2表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，
-R3表示C1～C6烷氧基，
-R4表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，或者R4构成-O-CH2-桥，基团-CH2-与同一个环上带有羧基官能团的碳原子相连，
-W表示氧原子或亚甲基。
5.如权利要求1或2中任何一项的多糖及其可药用盐，其中，多糖是五糖，如通式(I.3)：
其中R1、R2、R3、R4和W如对(I)所定义。
6.如权利要求5的多糖，其特征在于，取代基R1、R2、R3或R4中只有一个表示链-T-Biot，T和Biot都如对(I)所定义。
7.如权利要求5或6中任何一项的多糖及其可药用盐，其中，多糖是五糖，如通式(I.4)的通式(I.3)：
其中：
-T表示选自下面的链：
NH，
或者
其中，j和k相同或不同，是取自1～10的整数；
-Biot表示如下的基团：
-R1表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，
-R2表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，
-R3表示C1～C6烷氧基，
-R4表示C1～C6烷氧基或基团-OSO3 -，或者R4构成-O-CH2-桥，基团-CH2-与同一个环上带有羧基官能团的碳原子相连，
-W表示氧原子或亚甲基。
8.如权利要求1或2中之一的多糖，它们选自：
-甲基(2，3，4，6-四-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-生物素酰胺基-6-脱氧-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺酸根合-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐，
-甲基(2，3，4，6-四-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-[6-(生物素酰胺基)己酰胺基]-6-脱氧-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺酸根合-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐，
-甲基(2，3，4，6-四-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(6-[6-(6-生物素酰胺基己酰胺基)己酰胺基]-6-脱氧-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-[(2，3，6-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基)-(1→4)]3-(6-O-磺酸根合-2，3-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐，
-甲基(2-生物素酰胺基-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐，
-甲基-(2-[6-(6-生物素酰胺基己酰胺基)己酰胺基]-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐，
-甲基-(2-[6-(6-生物素酰胺基己酰胺基)己酰胺基]-2-脱氧-3，4-二-O-甲基-6-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸)-(1→4)-(2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖基)-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸根合-α-D-吡喃葡糖苷，钠盐。
9.含有如权利要求1～8中任何一项的多糖作为活性成分，还任选含有一种或多种适当的惰性赋形剂的药物组合物。
10.如权利要求9的药物组合物在如下方面的应用，用于在心血管系统和脑血管系统疾病显现的凝血系统的体内稳定功能改变有关的疾病，还可用于治疗或预防静脉源的血栓栓塞疾病，可用于预防或治疗在外科手术、肿瘤生长或由细菌、病毒或酶激活剂所诱发的凝血错乱所观察到的血栓形成并发症。
11.如权利要求10的应用，其中心血管系统和脑血管系统疾病为与患有动脉硬化和糖尿病有关的血栓栓塞疾病。
12.如权利要求11的应用，其中与患有动脉硬化和糖尿病有关的血栓栓塞疾病为与不稳定性心绞痛、中风、血管成形术、动脉内膜切除术、放置血管内植入物后的再狭窄，或者与血栓溶解后的再栓塞、梗死、局部缺血源的痴呆、外周动脉疾病、血液透析、心房纤维性颤动有关的血栓栓塞疾病或者当使用主动脉冠状动脉架桥的血管植入物时的血栓栓塞疾病。
13.如权利要求10的应用，其中静脉源的血栓栓塞疾病为肺栓塞。
14.如权利要求1～8中任何一项的多糖在覆盖植入体方面的应用。
15.如权利要求1～8中任何一项的多糖作为在多孔型气囊进行动脉内膜切除术时的佐剂。
16.用于中和如权利要求1的式(I)的多糖的方法，其特征在于其用于中和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。
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