ES2560467T3 - Pentasacáridos sintéticos que tienen vida media corta y alta actividad - Google Patents

Abstract

Un compuesto pentasacárido sintético de fórmula (I):**Fórmula** en donde: - R1 representa un grupo alquilo C1-C3; - R2 representa un grupo alcoxi C1-C3 y R7 representa un átomo de hidrógeno, o R2 y R7 forman un puente de -O-CH2- ó de -O-CH2-CH2-, donde -O- está unido al átomo de carbono que porta el grupo R2 y -CH2- está unido al átomo de carbono que porta el grupo R7; - R3 representa un átomo de hidrógeno o un grupo etilo; - R4 representa -OH, -NH2O-NH-LC-biotina, en donde LC representa un conector, ventajosamente de fórmula -(C>=O)-(CH2)n-NH-, con n de 1 a 10, y más ventajosamente de fórmula -(C>=O)-(CH2)4-NH; - cuando R5 y R6 son diferentes, R5 y R6 se eligen en medio de un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, un grupo etilo, un propilo, un grupo butilo y un grupo pentilo; - cuando R5 y R6 son idénticos, R5 y R6 se eligen en medio de un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, un grupo etilo, un propilo y un grupo pentilo; en la condición de que R1 difiere de al menos uno de R5 o R6; y la sal del mismo.

Description

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DESCRIPCION

Pentasacaridos sinteticos que tienen vida media corta y alta actividad Campo tecnico

La presente invencion se refiere a anticoagulantes (es dedr, sustancias que impiden la coagulacion de la sangre). Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a oligosacaridos antitromboticos.

Tecnica anterior

La heparina, un polisacarido sulfatado natural, es un anticoagulante que pertenece a la familia de los glicosaminoglicanos. La actividad anticoagulante de la heparina se debe a su capacidad de acelerar la inhibicion de varias proteasas, en particular el factor Xa y la trombina, en la cascada de coagulacion de la sangre.

La heparina y los farmacos derivados de heparina inhiben la actividad de factor Xa al unirse a un dominio de union espedfica de la antitrombina (AT). Una vez que los farmacos de heparina o derivados de heparina se unen al dominio de union espedfica de la antitrombina, inducen un cambio conformacional en la antitrombina (AT). Este cambio conformacional en la AT es responsable de la inhibicion del factor Xa. Las investigaciones han demostrado que el menor elemento estructural capaz de unirse de manera significativa a la AT, y de inhibir el factor Xa, es un pentasacarido.

El prototipo de este tipo de productos que induce cambios conformacionales es el fondaparinux. El fondaparinux sodico (Arixtra ™ - GlaxoSmithKline) es el primero de una nueva clase de agentes antitromboticos. Presenta una vida media en ratas de aproximadamente una hora y de 17 h en seres humanos. Se administra una vez al dfa a los pacientes que necesitan un tratamiento anticoagulante. Es un pentasacarido sintetizado qmmicamente que imita el sitio de union a antitrombina de la heparina. Es un inhibidor selectivo del factor Xa y por lo tanto un inhibidor de la generacion de trombina.

La smtesis de fondaparinux es larga y complicada. Asf, con el objetivo de simplificar la qmmica a la vez que se mantiene la misma actividad y el perfil farmacocinetico, se han disenado nuevas series de pentasacaridos descritos en el documento US 5.543.403, el documento WO 99/25720 o en el documento WO 99/36428.

Los documentos US 5.543.403 y WO 99/25720 describen pentasacaridos sinteticos en los que los grupos N-sulfato, N-acetato e hidroxilo se sustituyen por grupos alcoxi, y O-sulfato. El documento Wo 99/36428 describe pentasacaridos sinteticos similares, cuya unidad L-iduronica esta bloqueada en una conformacion 2S0, y cuya unidad D-glucuronica E tiene finalmente un grupo etilo en la posicion 5.

Sin embargo, mientras que la presencia de grupos alquilo en estas unidades pentasacaridas simplifica considerablemente su modo de preparacion, tambien aumenta la vida media haciendo problematico el uso clfnico.

El documento EP 2 074 131 tambien intenta proporcionar pentasacaridos sinteticos. En esta solicitud, se considero que la capacidad de los pentasacaridos para pasar a traves de la barrera intestinal era importante para una aplicacion como antitromboticos.

Sin embargo, pareda que muchos de los compuestos descritos por el documento EP 2 074 131 tambien tienen una vida media demasiado larga.

La vida media de los pentasacaridos anticoagulantes, el tiempo necesario para reducir a la mitad la concentracion plasmatica del farmaco, es un parametro farmacocinetico muy importante. De hecho, a veces es necesario, p. ej., en caso de una hemorragia, desconectar lo mas rapidamente posible el efecto anticoagulante de modo que la hemorragia pueda ser detenida.

Las vidas medias adecuadas para un rango de anticoagulante de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 horas en seres humanos, que corresponde a 0,5 horas a aproximadamente 3 horas en ratas.

La introduccion de un radical de biotina en el pentasacarido permite la supresion rapida de la actividad anticoagulante a traves de la inyeccion de avidina, una protema que se une fuertemente a la biotina.

El grupo biotina (nombre IUPAC: acido 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il]pentanoico; tambien conocido como vitamina B7) representa el siguiente grupo:

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Tales pentasacaridos biotinilados se conocen del documento EP 1 322 673. La Avidina evita que los compuestos tengan su efecto sobre sus dianas y acelera su elimination. La actividad anti-factor Xa de los compuestos biotinilados del documento EP322673 es equivalente a la actividad de sus contrapartes no biotiniladas.

Por lo tanto, es posible neutralizar la actividad anticoagulante de los compuestos biotinilados mediante la administration de avidina que finalmente permite el uso de pentasacaridos anticoagulantes de vida media larga.

Sin embargo, la enzima biotinidasa, que escinde el enlace amida en el extremo carboxilato de la biotina, esta presente en el plasma sangmneo y podria reaccionar con compuestos biotinilados para desbiotinilarlos. Como resultado, los compuestos desbiotinilados ya no son neutralizados por la avidina, manteniendo su actividad anticoagulante hasta que sean lavados fisiologicamente. Este es un problema real ya que los tratamientos anticoagulantes se pueden administrar durante un largo periodo de tiempo y el compuesto desbiotinilado puede acumularse en el plasma. Por lo tanto, sigue siendo altamente deseable tener compuestos biotinilados con una vida media corta para permitir su neutralization inmediata en caso de emergencia y para evitar su acumulacion en el plasma si son desbiotinilados por la biotinidasa.

Los autores de la presente invention han encontrado sorprendentemente que la vida media de pentasacaridos alquilados/O-sulfatados se puede modular mediante la variation de los grupos sustituyentes de la unidad D.

La introduction de una funcion amino en la position 2 reduce la vida media.

La biotinilacion de esta funcion 2-amino aumenta la vida media.

La introduccion de una funcion hidroxilo libre en la unidad D reduce la vida media.

Una combination de estas diversas observaciones permitio a los autores identificar pentasacaridos biotinilados potentes inhibidores de factor Xa con una vida media corta.

Por lo tanto, un objetivo de la invencion es proporcionar pentasacaridos, que sean faciles de sintetizar y con una vida media corta, y, en particular, pentasacaridos biotinilados.

Otro objetivo de la invencion es proporcionar pentasacaridos biotinilados con alta actividad anti-factor Xa, es decir bajo valor de CI50.

Por lo tanto, todos los inconvenientes de la tecnica anterior se superan con el uso de compuestos de acuerdo con la invencion, y mas en particular, de los biotinilados.

Compendio de la invencion

La invencion se refiere a un compuesto pentasacarido sintetico de formula (I)

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R1 representa un grupo alquilo (C1-C3);

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• R2 representa un grupo alcoxi (C1-C3) y R7 representa un atomo de hidrogeno, oR2yR7 forman un puente de -O-CH2- o -O-CH2-CH2-, donde -O- esta unido al atomo de carbono que porta el grupo R2 y -CH2- esta unido al atomo de carbono que porta el grupo R7;

• R3 representa un atomo de hidrogeno o un grupo etilo;

• R4 representa -OH, -NH2 o -NH-LC-biotina, en donde LC representa un conector, ventajosamente de la formula -(C=O)-(CH2)4-NH-, con n de 1 a 10, y mas ventajosamente de formula -(C=O)-(CH2)4-NH;

• cuando R5 y R6 son diferentes, R5 y R6 se eligen en medio de un atomo de hidrogeno, un grupo metilo, un grupo etilo, un propilo, un grupo butilo y un grupo pentilo;

• cuando R5 y R6 son identicos, R5 y R6 se eligen en medio de un atomo de hidrogeno, un grupo metilo, un grupo etilo, un propilo y un grupo pentilo;

con la condicion de que R1 difiere de al menos uno de R5 o R6; y la sal del mismo.

Ventajosamente, el compuesto pentasacarido sintetico de acuerdo con la presente invention tiene la siguiente formula (II)

imagen3

en donde:

• R1, R2, R3, R4, R5y R6 se definen como antes.

• R4puede representar -NH2 o -NH-LC-biotina, definiendose LC como antes.

En una realization, R5 y R6 representan el mismo grupo.

En otra realizacion, uno de R5 o R6 representa un atomo de hidrogeno, y el otro representa un grupo alquilo (C1-C5).

En una variante de todas las realizaciones descritas anteriormente, R2 y R7 forman un puente de -O-CH2-, donde -O- esta unido al atomo de carbono que porta el grupo R2, y - CH2- esta unido al atomo de carbono que porta el grupo R7, y R3 representa un grupo etilo.

En otra variante de todas las realizaciones descritas anteriormente, R2 representa un grupo alcoxi(C1-C3), y R3 y R7 representan atomos de hidrogeno.

La invencion tambien se refiere a una composition farmaceutica que comprende el compuesto pentasacarido sintetico y una sal del mismo descritos anteriormente y un diluyente o portador farmaceuticamente aceptables.

La invencion se refiere adicionalmente al compuesto pentasacarido sintetico y la sal del mismo para su uso como medicamento, por ejemplo destinado a la prevention y el tratamiento de trastornos de coagulation de la sangre.

Los trastornos de coagulacion de la sangre son, en particular, uno de trombosis venosa o trombosis arterial, incluyendo trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, smdrome coronario agudo, infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. Los trastornos de coagulacion de la sangre tambien pueden ser consecuencia de fibrilacion auricular.

La invencion tambien se refiere al compuesto pentasacarido sintetico y sus sales para uso como un medicamento para la prevencion de lesion por isquemia-reperfusion asociada con el trasplante de organos solidos.

La invencion se refiere ademas a un metodo de prevencion o de reducir el riesgo de coagulacion de la sangre en un circuito sangurneo extracorporeo durante la cirugia cardiaca, o durante la oxigenacion por membrana extracorporea, o durante la asistencia circulatoria tal como corazon artificial, que comprende la administration del compuesto pentasacarido sintetico descrito aqm mas arriba y la sal del mismo.

La invencion se refiere a un kit que comprende el compuesto pentasacarido sintetico descrito anteriormente y la sal del mismo o la composicion farmaceutica tambien descrita aqm mas arriba y avidina.

Definiciones

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Los compuestos de la presente invencion tambien pueden estar presentes en forma de sales farmaceuticamente aceptables. Para uso en medicina, las sales de los compuestos de esta invencion se refieren a "sales no toxicas farmaceuticamente aceptables". Las formas de sales farmaceuticamente aceptables aprobadas por la FDA incluyen sales acidas/anionicas o alcalinas/cationicas farmaceuticamente aceptables (Gould, P. L., Internacional J. Pharm., 1984, 33, 201-271; Berge, S. M. et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66 (1), 1-19).

Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos acidos o alcalinos de la invencion se pueden preparar por supuesto mediante procedimientos convencionales, por ejemplo haciendo reaccionar la base o acido libres con al menos una cantidad estequiometrica del acido o base formadores de sales deseados.

Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos acidos de la invencion incluyen sales con cationes inorganicos tales como sodio, potasio, calcio, magnesio, zinc, amonio, y sales con bases organicas. Las bases organicas adecuadas incluyen N-metil-D-glucamina, arginina, benzatina, diolamina, olamina, procama y trometamina.

Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos alcalinos de la invencion incluyen sales derivadas de acidos organicos o inorganicos. Los aniones adecuados incluyen acetato, adipato, besilato, bromuro, camsilato, cloruro, citrato, edisilato, estolato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hipurato, hiclato, hidrobromuro, hidrocloruro, yoduro, isetionato, lactato, lactiobionato, maleato, mesilato, metilbromuro, metilsulfato, napsilato, nitrato, oleato, pamoato, fosfato, poligalacturonato, estearato, succinato, sulfato, sulfosalicilato, tanato, tartrato, tereftalato, tosilato y trietyoduro. Las sales de sulfato son particularmente preferidas.

En los metodos de tratamiento de la presente invencion, la palabra "administrar" abarcara el tratamiento de los diversos trastornos descritos con los compuestos descritos espedficamente.

Se anticipa que los compuestos de la invencion se pueden administrar por via oral o parenteral, incluyendo intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutanea, transdermica, rectal y topica, e inhalacion.

Para la administracion oral, los compuestos de la invencion generalmente se proporcionaran en forma de comprimidos o capsulas o como una solucion o suspension acuosa.

Los comprimidos para uso oral pueden incluir el ingrediente activo mezclado con excipientes farmaceuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y calcio, sodio y fosfato de calcio y lactosa. El almidon de mafz y el acido algmico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidon y gelatina. El agente lubricante, si esta presente, sera generalmente estearato de magnesio, acido estearico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorcion en el tracto gastrointestinal.

Las capsulas para uso oral incluyen capsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente solido y capsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o aceite, tal como aceite de cacahuete, parafina lfquida o aceite de oliva.

Para uso parenteral, incluyendo intramuscular, intraperitoneal, subcutaneo e intravenoso, los compuestos de la invencion se proporcionaran generalmente en soluciones o suspensiones acuosas esteriles, tamponadas a un pH e isotonicidad apropiados. Los vedculos acuosos adecuados incluyen solucion de Ringer y cloruro de sodio isotonico. Las suspensiones acuosas de acuerdo con la invencion pueden incluir agentes de suspension tales como derivados de celulosa, alginato de sodio, polivinil-pirrolidona y goma de tragacanto, y un agente humectante tal como lecitina. Los conservantes adecuados para suspensiones acuosas incluyen p-hidroxibenzoato de etilo y n-propilo.

Modos de Administracion

Los compuestos de la presente invencion pueden ser suministrados directamente o en composiciones farmaceuticas que contienen excipientes (vease mas arriba), como es bien conocido en la tecnica. Los presentes metodos de tratamiento implican la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la presente invencion a un sujeto.

El termino "cantidad terapeuticamente eficaz" o "dosis terapeuticamente efectiva" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una cantidad de un compuesto de acuerdo con la presente invencion necesaria para: tratar; mejorar; evitar la afeccion de la enfermedad espedfica; exhibir un efecto terapeutico o preventivo detectable; prolongar la supervivencia de un paciente. La toxicidad y la eficacia terapeutica de tales moleculas pueden determinarse mediante procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales

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experimental, p. ej., mediante la determinacion de la DL50 (la dosis letal para 50% de la poblacion) y la DE50 (la dosis terapeuticamente eficaz en 50% de la poblacion). La razon de dosis de efectos toxicos a terapeuticos es el mdice terapeutico, que puede expresarse como la razon DL50/DE50. Se prefieren los agentes que muestran altos indices terapeuticos.

La cantidad terapeuticamente eficaz o la dosis terapeuticamente eficaz es la cantidad del compuesto o composicion farmaceutica que provocara la respuesta biologica o medica de un tejido, sistema, animal o ser humano que esta siendo buscada por el investigador, veterinario, medico, u otro profesional clmico. Por ejemplo, la actividad anticoagulante y el tratamiento de los trastornos de la coagulacion de la sangre, p. ej., la tromboembolia venosa profunda incluyendo la trombosis venosa profunda y la embolia pulmonar, la trombosis venosa profunda postquirurgica, el smdrome coronario, el infarto de miocardio, el accidente cerebrovascular, etc.

La formulacion exacta, la ruta de administracion, la dosis y el intervalo de dosificacion deben ser elegidos de acuerdo con metodos conocidos en latecnica, en vista de las caractensticas espedficas de la afeccion del paciente.

El nivel de dosificacion espedfico requerido para cualquier paciente concreto dependera de una serie de factores, incluyendo la gravedad de la afeccion que se vaya a tratar, la via de administracion, la salud general del paciente (es decir, la edad, el peso y la dieta), el genero del paciente, el tiempo y frecuencia de administracion, el criterio del medico prescriptor y la tolerancia/respuesta a la terapia. En general, sin embargo, la dosis diaria (tanto si se administra como una dosis unica o como dosis divididas) estara en el intervalo de 0,01 a 500 mg por dfa, mas usualmente de 0,1 a 50 mg por dfa, y lo mas usualmente de 1 a 10 mg por dfa. Alternativamente, las dosificaciones se pueden administrar por unidad de peso corporal y, en este caso, una dosis tfpica estara comprendida entre 0,001 mg/kg y 3 mg/kg, especialmente entre 0,01 mg/kg y 0,2 mg/kg, entre 0,02 mg/kg y 0,1 mg/kg.

Definiciones Qrnmicas

En aras de la simplicidad, los terminos que se utilizan normalmente para referirse a grupos monovalentes (tales como "alquilo") tambien se utilizan en la presente memoria para referirse a grupos de tipo puente divalentes, trivalentes o tetravalentes que se forman entre el grupo monovalente correspondiente por la perdida de uno o mas atomos de hidrogeno. Que tal termino se refiera a un grupo monovalente o a un grupo polivalente quedara claro a partir del contexto. Cuando un grupo de tipo puente polivalente se forma a partir de un radical dclico, los enlaces de union pueden estar en cualquier atomo anular adecuado, de acuerdo con las reglas normales de valencia.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "alquilo" se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente saturado lineal o ramificado, que tiene el numero de atomos de carbono indicado. Por ejemplo, el termino "alquilo C1-C5" incluye grupos alquilo C1, C2, C3, C4 y C5. A modo de ejemplo no limitante, los grupos alquilo adecuados incluyen metilo (-Me), etilo (-Et), propilo (-Pr), iso-propilo, butilo (-Bu), iso-butilo, terc-butilo, pentilo (-Pent).

Alcoxi se refiere al grupo "alquil-O-", en donde alquilo se define como antes. A modo de ejemplo no limitante, los grupos alcoxi adecuados incluyen metoxi, etoxi, propoxi e isopropoxi.

Se entendera que la invencion comprende los diferentes diastereoisomeros aislados unos de otros, asf como mezclas.

Los contra-iones, que compensan las formas cargadas de los compuestos de la presente invencion, son contraiones farmaceuticamente aceptables, tales como hidrogeno, o mas preferiblemente iones de metales alcalinos o alcalinoterreos, que incluyen sodio, calcio, magnesio y potasio.

Otras definiciones de grupos de 'compuestos' seran facilmente comprensibles por el experto en la tecnica basandose en las definiciones anteriores y las convenciones habituales de nomenclatura.

Se apreciara que cualquier caractenstica opcional que se ha descrito anteriormente en relacion con cualquier aspecto de la invencion tambien puede ser aplicable a cualquier otro aspecto de la invencion.

En la descripcion de los compuestos ejemplificados, "CI50" representa la actividad anti-factor Xa.

Aplicaciones

Los compuestos descritos aqrn anteriormente se pueden usar como medicamento. Mas en particular, se pueden utilizar como medicamento destinado al tratamiento de un trastorno de la coagulacion de la sangre.

Los trastornos de la coagulacion de la sangre son, en particular, uno de trombosis venosa o trombosis arterial, incluyendo trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, smdrome coronario agudo, infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. Los trastornos de coagulacion de la sangre tambien puede ser consecuencia de la

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fibrilacion auricular.

Los compuestos tambien se pueden utilizar durante el ECC (circuito extracorporeo de sangre). Por lo tanto es importante que el efecto anticoagulante pueda ser inhibido o suprimido.

El compuesto todav^a puede ser utilizado como un medicamento para prevenir la lesion por isquemia-reperfusion (suministro inadecuado de sangre debido a la obstruccion de los vasos sangumeos) asociada con el trasplante de organos solidos.

La invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Abreviaturas utilizadas

• DMF: N, N-dimetilformamida;

• DCM: diclorometano;

• EtOAc: acetato de etilo;

• THF: tetrahidrofurano;

• MTBE: metil-terc-butil-eter;

• TFA: acido trifluoroacetico;

• TfOH: acido triflico;

• C.A2O: antndrido acetico;

• Bn: bencilo;

• Ph: fenilo;

• Bz: benzoMo;

• Me: metilo, Et: etilo, Pr: propilo, Bu: n-butilo, Pent: pentilo, Hex: hexilo; y

• Ac: acetato.

Seccion 1: Smtesis de unidad monosacarida D

imagen4

El compuesto de 1,6 y 2,3-dianhidro-4-ORb-[beta]-D-manopiranosa 2 se sintetizo a partir Epoxido 1 Cerny de una manera similar a la descrita por Brill y Tirefort en Tetrahedron Lett. (1998), 39, pags. 787-790. El Compuesto 2 (17,5 mmoles) se disolvio en 130 mL de una mezcla de N,N-dimetilformamida/agua [4/1 (v/v)] y a continuacion se anadio azida de sodio (22,8 g, 350 mmoles). El medio de reaccion se calento a 100°C durante 6 horas. Despues de filtrar a traves de Celite, el producto filtrado se diluyo con acetato de etilo y despues se lavo con agua. La fase organica se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y despues se concentro a vacfo. El residuo se recristalizo a partir de una mezcla de acetato de etilo/ciclohexano (20 mL/7 mL) para proporcionar el compuesto 3 en forma de cristales.

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Preparacion del compuesto 4

A una mezcla enfriada (0°C) del compuesto 3 (11 mmoles) y Ra-X (33 mmoles) en N,N-dimetilformamida (80 mL) anhidra se le anadio hidruro de sodio en porciones (1,3 g, 33 mmoles) bajo una atmosfera de argon. La mezcla se agito durante 20 horas a temperatura ambiente. El exceso de hidruro sodico se destruyo con metanol. La mezcla de reaccion se concentro a vado y el residuo se recogio en EtOAc. La fase organica se lavo con agua, se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y despues se concentro a vado. La sustancia bruta se purifico mediante cromatografia en una columna de gel de sflice (n-heptano/EtOAc) para proporcionar el compuesto 4 en forma de un solido de color blanco.

Preparacion del compuesto 5: Metodo general para la acetolisis

En un matraz seco de fondo redondo, el compuesto 4 (11 mmoles) se disolvio en una mezcla de anddrido acetico (73 mL, 770 mmoles, 70 eq.) y acido trifluoroacetico (12,3 mL, 165 mmoles, 15 eq.) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito durante la noche a temperatura ambiente y los disolventes se separaron a presion reducida seguido de co- evaporacion con tolueno. El residuo se purifico por cromatografia ultrarrapida en columna de gel de sflice para proporcionar el compuesto deseado 5 o se utilizo directamente en la siguiente etapa sin ninguna purificacion adicional despues de lavar con una solucion acuosa saturada de NaHCO3.

Preparacion del compuesto 6: Introduccion del grupo p-clorotiofenol anomerico

Se anadio BF3.OEt2 (4,19 mL, 33 mmoles) a una suspension agitada del compuesto 5 (11 mmoles) y 4-p clorotiofenol (4,8 g, 33 mmoles) en tolueno (55 mL) a 0°C y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 7 horas. Se anadio una solucion saturada de NaHCO3 hasta pH = 7 y la mezcla de reaccion se enfrio a -20°C durante la noche. La capa organica se separo, se diluyo con EtoAc y se lavo con agua. La capa organica se seco sobre MgSO4, el disolvente se elimino a vado y el residuo se purifico mediante cromatografia en columna (n- heptano/acetato de etilo) para proporcionar el compuesto 6.

Datos de RMN para dos compuestos 6f (Ra= 0Et, Rb= OBn) y 6h (Ra= OEt, Rb= OEt) se describen a continuacion.

Compuesto 6f. RMN H1 (400 MHz, CDCl3, ppm) 5 7,77-7,41 (m, 10H arom.), 5,73 (d, 1H, J = 5,46 Hz, H-1a), 5,145,02 (m, 2H, CH2-Bn), 4,56 (d, 1H, J = 9,5 Hz, H-1 p), 4,48-4,45 (m, 2H, H-6a/b), 4,08-3,82 (m, 2H, R-CH2-CH3), 4,063,94 (m, 2H, H-2, H-3), 3,55-3,51 (m, 2H, H-4, H-5), 2,25 (s, 3H, CH3Ac), 1,42 (t, 3H, J = 7,1 Hz, R-CH2-CH3).

Compuesto 6h. RMN H1 (400 MHz, CDCl3, ppm) 5 7,45-7,40 (m, 2H arom.), 7,30-7,27 (m, 2H arom.), 5,48 (d, 1H, J = 5,2 Hz, H-1), 4,30-4,26 (m, 2H, H-6a/b), 3,81 (dd, 1 H, J = 5,2 Hz, J = 10,3 Hz, H-2), 3,72, 3,57 (2s, 6H, 2 x OMe), 3,50 (t, 1 H, J = 10,3 Hz, H-3), 2,08 (s, 3H, CH3-Ac).

Preparacion del compuesto 7: Saponificacion del grupo 6-OAc

Se anadio gota a gota hidroxido de sodio 1 N (120 mL) a una solucion del compuesto 6 (120,9 mmoles) en 450 mL de THF/metanol (2/1) a 0°C bajo agitacion. La mezcla de reaccion se agito durante 3 horas a temperatura ambiente y despues se concentro a vado. El residuo se disolvio en agua y se extrajo con EtOAc. La capa organica se seco sobre MgSO4 y el disolvente se evaporo para proporcionar el compuesto 7 que se uso directamente en la siguiente etapa sin ninguna purificacion adicional.

Preparacion del compuesto 8: Introduccion del grupo 6-(p-metoxibenzoilo)

Se anadio gota a gota Cloruro de p-anisoilo (0,635 g, 3,72 mmoles) a una solucion agitada del compuesto 7 (3,1 mmoles) en piridina (10 mL) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito durante 3 h a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se diluyo con DCM (20 mL), se lavo con HCl 1 N (10 mL), se seco sobre MgSO4 y se concentro a vado para proporcionar material bruto 8. La purificacion mediante cromatografia en columna (n-heptano/acetato de etilo) proporciono el compuesto 8 puro con un buen rendimiento en forma de un solido de color blanco.

imagen5

compuesto

8a 8b 8c 8d 8e 8f

Ob

OBn OMe OEt OPr OBn OBn

compuesto

8g 8h 8i 8j 8k 8l

Oa

OMe OEt OPr OBu OPent OPr

Ob

OMe OEt OPr OBu OPent OBn

Se han preparado doce compuestos (8a a 8l) y los datos de RMN de algunos ejemplos se describen a continuacion.

5 Compuesto 8a. RMN H1 (400 MHz, CDCl3, ppm) 6 7,83-7,77 (m, 2H arom.), 7,36-7,16 (, m, 12H arom.), 7,09-7,03 (m, 2H arom.), 6,86-6,80 (m, 2H arom.), 5,51 (d, 1H, J = 5,3 Hz, H-1a), 4,92-4,74 (m, 4H, 2 x CH2-Bn), 4,31 (d, 1H, J = 9,8 Hz, H-1p), 3,93-3,85 (m, 1H, H-2), 3,84-3,70 (m, 3H, H-3, H-4, H -5) 3,79 (s, 3H, OMe).

Compuesto 8f. RMN H1 (400 MHz, CDCI3, ppm) 6 8,13-8,08 (m, 2H arom.) 7,69-7,51 (m, 7H arom.), 7,38-7,33 (m, 10 2H arom.), 7,15-7,9 (m, 2H arom.), 5,79 (d, 1H, J = 5,46 Hz, 0,79 H-1a), 5,15-5,05 (m, 2H, CH2-Bn), 4,79-4,65 (m, 2H, H-6a/b), 4,58 (d, 1H, J = 9,5 Hz, 0,21 H-1P), 4,12-3,87 (m, 2H, R-CH2-CH3), 4,11-4,01 (m, 3H, H-2, H-3, H-4), 4,08 (s, 3H, OMe), 3,64-3,58 (m, 1H, H-5), 1,45 (t, 3H, J = 7,1 Hz, R-CH2-CH3).

Compuesto 8g. RMN H1 (400 MHz, CDCI3, ppm) 6 8,15-8,06 (m, 2H arom.) 7,70-7,50 (m, 7H arom.), 7,38-7,32 (m, 15 2H arom.), 7,15-7,9 (m, 2H arom.), 5,15-5,05 (m, 2H, CH2-Bn), 5,80 (d, 1 H, J = 5,46 Hz, H-1a), 4,56 (m, 1 H, H-1P), 4,13-3,99 (m, 2H, H-2, H-3), 3,74-3,70 (m, 3H, H-5, H-4), 4,78-4,57 (m, 2H, H-6a/b), 4,03-3,71 (m, 2H, R-CH2-CH2- CH3), 1,92-1,76 (m, 2H, R-CH2-CH2-CH3), 1,12 (t, 3H, J = 7,1 Hz, R-CH2-CH2-CH3).

Compuesto 8h. RMN H1 (400 MHz, CDCI3, ppm) 6 7,94-7,90 (m, 2H arom.), 7,41-7,38 (m, 2H arom.), 7,17-7,14 (m, 20 2H arom.), 6,96-6,91 (m, 2H arom.), 5,54 ( d, 1H, J = 5,2 Hz, H-1), 4,56 (m, 2H, H-6a/b), 4,44 (m, 2H, H-4, H-5), 3,84 (dd, 1 H, J = 5,2 Hz, J = 10,3 Hz, H-2), 3,79, 3,75, 3,61 (3s, 9H, 3 x OMe),3,50 (t, 1 H, J = 10,3 Hz, H-3).

Seccion 2: Smtesis de Pentasacaridos 13 y 15.

imagen6

AcOQMe

Na03S0 QMe

Na03S00Me

Na03S00Me

Esquema 2. a) TfOH, Bromodan, CH2Cl2/MTBE; b) 2N KOH, CH30H/THF; c) Py.S0: piridina; d) H2, Pd/C, t-Bu0H/H20; e) iPr2NEt, DMF.

Preparacion del compuesto 10: Etapa de glicosidacion

5 El tetrasacarido 9 (9,59 mmoles), que fue descrito previamente en el documento WO2008/041131, y el monosacarido 8 (19,2 mmoles, 2 equiv.) preparado anteriormente se disolvieron en una mezcla de

10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

diclorometano/metil-ferc-butil eter 1/3 (v/v) (267 mL). Despues de la adicion de polvo de tamiz molecular 4 A (1 equivalente en peso /tetrasacarido 9), La suspension se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se enfrio a -50°C, se anadieron Bromodan (28,77 mmoles, 3 equiv.) seguido de acido tnflico (13,43 mmoles, 1,4 equiv.) y la mezcla de reaccion se agito durante 2 horas a -50°C. Se anadio una cantidad adicional de monosacarido 8 (1 equiv.) y la mezcla de reaccion se agito durante 1 hora a -50°C y se almaceno a -20°C durante la noche. Despues, la mezcla de reaccion se neutralizo mediante la adicion de trietilamina a pH 7-8, se concentro a vado y el residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (tolueno/acetona: 90/10 a 80/20) para proporcionar el pentasacarido 10 con un rendimiento de 60 a 84%.

Preparacion del compuesto 11: Desacetilacion y saponificacion

Una solucion de hidroxido de potasio acuoso 2M (6,2 mL) se anadio a 0°C a una solucion del compuesto 10 (0,14 mmoles) en una mezcla 2/1 (v/v) de tetrahidrofurano/metanol (15 mL) y la mezcla se agito durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se neutralizo con resina acida Dowex 50x8-100 hasta pH 4. La resina se separo por filtracion y el producto filtrado se concentro a sequedad a vado para proporcionar el compuesto 11 con un rendimiento cuantitativo.

Preparacion del compuesto 12: Sulfatacion

El complejo de trioxido de azufre piridina (4,2 mmoles, 30 equiv.) se anadio a una solucion del compuesto 11 (0,14 mmoles) en piridina anhidra (3 mL). La mezcla se calento a 80°C durante 16 h excluyendo la luz. Despues de enfriar a 0°C, se anadio metanol (2 mL) y la solucion se agito durante 1 hora. A continuacion se anadio una solucion acuosa al 5% de NaHCO3 hasta pH 7-8 y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante la noche y se concentro hasta sequedad. El residuo se disolvio en agua y se desalo en una columna Sephadex G-25 se eluyo con agua para proporcionar el compuesto 12 con un rendimiento de 70 al 80%.

Preparacion del compuesto 13: Hidrogenolisis

Una solucion del compuesto 12 (0,16 mmoles) en una mezcla de ferc-butanol (8 mL)/agua (8 mL) se trato bajo presion atmosferica de hidrogeno en presencia de paladio al 10% sobre carbon vegetal (1 equivalente en peso) durante 16 h. Despues de la filtracion (filtro Millipore (R) LSWP 5 [mu]m), la solucion se concentro hasta sequedad para proporcionar el compuesto 13 con un rendimiento cuantitativo.

Compuesto 13a (O5= OH, OR6= OH): [a]o= +52.4 (c = 0,82, H2O); Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z

480.6 [M-3H]3-. RMN H1 (400 MHz, D2O, ppm) 6 5,64 (d, 1 H, J = 3,7 Hz, H-1 Glc1"), 5,43 (s, 1 H, H-1 GlcUA11), 5,215,19 (m, 2H, H-1 Glc1, H-1 GlcV), 5,07 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1 GlcUAIV), 3,75-3,57 (5s, 15H, 5 x OMe), 2,26/1,87 (m, 2H, R-CH2-CH3), 1,06 (t, 3H, J = 6,9 Hz, R-CH2-CH3).

Compuesto 13b (OR5= OH, OR6= OMe): Masa (metodo de ESI, modo negativo); 922,8055 [M +

3dBA-5H]2-, 857,7206 [M + 2DBA-4H]2-, 793,1449 [M + DBA-3H], 528,4258 [M + DBA-4H]3-, 485,3701 [M -3H]3'.

Compuesto 13c (OR5= OH, OR6= OEt): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 929,8 [M + 3DBA-5H]2-, 864,7 [M + 2DBA-4H]2-, 760,2 [M 2H]2', 490,0 [M 3H]3'. RMN H1 (400 MHz, D2O, ppm) 6 5,49 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H-1 Glc11'), 5,28 (d, 1 H, J = 1,4 Hz, H-1 ManUA11), 5,21 (d, 1 H, J = 3,4 Hz, H-1 GlcV), 5,07 (d, 1 H, J = 3,7 Hz, H-1 Glc1), 4,84 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H-1 GlcIV), 3,93-3,74 (m, 2H, R-CH2-CH3), 3,60, 3,53, 3,45, 3,44, 3,42 (5s, 15H, 5 xOMe), 2,07/1,71 (m, 2H, -CH2-CH3), 1,19 (t, 3H, J = 6,9 Hz, R-CH2-CH3), 0,90 (t, 3H, J = 7,2 Hz, -CH2-CH3).

Compuesto 13d (OR5= OH, OR6= OPr): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 872,1984 [M + 2DBA-4H]2-, 807,6226 [M + 1DBA-3H]2-, 767,6424 [M -2H]2'.

Compuesto 13e (OR5= OMe, OR6= OH): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 857,66 [M + 2DBA-4H]2-,

793,09 [M + 1 DBA-3H]2-, 486,10 [M -3H]3'.

Compuesto 13f (OR5= OEt, OR6= OH): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 929,3 [M + 3dBA-5H]2-, 864,7 [M + 2DBA-4H]2-, 800,1 [M + DBA-3H]2-, 760,2 [M - 2H]2', 490,0 [M -3H]3-.

Compuesto 13g (OR5= OPr, OR6= OH): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 871,6919 [M + 2DBA-4H]2-, 807,1179 [M + DBA-3H]2-, 767,1397 [M -2H]2'.

Compuesto 13h (OR5= OMe, OR6= OMe): [a]o= 71,6 (c = 1, H2O); Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z

864.6 [M + 2DBA-4H]2-, 800,0 [M + DBA-3H]2-, 533,0 [M + DBA-4H]3-, 590,0 [M-3H]3'.

Compuesto 13i (OR5= OEt, OR6= OEt): [a]o= 79,3 (c = 1, H2O); Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 943,3 [M + 3dBA-5H]2-, 878,7 [M + 2DBA-4H], 814,2 [M + DBA + 3H]2'.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Compuesto 13j (OR5= OPr, OR6= OPr): [a]D= 64,5 (c = 1, H2O); Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 508,7 [M-3H]3-.

Compuesto 13k (OR5= OBu, OR6= OBu): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 906,6991 [M + 2DBA-4H]2", 561,0756 [M + DBA-4H]3", 518,0267 [M-3H]3

Compuesto 13l (OR5= OPent, OR6= OPent): [a]D= 66,9 (c = 1, H2O); Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 985,3 [M + 3dBA-5H]2-, 920,8 [M + 2DBA-4H]2", 570,4 [M + DBA-4H]3", 527,4 [M-3H]3-

Preparacion del compuesto 15: biotinilacion LC

A una solucion del compuesto 13 (0,086 mmoles) en DMF anhidra (8 mL), se le anadieron 6-(biotinamido)hexanoato de succinimidilo 14 (58,6 mg, 0,129 mmoles) y diisopropiletilamina (22,5 pl, 0,129 mmoles) y la mezcla se agito durante 20 h a temperatura ambiente. A continuacion, se anadio una solucion acuosa al 5% de NaHCO3 (3,6 mL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante la noche y se concentro a sequedad. El residuo se disolvio en agua y se desalo en una columna Sephadex G-25 eluida con agua para proporcionar el compuesto 15 con un rendimiento de 68 al 87%.

Compuesto 15a (OR5= OH, OR6= OH): [ci]d= 64,8 (c = 1, H2O); Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1149,9 [M + 4DBA-6H]2-, 1,084,8 [M + 3dBA-5H], 1,020,3 [M + 2DBA-4H12', 679,8 [M + 2DBA-5H]3", 636,8 [M + DBA-4H]3". RMN H1 (400 MHz, D2O, ppm) 6 5,66 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H-1 Glc"1), 5,42 (s, 1H, H-1 ManUA"), 5,32 (d, 1H, J = 3,6 Hz, H-1 GlcV), 5,22 (d, 1H, J = 3,8 Hz, H-1 GlcI), 5,17 (d, 1H, J = 7,4 Hz, H-1 GlcIV), 4,54 (m, 1H, H-6 biotina), 4,42 (m, 1H, H-2 biotina), 3,75-3,54 (5s, 15H, 5 x OMe), 3,33 (m, 1H, H-1 biotina), 2,99 (dd, 1H, J = 5,0 Hz, J = 13,2 Hz, H-7a biotina), 2,76 (d, 1H, J = 13,2 Hz, H-7b biotina), 2,28/1,93 (m, 2H, R-CH2-CH3), 1,19 (t, 3H, J = 6,9 Hz, R-CH2- CH3).

Compuesto 15b (OR5= OH, OR6= OMe): [a]D= 59,2 (c = 1, H2O); Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1156.9768 [M + 4DBA-6H]2-, 1092.9164 [M + 3dBA-5H]2-, 1027.3103 [M + 2DBA-4H]2-.

Compuesto 15c (OR5= OH, OR6= OEt): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1163,9 [M + 4DBA-6H]2-,

1.098.9 [M + 3dBA-5H]2-, 1,034,3 [M + 2DBA-4H]2-, 969,7 [M + DBA-3H]2-, 689,2 [M + 2DBA-5H]3-, 646,1 [M + DBA- 4H]3-. RMN H1 (400 MHz, D2O, ppm) 6 5,49 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1 Glcm), 5,26 (s, 1H, H-1 ManUA"), 5,16 (d, 1H, J = 3,6 Hz, H-1 GlcV), 5,06 (d, 1 H, J = 3,8 Hz, H-1 GlcI), 5,01 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H-1 GlcIV), 4,54 (m, 1 H, H-6 biotina), 4,42 (m, 1 H, H-2 biotina), 3,98-3,73 (m, 2H, R-CH2-CH3), 3,59, 3,47, 3,44, 3,43, 3,38 (5s, 15H, 5 x OMe), 3,33 (m, 1H, H-1 biotina), 2,99 (dd, 1 H, J = 5,0 Hz, J = 13,2 Hz, H-7a biotina), 2,76 (d, 1 H, J = 13,2 Hz, H-7b biotina), 1,19 (t, 3H, J = 6,9 Hz, R-CH2-CH3).

Compuesto 15e (OR5= OMe, OR6= OH): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1156,9 [M + 4DBA-6H]2-,

1.091.9 [M + 3dBA-5H]2-, 1,027,3 [M + 2DBA-4H]2-, 962,7 [M + DBA-3H]2-. RMN1 H (400 MHz, D2O, ppm) 6 7,9 (d, 1H, J = 9,1 Hz, NH GlcV), 5,50 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H-1 GlcIfI), 5,27 (s, 1H, H-1 ManUA"), 5,12 (d, 1H, J = 3,6 Hz, H-1 GlcV), 5,06 (d, 1 H, J = 3,8 Hz, H-1 GlcI), 5,01 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H-1 GlcIV), 4,59 (m, 1H, H-6 biotina), 4,41 (m, 1H, H-2 biotina), 3,59, 3,55, 3,47, 3,44, 3,43, 3,37 (6s, 18H, 6 x OMe), 3,33 (m, 1H, H-1 biotina), 2,99 (dd, 1H, J = 5,0 Hz, J = 13,2 Hz, H-7a biotina), 2,76 (d, 1H, J = 13,2 Hz, H-7b biotina).

Compuesto 15f (OR5= OEt, OR6= OH): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1163,9 [M +

4DBA-6H]2-, 1,098,9 [M + 3dBA-5H]2-, 1,034,3 [M + 2DBA-4H]2-, 969,7 [M + DBA-3H]2-, 745,2 [M + 3dBA-6H]3-, 646,1 [M + DBA-4H]3-.

Compuesto 15h (OR5= OMe, OR6= OMe): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1164.5 [M + 4DBA-6H]2-.

Compuesto 15i (OR5= OEt, OR6= OEt): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1178,5 [M +

4DBA-6H]2-, 1.048,8 [M + 2DBA-4H]2-, 984,2 [M + DBA-3H]2-, 698,9 [M + 2DBA-5H]3-, 655,8 [M + DBA-4H]3-.

Compuesto 15j (OR5= OPr, OR6= OPr): [a]D= 47,4 (c = 1,6, H2O); Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 707,8 [M + 2DBA-5H], 664,8 [M + DBA-4H]3-, 621,7 [M 3H]3', 466,0 [M 4H]4

Compuesto 15k (OR5= OBu, OR6= OBu): [a]D= 56,1 (c = 0,95, H2O) Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1206,4319 [M + 4DBA-6H]2-, 1141,9298 [M + 3dBA-5H]2-, 717,5716 [M + 2DBA-5H]3-, 674,5105 [M + DBA-4H]3-, 631,4722 [M - 3H]3

Compuesto 15l (OR5= OPent, OR6= OPent): [a]D= 64,0 (c = 1, H2O); Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1220,0267 [M + 4DBA-6H]2-, 1155,4486 [M + 3dBA-5H]2-, 1090,3690 [M + 2DBA-4H]2-, 726,5686 [M + 2DBA-5H]3-, 683,5173 [M + DBA-4H]3-, 640,4665 [M 3H]3

5

10

15

20

25

30

Seccion 3: Smtesis de pentasacaridos 17 y 18

Los compuestos 17 y 18 se prepararon de una manera similar a la descrita para los compuestos 13 y 15 (Esquema 2) a partir del tetrasacarido 16 descrito anteriormente en el documento WO2006/067173 y los monosacaridos 8 como se representa en el Esquema 3 a continuation.

imagen7

Esquema 3. Ruta sintetica de los compuestos 17 y 18 partiendo de los intermedios 8 y 16

La preparation de compuestos 17 se llevo a cabo de una manera similar a la descrita para los compuestos 13.

Compuesto 17a (OR5= OH, OR6= OH): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 837,6353 [M + 2DBA-4H]2-, 773,0602 [M + DBA-3H]2-, 708,4929 [M-2H]2-. RMN H1 (400 MHz, D2O, ppm) 5 5,56 (d, 1 H, J = 3,4 Hz, H-1 GlcV), 5,51 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1 Glc'"), 5,20 (d, 1H, J = 3,6 Hz, H-1 Glc1), 4,99 (s, 1H, H-1 GlcUA11), 4,81 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, H-1 GlcUA'V), 3,76-3,57 (6s, 18H, 6x OMe).

Compuesto 17b (OR5= OH, OR6= OMe): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 909,2 [M +

3dBA-5H]2-, 844,7 [M + 2DBA-4H]2-, 780,1 [M + DBA-3H]2-, 715,5 [M-2H]2-. RMN H1 (400 MHz, D2O, ppm) 5 5,35 (d, 1 H, J = 3,6 Hz, H-1 Glc'''), 5,31 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H-1 GlcV), 5,04 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H-1 Glc'), 4,98 (s, 1H, H-1 GlcUA''), 4,64 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1 GlcUA'V), 3,61 (s, 3H, OMe), 3,55 (2s, 6H, OMe), 3,50 (2s, 6H, OMe), 3,48 (s, 3H, OMe), 3,42 (s, 3H, OMe).

Compuesto 17c (OR5= OH, OR6= OEt): Masa (metodo de ES!, modo negativo); m/z 851,6870 [M + 2DBA-4H]2-, 787,1106 [M + DBA-3H]2-, 722,5338 [M-2H]2-, 481,3487 [M-3H]3-. RMN H1 (400 MHz, D2O, ppm) 5 5,50 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H-1 Glc'''), 5,42 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1 GlcV), 5,19 (d, 1 H, J = 3,8 Hz, H-1 Glc'), 5,13 (s, 1H, H-1 !dour"), 4,79 (d, 1H, J = 7,7 Hz, H-1 GlcUA'V), 3,98-3,91 (m, 2H, R-CH2-CH3), 3,75-3,57 (6s, 18H, 6 x OMe), 1,32 (t, 3H, J = 6,9 Hz, R-CH2-CH).

Compuesto 17e (OR5= OMe, OR6= OH): Masa (metodo de ES', modo negativo); m/z 844,6550 [M + 2DBA-4H]2-, 780,0801 [M + DBA-3H]2-, 715,5092 [M-2H]2-, 476,6641 [M-3H]3-.

5

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25

30

35

40

45

50

55

60

Compuesto 17f (OR5= OEt, OR6= OH): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 851,7 [M + 2DBA-4H]2", 787,1 [M + DBA-3H]2", 722,5 [M-2H]2', 481,3 [M-3H]3'.

Compuesto 17h (OR5= OMe, OR6= OMe): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 916,2817 [M + 3dBA-5H]2-, 851,7057 [M + 2DBA + 2Na-4H]2', 787,1298 [M + DBA-3H]2", 722,5541 [M-2H]2', 481,3654 [M-3H]3'. RMN H1 (400 MHz, D2O, ppm), 6 5,48 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1 GlcV), 5,36 (d, 1 H, J = 3,4 Hz, H-1 Glc1"), 5,04 (m, 2H, H-1 GlcUA11, H-1 Glc1), 4,67 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1 GlcUAIV), 3,64-3,42 (8s, 24H, 8x OMe).

La preparacion de los compuestos 18 se llevo a cabo de una manera similar a la descrita para los compuestos 15.

Compuesto 18a (OR5= OH, OR6= OH): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 718,215 [M + 3dBA-6H]3-, 671,528 [M + 2DBA-5H]3-, 628,142 [M + DBA-4H]3-, 585,090 [M-3H]3-. RMN H1 (400 MHz, D2O, ppm) 6 5,35 (d, 1H, J = 3,6 Hz, H-1 Glc1"), 5,29 (d, 1H, J = 3,9 Hz, H-1 GlcV), 5,04 (d, 1 H, = 3,7 Hz, H-1 Glc1), 4,99 (s, 1H, H-1 GlcUA11), 4,67 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1 GlcUAIV), 3,60-3,42 (6s, 18H, 6x OMe), 4,61 (m, 1H, H-6 biotina), 4,42 (m, 1H, H-2 biotina), 3,33 (m, 1H, H-1 biotina), 3,01 (dd, 1H, J = 4,9 Hz, J = 13,1 Hz, H-7a biotina), 2,77 (d, 1H, J = 13,1 Hz, H-7b biotina).

Compuesto 18c (OR5= OH, OR6= OEt): Masa (metodo de ESI, modo negativo), m/z 1150,8828 [M + 4DBA-6H]2-, 1086,3187 [M + 3dBA-5H]2-, 1021,2565 [M + 2DBA-4H]2-, 956,6723 [M + DBA-3H], 892,1098 [M-2H]2', 594,3942 [M- 3H]3-.

Compuesto 18e (OR5= OMe, OR6= OH): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1143,8594 [M + 4DBA-6H]2-, 1078,7886 [M + 3dBA-5H]2-, 1014,2141 [M + 2DBA-4H]2-, 949,6444 [M + DBA-3H]2-, 632,7502 [M + DBA-4H]3-, 589,7020 [M-3H]3-.

Compuesto 18f (OR5= OEt, OR6= OH): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 1151,4 [M +

4DBA-6H]2-, 1.085,8 [M + 3dBA-5H]2-, 1.021,2 [M + 2DBA-4H]2-, 957,2 [M + DBA-3H]2-, 637,4 [M + DBA-4H]3-, 594,4 [M-3H]3-.

Compuesto 18h (OR5= OMe, OR6= OMe): Masa (metodo de ESI, modo negativo); m/z 637,4261 [M + DBA-4H]3-, 594,3792 [M-3H]3', 445,0662 [M-4H]4 RMN H1 (400 MHz, D2O, ppm), 6 5,36 (d, 1H, J = 3,4 Hz, H-1 Glcm), 5,24 (d, 1H, J = 3,9 Hz, H-1 GlcV), 5,04 (m, 2H, H-1 Glc', H-1 GlcUA"), 4,66 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1 GlcUAIV), 3,59-3,43 (8s, 24H, 8 x OMe), 4,59 (m, 1 H, H-6 biotina), 4,42 (m, 1 H, H-2 biotina), 3,33 (m, 1H, H-1 biotina), 2,99 (dd, 1H, J = 4,9 Hz , J = 13,1 Hz, H-7a biotina), 2,76 (d, 1 H, J = 13,1 Hz, H-7b biotina).

Ensayo biologico

Se entendera que una variedad de analisis son adecuados para someter a ensayo la actividad biologica de los compuestos de la presente invencion. Sin embargo, los metodos adecuados para someter a ensayo la actividad biologica de los compuestos de la presente invencion se enumeran a continuacion.

Determinacion de la actividad anti-factor Xa de los compuestos (CI50)

Los compuestos de la presente invencion inhiben el factor Xa de coagulacion de la sangre a traves de la activacion de la antitrombina (AT). Los compuestos se compararon en cuanto a su capacidad de inhibir el factor Xa en presencia de AT bajo condiciones convencionales. Para cada compuesto se trazo una curva que representa el % de inhibicion frente a la concentracion. Se determino la concentracion que inhibe el 50% de la actividad del factor Xa (CI50). Para este fin se utilizo un sistema disponible en el mercado: kit Stachrom HP (Diagnostica Stago). Este analisis se llevo a cabo en un STA Compact (Diagnostica Stago).

Cuantificacion de los compuestos en plasma

La concentracion plasmatica de los compuestos (|jg de compuesto/mL de plasma) en rata se determino utilizando un analisis biologico basado en su actividad anti-factor Xa (kit Stachrom HP, Diagnostica Stago como se describio anteriormente). Este analisis se llevo a cabo en un STA Compact (Diagnostica Stago). Se realizo una curva de calibracion espedfica con cada compuesto para ser cuantificado en plasma de rata.

Estudio farmacocinetico despues de la administracion intravenosa (vida media de eliminacion, T1/2)

Las farmacocineticas de los compuestos de la presente invencion se investigaron en ratas hembra Wistar Han despues de la administracion intravenosa.

Se tomaron muestras de sangre en varios momentos y la sangre (9 volumenes) se mezclo con citrato sodico (1

5

10

15

20

25

30

volumen) y se enfrio inmediatamente en hielo. La muestra se sometio a una centrifugation a 3000 xg durante 10 minutos a baja temperatura (el plasma es tipicamente estable durante 24 h a temperatura inferior a 8°C) y se almaceno congelada a -20°C. La concentration del compuesto (por mL de plasma) se determino mediante su actividad anti-factor Xa utilizando la actividad del factor Xa como se ha descrito anteriormente.

Para cada compuesto, la vida media de elimination se calculo a partir de la concentracion frente a la curva de tiempo obtenida de este modo.

Resultados

Familia 1 (R2 y R7 forman un puente, R4 = -NH2 y R5 = R6)

imagen8

compuesto

O5/Ob IC50 (nM) T1/2 (h) (Rata)

13h

-OMe 99 1,2 ±0,1

13i

-OEt 45 1,5 ± 0,1

13j

-OPr 47 1,8 ± 0,1

13k

-OBu 34 2,2 ±0,1

13l

-OPent 34 3,2 ±0,1

Comparacion 1

El compuesto PA01 se sintetizo de una manera similar a la descrita por Petitou en el documento WO 99/36428.

imagen9

El compuesto PA01 tiene una vida media T1/2 en rata de 3,5 ± 0,3 h y una actividad CI50 de 34 nM.

El compuesto PA01 y el compuesto 13h difieren en el grupo R4: el compuesto (PA01) que tiene un grupo

-OMe y el compuesto 13h que tiene un grupo -NH2. Cuando se comparan, se observa que la vida media del

compuesto 13h se reduce en aproximadamente 66% con respecto a la vida media del compuesto PA01.

Tambien se puede realizar una comparacion con los compuestos 13ia 13l. Cabe observar que estos compuestos tienen una vida media mas corta que la del compuesto PA01 mientras se preserva su actividad inhibidora del factor Xa.

Comparacion 2

El compuesto PA02 se sintetizo de una manera similar a la descrita en el documento EP 2 074 131.

5

10

15

20

25

imagen10

El compuesto PA02 tiene una vida media Ti/2 en rata de 4,8 ± 0,5 y una actividad CI5o de 108 nM.

Los compuestos 13h a 13l difieren del compuesto PA02 por tener un grupo alquiloxi en el R5 y R6 con un menor numero de atomos de carbono. Las vidas medias en rata de los compuestos 13h a 13k son mas cortas que las de los compuestos PA02, que van desde 1,2 h (-OMe) a 3,2 h (-OPent).

Ademas, la actividad anti-factor Xa de los compuestos 13h a 13l se incrementa en comparacion con la del compuesto PA02, es decir la CI50 de los compuestos 13h a 13k disminuye. Los valores de CI50 de los compuestos 13h a 13l van de 99 nM (-OMe) a 34 nM (-OBu y -OPent).

Cabe senalar que esta seleccion restringida ha producido compuestos con vidas medias cortas en comparacion con los compuestos de la tecnica anterior.

Familia 2 (R2 y R7 formar un puente, R4 = -NH2 y R5 * R6)

imagen11

compuesto

OR5/OR6 CI50 (nM) T1/2 (h) (Rata)

13c

-OH/OEt 84 1,4 ± 0,1

13d

-OH/OPr 94 0,9 ± 0,1

Debe observarse de nuevo que esta seleccion restringida ha producido compuestos con vidas medias cortas en comparacion con los compuestos de la tecnica anterior.

Familia 3 (R2 y R7 forman un puente, R4 = -NH-LC-biotina y R5 = R6)

imagen12

compuesto

OR5/OR6 CI50 (nM) T1/2 (h) (Rata)

15a

-OH 56 1,7 ±0,2

15h

-OMe 32 1,6 ±0,2

15i

-OEt 21 2,8 ±0,1

15k

-OBu 32 3,0 ±0,2

LC representa la siguiente formula:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

imagen13

0

(LC).

La biotina (o nombre IUPAC acido 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-cf]imidazol-4-il]pentanoico, tambien conocido como vitamina B7) representa el siguiente grupo:

imagen14

Comparacion 3

El compuesto PA01 y el compuesto 15h difieren en el grupo R4 teniendo el compuesto PA01 un grupo -OMe y teniendo el compuesto 15h un grupo -NH-LC-biotina. Cuando se comparan, se observa que la vida media del compuesto 15h se reduce en aproximadamente 54% con respecto a la vida media del compuesto PA01.

Tambien se puede hacer una comparacion con los compuestos 15a y 15i. Se debe observar que estos compuestos tienen una vida media mas corta que la del compuesto PA01.

Adicionalmente, los compuestos 15h, 15i y 15k, despliegan una actividad CI5o inferior y por lo tanto son mejores inhibidores del factor Xa que el compuesto PA01.

Comparacion 4

El compuesto PA02 y el compuesto 15a difieren en los grupos R5 y R6, teniendo el compuesto PA02 un grupo -OHex (hexoxi) mientras que el compuesto 15a tiene un grupo -OH y en el grupo R4 teniendo el compuesto PA02 un grupo - NH2 mientras que el compuesto 15a tiene un grupo -NH-LC-biotina. Cuando se comparan ambos, se observa que la vida media del compuesto 15a se reduce en aproximadamente 73% con respecto al Compuesto PA02.

Los compuestos 15h a 15k difieren del compuesto PA02 por tener un grupo alquiloxi en R5 y R6 con un menor numero de atomos de carbono. Las vidas medias de los compuestos 15h a 15k son mas cortas que la de los compuestos PA02.

Ademas, la actividad de los compuestos 15h a 15k se incrementa en comparacion con la del compuesto PA02. El valor de CI50 del compuesto 15a es 56 nM, mientras que las de los compuestos 15h a 15i permanecer por debajo de 33 nM.

Comparacion 5

Los compuestos de la familia 1 y de la familia 3 difieren en el grupo R4, los compuestos de la Familia 1 que tienen un grupo -NH2 mientras que los de la Familia 3 tiene un grupo -NH-LC-biotina. Los compuestos de la Familia de 3 tienen una actividad anti-factor Xa mayor (CI50 menor) que los compuestos de la Familia 1 sin dejar de tener valores de vida media aceptables.

Por lo tanto, el injerto de un grupo biotina en los compuestos de la Familia 1 aumenta sorprendentemente la actividad anti-factor Xa.

Familia 4 (R2 y R7 forman un puente, R4 = -NH-LC-biotina y R5 + R6)

imagen15

5

10

15

20

25

compuesto

OR5/OR6 CI50 (nM) T1/2 (h) (Rata)

15b

-OH/OMe 42 1,3 ± 0,1

15e

-OMe/OH 65 1,3 ± 0,1

15c

OH/OEt 30 2,2 ±0,2

15f

-OEt/OH 50 1,3 ±0,0

Comparacion 6

Los compuestos de la Familia de 2 y de la Familia 4 difieren en el grupo R4 teniendo los compuestos de la Familia 2 un grupo -NH2 mientras que los de la Familia 4 tienen un grupo -NH-LC-biotina. Los compuestos de la Familia 4 tienen una actividad anti-factor Xa mayor (CI5o menor) que los compuestos de la Familia 2 sin dejar de tener valores de vida media aceptables.

Por lo tanto, el injerto de un grupo biotina en los compuestos de la Familia 2 aumenta sorprendentemente la actividad anti-factor Xa.

Familia 5 (R2 = alcoxi, R7 = H, R4 = -NH2)

0

MeO

compuesto

OR5/OR6 CI50 (nM) T1/2 (h) (Rata)

17h

-OMe/OMe 59 1,2 ±0,1

17c

-OH/OEt 103 1,3 ± 0,1

Familia 6(R2 = alcoxi, R7 = H, R4 = -NH-LC-biotina)

imagen16

imagen17

imagen18

compuesto

OR5/OR6 CI50 (nM) | T1/2 (h) (Rata)

18a

-OH/OH 53 1,9 ± 0,1

18b

-OH/OMe 34 2,4 ± 0,1

18e

-OMe/OH 55 1,5 ± 0,1

18f

-OEt/OH 39 2,3 ±0,2

18c

-OH/OEt 31 1,9 ± 0,2

Comparacion 7

Al comparar los correspondientes compuestos de la Familia de 5 y de la Familia 6, que se diferencian en el grupo R4, la Familia 5 tiene un grupo -NH2 mientras que los de la Familia 6 tienen un grupo -NH-LC-biotina, la actividad anti-factor Xa de los compuestos de la Familia de 6 tienen una actividad anti-factor Xa superior a la de los compuestos de la Familia de 5 mientras siguen teniendo valores de vida media aceptables.

Por lo tanto, el injerto de un grupo biotina en los compuestos de la Familia de 5 aumenta sorprendentemente la actividad anti-factor Xa.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto pentasacarido sintetico de formula (I):

   imagen1

   en donde:

   - R1 representa un grupo alquilo C1-C3;

   - R2 representa un grupo alcoxi C1-C3 y R7 representa un atomo de hidrogeno, oR2yR7 forman un puente de -O-CH2- o de -O-CH2-CH2-, donde -O- esta unido al atomo de carbono que porta el grupo R2 y -CH2- esta unido al atomo de carbono que porta el grupo R7;

   - R3 representa un atomo de hidrogeno o un grupo etilo;

   - R4 representa -OH, -NH2O-NH-LC-biotina, en donde LC representa un conector, ventajosamente de formula -(C=O)-(CH2)n-NH-, con n de 1 a 10, y mas ventajosamente de formula -(C=O)-(CH2)4-NH;

   - cuando R5 y R6 son diferentes, R5 y R6 se eligen en medio de un atomo de hidrogeno, un grupo metilo, un grupo etilo, un propilo, un grupo butilo y un grupo pentilo;

   - cuando R5 y R6 son identicos, R5 y R6 se eligen en medio de un atomo de hidrogeno, un grupo metilo, un grupo etilo, un propilo y un grupo pentilo;

   en la condicion de que R1 difiere de al menos uno de R5 o R6; y la sal del mismo.
2. 2. El compuesto pentasacarido sintetico de la reivindicacion 1, en donde este tiene la siguiente formula (II):

   imagen2

   en donde:

   - R1, R2, R3, R4, R5 y R6se definen como en la reivindicacion 1 o la sal del mismo.
3. 3. El compuesto pentasacarido sintetico y la sal de la reivindicacion 1 o 2, en donde R4 representa -NH2 o -NH-LC- biotina, en donde LC se define como en la reivindicacion 1, R4 representa ventajosamente -NH-LC-biotina, en donde LC se define como en la reivindicacion 1.
4. 4. El compuesto pentasacarido sintetico y la sal de la reivindicacion 3, en donde R4 representa -NH2.
5. 5. El compuesto pentasacarido sintetico y la sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde que R5 y R6 representan el mismo grupo.
6. 6. El compuesto pentasacarido sintetico y la sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde uno de R5 o R6 representa un atomo de hidrogeno, y el otro representa un grupo alquilo C1-C5.
7. 7. El compuesto pentasacarido sintetico y la sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde R y R forman un puente de -O-CH2-, donde -O- esta unido al atomo de carbono que porta el grupo R2 y -CH2- esta unido al atomo de carbono que porta el grupo R7, y R3 representa un grupo etilo.
8. 8. El compuesto pentasacarido sintetico y la sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde R2 representa un grupo alcoxi C1-C3, y R3 y R7 representan un atomos de hidrogeno.
9. 9. El compuesto pentasacarido sintetico y la sal de la reivindicacion 1 o 2 elegidos entre la lista que consiste en:

   19

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   
   - los Compuestos 13a, 13b, 13c, 13d, 13e, 13f, 13g, 13h, 13i, 13j, 131;

   
   - los Compuestos 15a, 15b, 15c, 15d, 15e, 15f, 15g, 15h, 15i, 15j, 151;

   
   - los Compuestos 17a, 17b, 17c, 17d, 17e, 17f, 17g, 17h; y

   
   - los Compuestos 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 18f, 18g, 18h.
10. 10. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto pentasacarido sintetico y la sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.
11. 11. El compuesto pentasacarido sintetico y la sal de cualquiera las reivindicaciones 1 a 10 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 10 para su uso como medicamento.
12. 12. El compuesto pentasacarido sintetico y sal de cualquiera las reivindicaciones 1 a 9 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 10 para el uso de la reivindicacion 11, en donde el medicamento se destina para el tratamiento de un trastorno de la coagulacion de la sangre.
13. 13. El compuesto pentasacarido sintetico y sal de cualquiera las reivindicaciones 1 a 9 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 10 para el uso de la reivindicacion 11, en donde el medicamento esta destinado a la prevencion de lesiones por isquemia-reperfusion asociadas con el trasplante de organos solidos.
14. 14. Un metodo de prevencion o de reduccion del riesgo de coagulacion de la sangre en un circuito sangumeo extracorporeo durante la cirugfa cardfaca, o durante la oxigenacion por membrana extracorporea, o durante la asistencia circulatoria tal como el corazon artificial, que comprende la administracion del compuesto pentasacarido sintetico y la sal de la reivindicacion 3, en donde R4 representa -NH-LC-biotina, en donde LC se define como en la reivindicacion 1 o el compuesto pentasacarido sintetico y sal de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 10.
15. 15. Un kit que comprende el compuesto pentasacarido sintetico y la sal de la reivindicacion 3, en donde R4 representa -NH-LC-biotina, en donde LC se define como en la reivindicacion 1 o el compuesto pentasacarido sintetico y sal de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 11 y avidina.