SK287218B6 - Použitie avidínu alebo streptavidínu na prípravu liečiv na neutralizáciu antitrombotickej aktivity syntetických polysacharidov - Google Patents

Abstract

Opisuje sa použitie avidínu alebo streptavidínu na prípravu liečiv na neutralizáciu antitrombotickej aktivity syntetických polysacharidov a ich farmaceuticky prijateľných solí obsahujúcich najmenej jednu kovalentnú väzbu s biotínom alebo derivátom biotínu.

Description

Predložený vynález sa týka neutralizácie antitrombotickej aktivity syntetických polysacharidov použitím antidóda, ktorým j e avidín alebo streptavidín.

Doterajší stav techniky

Heparín katalyzuje najmä prostredníctvom antitrombínu III (AT III) inhibíciu dvoch enzýmov, ktoré sú zahrnuté do kaskády zrážania krvi, konkrétne faktora Xa a faktora Ila (alebo trombínu). Prípravky obsahujúce heparíny s nízkou molekulovou hmotnosťou (LMWH) obsahujú reťazce 4 až 30 monosacharidov a majú schopnosť pôsobiť selektívnej šie vzhľadom na faktor Xa, ako na trombín.

Je známe, že inhibícia faktora Xa vyžaduje pripojenie heparínu na AT III prostredníctvom domény viažucej antitrombín (Doména A) a že inhibícia faktora Ila (trombínu) vyžaduje pripojenie na AT III prostredníctvom domény A a na trombín prostredníctvom skôr definovanej väzbovej domény (Doména T).

Syntetické oligosacharidy zodpovedajúce doméne Doména-A heparínu sú známe. Sú opísané napríklad v Patentoch EP 84 999 a EP 529 715, Medzinárodných patentových prihláškach WO 99/36428 a článku Bioorg. Med. Chem., 1998, 6, 1509-1516. Tieto syntetické oligosacharidy selektívne inhibujú prostredníctvom antitrombínu III koagulačný faktor Xa bez toho, aby mali akúkoľvek aktivitu k trombínu. Majú antitrombotickú aktivitu pri žilovej trombóze.

Syntetické oligosacharidy schopné inhibovať trombín a faktor Xa prostredníctvom aktivácie AT III sú opísané v Medzinárodných patentových prihláškach WO 98/03554 a WO 99/36443.

Nové biologicky aktívne sulfátované a alkylované deriváty polysacharidov sú opísané v týchto patentových prihláškach. Sú to najmä antikoagulanty a antitrombotiká. Ukázalo sa najmä, že tieto sulfátované a alkylované polysacharidy môžu byť účinnými antitrombotickými a antikoagulačnými činidlami v závislosti od usporiadania alkylových skupín a sulfátových skupín, ktoré sú viazané na chrbtici sacharidov. Všeobecnejšie sa zistilo, že prípravou polysacharidových sekvencií je možné presne nastaviť aktivitu typu GAG s cieľom získať veľmi aktívne produkty, ktoré majú antikoagulačné a antitrombotické farmakologické vlastnosti heparínu. V porovnaní s heparínom majú tú výhodu, že majú špecifickú štruktúru a nereagujú s faktorom 4 krvných doštičiek, čo spôsobuje trombocytopenické účinky heparínu.

Použitie niektorých produktov opísaných v patentových prihláškach číslo WO 98/03554 a WO 99/36443 a patente EP 529 715 v humánnej medicíne sa však môže ukázať ako problematické, najmä ak majú tieto produkty dlhý polčas rozpadu. V oblasti prevencie alebo liečenia trombózy skôr uvedenými prostriedkami sa musí upraviť alebo udržiavať tekutosť krvi, aby sa predišlo vzniku krvácania.

Je to preto, že je dobre známe, že krvácanie sa môže u pacienta spustiť pri akejkoľvek nehode. Môže byť tiež nutné u pacienta liečeného antitrombotickou liečbou chirurgicky zasiahnuť. Ďalej sa môžu pri chirurgických zákrokoch použiť antikoagulanty vo vysokých dávkach, aby sa predišlo zrážaniu krvi a je nevyhnutné ich neutralizovať na konci operácie. Je preto výhodné mať k dispozícii antitrombotické činidlá, ktoré sa môžu neutralizovať, aby sa zastavila antikoagulačná aktivita v akejkoľvek chvíli. Je skutočnosťou, že známe syntetické oligosacharidy opísané skôr sa nemôžu ľahko neutralizovať známymi antidotami proti heparínu alebo LMWH vrátane protaminsulfátu.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je použitie avidínu alebo streptavidínu na prípravu liečiv na neutralizáciu antitrombotickej aktivity syntetických polysacharidov a ich farmaceutický prijateľných solí obsahujúcich najmenej jednu kovalentnú väzbu s biotínom alebo derivátom biotínu. Pri neutralizácii antitrombotickej aktivity syntetických polysacharidov a ich farmaceutický prijateľných solí obsahujúcich najmenej jednu kovalentnú väzbu s biotínom alebo derivátom biotínu, sa ako antidótum použije avidín alebo streptavidín.

Predložený vynález sa týka použitia nových syntetických polysacharidov so štruktúrou, ktorá je podobná zlúčeninám opísaným v patentových prihláškach číslo WO 98/03554 a WO 99/36443 a v patente EP 529 715: štruktúry syntetických oligosacharidov, ktoré sú predmetom podľa predloženého vynálezu, sú modifikované vtom zmysle, že obsahujú kovalentnú väzbu sbiotínom (hexahydro-2-oxo-l/7-tieno[3,4-í/]-imidazol-4-pentánovou kyselinou) alebo s derivátom biotínu. Prekvapujúco sa ukázalo, že zavedenie biotínu alebo derivátu biotínu nemení farmakologickú aktivitu polysacharidov. V skutočnosti nové polysacharidy majú antitrombotickú aktivitu, ktorá je porovnateľná s oligosacharidmi podľa doterajšieho stavu techniky. Majú však ďalej tú výhodu, že je možné ich v prípade potreby rýchlo neutralizovať pomocou špecifického antidota. Týmto špecifickým antidotom je avidín (The Merck Index, dvanáste vydanie, 1996, M. N. 920, strany 151-152) alebo streptavidín, čo sú dva tetraméme proteíny so zodpovedajúcimi molekulovými hmotnos

SK 287218 Β6 ťami asi 66 000 a 60 000 Da, ktoré majú veľmi vysokú afinitu na biotín.

Všeobecne sa predložený vynález týka použitia syntetických polysacharidov s antitrombotickou aktivitou, ktoré obsahujú aspoň jednu kovalentnú väzbu s biotínom alebo derivátom biotínu.

Je potrebné podotknúť, že ako deriváty biotínu sa môžu použiť deriváty biotínu uvedené v katalógu Pier-

SK 287218 Β6

Preložený vynález sa konkrétne týka použitia avidínu alebo streptavidínu na prípravu liečiv na neutralizáciu antitrombotickej aktivity polysacharidov vzorca

(I), kde:

- vlnovka znamená väzbu umiestnenú buď pod rovinou pyranózového kruhu alebo nad rovinou pyranózové5 ho kruhu,

(Po)·

Po znamená polysacharid obsahujúci n rovnakých alebo rôznych monosacharidových jednotiek viazaných prostredníctvom ich anomémeho atómu uhlíka na Pe,

je schematické znázornenie monosacharidovej jednotky so štruktúrou pyranózy vybranej zhexóz, pentóz a zodpovedajúcich deoxysacharidov, pričom táto jednotka je viazaná prostredníctvom jej anomérneho atómu uhlíka k ďalšej monosacharidovej jednotke a hydroxylové skupiny tejto jednotky sú substituované rovnakými alebo rôznymi skupinami R¹, kde R¹ je definovaná ďalej,

- Pe je pentasacharid so štruktúrou:

(Pe)

- h je rovné 1 alebo 2,

- n je celé číslo a môže nadobúdať hodnoty 0 až 25,

- R¹ je môstik -T-Biot, alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka alebo skupina -OSO₃‘,

- R² je mostík -T-Biot, alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka alebo skupina -OSO₃’,

- R³ je mostík -T-Biot alebo alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka,

- R⁴ je mostík -T-Biot, alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka alebo skupina -0SO3‘ alebo inak R⁴ tvorí mostík -O-CH2-, kde skupina -CH₂- je viazaná k atómu uhlíka, ktorý nesie karboxylovú funkčnú skupinu na tom istom kruhu;

pričom sa rozumie, že najmenej jedna zo skupín R¹, R², R³ alebo R⁴ je skupina -T-Biot,

- W je atóm kyslíka alebo metylénová skupina,

- T je mostík vybraný zo skupiny, ktorú tvorí:

NH,

kde j a k, ktoré sú rovnaké alebo rôzne, sú celé čísla, ktoré môžu nadobúdať hodnoty 1 až 10; - Biot je skupina:

a ich farmaceutický prijateľných solí.

Ako je uvedené skôr, je potrebné podotknúť, že všeobecne v opise podľa predloženého vynálezu znamená vlnovkovitá čiara väzbu umiestnenú buď pod rovinou pyranózového kruhu alebo nad rovinu pyranózového kruhu.

Monosacharidy znázornené v Po môžu byť rovnaké alebo rôzne a interglykozidové väzby môžu byť typu a alebo β.

Tieto monosacharidy sú výhodne vybrané z D alebo L hexóz, alózy, altrózy, glukózy, manózy, galózy, idózy, galaktózy alebo talózy (v tomto prípade h = 2) alebo z D alebo L pentóz ribózy, arabinózy, xylózy alebo lyxózy (v tomto prípade h = 2). Môžu sa tiež použiť ďalšie monosacharidy, ako sú napríklad deoxysacharidy (h = 1 a/alebo -CH₂R’ = CH₃).

Polysacharidová časť Po môže obsahovať 0 až 25 alkylovaných a di- alcto trisulfátovaných monosacharidových jednotiek.

Polysacharidová časť Po môže tiež obsahovať 0 až 25 alkylovaných a mono- alebo disulfátovaných monosacharidových jednotiek.

Polysacharidová časť Po môže obsahovať 0 až 25 nenabitých a/alebo čiastočne nabitých, a/alebo celkom nenabitých alkylovaných monosacharidových jednotiek.

Nabité alebo nenabité jednotky môžu byť rozptýlené pozdĺž reťazca alebo môžu byť zoskupené do nabitých alebo nenabitých sacharidových domén.

Väzby medzi jednotkami môžu byť 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; a typu a alebo β.

V predloženom opise sa výber uskutočnil tak, aby predstavoval konformáciu 'C₄ pre L-idurónovú kyselinu a konformáciu ⁴Ci pre D-glukurónovú kyselinu, ale je dobre známe, že sa všeobecne konformácia v roztoku monosacharidov mení.

L-idurónová kyselina môže mať teda konformáciu ’C₄,²S₀ alebo ⁴Cj.

Podľa jedného aspektu sa predložený vynález týka použitia, kde uvedené polysacharidy zodpovedajú vzorcu (1.1):

v ktorom:

znamená konkrétnu skupinu polysacharidov Po, ktoré sú viazané prostredníctvom ich anomémeho atómu uhlíka k Pe, ako je definované pre zlúčeniny všeobecného vzorca (I),

je taká, ako je definované pre zlúčeniny vzorca (I),

- skupiny R¹ sú také, ako je definované pre zlúčeniny všeobecného vzorca (I) a pre rovnaký monosacharid, môžu byť rovnaké alebo rôzne,

- monosacharid uvedený v []_m sa opakuje m-krát, monosacharid uvedený v []_t sa opakuje t-krát a monosacharid uvedený v []_p sa opakuje p-krát,

- m je celé číslo pohybujúce sa v rozsahu 1 až 5, t je celé číslo pohybujúce sa v rozsahu 0 až 24 a p je celé číslo pohybujúce sa v rozsahu 0 až 24, pričom sa rozumie, že 1 < m +1 + p < 25, a ich farmaceutický prijateľných solí.

Medzi týmito polysacharidmi všeobecného vzorca (1.1) tvorí použitie polysacharidov, v ktorých len jedna

SK 287218 Β6 zo skupín R¹, R², R³ alebo R⁴ je mostík T-Biot, kde T a Biot sú rovnaké, ako je definované pre zlúčeniny všeobecného vzorca (I), a ich farmaceutický prijateľné soli, ďalší aspekt podľa predloženého vynálezu.

Podľa zvláštneho aspektu sa predložený vynález týka použitia hexadekasacharidov všeobecného vzorca (1.2):

kde:

- T je mostík vybraný zo skupiny, ktorú tvorí:

NH,

alebo

kde j a k, ktoré sú rovnaké alebo rôzne, sú celé čísla pohybujúce sa v rozsahu 1 až 10; - Biot je skupina

- R je alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka alebo skupina -OSO₃‘,

- R² je alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka alebo skupina -OSO₃‘,

- R³ je alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka,

- R⁴ je alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka alebo skupina -OSO3', alebo inak R⁴ tvorí mostík -O-CH2-, kde skupina -CH₂- je viazaná k atómu uhlíka, ktorý nesie karboxylovú funkčnú skupinu na rovnakom kruhu,

- W je atóm kyslíka alebo mety léno vá skupina, a ich farmaceutický prijateľných solí.

Podľa ďalšieho aspektu sa predložený vynález týka použitia pentasacharidov všeobecného vzorca (1.3):

kde R¹, R², R^J, R⁴ a W sú rovnaké, ako je definované pre zlúčeniny všeobecného vzorca (I) a ich farmaceutický prijateľných solí.

Medzi týmito pentasacharidmi všeobecného vzorca (1.3) tvoria pentasacharidy, v ktorých len jedna zo skupín R¹, R², R³ alebo R⁴ je mostík -T-Biot, kde T a Biot sú rovnaké, ako je definované pre zlúčeniny všeobecného vzorca (I), a ich farmaceutický prijateľné soli, ďalší aspekt podľa predloženého vynálezu.

Medzi týmito pentasacharidmi všeobecného vzorca (1.3) tvorí ďalší predmet podľa predloženého vynálezu použitie pentasacharidov všeobecného vzorca (1.4):

- T je mostík vybraný zo skupiny, ktorú tvorí: skupina NH,

alebo

kde jak, ktoré sú rovnaké alebo rôzne, sú celé čísla, ktoré môžu nadobúdať hodnoty v rozsahu 1 až 10; - Biot je skupina:

- R¹ je alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka alebo skupina -OSO₃',

- R² je alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka alebo skupina -OSO₃‘,

- R³ je alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka,

- R⁴ je alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka alebo skupina -OSO3', alebo inak R⁴ tvorí mostík —O-CH2~, kde skupina -CH₂- je viazaná k atómu uhlíka, ktorý nesie karboxylovú funkčnú skupinu na tom istom kruhu,

- W jc atóm kyslíka alebo mety léno vá skupina, a ich farmaceutický prijateľných soli.

Podľa ďalšieho aspektu sa predložený vynález týka použitia nasledujúcich polysacharidov:

- sodná soľ metyl-(2,3,4,6-tetra-0-sulfonáto-oc-Z)-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-P-Z>-glukopyranozyl)-(l—>4)-(6-biotínamido-6-deoxy-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-Z)-glukopyranozyl)-( 1 -^4)-((2,3,6-tri-O-metyl-u-DSK 287218 B6

-glukopyranozyl)-(l-+4)-0-(2,3,6-tri-0-metyl-P-£>-glukopyranozyl)-(l-+4)]₃-(6-0-sulfonáto-2,3-di-0-metyl-oc-£>-glukopyranozyl)-( 1 -+4)-(2,3-di-O-metyl-p+D-glukopyranozylurónová kyselina)-( 1 —+4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l -+4)-(2,3-di-0-metyl-a-£-idopyranozylurónová kyselina)-(l-+4)-2,3,6-tn-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu,

- sodná soľ metyl-(2,3,4,6-tetra-O-sulfonáto-a-£>-glukopyranozyl)-( 1-+4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-( 1 -+4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-P-Z)-glukopyranozyl)-( 1 -+4)-(6-[6-(biotínamido)hexamido]-6-deoxy-2,3-di-O-metyl-a-ZÍ-glukopyranozyl)-(l-+4)-(2,3,6-tri-O-metyl-p-Z)-glukopyranozyl)-(I-+4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-Z)-glukopyranozyl)-(l -+-4)-0-(2,3,6-tri-O-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(l-+4)]₃-(6-O-sulfonáto-2,3-di-0-metyl-oc-D-glukopyranozyl)-(l -+4)-(2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(1 -+4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a+D-glukopyranozyl)-( 1-+4)-(2,3-di-O-metyl-a-Á-idopyranozylurónová kyselina)^ 1 -+4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu,

- sodná soľ metyl-(2,3,4,6-tetra-0-sulfonáto-a-ZJ-glukopyranozyl)-(l-+4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-Z)-glu- kopyranozyl)-( 1-+4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-P-D-glukopyranozyl)-(l—+4)-(6-[6-(6-biotínamidohexamido)hexamido]-6-deoxy-2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1-+4)-(2,3,6-tri-O-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(l—+4)-((2,3,6-tri-O-metyl-a-£>-glu-kopyranozyl)-(l—+4)-0-(2,3,6-tri-O-metyl-P-Z)-glukopyranozyl)(l-+4)]₃-(6-0-sulfonáto-2,3-di-0-metyl-a-Z)-glukopyranozyl)(l-+4)-(2,3-di-0-metyl-3-D-glukopyranoz ylurónová kyselina)-(l—+4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-.D-glukopyranozyl)-(l-+4)-(2,3-di-O-metyl-cc-£-idopyranozylurónová kyselina)-( 1 -+4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu,

- sodná soľ metyl-(2-biotínamido-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-6-0-sulfonáto-oc-Z)-glukopyranozyl)-(l—+4)-(2,3-

-di-O-metyl-3-D-glukopyranozylurónová kyselina)-) 1-+4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(1—+4)-(2,3-di-O-metyl-a-Á-idopyranozylurónová kyselina)-(l—+4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-£>-glukopyranoz idu,

- sodná soľ metyl-(2-[N-(6-biotínamidohexanoyl)]-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-6-0-sulfonáto-cc-£>-glukopyra- nozyl)-(l-+4)-(2,3-di-O-metyl-p-Z)-glukopyranozylurónová kyselina)-( 1-+4)-(2,3,6-tri-0—sulfonáto-a-D-glukopyranozy 1)-(1 -+4)-(2,3-di-O-metyl-a-Á-idopyranozylurónová kyselina)-(l—+4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu,

- sodná soľ metyl-(2-[6-(6-biotínamidohexamido)hexamido]-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-6-0-sulfonáto-a-Z)glukopyranozyl)-(l-+4)-(2,3-di-0-metyl-P-Z)-glukopyranozylurónová kyselina)-( 1-+4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-)!-+4)-(2,3-di-0-metyl-a-í-idopyranozylurónová kyselina)-(l-+4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu.

Predložený vynález sa týka použitia polysacharidov v kyslej forme alebo vo forme akejkoľvek farmaceutický prijateľnej soli. V kyslej forme sú skupiny -COO' a -SO₃‘ v tomto poradí vo forme -COOH a -SO₃H.

Termínom farmaceutický prijateľná soľ polysacharidu podľa predloženého vynálezu sa rozumie polysacharid, v ktorom je jedna alebo viac funkčných skupín -COO’ a/alebo -SOý viazaná iónovo k farmaceutický prijateľnému katiónu. Medzi výhodné soli zlúčenín podľa predloženého vynálezu patria tie, ktorých katión je vybraný z katiónov alkalických kovov a výhodnejšie tie, kde katiónom je Na⁺ alebo K⁺.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) uvedeného skôr tak zahŕňajú zlúčeniny, v ktorých je jeden alebo viac atómov vodíka alebo atómov uhlíka nahradených rádioaktívnym izotopom, napríklad tríciom alebo uhlíkom-14. Tieto značené zlúčeniny sa používajú vo výskume, pri metabolických alebo farmakokinetických štúdiách a pri biochemických testoch ako ligandy.

Princíp spôsobu prípravy zlúčenín podľa predloženého vynálezu spočíva v použití di- alebo oligosacharidových báz syntónov (des synthons de base di ou oligosacharidiques) pripravených podľa postupov opísaných v literatúre. Je možné odkázať sa najmä na patenty a patentové prihlášky EP 300 099, EP 529 715, EP 621 282 a EP 649 854 a dokumenty C. van Boeckel, M. Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1671-1690. Tieto syntóny sa následne navzájom kondenzujú, pričom sa získajú plne chránené ekvivalenty polysacharidov podľa predloženého vynálezu. Tieto chránené ekvivalenty sa potom prevedú na zlúčeniny podľa predloženého vynálezu.

Jedna zo zásad syntónov uvedených skôr obsahuje špecificky chránenú funkčnú skupinu umožňujúcu následné zavedenie biotínu alebo derivátu biotinu, napríklad latentnú amino funkčnú skupinu vo forme azidoskupiny alebo chránenú vo forme N-ftalimidoskupiny.

Pri kondenzačných reakciách uvedených skôr „donor“ di- alebo oligosacharidov aktivovaný na anomérnom atóme uhlíka reaguje s „akceptorom“ di- alebo oligosacharidu obsahujúcim hydroxylovú skupinu.

Predložený vynález sa týka spôsobu prípravy zlúčenín všeobecného vzorca (I), ktorý sa vyznačuje tým, že v prvok kroku sa syntetizuje plne chránený ekvivalent požadovaného polysacharidu I, obsahujúci chránený prekurzor domény Pe predĺžený na neredukujúcom konci chráneným prekurzorom sulfátovaného polysacharidu Po, jeden z týchto prekurzorov obsahuje výhodne vhodne chránenú amino funkčnú skupinu na následné zavedenie biotínu alebo derivátu biotínu; v druhom kroku sa zavedú a/alebo odstránia záporne nabité skupiny; v treťom kroku sa odstráni ochranná skupina z aminoskupiny a potom sa zavedie biotín alebo derivát bio tmu.

Syntéza Pe sa uskutočňuje pomocou spôsobov opísaných najmä v patentových prihláškach WO 98/03554 a WO 99/36443 a v literatúre citovanej skôr.

Polysacharidová časť, ktorá je prekurzorom Po sa syntetizuje pomocou reakcií, ktoré sú odborníkom v tejto oblasti známe, s použitím spôsobov syntézy oligosacharidov (G. J. Boons, Tetrahedron, 1996, 52, 1095-1121, WO 98/03554 a WO 99/36443) alebo sa oligosacharid, pokiaľ oligosacharid, ktorý je donorom glykozidickej väzby, kondenzuje s oligosacharidom, ktorý j e akceptorom glykozidickej väzby, pričom vzniká iný oligosacharid, ktorého veľkosť sa rovná súčtu veľkostí obidvoch reakčných partnerov. Tento postup sa opakuje, pokiaľ sa nezíska požadovaná zlúčenina všeobecného vzorca (I). Povahu a profil náboja finálnej požadovanej zlúčeniny určuje povaha chemických entít použitých v rôznych stupňoch syntézy podľa pravidiel, ktoré sú odborníkom v tejto oblasti známe. Ako odkazy je možné uviesť napríklad C. van Boeckel a M. Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1671-1690 alebo H. Paulsen, Advances in selective chemical syntheses of complex oligosaccharides, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 21, 155-173 (1982).

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa získajú zo svojich plne chránených polysacharidových prekurzorov s použitím nasledujúcej série reakcií:

- alkoholové funkčné skupiny, ktoré sa majú previesť na O-sulfoskupinu a karboxylovú skupinu, sa zbavia ochranných skupín použitých pri príprave hlavného reťazca (chrbtice), potom

- sa následne zavedú sulfoskupiny,

- odstránia sa ochranné skupiny z amino funkčných skupín, čo umožní zavedenie biotínu alebo derivátu biotínu,

- pomocou obvyklých kondenzačných reakcií amín/kyselina sa zavedie biotín alebo derivát biotínu.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu samozrejme pripraviť s použitím rôznych stratégii, ktoré sú odborníkov v tejto oblasti známe na syntézu oligosacharidov.

Spôsob opísaný skôr je výhodným spôsobom. Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa však môžu pripraviť pomocou iných spôsobov, ktoré sú dobre známe v oblasti chémie sacharidov, opísaných napríklad v publikácii Monosaccharides, their chemistry and their roles in natural products, P. M. Collins a R. J. Ferrier, J. Wiley & Sons, 1995 a v G. J. Boons, Tetrahedron, 1996, 52, 1095-1121.

Pentasacharidy Pe sa môžu teda získať z disacharidových syntónov spôsobom opísaným v publikácii C. van Boeckel a M. Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1671-1690.

Ochrannými skupinami použitými pri spôsobe prípravy zlúčenín všeobecného vzorca (I) sú také skupiny, ktoré sa bežne používajú v chémii sacharidov, napríklad tie, ktoré sú opísané v Protective Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene, John Wiley & Sons, New York, 1981.

Ochranné skupiny sú výhodne vybrané zo skupiny, ktorú tvorí acetylová skupina, halogénmetylová skupina, benzoylová skupina, levulinylová skupina, benzylová skupina, substituovaná benzylová skupina, prípadne substituovaná tritylová skupina, tetrahydropyranylová skupina, alylová skupina, pentenylová skupina, /erc-butyldimetylsilylová skupina (íBDMS) alebo trimetylsilyletylová skupina.

Aktivačnými skupinami sú skupiny, ktoré sa bežne používajú v chémii sacharidov a sú opísané napr. v G. J. Boons, Tetrahedron, 1996, 52, 1095-1121. Tieto aktivačné skupiny sú napríklad vybrané zo skupiny, ktorú tvoria imidáty, tioglykozidy, pentenylglykozidy, xantáty, fosfity alebo halogenidy.

Ak ide o spôsob, ktorým sa viaže biotín k oligosacharidu a povahu derivátu biotínu, chemická literatúra ponúka rôzne možnosti, ktoré môžu využívať sady ochranných skupín, ktoré sú odborníkom v tejto oblasti dobre známe. Výhodne sa používajú amino funkčné skupiny, tiolové funkčné skupiny alebo karboxylové funkčné skupiny alebo aldehydické funkčné skupiny, ktoré budú reagovať s derivátom biotínu obsahujúcim reaktívnu skupinu typu aktivovaného esteru, maleimidu, jódacetylovej alebo primárnej aminoskupiny, pričom sa reakcia uskutočňuje podľa podmienok opísaných v literatúre (napríklad Savage a kol., Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook; Pierce Chemical Company, 1992).

Spôsob opísaný skôr umožňuje získať zlúčeniny podľa predloženého vynálezu vo forme solí. S cieľom získať zodpovedajúce kyseliny sa zlúčeniny podľa predloženého vynálezu vo forme solí uvedú do styku s katiónovo výmennou živicou vo forme kyseliny.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu vo forme kyselín sa môžu následne neutralizovať pomocou zásady, pričom sa získa požadovaná soľ. Na prípravu solí zlúčenín všeobecného vzorca (I) sa môžu použiť akékoľvek anorganické alebo organické zásady, ktoré poskytujú farmaceutický prijateľné soli zlúčenín všeobecného vzorca (I). Ako zásada sa výhodne použijú hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý alebo hydroxid horečnatý. Výhodnými soľami sú sodné a vápenaté soli zlúčenín všeobecného vzorca (I).

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa podrobili biochemickým a farmakologickým testom.

Celková antitrombotická aktivita týchto látok a ich neutralizácia sa študovali na moleli žilovej trombózy zahŕňajúcom injekciu tkanivového faktora, po ktorej nasledovalo hromadenie krvi v dutej žile krýs podľa postupu opísaného v J. M. Herbert a kol., Blood, 1998, 91, 4197-4205. Na tomto modeli sa dosiahla 60 % inhibícia trombózy po vnútrožilovej injekcii 0,1 až 30 mmol/kg zlúčenín. Injekcia avidínu v molámom pomere 1 ku 1000 výborne znížila antitrombotický účinok týchto zlúčenín, kedy bolo možné dosiahnuť zníženie väčšie

SK 287218 Β6 ako 50 %. Rovnakým spôsobom sa neutralizovala prohemoragická aktivita zlúčenín prostredníctvom injekcie avidínu v skôr uvedených dávkach. Tiež obehová aktivita oligosacharidov, meraná prostredníctvom anti-Xa aktivity a/alebo anti-IIa aktivity, sa neutralizuje pomocou injekcie avidínu.

Ďalším aspektom podľa predloženého vynálezu je teda spôsob použitia avidínu alebo streptavidínu, ktorý sa vyznačuje tým, že umožňuje neutralizovať polysacharidy podľa predloženého vynálezu. Avidín alebo streptavidín sa môžu použiť na prípravu liečiv určených na neutralizáciu polysacharidov podľa predloženého vynálezu.

Pre svoju biochemickú a farmaceutickú aktivitu sú oligosacharidy podľa predloženého vynálezu veľmi vhodnými liečivami. Ich toxicita je celkom zlúčiteľná s ich použitím. Sú tiež veľmi stabilné, a preto sú veľmi vhodné na to, aby tvorili aktívnu zložku patentovaných farmaceutických produktov.

Môžu sa použiť pri rôznych ochoreniach vznikajúcich ako dôsledok modifikácie homeostázy systému zrážania krvi vyskytujúci sa najmä pri ochoreniach kardiovaskulárneho alebo cerebrovaskulárneho systému, ako sú tromboembolické ochorenia súvisiace s aterosklerózou a diabetom, napríklad nestabilná angína, apoplexia, restenóza po angioplastike, endarterektómia alebo vloženie endovaskulárnej protézy; alebo tromboembolické ochorenie súvisiace s retrombózou po trombolýze, s infarktom, s demenciou ischemického pôvodu, s ochorením periférnych artérií, s hemodialýzou alebo s aurikulámou fibriláciou, alebo pri použití cievnych protéz pri aortokoronámom bypase. Ďalej sa môžu tieto zlúčeniny použiť na liečenie alebo prevenciu tromboembolických ochorení žilového pôvodu, ako je pľúcna embólia. Môžu sa použiť pri liečení alebo prevencii trombotických komplikácií pozorovaných napríklad po chirurgických operáciách, raste nádorov alebo poruchách koagulácie vyvolaných baktériami, vírusovými alebo enzymatickými aktivátormi. V prípade ich použitia pri vkladaní protéz môžu zlúčeniny podľa predloženého vynálezu pokryť protézy a tak dosiahnuť ich hemokompatibilitu. Môžu sa najmä takto naniesť na intravaskuláme protézy (stenty). V tomto prípade sa môžu prípadne chemicky modifikovať zavedením vhodného ramena na neredukujúci alebo redukujúci koniec, ako je opísané napríklad v EP 649 854.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu tiež použiť ako adjuvans pri enarterektómii uskutočňovanej pomocou poréznych balónov.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu použiť pri príprave liečiv určených na liečbu uvedených ochorení.

Podľa ďalších aspektov je predmetom podľa predloženého vynálezu farmaceutická kompozícia obsahujúca ako aktívnu látku syntetický polysacharid podľa predloženého vynálezu alebo jednu z jeho farmaceutický prijateľných solí, prípadne v kombinácii s jedným alebo viacerými inertnými a vhodnými vehikulami.

Uvedené vehikulá sa vyberú podľa požadovanej farmaceutickej formy a požadovaného spôsobu podávania: orálne, podjazykové, subkutánne, intramuskuláme, vnútrožilové, transdermálne, transmukozálne, miestne alebo rektálne.

Aktívna zložka môže byť tiež prítomná vo forme komplexu s cyklodextrínmi, napríklad α-, β- alebo γ-cyklodextrínom, Ž-hydiOxypropyl-P-cyklodextrínom alebo metylY-cyklodextrínom.

Aktívna zložka sa môže tiež uvoľňovať pomocou balónika obsahujúceho túto látku alebo pomocou endovaskulámeho expandéra zavedeného do cievy. Farmakologická účinnosť aktívnej látky tým zostáva nezmenená.

V každej liekovej jednotke (dosage unit) je aktívna zložka prítomná v množstvách vhodných na prepokladané denné dávky, ktoré poskytnú požadovaný profylaktický alebo terapeutický účinok. Každá lieková jednotka môže obsahovať 0,1 až 100 mg aktívnej látky, výhodne 0,5 až 50 mg aktívnej látky. Tieto dávky antikoagulačných zlúčenín sa môžu neutralizovať dávkami avidínu alebo streptavidínu pohybujúcimi sa v rozsahu 1 až 1000 mg pri iv (vnútrožilovom) injekcii, boluse alebo infúzii.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu tiež použiť v kombinácii s jednou alebo viacerými inými aktívnymi látkami vhodnými na použitie pri požadovanej liečbe, ako sú napríklad antitrombotiká, antikoagulanty, inhibítory agregácie krvných doštičiek, ako sú napríklad dipyridamole, aspirín, ticlopidine alebo clopidogrel, alebo antagonisty komplexu glykoproteínu Ilb/IIIa.

Nasledujúce spôsoby, prípravy a schémy ilustrujú syntézy rôznych medziproduktov na použitie pri príprave polysacharidov podľa predloženého vynálezu.

Používajú sa nasledujúce skratky: Bn: benzylová skupina; Bz: benzoylová skupina; TLC: chromatografia na tenkej vrstve; Ts: tosylová skupina; Lev: levulinylová skupina; Et: etylová skupina; Ph: fenylová skupina; Me: metylová skupina; Ac: acetylová skupina; SE: trimetylsilyletylová skupina; ESI: ionizácia pomocou elektrónspreja; Biotin: hexahydro-2-oxo-l//-ticno[3,4-r/]imidazol-4-pentánová kyselina; Z: benzyloxykarbonylová skupina.

Nasledujúce príklady syntézy zlúčenín podľa predloženého vynálezu sú podrobne opísané na ilustráciu a v žiadnom ohľade neobmedzujú rozsah predloženého vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Schéma 1 - syntéza trisacharidu 9

OSE

Ph O

/x^c

Ph O

OSE

OBz

B

Príprava 1 2-(Trimetylsilyl)etyl-4,6-0-benzylidén-2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozid (2) g hydridu sodného sa pri 0 °C po častiach pridá k roztoku 15,8 g (42,8 mmol) zlúčeniny 1 (pripravenej podľa postupu opísaného v K. Jansson a kol., J. Org. Chem., 1988, 53, 5629-5647) a 20 ml (319 mmol) metylj odídu v 350 ml tetrahydrofuránu. Reakčná zmes sa mieša 4 hodiny pri teplote miestnosti. Prebytok hydridu sodného sa rozloží metanolom a reakčná zmes sa naleje do 1,51 ľadovo studenej vody. Po extrakcii etylacetátom sa organická fáza premyje nasýteným roztokom chloridu sodného a vodou, suší sa nad síranom sodným a potom sa odparí vo vákuu. Zvyšok sa čistí pomocou chromatografie na kolóne silikagélu za elúcie zmesou 15/1 (objemovo) cyklohexán/etylacetát a získa sa 16,8 g zlúčeniny 2.

[a]_D = -41° (c = 0,69, dichlórmetán).

Príprava 2 2-(Trimetylsilyl)etyl-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid (3) g 3Ä molekulových sít, metyloranž ako farebný indikátor, 34 g (526 mmol) kyanoborohydridu sodného sa postupne pridá k 16 g (40,3 mmol) roztoku zlúčeniny 2 v 600 ml tetrahydrofuránu a potom sa prikvapkáva nasýtený roztok chlorovodíka v dietyléteri, pokiaľ sa nedosiahne ružové sfarbenie. Po filtrácii a extrakcii etylacetátom sa organická fáza premyje nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, suší sa nad síranom sodným a potom sa odparí vo vákuu. Po chromatografii na kolóne silikagélu za elúcie zmesou 3/1 (objemovo) toluén/etylacetát sa získa 12,5 g zlúčeniny 3.

[a]_D = -42° (c = 1,2, dichlórmetán).

Príprava 3 2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3-di-O-benzoyl-4,6-O-benzylidén-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-benzoyl-[LD-glukopyranozyl)-( 1 -^4)-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid (5)

Zmes 16,52 g (16,60 mmol) tioglykozidu 4 (získaného podľa prípravy 1 opísanej v medzinárodnej patentovej prihláške WO 99/36443), 6,0 g (15,05 mmol) zlúčeniny 3 a 16,7 g 4Á práškových molekulových sít v 300 ml toluénu sa 1 hodinu mieša v atmosfére argónu. Zmes sa potom ochladí na -20 °C. K reakčnej zmesi sa prikvapká roztok 3,9 g (17,4 mmol) N-jódsukcínimidu a 0,17 ml (1,97 mmol) trifluórmetánsulfónovej kyseliny v 86 ml zmesi 1/1 (objemovo) dichlórmetán/dioxán. Po 10 minútach sa reakčná zmes filtruje, zriedi sa dichlórmetánom, postupne sa premyje IM roztokom tiosíranu sodného, 10 % roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou, suší sa nad síranom sodným a odparí sa vo vákuu. Zvyšok sa čistí pomocou chromatografie na kolóne silikagélu za elúcie zmesou 6/1 (objemovo) toluén/etylacetát a získa sa 18,8 g trisacharidu 5. [a]_D = +34° (c = 1,26, dichlórmetán).

Príprava 4 2-(Trimetylsilyl)etyl-(4,6-O-benzylidén-a-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-(P-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozid (6)

3,15 g íerc-butoxidu draselného sa pridá k roztoku 18,7 g (14 mmol) zlúčeniny 5 v 140 ml zmesi 1/1 (objemovo) metanol/dioxán. Reakčná zmes sa mieša 2 hodiny pri teplote miestnosti. Neutralizuje sa na živici Dowex® 50WX4 H⁺, filtruje sa a odparí sa vo vákuu. Zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli za elúcie zmesou 20/1 (objemovo) dichlórmetán/metanol a získa sa 10,0 g zlúčeniny 6.

[a]_D = +29° (c = 1,11, dichlórmetán).

Príprava 5 2-(Trimetylsilyl)etyl-(4,6-O-benzylidén-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-p-D-glukopyranozyl)-(I—>4)-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid (7)

5,2 g (216 mmol) hydridu sodného sa po častiach v atmosfére argónu pridá k ochladenej (0 °C) zmesi 9,93 g (12,24 mmol) zlúčeniny 6 a 9,0 ml (138 mmol) metyljodidu v 100 ml bezvodého tetrahydrofuránu. Zmes sa mieša 20 hodín pri teplote miestnosti. Prebytok hydridu sodného sa rozloží metanolom a reakčná zmes sa naleje do 500 ml ľadovo studenej vody. Po extrakcii etylacetátom sa organická fáza premyje nasýteným roztokom chloridu sodného, suší sa nad síranom sodným a potom sa odparí vo vákuu a získa sa 11 g zlúčeniny 7, ktorá sa použije v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia.

TLC: Rf = 0,38, silikagél, 3/2 (objemovo) toluén/etylacetát.

Príprava 6 2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(T >4)-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P~D-glukopyranozid (8) g zlúčeniny 7 sa rozpustí v 180 ml 60 % kyseliny octovej a mieša 1,5 hodiny pri 80 °C. Zmes sa odparí a potom sa ešte raz odparí spolu s toluénom. Zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli za elúcie zmesou 2/1 (objemovo) toluén/acetón a získa sa 8,46 g zlúčeniny 8.

TLC: R_f = 0,36, silikagél, 1/1 (objemovo) toluén/acetón.

Príprava 7 2-(Trimetylsilyl)etyl-(6-0-benzoyl-2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(l->4)-6-0-benzyl-2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozid (9)

5,36 g (22,4 mmol) l-benzoyloxy-l//-benzotriazolu a 3,32 ml trietylamínu sa pridá k roztoku 8,41 g (10,6 mmol) zlúčeniny 8 v 110 ml dichlórmetánu. Zmes sa mieša 20 minút pri teplote miestnosti a potom sa zriedi dichlórmetánom, premyje sa nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou, suší sa nad síranom sodným a potom sa odparí vo vákuu. Zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli za elúcie zmesou 5/0,5/0,25 (objemovo) cyklohexán/etylacetát/etanol a získa sa 8,40 g zlúčeniny 9.

[a]_D = +15° (c = 2, dichlórmetán).

Schéma 2 - Syntéza peatasacharidu 14

OBz ⁹

Príprava 8

2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3-di-0-benzoyl-4,6-0-benzylidén-a-D-glukopyranozyl)-( 1^4)-(2,3,6-tri-O-benzoyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(6-O-benzoyl-2,3-di-O-metyl-cc-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-me5 tyl-3-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-3-D-glukopyranozid (10)

Zlúčenina 9 sa prevedie na zlúčeninu 10 podľa postupu opísaného v príprave 3.

[oc]_D = +42° (c = 2, dichlórmetán).

Príprava 9

2-(Trimetylsilyl)etyl-(4,6-0-benzylidén-a-D-glukopyranozyl-(l->4)-(3-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—»4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-6-O-benzyl-2,314

-di-O-metyl-p-D-glukopyranozid (11)

Zlúčenina 10 sa prevedie na zlúčeninu 11 podľa postupu opísaného v príprave 4.

TLC: R_f = 0,35, silikagél, 10/1 (objemovo) dichlórmetán/metanol.

Príprava 10 2-(Trimetylsilyl)etyl-(4,6-O-benzylidén-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l-x4)-(2,3,6-tri-O-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-3-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-6-0-benzyl-2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozid (12)

Zlúčenina 11 sa prevedie na zlúčeninu 12 podľa postupu opísaného v príprave 5.

TLC: R_f = 0,11, silikagél, 1/2 (objemovo) cyklohexán/etylacetát.

Príprava 11

2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l-»4)-(2,3,6-tri-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-6-0-benzyl-2,3-di-0-mctyl-[j-D-glukopyranoz.id (13)

Zlúčenina 12 sa prevedie na zlúčeninu 13 podľa postupu opísaného v príprave 6.

TLC: R_f = 0,33, silikagél, 2/0,5/0,5 (objemovo) cyklohcxán/etylacetát/etanol.

Príprava 12

2-(Trimetylsilyl)etyl-(6-0-benzoyl-2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l-»4)-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid (14)

Zlúčenina 13 sa prevedie na zlúčeninu 14 podľa postupu opísaného v príprave 7.

TLC: Rf = 0,16, silikagél, 3/0,5/0,5 (objemovo) cyklohexán/etylacetát/etanol.

Schéma 3 - Syntéza heptasacharidu 19

1S

Príprava 13

2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3-di-0-benzoyl-4,6-0-benzylidén-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-benzoyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(6-0-benzoyl-2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—»4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(l->4)-6-0-benzyl-2,3-di-0-metyl-3-D-glukopyranozid (15)

Kondenzačná reakcia zlúčeniny 14 s disacharidom 4 sa uskutoční podľa postupu opísaného v príprave 3 a získa sa zlúčenina 15.

[cc]_D = +52° (c = 1,1, dichlórmetán).

Príprava 14

2-(Trimetylsilyl)etyl-(4,6-O-benzylidén-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —»4)-(P-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-(2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—»4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-6-0-benzyl-2,3-di-0-metyl-p-D-glukopyranozid (16)

Zlúčenina 15 sa prevedie na zlúčeninu 16 podľa postupu opísaného v príprave 4.

TLC: R_f= 0,31, silikagél, 10/1 (objemovo) dichlórmetán/metanol.

Príprava 15 2-(Trimetylsilyl)etyl-(4,6-O-benzylidén-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-( l->4)]₂-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozid (17)

Zlúčenina 16 sa prevedie na zlúčeninu 17 podľa postupu opísaného v príprave 5.

TLC: Rf = 0,46, silikagél, 10/1 (objemovo) dichlórmetán/metanol.

Príprava 16 2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)(1—>4)-(2,3,6-tri-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-( 1 -^4)-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid (18)

Zlúčenina 17 sa prevedie na zlúčeninu 18 podľa postupu opísaného v príprave 6.

TLC: R_f=0,42, silikagél, 1/0,5/0,5 (objemovo) cyklohexán/etylacetát/etanol.

Príprava 17 2-(Trimetylsilyl)etyl-(6-O-benzoyl-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l-»4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-( 1—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 -^-4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-cc-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l-»4)-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid(19)

Zlúčenina 18 sa prevedie na zlúčeninu 19 podľa postupu opísaného v príprave 7.

TLC: R_f = 0,25, silikagél, 3/0,5/0,5 (objemovo) cyklohexán/etylacetát'etanol.

Schéma 4 - Syntéza nonasacharidu 23

Príprava 18

2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3-di-0-benzoyl-4,6-0-benzylidén-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-benzoyl-3-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(6-O-benzoyl-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-ghikopyranozyl)-(l->4)-[(2,3,6-tri-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l-»4)]2-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid (20)

Zmes 5,2 g (5,23 mmol) tioglykozidu 4, 4,72 g (2,75 mmol) heptasacharidu 19 a 4Ä práškových molekulových sít v toluéne sa mieša 1 hodinu v atmosfére argónu. Potom sa pri 0 °C prikvapká roztok 1,36 g (5,85 mmol) N-jódsukcínimidu a 0,140 ml (1,56 mmol) trifluórmetánsulfónovej kyseliny v 32 ml zmesi 1/1 (objemovo) dichlórmetán/dioxán. Po 15 minútach sa reakčná zmes filtruje, postupne sa premyje IM roztokom tiosíranu sodného, 10 % roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou, suší sa nad síranom sodným a odparí sa vo vákuu. Zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli za elúcie zmesou 3/0,5/0,5 (objemovo) cyklohexán/etylacetát/etanol a získa sa 7,13 g zlúčeniny 20.

[a]_D = +65° (c = 1,4, dichlórmetán).

Príprava 19 2-(Trimetylsilyl)etyl-(4,6-O-benzylidén-a-D-glukopyranozyl)-(T->4)-(p-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-p-D-glukopyranozyl)-(l->4)]₂-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozid (21)

Zlúčenina 20 sa prevedie na zlúčeninu 21 podľa postupu opísaného v príprave 4. TLC: R_f = 0,27, silikagél, 10/1 (objemovo) dichlormetán/metanol.

Príprava 20 2-(Trimetylsilyl)etyl-(4,6-O-benzylidcn-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)]3-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid (22)

Zlúčenina 21 sa prevedie na zlúčeninu 22 podľa postupu opísaného v príprave 5. TLC: R_f = 0,31, silikagél, 5/1/1 (objemovo) cyklohexán/etylacetát/etanol.

Príprava 21 2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-trLO-metyl-p-D-glukopyranozyl)-(1 —>4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-( 1->4)]₃-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid (23)

Zlúčenina 22 sa prevedie na zlúčeninu 23 podľa postupu opísaného v príprave 5. TLC: R_f = 0,35, silikagél, 2/1/1 (objemovo) cyklohexán/etylacetát/etanol.

Schéma 5 - Syntéza nonasacharidu 29

2S

SK 287218 Β6

Príprava 22

2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3-di-O-metyl-6-O-tosyl-cc-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l-»4)-[(2,3,6-tri-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)]₃-6-O-benzyl-2,3-di-O-O-metyl-P-D-glukopyranozid (24)

1,09 g zlúčeniny 23 sa v atmosfére argónu rozpustí v 10 ml pyridínu a potom sa pridá 1,03 g tosylchloridu. Po 2 hodinách miešania sa reakčná zmes zriedi 100 ml dichlórmetánu. Organická fáza sa postupne premyje 10 % roztokom hydrogensiranu draselného a potom vodou, suší sa a odparí do sucha. Po kolónovej chromatografh na silikagéli za elúcie zmesou 2,3/2 (objemovo) toluén/acetón sa získa 1,77 g zlúčeniny 24. TLC: R_f = 0,5, silikagél, 3/1/1 (objemovo) cyklohexán/etylacetát-'etanol.

Príprava 23 2-(Trimetylsilyl)etyl-(6-deoxy-2,3-di-0-metyl-6-ftalimido-a-D-glukopyranozyl)-(l —>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)]₃-6-0-benzyl-2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozid (25)

225 mg (1,38 mmol) ftalimidu draselného a potom 121,5 mg (0,46 mmol) crownéteru 18-crown-6 sa pridá k roztoku 500 mg (0,23 mmol) zlúčeniny 24 v 11 ml Ν,Ν-dimctylformamidu obsahujúcom 4Ä práškové molekulové sitá. Zmes sa mieša 4 hodiny pri 80 °C. Po ochladení sa reakčná zmes zriedi dichlórmetánom, filtruje sa cez kremelinu a odparí sa. Zvyšok sa čistí pomocou chromatografie na géli Sephadex® LH20 (3 x 100 cm) (1/1 (objemovo) dichlórmetán/etanol), potom pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli za elúcie zmesou 11/2 (objemovo) toluén/etanol a získa sa 417,4 mg zlúčeniny 25.

TLC: R_f = 0,38, silikagél, 11/2 (objemovo) toluén/etanol.

Príprava 24 2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-acetyl-a-D-glukopyra nozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-acetyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(6-deoxy-2,3-di-O-metyl-6-ftalimido-a-D-glukopyranozyl)-( 1->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-( 1->4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)]₃-6-O-benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid (27)

Zmes 1,515 g (1,564 mmol) tioglykozidu 26 (pripraveného podľa postupu na prípravu zlúčeniny 41, prípravy 36, patentovej prihlášky WO 99/36443), 840 mg (0,391 mmol) akceptora 25 a 2,15 g 4Á molekulových sít v 33 ml toluénu sa mieša 1 hodinu v atmosfére argónu. Reakčná zmes sa ochladí na 0 °C a pridá sa roztok 385 mg N-jódsukcínimidu a 55,4 μΐ trifluórmetánsulfónovej kyseliny v 7 ml zmesi 1/1 (objemovo) dichlórmetán/dioxán. Po 10 minútach sa zmes filtruje, zriedi sa toluénom, postupne sa premyje IM roztokom tiosíranu sodného, 10 % roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou, suší sa nad síranom sodným a potom sa odparí vo vákuu. Zvyšok sa čistí pomocou chromatografie na géli Sephadex® LH20 (1/1 (objemovo) dichlórmetán/etanol), potom pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli (5/4 (objemovo) toluén/acetón) a získa sa 887 mg zlúčeniny 27.

[a]_D = +70° (c = 0,35, dichlórmetán).

Príprava 25 2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3,4,6-tetra-0-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-acetyl-a-D-glukopyra nozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-acetyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—»4)-(6-deoxy-2,3-di-0-metyl-6-ftalimido-oc-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l-»4)]₃-2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozid (28)

Roztok 750 mg (0,245 mmol) zlúčeniny 27 v 37 ml kyseliny octovej sa hydrogenuje pri tlaku 500 kPa v prítomnosti 750 mg 10 % paládia na uhlí 2,5 hodiny. Po filtrácii sa roztok odparí a zvyšok sa čistí pomocou chromatografie na kolóne silikagélu za elúcie zmesou 6/1 (objemovo) toluén/etanol a získa sa 728 mg zlúčeniny 28.

TLC: R_f = 0,32, silikagél, 6/1 (objemovo) toluén/etanol.

Príprava 26 2-(Trimetylsilyl)etyl-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-acetyl-a-D-glukopyra nozyl)-(l-»4)-(2,3,6-tri-0-acetyl-3-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(6-deoxy-2,3-di-0-metyl-6-ftalimido-a-D-glukopyranozy 1)-(1 —>4)-(2,3,6-tri-0-metyl-p-D-gkikopyranozyl)-(l->4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)]₃-6-O-acetyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozid (29)

51,1 μΐ (0,368 mmol) trietylamínu, 32,5 μΐ (0,344 mmol) anhydndu kyseliny octovej a 6,0 mg (0,049 mmol) dimetylaminopyridínu sa pridá k roztoku 728 mg (0,245 mmol) zlúčeniny 28 v 10 ml dichlórmetánu. Po 1 hodine miešania sa reakčná zmes zriedi dichlórmetánom, postupne sa premyje 10 % roztokom

SK 287218 Β6 hydrogenuhličitanu draselného, vodou, nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou, suší sa nad síranom sodným a odparí sa vo vákuu. Po čistení zvyšku pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli sa získa 0,618 g zlúčeniny 29.

TLC: R_f = 0,37, silikagél, 6/1 (objemovo) toluén/etanol.

Schéma 6 - Syntéza oligosacharidu 31

Príprava 27 (2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(l-»4)-(2,3,6-tri-0-acetyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(6-deoxy-2,3-di-0-metyl-6-ftalimido-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l-»4)-[(2,3,6-tri-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(1^4)]₃-6-0-acetyl-2,3-di-0-metyl-D-glukopyranóza (30)

Roztok 579 mg (0,192 mmol) zlúčeniny 29 v 11,5 ml zmesi 2/1 (objemovo) trifluóroctová kyselina/dichlórmetán sa mieša 1 hodinu. Reakčná zmes sa zriedi 69 ml zmesi 2/1 (objemovo) toluén/n-propylacetát, odparí sa a potom sa odparí spolu s toluénom. Zvyšok sa čistí pomocou chromatografie na kolóne silikagélu za elúcie zmesou 5/1 (objemovo) toluén/etanol a získa sa 523 mg zlúčeniny 30. TLC: R_f= 0,31, silikagél, 5/1 (objemovo) toluén/etanol.

Príprava 28

Trichlóracetimidát (2,3,4,6-tetra-0-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-0-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-acetyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(6-deoxy-2,3-di-0-metyl-6-ftalimido-o:-D-glukopyrano-zyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)]₃-6-0-acetyl-2,3-di-0-metyl-D-glukopyranózy (31)

65,5 μΐ (0,85 mmol) trichlóracetonitrilu a 88,4 mg (0,27 mmol) uhličitanu cézneho sa pridá k 3 ml roztoku zlúčeniny 30 v dichlórmetáne. Po 2 hodinách miešania sa zmes filtruje a odparí. Zvyšok sa čistí pomocou chromatografie na kolóne silikagélu za elúcie zmesou 6/1 (objemovo) toluén/etanol + 0,1 % trietylamínu a získa sa 477 mg zlúčeniny 31.

TLC: R_f = 0,35, silikagél, 6/1 (objemovo) toluén/etanol.

SK 287218 Β6

Schéma 7 - Syntéza hexadekasacharidu 35

C

Príprava 29

Metyl-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-(2,3,6-tri-0-acetyl-oi-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)5 (2,3,6-tri-O-acetyl-3-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(6-deoxy-2,3-di-O-metyl-6-ftalimido-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-[(2,3,6-tri-0-metyl-ci-D-glukopyranozyl)-(l->4)-0-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)]3-(6-O—acetyl-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)(benzyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozyluronát)-(l—>4)-(3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-a-D-glukopyranozvl)-( 1 ->4)-(benzyl-2,3-di-O-metyl-a-Ľ-idopyranozyluronát)-( 1 ->4)-2,3,6-tri-0-benzyl-a-D10 -glukopyranozid (33)

SK 287218 Β6

370 mg (0,121 mmol) imidátu 31 a 336 mg (0,242 mmol) zlúčeniny 32 (pripravenej podľa postupu opísaného v P. Westerduin a kol., Bioorg. Med. Chem., 1994, 2, 1267) sa rozpustí v 5,5 ml zmesi 1/2 (objemovo) dichlórmetán/dietyléter. Po pridaní 4Ä práškových molekulových sít sa zmes ochladí na -20 °C a pridá sa 181,5 μΐ 0,1Μ roztoku trimetylsilyltrifluórmetánsulfonátu v dichlórmetáne. Po 25 minútach sa zmes neutralizuje pridaním pevného hydrogenuhličitanu sodného. Po filtrácii a odparení sa zvyšok čistí pomocou chromatografie na géli Sephadex® LH20, potom pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli za elúcie zmesou 6/5 (objemovo) toluén/acctón a získa sa 302 mg zlúčeniny 33.

[ct]_D = +86° (c = 1, dichlórmetán).

Príprava 30

Metyl-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —> 4)-(2,3,6-tri-0-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-(2,3,6-tri-O-acetyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(6-deoxy-2,3-di-O-metyl-6-ftalimido-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-O-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)]₃-(6-O-acetyl-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozylurónovákyselma)-(l->4)-(3,6-di-0-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-O-metyl-cc-L-idopyranozylurónová kysclina)-( 1—>4)-cc-D-glukopyranozid (34)

Roztok 104 mg (0,024 mmol) zlúčeniny 33 v 5 ml kyseliny octovej sa hydrogenuje pri tlaku 400 kPa v prítomnosti 104 mg paládia na uhlí 4 hodiny. Po filtrácii sa roztok lyofilizuje a získa sa 87 mg zlúčeniny 34, ktorá sa použije v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia.

Príprava 31

Metyl-(oi-D-g1ukopyranozyl)-( 1 -^4)-(a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-( 3-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-(6-deoxy-2,3-di-O-metyl-6-ftalimido-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-O-(2,3,6-tri-O-metyl-p-D-glukopyranozyl)-(l->4)]₃-(2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l->4)-(a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-(l->4)-a-D-glukopyranozid (35)

140 μΐ molámeho roztoku metoxidu sodného sa v prítomnosti 875 mg 3Á práškových molekulových sít pridá k roztoku 80 mg (0,021 mmol) zlúčeniny 34 v 6,9 ml bezvodého metanolu. Po 20 hodinách pri teplote miestnosti sa reakčná zmes filtruje a filtrát sa neutralizuje kyselinou octovou. Roztok sa odparí na polovicu a nanesie sa na gélovú kolónu Sephadex® G-25 Fine (3 x 92 cm). Po elúcii vodou a lyofilizácii sa získa 66 mg zlúčeniny 35.

SK 287218 Bé

Príprava 32

Sodná soľ metyl-(2,3,4,6-tetra-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(6-deoxy-2,3-di-O-metyl-6-ftaliniido-a-D-glukopyranozyl)-( 1-+4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l-+4)-0-(2,3,6-tri-0-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(l->4)]₃-(6-0-sulfonáto-2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-(2,3-di-0-metyl-3-D-glukopyranozylurónová kyselina)-( 1 -+4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-0-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-) 1-+4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu (3 6)

66,4 mg (0,021 mmol) polyolu 35 sa rozpustí v 1,8 ml Ν,Ν-dimetylformamidu. Pridá sa 320 mg (1,77 mmol) komplexu oxid sírový/trietylamín a zmes sa mieša 20 hodín pri 55 °C. Roztok sa nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine (3 x 92 cm) a eluuje sa 0,2 M chloridom sodným. Frakcie obsahujúce produkt sa odparia a odsolenie sa uskutoční s použitím rovnakej kolóny za elúcie vodou. Po lyofilizácii sa získa 83 mg zlúčeniny 36.

Hmota: metóda ESI, negatívny mód: chemická hmota = 4968,92; experimentálna hmota = 4966,52 ± 0,16 a.m.u.

Príprava 33

Sodná soľ metyl-(2,3,4,6-tetra-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-p-D-glukopyranozyl)(l >4)-(6-amino-6-deoxy-2,3-di-O-mctyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-metyl-3-D-glukopyranozyl)-(l->4)-[(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-0-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)]₃-(6-O-sulfonáto-2,3-di-O-metyl-ot-D-glukopyranozyl)-( l->4)-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopvranoz.ylurónová kyseltna)-(l—>4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l-+4)-(2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-) 1 —>4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozid (37) mg (0,017 mmol) zlúčeniny 36 sa rozpustí v 1,67 ml zmesi 2/1 (objemovo) etanol/voda. Pridá sa

81,2 μΐ (1,67 mmol) hydrátu hydrazínu a zmes sa 20 hodín zahrieva do varu pod spätným chladičom. Roztok sa nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine (3 x 92 cm) a eluuje sa vodou. Po odparení frakcií obsahujúcich produkt sa zvyšok rozpustí v 5,00 ml zmesi etanol/voda a znova sa reaguje za podmienok uvedených skôr s

81,2 μΐ hydrátu hydrazínu a získa sa 71 mg zlúčeniny 37.

Hmota: Metóda ESI, negatívny mód: chemická hmota = 4838,32; experimetálna hmota = 4814,6 ± 0,70 a.m.u.

Schéma 9 - Syntéza pentasacharidu 39

Príprava 34

Metyl-(6-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(benzyl-2,3-di-O-metyl-3-D-glukopyranozyluronát)-(l—>4)-(3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-a-D-glukopyranozyl)-(l -+4)-(benzyl-2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-(l->4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid (39)

265 mg (0,631 mmol) trichlóracetimidátu 6-O-acetyl-2-azido-2-deoxy-3,4-di-O-metyl-a,3-D-glukopyranózy 38 získaného podľa postupu opísaného v J. Basten a kol., Bioorg. Med. Chem. Letí. (1992), 2(9), 901) a 584 mg (0,420 mmol) zlúčeniny 32 (získanej podľa postupu opísaného v P. Westerduin a kol., Bioorg.

SK 287218 Β6

Med. Chem., 1994, 2, 1267) sa rozpustí v 28,5 ml zmesi 1/2 (objemovo) dichlórmetán/dietyléter. Po pridaní práškových 4Ä molekulových sít sa zmes ochladí na -20 °C a pridá sa 94,6 μΐ 0,1 M roztoku trimetylsilyltrifluórmetánsulfonátu v dichlórmetáne. Po 10 minútach sa znova pridá 53,8 mg imidátu, potom 19,2 μΐ Ο,ΙΜ roztoku trimetylsilyltrifluórmetánsulfonátu v dichlórmetáne. Po 10 minútach sa zmes neutralizuje pridaním 5 pevného hydrogenuhličitanu sodného. Po filtrácii a odparení sa zvyšok čistí pomocou chromatografie na kolóne silikagélu za elúcie zmesou 3/1 (objemovo) toluén/etylacetát a získa sa 499 mg zlúčeniny 39.

[a]_D = +66° (c = 1,07, dichlórmetán).

Schéma 10 - Syntéza pentasacharidu 44 (spôsob I)

Príprava 35

Metyl-(6-0-acetyl-2-amino-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l->4)-(3,6-di-O-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(1->4)-(2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-) l->4)-a-D-glukopyranozid (40)

Roztok 552,6 mg (0,335 mmol) zlúčeniny 39 v 16 ml zmesi 5/1 (objemovo) ŕerc-butanol/etylacetát sa hydrogenuje pri tlaku 1 MPa v prítomnosti 1,10 g 10 % paládia na uhlí a 0,336 ml IM kyseliny chlorovodíkovej 4,5 hodiny. Po filtrácii sa roztok odparí a získa sa zlúčenina 40, ktorá sa použije v ďalšom kroku bez čistenia.

Príprava 36 Metyl-(2-amino-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-0-metyl-3-D-glukopyranozylurónová kyselina)-( 1 ->4)-(oc-D-glukopyranozyl)-( 1 -»4)-(2,3-di-0-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-) 1 ->4)-a-D-glukopyranozid (41)

324 mg (0,300 mmol) zlúčeniny 40 sa rozpustí v 8,8 ml metanolu. Pridajú sa 2,2 ml 5 M roztoku hydroxidu sodného a reakčná zmes sa mieša 16 hodín pri teplote miestnosti. Neutralizuje sa na živici Dowex® 50 H⁺ a filtruje sa. Roztok sa prefiltruje cez kolónu Sephadex® G-25 Fine za elúcie vodou. Frakcie obsahujúce produkt sa odparia a získa sa 254,2 mg zlúčeniny 41. V tomto stupni sa potvrdí pomocou NMR, že sa odstránili ochranné skupiny (benzylová skupina a acetylová skupina).

TLC: Rf = 0,26, silikagél, 5/5/1/3 (objemovo) etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda.

Príprava 37 Metyl-(2-(benzyloxykarbonyl)amino-2-deoxy-3,4-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(1 ->4)-(2,3-di-O-metyl-β-ϋ—glukopyranozylurónová kyselina)-)l-»4)-(a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-O-metyl-cc-L-idopyranozylurónová kyselina)-) 1—>4)-a-D-glukopyranozid (42)

241,1 mg (0,253 mmol) zlúčeniny 41 sa rozpustí v 12,4 ml vody a pridá sa 63,7 mg hydrogenuhličitanu sodného a potom sa prikvapká 41 μΐ benzylchloroformiátu. Po 12 hodinách miešania sa reakčná zmes nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine a eluuje sa vodou. Frakcie obsahujúce produkt sa odparia. Po čistení pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli za elúcie zmesou 21/17/3,6/10 (objemovo) etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda sa získa 221 mg zlúčeniny 42.

TLC: R_f = 0,63, silikagél, 5/5/1/3 (objemovo) etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda.

Príprava 38

Sodná soľ metyl-(2-(benzyloxykarbonyl)amino-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-6-0-sulfonáto-oc-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-O-metyl-3-D-glukopyranozylurónová kyselina)-) 1—>4)-(2,3,6-tri-O-sul fonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-0-metyl-ot-L-idopyranozylurónová kyselina)-) 1—>4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu (43)

19,6 mg (0,018 mmol) polyolu 42 sa rozpustí v 1,62 ml Ν,Ν-dimetylformamidu. Pridá sa 114 mg komplexu oxid sírový-trietylamín a zmes sa mieša 20 minút pri 55 °C s vylúčením svetla. Roztok sa nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine a eluuje sa 0,2M chloridom sodným. Frakcie obsahujúce produkt sa odparia a odsolia sa s použitím rovnakej kolóny za elúcie vodou. Po lyofilizácii sa získa 28,3 mg zlúčeniny 43.

[a]_D = +48° (c = 2,75, voda).

Príprava 39

Sodná soľ metyl-(2-amino-2-deoxy-3,4-di-O-metyl-6-O-sulfbnáto-a-D-glukopyranozyl)-( 1—>4)-(2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozylurónová kyselina)-( 1—>4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-) 1—>4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-cc-D-glukopyranozidu (44)

Roztok 27,5 mg (0,015 mmol) zlúčeniny 43 v smesi 333 μΐ tórc-butanolu a 500 μΐ vody sa hydrogenuje pri tlaku vodíka 500 kPa v prítomnosti 8,25 mg 10 % paládia na uhlí 16 hodín. Po filtrácii sa roztok odparí a zvyšok sa nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine (3 x 92 cm). Po eluovaní vodou a lyofilizácii sa získa 23,7 mg zlúčeniny 44.

[ot]_D = +58° (c = 1, voda).

SK 287218 Β6

Schéma 11 - Syntéza tetrasacharidu 48

OAc

OAc

Príprava 40

Metyl-(4-O-levulinyl-2,3-di-O-metyl-3-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l—>4)-(3,6-di-O-acetyl-a.-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-0-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-/ l-»4)-a-D-glukopyranozid (46)

Roztok 4,50 g (3,02 mmol) zlúčeniny 45 (získanej podľa postupu opísaného v P. Westerduin a kol., Bioorg. Med. Chem., 1994, 2, 1267) v 72 ml zmesi etylacetát/terc-butanol (1/1, objemovo) reaguje pri tlaku vodíka 400 kPa v prítomnosti 9,0 g 10 % paládia na uhlí 6 hodín. Po filtrácii a odparení sa získaná zlúčenina 46 použije priamo, bez čistenia v nasledujúcom kroku.

TLC: Rf = 0,54, 26/22/4,6/17 objemovo etylacetát/pyridín/ kyselina octová/voda.

Príprava 41

Metyl-(metyl-4-0-levulmyl-2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozyluronát)-( l->4)-(2,3,6-tri-O-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(metyl-2,3-di-D-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-(l—>4)-2,3,6-tri-O-acetyl-a-D-glukopyranozid (47)

2,71 g hydrogenuhličitanu draselného a 3,4 ml metyljodidu sa pri 0 °C pridá k 2,57 g (2,71 mmol) zlúčeniny 46 v 35 ml bezvodého Ν,Ν-dimetylformamidu. Po 16 hodinách miešania pri teplote miestnosti sa reakčná zmes ochladí na 0 °C. Potom sa postupne pridá 132 mg dimetylaminopyridínu a 1,5 ml anhydridu kyseliny octovej. Zmes sa mieša 16 hodín. Po neutralizácii prebytku anhydridu kyseliny octovej sa zmes zriedi etylacetátom. Organická fáza sa postupne premyje 10 % roztokom hydrogensíranu sodného a potom nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou, suší sa nad síranom sodným, filtruje sa a potom sa odparí do sucha. Zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli za elúcie zmesou 9/5 cyklohexán/( 1/1 etylacetát/etanol) a získa sa 2,51 g zlúčeniny 47.

TLC: Rf = 0,41, 2/1 objemovo toluén/acetón.

Príprava 42 Metyl-(metyl-2,3-di-0-metyl-p-D-glukopyranozyluronát)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-acetyl-cc-D-gIukopyranozyl)-(l->4)-(metyl-2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-(l —>4)-2,3,6-tri-O-acetyl-a-D-glukopyranozid (48)

2,5 g (2,56 mmol) zlúčeniny 47 sa rozpustí v 500 ml zmesi 1/1 objemovo toluén/etanol. Pridá sa 1,01 g acetátu hydrazínu. Po 2 hodinách miešania pri teplote miestnosti sa reakčná zmes odparí do sucha. Zvyšok sa rozpustí v dichlórmetáne. Organická fáza sa postupne premyje 2 % roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou, suší sa nad síranom sodným, filtruje sa a odparí do sucha. Po čistení pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli za elúcie zmesou % (objemovo) toluén/etylacetát sa získa 2,01 g zlúčeniny 48. TLC: R_f = 0,37, 2/1 objemovo toluén/acetón.

Príprava 43

Metyl-(6-0-acetyl-2-azido-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-oc-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(metyl-2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozyluronát)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(metyl-2,3-di-0-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-(l—>-4)-2,3,6-tri-O-acetyl-a-D-glukopyranozid (49)

1,18 g (2,81 mmol) imidátu 38 (získaného podľa postupu opísaného v J. Basten a kol., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1992), 2(9), 901) a 1,83 g (1,75 mmol) zlúčeniny 48 sa rozpustí v 126 ml zmesi 1/2 (objemovo) dichlórmetán/dietyléter. Po pridaní práškových 4Ä molekulových sít sa zmes ochladí na -20 °C a pridá sa 421 μΐ 1 M roztoku fôrc-butyldimetylsilyltrifluórmetánsulfonátu v dichlórmetáne. Po 30 minútach sa pridá ďalších 266 mg imidátu a 168 μΐ IM roztoku terc-butyldimetylsilyltrifluórmetánsulfonátu v dichlórmetáne. Po 10 minútach sa zmes neutralizuje pridaním pevného hydrogenuhličitanu sodného a filtruje sa. Roztok sa prevrství dichlórmetánom, postupne sa premyje 2 % roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou, suší sa nad síranom sodným a potom sa odparí vo vákuu. Získaný zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli za elúcie zmesou 4/3 a potom 1/1 objemovo dichlórmetán/etylacetát a získa sa 1,814 g zlúčeniny 49.

TLC: R_f = 0,57, 3/1 objemovo toluén/etylacetát.

[ot]_D = +93° (c = 1,15, dichlórmetán).

Schéma 13: Syntéza pentasacharidu 44 (spôsob II)

Príprava 44

Metyl-(2-azido-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-O-metyl^-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l-»4)-(ct-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-0-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-(l->4)-a-D-glukopyranozid (50) ml 30 % vodného roztoku peroxidu vodíka sa pri -5 °C pridá k roztoku 845,3 mg zlúčeniny 49 v 104 ml tetrahydrofuránu. Po 5 minútach miešania sa prikvapká 0,7 M vodný roztok hydroxidu lítneho. Reakčná zmes sa mieša 1 hodinu pri -5 °C, potom 4 hodiny pri 0 °C a nakoniec 16 hodín pri teplote miestnosti. Neutralizuje sa 1 M roztokom kyseliny chlorovodíkovej. Roztok sa nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine (5 x 1000 cm) a eluuje sa vodou. Frakcie obsahujúce očakávanú zlúčeninu sa spoja, odparia sa a nanesú na kolónu obsahujúcu 50 ml živice Dowex AG 50 WX4 H⁺. Zlúčenina sa odoberie pri 0 °C a odparí sa, pričom sa získa 618 mg zlúčeniny 50.

TLC: Rf = 0,56, 26/22/4,6/17 objemovo etylacetát/pyridín/ kyselina octová/voda.

Príprava 45

Sodná soľ metyl-(2-azido-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-6-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-(2,3 -di-0-metyl-p-D-glukopyranozyluronát)-(l-»4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l -^4)-(2,3-di-0-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-(l->4)-2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-gIukopyranozidu (51)

Bezprostredne pred použitím sa zlúčenina 50 destiluje trikrát s 29 ml Ν,Ν-dimetylformamidu. K roztoku 612 mg (0,624 mmol) zlúčeniny 50 v 58 ml Ν,Ν-dimetylformamidu sa pridá 3,84 g komplexu oxid sírový-trietylamín. Zmes sa mieša 16 hodín pri 55 °C bez prístupu svetla. Zmes sa ochladí na 0 °C a prikvapká sa k nej roztok 5,33 g hydrogenuhličitanu sodného v 200 ml vody. Zmes sa mieša 16 hodín pri teplote miestnosti a odparí sa do sucha. Zvyšok sa rozpustí vo vode a roztok sa nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine a eluuje sa 0,2M roztokom chloridu sodného. Frakcie obsahujúce produkt sa odparia a odsolia sa s použitím rovnakej kolóny za elúcie vodou. Po lyofilizácii sa získa 1,06 g zlúčeniny 51. TLC: R_r= 0,5, 3/5/1/3 objemovo etylacetáť'pyridin'kyselina octová/voda.

Príprava 46

Sodná soľ metyl-(2-amino-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-6-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-(2,3-di-O-metvI-fí-D-g lukopyranozy lurónová kyselina)-) 1 —>4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-cc-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-(2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-) 1—>4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu (44)

Táto hydrogenolýza sa uskutoční dvakrát a v každom prípade na 534,4 mg zlúčeniny 51.

Roztok 534,4 mg zlúčeniny 51 v zmesi 6,7 ml (12,6 ml/g) ŕerc-butanolu a 10 ml (19 ml/g) vody sa reaguje s vodíkom za tlaku 500 kPa v prítomnosti 160 mg 10 % paládia na uhlí 4 hodiny pri 40 ^CC. Po filtrácii (filter Millipore® LSWP 5 pm) sa roztok odparí do sucha a získa sa 530 mg zlúčeniny 44.

TLC: Rf = 0,49, 3/5/1/3 objemovo etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda.

Príklad 1

C

Príklad 3

fc29

SK 287218 Β6

Príklad 1

Sodná soľ metyl-(2,3,4,6-tetra-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-P-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(6-biotínamido-6-deoxy-2,3-di-O-me5 tyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l-^4)-[(2,3,6-tri-0-metyl-oc-D-glukopyranozyl)-(l~>4)-0-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)]₃-(6-0-sulfonáto-2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-(2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozylurónová kyselina)-( 1 —>4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-(2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-( 1 ->4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu

16,5 mg sulfosukcínimidu biotínu sa pridá k roztoku 18 g (3,72 pmol) zlúčeniny 37 v 1,5 ml 0,5 % roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Po 16 hodinách miešania pri teplote mmiestnosti sa reakčná zmes nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine a eluuje sa roztokom chloridu sodného. Frakcie obsahujúce produkt sa odparia a odsolia sa s použitím rovnakej kolóny za elúcie vodou. Po lyofilizácii sa získa 15,9 mg zlúčeniny z príkladu 1.

[a]_D = +59° (c = 0,78, voda).

Hmota: metóda ESI, negatívny mód: chemická hmota = 5065,12; experimentálna hmota - 5064,18 ± 1,04 a.m.u.

Príklad 2

Sodná soľ metyl-(2,3,4,6-tetra-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4 )-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-p-D-glukopyranozyl)(l-H-4)-('6-[6-(biotínamido)-hexamido]-6-deoxy-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)-[(2,3,6-tri-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-0-(2,3,6-tri-0-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l-»4)]₃-(6-0-sulfonáto-2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozylurónová kyselina)-( 1 -»4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-( 1 -»4)-(2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozyluróno vá kyselina)-( 1 —>4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu

16.5 mg 6-(biotinamido)hexanoátu sa pridá k roztoku 18 mg (3,72 μιηοΐ) zlúčeniny 37 v 1,5 ml 0,5 % roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Po 16 hodinách miešania pri teplote mmiestnosti sa reakčná zmes nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine a eluuje sa roztokom chloridu sodného. Frakcie obsahujúce produkt sa odparia a odsolia sa s použitím rovnakej kolóny za elúcie vodou. Po lyofilizácii sa získa 17,9 mg zlúčeniny z príkladu 2.

[a]_D = +60° (c = 1,0, voda).

Hmota: metóda ESI, negatívny mód: chemická hmota = 5178,28; experimentálna hmota = 5176,3 ± 0,77 a.m.u.

Príklad 3

Sodná soľ metyl-(2,3,4,6-tetra-0-sulfbnáto-o:-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-ct-D-glukopyranozyl)(l->4)-(2,3,6-tri-0-sulfonáto-P-D-glukopyranozyl)(l->4)-(6-[6-(6-biotínamidohexamido)hexamido]-6-deoxy-2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3,6-tri-0-metyl-p-D-glukopyranozyl)-(1 —>4) - [(2,3,6-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-O-(2,3,6-tri-O-metyl-P-D-glukopyranozyl)-(l->4)]₃-(6-0-sulfonáto-2,3-di-0-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l->4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-O-metyl-<x-L-idopyranozylurónová kyselina)-( 1—>4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-cc-D-glukopyranozidu

23.6 mg sulfosukcínimidyl-6-(6-biotínamidohexamido)hexanoátu sa pridá k roztoku 17 mg (3,51 pmol) zlúčeniny 37 v 1,4 ml 0,5 % hydrogenuhličitanu sodného. Po 16 hodinách miešania pri teplote miestnosti sa reakčná zmes nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine a eluuje sa chloridom sodným a odsolí sa s použitím rovnakej kolóny a elúcie vodou. Po lyofilizácii sa získa 17,4 mg zlúčeniny z príkladu 3.

[a]_D = +64° (c = 1,0, voda).

Hmota: metóda ESI, negatívny mód: chemická hmota = 5291,44; experimentálna hmota = 5292,1 ± 0,83 a.m.u.

Príklad 4

Sodná soľ metyl-(2-biotínamido-2-deoxy-3,4-di-O-metyl-6-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina)-( 1—>4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyI)-(1 ->4)-(2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-( 1 —>4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-cc-D-glukopyranozidu

Roztok 42 mg biotm-N-hydroxysukcínimidu v 750 μΐ Ν,Ν-dimetylformamidu sa pridá k roztoku 21,2 mg (0,012 mmol) zlúčeniny 44 v 750 μΐ 0,5 % hydrogenuhličitanu sodného. Po 16 hodinách miešania pri teplote miestnosti sa reakčná zmes nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine. Po elúcii vodou a lyofilizácii sa získa 22,3 mg zlúčeniny z príkladu 4.

[a]_D = +38° (c = 0,15, voda).

Hmota: metóda ESI, negatívny mód: chemická hmota = 1938,48; experimentálna hmota = 1937,48 ± 0,11 a.m.u.

Príklad 5

Sodná soľ metyl-(2-[N-(6-biotmamidohexanoyl)]-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-6-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-(2,3-di-O-metyl-P-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l-»4)(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a.-D-glukopyranozyl)-(l—>4)(2,3-di-O-metyl-cc-L-idopyranozylurónová kyselina)-( 1 —>4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu

Táto reakcia sa v každom prípade uskutoční dvakrát so 494,5 mg zlúčeniny 44.

494,5 mg (0,289 mmol) zlúčeniny 44 sa rozpusti v 116 ml 0,5 % vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Potom sa prikvapká roztok 1,46 g (2,63 mmol) sulfosukcinimidu 6-biotinamidohexanoátu v 12 ml 0,5 % roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Po 16 hodinách miešania pri teplote miestnosti sa pridá IM vod ný roztok hydroxidu sodného a zmes sa mieša 1 hodinu. Reakčná zmes sa nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine (5 x 1000 cm) a eluuje sa chloridom sodným. Frakcie obsahujúce produkt, ktorý pochádza z obidvoch reakcií sa spoja. Po lyofilizácii sa získa 999,2 mg zlúčeniny z príkladu 5.

TLC: Rf = 0,42, 3/5/1/3 objemovo etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda. Hmota: metóda ESI, negatívny mód: chemická hmota = 2051,64; experimentálna hmota: 2051,60 ± 0,43 a.m.u.

Príklad 6

Sodná soľ metyl-(2-[6-(6-biotínamidohexamido)hexamido]-2-deoxy-3,4-di-0-metyl-6-0-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l-»4)-(2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozylurónová kyselina)-) 1—>4)-(2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-(2,3-di-0-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-) 1 —>4)-2,3,6-tri-O-sulfonáto-a-D-glukopyranozidu

30,1 mg (17,6 pmol) zlúčeniny 44 sa rozpustí v 7 ml 0,5 % vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Potom sa prikvapká roztok 118 mg (176 pl) sulfosukcínimidyl-6-(6-biotínamidohexamidu) v 1 ml 0,5 % vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Po 16 hodinách miešania pri teplote miestnosti sa pridá IM vodný roztok hydroxidu sodného a zmes sa mieša 1 hodinu. Reakčná zmes sa nanesie na kolónu Sephadex® G-25 Fine (2 x 85 cm) a eluuje sa chloridom sodným. Frakcie obsahujúce produkt sa spoja a odsolia sa na kolóne Sephadex® G-25 Fine (2 x 85 cm) za elúcie vodou. Po lyofilizácii sa získa 26,5 mg zlúčeniny z príkladu 6. Hmota: metóda ESI, negatívny mód: chemická hmota = 2164,48; experimentálna hmota: 2164,29 ± 0,38 a.m.u.

Claims (1)

1. Použitie avidínu alebo streptavidínu na prípravu liečiv na neutralizáciu antitrombotickej aktivity polysacharidov vzorca