ES2198081T3 - Derivados de hidrato de glucido. - Google Patents
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Abstract
Un derivado carbohidratado que tiene la fórmula I donde R1 es alcoxi C1-C4; R2, R3 y R4 son independientemente alcoxi C1-C4 o OSO3-; el número total de grupos sulfato es de 4, 5 o 6; y las líneas retorcidas representan enlaces o bien por encima o bien por debajo del plano del anillo de seis miembros al cual están anclados; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Description
Derivados de hidrato de glúcido.
La invención se refiere a un derivado
carbohidratado, a una composición farmacéutica que lo contiene, así
como al uso de dicho derivado carbohidratado para la fabricación de
un medicamento.
La heparina es un anticoagulante comúnmente
utilizado de fuentes biológicas tales como la mucosa intestinal. En
presencia de heparina, la desactivación de la trombina por la
anti-trombina III (AT-III) es
enormemente acelerada, implicando cambios tanto en la conformación
de la heparina como de la AT-III sobre la formación
de complejos. La trombina regula la última etapa de la cascada de
coagulación de la sangre. La principal función de la trombina es la
escisión del fibrinógeno para generar monómeros de fibrina que
forman un gel insoluble, un coágulo de fibrina, mediante
entrecruzamiento.
Los rasgos estructurales de la heparina que se
requieren para la interacción con la AT-III han
sido sometidos a diversas investigaciones. Existen partes en el
polímero de heparina que sólo muestran una baja afinidad por la
AT-III, mientras se ha encontrado que otras partes
son más importantes para la unión a la AT-III.
Estudios de la heparina fragmentada han dado como resultado
finalmente la identificación de un fragmento pentasacárido que
representa la estructura de alta afinidad mínima que se une a la
AT-III (ver v.g. Physiological Reviews, 71 (2),
488/9, 1.991). En este fragmento de elevada afinidad se
encuentran presentes ocho grupos sulfato. Se encontró que cuatro de
los grupos sulfato eran esenciales para la unión a la
AT-III (Advances in Carbohydrate Chemistry and
Biochemistry, Vol. 43; Eds. R.S. Tipson, D. Horton; Publ. Harcourt
Brace Jovanovich; B. Casu (páginas 51-127), párrafo
6), mientras los otros se atribuyen adicionalmente a una mayor
afinidad. Este descubrimiento fue confirmado en análogos sintéticos
del fragmento pentasacárido (ver v.g. Angew Chem.
32(12), 1671-1818, 1.993).
La identificación del fragmento pentasacárido de
elevada afinidad inspiraba la preparación de análogos sintéticos del
mismo. Se encontró que pequeñas moléculas de carbohidrato
sintéticas de tipo glicosaminoglicano eran inhibidores potentes y
selectivos anti-Xa. Ver por ejemplo la Patente
Europea 84.999. Patentes/solicitudes de patente presentadas más
tarde demostraron que muchas variantes de estas moléculas tenían
actividades similares e incluso superiores y propiedades
farmacológicas adicionalmente mejoradas tales como los derivados
carbohidratados relacionados con glicosaminoglicanos descritos en EP
529.715, EP 300.099, y EP 454.220. Estos derivados carbohidratados
están desprovistos de los grupos funcionales característicos de los
glicosaminoglicanos: grupos hidroxilo libres, grupos
N-sulfato y N-acetilo.
Adicionalmente, todos los pentasacáridos descritos en estas últimas
solicitudes de patente llevan al menos siete grupos sulfato. En el
campo de los derivados oligosacáridos antitrombóticos se suponía
generalmente que se requieren al menos siete grupos sulfato en los
compuestos pentasacáridos con el fin de obtener niveles
clínicamente aceptables de actividad antitrombótica.
Inesperadamente, sin embargo, se ha descubierto
ahora una clase de derivados carbohidratados relacionados con los
glicosaminoglicanos que tiene sólo de cuatro a seis grupos sulfato
y que todavía despliega una actividad antitrombótica clínicamente
eficaz significativa. Además, los compuestos de esta invención
muestran efectos secundarios menores. Por ejemplo, se reducen los
riesgos de hemorragia y el bajo contenido en sulfato de los
compuestos no da lugar a trombocitopenia inducida por heparina
(HIT) [la HIT es un grave efecto secundario, que puede ser causa de
muerte de un paciente]. Adicionalmente, los compuestos de esta
invención tienen una vida media biológica que permite un
tratamiento de una vez al día. El tratamiento de una vez al día
puede ser considerado más favorable que, por ejemplo, el tratamiento
de una vez a la semana, permitiendo una rápida adaptación del
tratamiento médico si el estado del paciente lo requiere. Asimismo
las logísticas hospitalarias son más fáciles con el tratamiento de
una vez al día, ya que no se requieren programas de dosificación
complejos para el tratamiento de los pacientes.
De este modo, los compuestos de la invención
despliegan un perfil farmacológico inesperado y delicadamente
equilibrado.
La invención hace referencia por lo tanto a un
derivado carbohidratado que tiene la fórmula I
donde R^{1} es alcoxi
C_{1}-C_{4}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son
independientemente alcoxi C_{1}-C_{4} o
OSO_{3}^{-}; el número total de grupos sulfato es de 4, 5 ó 6, y
las líneas retorcidas representan enlaces o bien por encima o bien
por debajo del plano del anillo de seis miembros al cual están
anclados; o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
Los compuestos de la presente invención son
útiles para tratar y prevenir las enfermedades mediadas por la
trombina y asociadas con la trombina. Entre estas se incluyen
numerosos estados trombóticos y pro-trombóticos en
los que la cascada de coagulación es activada que incluyen, pero no
están limitados a, la trombosis venosa profunda, la embolia
pulmonar, la tromboflebitis, la oclusión arterial a partir de
trombosis o embolia, la reoclusión arterial durante o después de la
angioplastia o la trombolisis, la restenosis que sigue a la lesión
arterial o los procedimientos cardiológicos invasivos, la trombosis
o la embolia venosa postoperatoria, la aterosclerosis aguda o
crónica, la apoplejía, el infarto de miocardio, el cáncer y la
metástasis, y las enfermedades neurodegenerativas. Los derivados
carbohidratados de la invención también pueden ser utilizados como
inhibidores de la proliferación de las células de la musculatura
lisa y para el tratamiento de la angiogénesis, el cáncer y las
infecciones por retrovirus, como el VIH.
Adicionalmente los compuestos de la invención
pueden ser utilizados como anticoagulantes y revestimientos
anticoagulantes en circuitos sanguíneos extracorpóreos, según sea
necesario, en diálisis y cirugía.
Los compuestos de la invención también pueden ser
utilizados como anticoagulantes in vitro o ex
vivo.
Los derivados carbohidratados preferidos según la
invención tienen la fórmula I, donde la unidad D tiene la
estructura
R^{1} es metoxi, y R^{2}, R^{3} y R^{4}
son independientemente metoxi o OSO_{3}^{-}.
Los derivados carbohidratados más preferidos son
aquellos en los que R^{2} es metoxi. En los derivados
carbohidratados concretamente preferidos R^{3} es metoxi. El
derivado carbohidratado más preferido es aquél en el que R^{4} es
metoxi.
En el término alcoxi
C_{1}-C_{4}, el grupo alquilo
C_{1}-C_{4} es un grupo alquilo ramificado o no
ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, tal como metilo,
etilo, isopropilo, t-butilo, y similares. El grupo
alquilo más preferido es metilo.
Los contraiones que compensan los radicales
cargados son contraiones farmacéuticamente aceptables, como
hidrógeno, o más preferiblemente iones de metales alcalinos o
alcalinotérreos, como sodio, calcio, o magnesio.
Los derivados carbohidratados según esta
invención pueden ser preparados según métodos bien conocidos
descrito y utilizados para la síntesis de oligosacáridos. Con
respecto a esto, se hace una referencia concreta a la patente
Europea anteriormente mencionada EP 529.715. Un procedimiento
adecuado para la preparación de los derivados carbohidratados de
fórmula I se caracteriza por un procedimiento en el que se acoplan
monosacáridos protegidos que tienen diferentes estructuras para dar
disacáridos protegidos, después de lo cual;
- (a)
- los disacáridos protegidos de un tipo son acoplados a los disacáridos protegidos de otro tipo para dar tetrasacáridos protegidos, cuyos tetrasacáridos son acoplados a un monosacárido protegido para dar pentasacáridos protegidos; o
- (b)
- monosacáridos protegidos son acoplados a disacáridos protegidos para dar trisacáridos protegidos, que son acoplados adicionalmente a disacáridos protegidos para dar pentasacáridos protegidos;
después de lo cual los grupos protectores son
escindidos y los grupos hidroxi libres son sulfatados; después de
lo cual el compuesto obtenido es opcionalmente convertido en una
sal farmacéuticamente
aceptable.
Los monosacáridos son D-glucosa,
D-manosa, L-idosa, ácido
D-glucurónico o ácido L-idurónico,
adecuadamente funcionalizados con los grupos alquilo requeridos o
por grupos temporalmente protectores. Los grupos protectores
adecuados son bien conocidos en la técnica. Entre los grupos
protectores preferidos se incluyen bencilo y acetilo para los
grupos hidroxi, y bencilo para los grupos carboxilato de los ácidos
urónicos. Otros grupos protectores tales como benzoílo, levulinilo,
alcoxifenilo, cloroacetilo, tritilo, y similares pueden ser
utilizados con igual éxito. El acoplamiento del sacárido se realiza
de una manera conocida en la técnica, v.g., desprotección de la
posición 1 del donador de glicosilo, y/o activación de esta
posición (v.g. elaborando un derivado bromuro, pentenilo, fluoruro,
tioglicósido, o tricloroacetimido) y acoplamiento del donador de
glicosilo activado con un aceptor de glicosilo opcionalmente
protegido.
Para el tratamiento de la trombosis venosa o para
la inhibición de la proliferación de las células de la musculatura
lisa, los compuestos de la invención pueden ser administrados
entéricamente o parenteralmente, y para humanos preferiblemente a
una dosis diaria de 0,001-10 mg por kg de peso
corporal. Mezclado con coadyuvantes farmacéuticamente adecuados,
v.g. como se describe en la referencia patrón, Gennaro y col.
Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª ed., Mack Publishing
Company, 1.990, ver especialmente la Parte 8: Pharmaceutical
Preparations and Their Manufacture), los compuestos pueden ser
comprimidos en unidades de dosificación sólidas, tales como
píldoras, tabletas, o ser elaborados en cápsulas o supositorios.
Por medio de líquidos farmacéuticamente adecuados los compuestos
también pueden ser aplicados como una preparación inyectable en
forma de una solución, suspensión, emulsión, o en forma de
pulverización, v.g. una pulverización nasal.
Para elaborar unidades de dosificación, v.g.,
tabletas, se contempla el uso de aditivos tales como cargas,
colorantes, aglutinantes poliméricos y similares. En general se
puede utilizar cualquier aditivo farmacéuticamente aceptable que no
interfiera en la función de los compuestos activos. Entre los
portadores adecuados con los que se pueden administrar las
composiciones se incluyen lactosa, almidón, derivados de celulosa y
similares, o mezclas de los mismos, utilizados en cantidades
adecuadas.
La invención se ilustra adicionalmente mediante
los siguientes ejemplos.
Preparación del ejemplo I (compuesto
32)
Compuesto
2
Se disolvió el compuesto 1 (60 g,
asequible comercialmente) en N,N-dimetilformamida
(858 ml) junto con bromuro de benzoílo (50,5 ml). Después de
enfriar +10ºC se añadió gota a gota una solución acuosa al 20% de
hidróxido de sodio. Después de agitar durante 1 hora la temperatura
se elevó a 20ºC y la mezcla se agitó otras 20 horas. La solución se
vertió después en una mezcla de agua con hielo y tolueno y se
extrajo. La capa orgánica se concentró y el producto bruto se
purificó mediante cristalización para dar 30,0 g del compuesto
2.
TLC: Rf = 0,60, tolueno/acetato de etilo: 7/3,
v/v.
Compuesto
3
Se disolvió el compuesto 2 (26,4 g) en
N,N-dimetilformamida (211 ml) y se enfrió en hielo.
Se añadió hidruro de sodio (2,5 g) en atmósfera de nitrógeno.
Después se añadió gota a gota cloruro de
4-metoxibencilo (13,3 g) y la mezcla se agitó
durante 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla se diluyó
después con acetato de etilo, se lavó agua (2X) y se concentró para
dar 40,7 g del compuesto 3 bruto.
TLC: Rf = 0,80, tolueno/acetato de etilo: 7/3,
v/v.
Compuesto
4
Se disolvió el compuesto 3 (34,9 g) en
ácido acético acuoso al 60% y se agitó durante 4 horas a 60ºC. La
mezcla se diluyó con tolueno y se concentró. La purificación
mediante cromatografía en gel de sílice dio 26,4 g del compuesto
4.
TLC: Rf = 0,07, tolueno/acetato de etilo: 7/3,
v/v.
Compuesto
5
Se disolvió el compuesto 4 (26,4 g) en
diclorometano (263 ml) en atmósfera de nitrógeno. Se añadieron
tetrafluoroborato de trimetiloxonio (11,6 g) y
2,6-di-t-butil-4-metilpiridina
(17,4 g) a la temperatura ambiente. Al cabo de 4 horas la mezcla se
vertió en agua con hielo y se extrajo con diclorometano. La capa
orgánica se lavó con hidrogenocarbonato de sodio y se evaporó. La
purificación del producto bruto mediante cromatografía en gel de
sílice dio 18,5 g del compuesto 5.
TLC: Rf = 0,25, tolueno/acetato de etilo: 7/3,
v/v.
Compuesto
7
Se disolvió el compuesto 6
(3-metil-1,2,4,6-tetraacetil-idosa)
(48,4 g) en tolueno (175 ml). En atmósfera de nitrógeno se
añadieron etanotiol (20 ml) y dietileterato de trifluoruro de boro
(1 M en tolueno; 134 ml). Después de agitar durante 1 hora se
añadió hidrogenocarbonato de sodio acuoso (400 ml) y la mezcla se
agitó durante otra hora. Después la mezcla se vertió en acetato de
etilo. La capa orgánica se lavó dos veces con agua y se concentró.
La purificación mediante cromatografía en gel de sílice dio 29,6 g
del compuesto 7.
TLC: Rf = 0,45, tolueno/acetato de etilo: 6/4,
v/v.
Compuesto
8
Se disolvieron el compuesto 5 (17,5 g) y
el compuesto 7 (28,2 g) en tolueno (525 ml) en atmósfera de
nitrógeno. Tras la adición de tamices moleculares (4 \ring{A}) en
polvo la reacción se enfrió a-20ºC. Se añadieron
gota a gota una solución 0,1 M recién preparada de
N-yodosuccinimida (17,4 g) y ácido
trifluorometanosulfónico (1,38 ml) en dioxano/diclorometano (1/1
v/v) bajo un flujo continuo de nitrógeno. Al cabo de 10 minutos la
mezcla de reacción de color rojo se filtró y se lavó sucesivamente
con tiosulfato de sodio acuoso a e hidrogenocarbonato de sodio
acuoso. La capa orgánica se concentró a vacío y se aislaron
30,0 g del compuesto 8.
TLC: Rf = 0,45, diclorometano/acetato de etilo:
8/3, v/v.
Compuesto
9
Se disolvió el compuesto 8 (30,0 g) en 400
ml de metanol/dioxano (1/1, v/v) y se añadió butanolato de potasio
para la saponificación. Al cabo de 15 minutos la mezcla se
neutralizó con Dowex forma 50WX8H* y se concentró a vacío. La
purificación se estableció mediante cromatografía en gel de sílice
para dar 17,4 g del compuesto 9.
TLC: Rf = 0,25, diclorometano/metanol: 95/5,
v/v.
Compuesto
10
Se disolvió el compuesto 9 (17,4 g) en
atmósfera de nitrógeno en N,N-dimetilformamida (77
ml). Se añadieron 1,2-dimetoxipropano (26 ml) y
ácido p-toluenosulfónico y la mezcla se agitó
durante 30 minutos. Diluyendo la mezcla con hidrogenocarbonato de
sodio acuoso y extrayéndola con acetato de etilo se proporcionaron
19,7 g del compuesto 10 tras la evaporación del
disolvente.
TLC: Rf = 0,45, diclorometano/metanol: 95/5,
v/v.
Compuesto
11
Se disolvió el compuesto 10 (18,5 g) en
N,N-dimetilformamida (24,4 ml) y se enfrió a 0ºC.
En atmósfera de nitrógeno se añadieron hidruro de sodio (1,47 g,
dispersión en aceite al 60%) y yodometano (2,36 ml). Al cabo de 1
hora se neutralizó el exceso de hidruro de sodio, la mezcla se
extrajo con diclorometano y se concentró para dar 20,0 g del
compuesto 11.
TLC: Rf = 0,85, diclorometano/metanol: 95/5,
v/v.
Compuesto
12
Se disolvió el compuesto 11 (18,4 g) en
diclorometano (838 ml) y agua (168 ml). Se añadió
2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona
(7,1 g) y la mezcla se agitó durante 18 horas a 4ºC. La mezcla se
vertió en hidrogenocarbonato de sodio acuoso y se extrajo con
diclorometano. La concentración de la capa orgánica dio 12,7 g del
compuesto 12.
TLC: Rf = 0,40, diclorometano/metanol: 95/5,
v/v.
Compuesto
13
El compuesto 12 se convirtió en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 11.
TLC: Rf = 0,48, tolueno/acetato de etilo: 1/1,
v/v.
Compuesto
14
Tras disolver el compuesto 13 (2,5 g) en
ácido acético (14,6 ml) y agua (6,1 ml), la mezcla se agitó durante
la noche a la temperatura ambiente. La evaporación simultánea con
tolueno y la purificación mediante cromatografía en gel de sílice
dieron 1,9 g del compuesto 14.
TLC: Rf = 0,31, acetato de etilo, v/v.
\newpage
Compuesto
15
A una solución del compuesto 14 (1,7 g) en
diclorometano (9 ml) se añadieron
2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi
(5 mg), una solución saturada de hidrogenocarbonato de sodio (5,8
ml), bromuro de potasio (32 mg) y cloruro de tetrabutilamonio (42
mg). La mezcla se enfrió a 0ºC y se añadió una mezcla de una
solución saturada de cloruro de sodio (6,5 ml) y una solución
saturada de hidrogenocarbonato de sodio (3,2 ml) e hipoclorito de
sodio (1,3 M, 7,3 ml) durante 15 minutos. Tras agitar durante 1
hora la mezcla se diluyó con agua y se extrajo (3 veces) con
diclorometano. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre
sulfato de magnesio, se filtró y se evaporó hasta sequedad para dar
1,74 g del compuesto 15 bruto.
TLC: Rf = 0,14, diclorometano/metanol: 9/1,
v/v.
A una solución de 1,74 g del compuesto 15
en N,N-dimetilformamida se añadieron en atmósfera
de nitrógeno 1,68 ml de bromuro de bencilo y 1,1 g de
hidrogenocarbonato de potasio. Después de agitar la solución durante
90 minutos se añadió agua y la mezcla se extrajo con acetato de
etilo. Tras la evaporación de la capa orgánica y la purificación
mediante cromatografía en gel de sílice, se aislaron 1,64 g del
compuesto 16.
TLC: Rf = 0,50, tolueno/acetato de etilo: 1/1,
v/v.
Compuesto
17
Se disolvió el compuesto 12 (10,5 g) en
N,N-dimetilformamida seca (178 ml), se enfrió a 0ºC
en atmósfera de nitrógeno. Se añadió hidruro de sodio (1,91 g,
dispersión en aceite al 60%) después de lo cual se añadió gota a
gota bromuro de bencilo (3,3 ml). Al cabo de 30 minutos la reacción
se había completado y el exceso de hidruro de sodio se neutralizó.
Se añadió agua y la mezcla se extrajo dos veces con acetato de
etilo. La evaporación del disolvente dio 13,6 g del compuesto
17.
TLC: Rf = 0,50, tolueno/acetato de etilo: 1/1,
v/v.
Compuesto
18
Se convirtió el compuesto 17 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 14.
TLC: Rf = 0,68, diclorometano/metanol: 9/1,
v/v.
Compuesto
19
Se convirtió el compuesto 18 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 15.
TLC: Rf = 0,14, diclorometano/metanol: 9/1,
v/v.
Compuesto
20
Se convirtió el compuesto 19 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 16.
TLC: Rf = 0,38, diclorometano/metanol: 85/15,
v/v.
Compuesto
21
Se disolvió el compuesto 20 (9,9 g) en 300
ml de metanol (seco) y se sometió a reflujo en atmósfera de
nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución 1 M de metóxido de
sodio (65,2 ml) y se agitó durante 3 horas. Después la temperatura
se enfrió a la temperatura ambiente y se añadió hidróxido de sodio
1N (22,2 ml) y se agitó durante 90 minutos. La neutralización con
Dowex 50W/forma X8H* y la evaporación del disolvente dieron el
residuo bruto.
Se añadieron N,N-dimetilformamida
(192 ml) y tamices moleculares (4 \ring{A}) en atmósfera de
nitrógeno. Se añadieron hidrogenocarbonato de potasio (3,2 g) y
bromuro de bencilo (4,8 ml) y la mezcla se agitó durante 5 horas
después de lo cual se añadió acetato de etilo y la mezcla se lavó
con agua. La evaporación del disolvente y la purificación del
producto bruto mediante cromatografía en gel de sílice dieron 6,19
g del compuesto 21 y 1,88 g del compuesto 20
recuperado.
TLC: Rf = 0,74, diclorometano/metanol: 9/1,
v/v.
Compuesto
22
Se disolvió el compuesto 21 (6,2 g) en 40
ml de dioxano. Se añadieron ácido levulínico (2,1 g),
diciclohexilcarbodiimida (3,75 g) y
4-dimetilamino-piridina (0,2 g) y la
mezcla se agitó durante 2 horas en atmósfera de nitrógeno. Se
añadió éter (95 ml) y el producto precipitado se separó por
filtración. La capa orgánica se lavó con hidrogenosulfato de potasio
acuoso y se concentró. La cristalización en éter dietílico/heptano
dio 6,2 g del compuesto 22.
TLC: Rf = 0,26, diclorometano/acetona: 95/5,
v/v.
Compuesto
23
Se disolvió el compuesto 22 (6,1 g) en
anhídrido acético (256 ml) en atmósfera de nitrógeno y se enfrió a
\-20ºC. Se añadió gota a gota una mezcla de ácido sulfúrico (4,9 ml) en anhídrido acético (49 ml) durante 30 minutos. Al cabo de 60 minutos se añadió acetato de sodio hasta que el pH de la mezcla fuera neutro. Se añadieron acetato de etilo y agua y la capa orgánica se concentró. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice dio 4,2 g del compuesto 23.
TLC: Rf = 0,63, diclorometano/acetona: 9/1,
v/v.
Compuesto
24
Se disolvió el compuesto 23 (4,2 g) en
tetrahidrofurano (42 ml) y se añadió piperidina (4,1 ml). La mezcla
se agitó durante la noche a la temperatura ambiente. Se añadió
acetato de etilo y la mezcla se lavó con ácido clorhídrico 0,5 N.
La capa orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante
cromatografía en gel de sílice para dar 3,2 g del compuesto
24.
TLC: Rf = 0,33, diclorometano/acetato de etilo:
1/1, v/v.
Se disolvió el compuesto 24 (1,59 g) en
diclorometano en atmósfera de nitrógeno. Se añadieron
tricloroacetonitrilo (1,1 ml) y carbonato de cesio (72 mg) y la
mezcla se agitó durante 1 hora. El carbonato de cesio se separó por
filtración y el producto filtrado se concentró. La purificación
mediante cromatografía en gel de sílice dio 1,57 g del compuesto
25.
TLC: Rf = 0,60, tolueno/acetato de etilo: 3:7,
v/v.
Compuesto
26
Una mezcla del compuesto 16 (0,530 mg) y
el compuesto 25 (0,598 mg) se secó mediante evaporación
simultánea con tolueno seco y se disolvió en 8,2 ml de
diclorometano seco. Se añadieron tamices moleculares en polvo (4
\ring{A}) y la mezcla se enfrió a
\-20ºC en atmósfera de nitrógeno y se agitó durante 30 minutos. A la suspensión resultante se añadió trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (15% en moles en relación con el compuesto 25). Después de agitar durante 10 minutos se añadió hidrogenocarbonato de sodio, la mezcla se filtró y se añadieron agua y diclorometano. La capa orgánica se extrajo después, se concentró y el producto bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para dar 0,62 g del compuesto 26.
TLC: Rf = 0,47, tolueno/acetato de etilo: 3:7,
v/v.
A una solución del compuesto 26 (0,58 g)
en piridina se añadió una mezcla de 2,76 ml de ácido acético, 0,32
ml de hidrato de hidrazina en 2,1 ml de piridina. Al cabo de 9
minutos, se añadieron agua y diclorometano y la capa orgánica se
lavó con ácido clorhídrico 1 N y una solución acuosa de
hidrogenocarbonato de sodio. La purificación mediante cromatografía
en gel de sílice dio 0,27 g del compuesto 27.
TLC: Rf = 0,45, tolueno/acetato de etilo: 3:7,
v/v.
Compuesto
29
Una mezcla del compuesto 27 (150 mg) y 76
mg del compuesto 28 (Ref: Bioorganic & Medicinal
Chemistry, vol 2, núm. 11, 1267-1280, 1.994) se secó
mediante evaporación simultánea con tolueno seco y se disolvió en
7,5 ml de diclorometano seco. En atmósfera de nitrógeno, se
añadieron tamices moleculares en polvo (4 \ring{A}) y la mezcla
se enfrió a
\-20ºC. Después de agitar durante 20 minutos se añadió trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (15% en moles en relación con el compuesto 28). Después de agitar durante 30 minutos se añadió hidrogenocarbonato de sodio acuoso. La mezcla se filtró y la capa orgánica se lavó con agua. La concentración del disolvente dio el producto bruto que después se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para dar 136 mg del compuesto 29.
TLC: Rf = 0,33, tolueno/acetato de etilo: 4/6,
v/v.
Compuesto
30
Se diluyó el compuesto 29 en una mezcla de
t-butanol (8 ml) y agua (1 ml). A la solución se
añadieron 122 mg de paladio sobre carbono al 10% y la mezcla se
agitó durante la noche en atmósfera de hidrógeno. El paladio sobre
carbono se filtró y la solución se concentró para dar 84,5 mg del
compuesto 30.
TLC: Rf = 0,49, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua: 13/7/1,6/4, v/v.
Compuesto
31
Se diluyó el compuesto 30 en 5 ml de
hidróxido de sodio 0,3 N y se agitó durante 3 horas. La mezcla de
reacción se neutralizó después con ácido clorhídrico 0,5 N y se
evaporó. El residuo se desaló sobre una columna Sephadex G25 con
agua/acetonitrilo: 9/1 (v/v) y se hizo pasar a través de una columna
corta de Dowex forma 50WX8H*. Tras la evaporación se aislaron 75,6
mg del compuesto 31.
TLC: Rf = 0,43, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua: 8/7/1,6/4, v/v.
Se disolvió el compuesto 31 (30,6 mg) en
2,15 ml de N,N-dimetilformamida (destilada; seca) y
se añadió complejo de trietilamina-trióxido de
azufre (120 mg) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó
durante la noche a 55ºC. Se añadió una suspensión de
hidrogenocarbonato de sodio en agua. La mezcla se agitó durante 1
hora a la temperatura ambiente y el disolvente se evaporó. El
residuo se disolvió en agua (2 ml) y se desaló sobre una columna
Sephadex G25 con agua/acetonitrilo: 9/1 (v/v). El producto aislado
se hizo eluir en una columna Dowex forma 50WX8Na^{-} con agua para
dar 42,5 mg del compuesto pentasacárido 32.
Desplazamiento químico de protones anoméricos:
5,32, 5,22, 4,97, 4,89 y 2,24 ppm.
Preparación del ejemplo II (compuesto
38)
Compuesto
33
Se acoplaron el compuesto 25 y el
compuesto 20 para dar el compuesto del título según los
mismos procedimientos descritos para la preparación del compuesto
26.
TLC: Rf = 0,47, tolueno/acetato de etilo: 3/7,
v/v.
El compuesto 33 se convirtió en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 27.
TLC: Rf = 0,39, heptano/acetato de etilo: 3/7,
v/v.
Compuesto
35
El compuesto 34 y el compuesto 28
se acoplaron para dar el compuesto del título según los mismos
procedimientos descritos para la preparación del compuesto
29.
TLC: Rf = 0,60, tolueno/acetato de etilo: 3/7,
v/v.
Compuesto
36
Se convirtió el compuesto 35 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 30.
TLC: Rf = 0,39, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua: 13/7/1,6/4, v/v.
Compuesto
37
Se convirtió el compuesto 36 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 31.
TLC: Rf = 0,32, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua: 13/7/1,6/4, v/v.
El compuesto 37 se convirtió en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 32.
[\alpha]^{20}_{D} = +53,6 (c=1,
H_{2}O)
Desplazamiento químico de protones anoméricos:
5,32, 5,23, 4,99, 4,9 y 4,23 ppm.
Preparación del ejemplo III (compuesto
56)
Compuesto
39
El compuesto 2 se convirtió en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 11.
TLC: Rf = 0,52, diclorometano/acetona: 98/2,
v/v.
Compuesto
40
El compuesto 39 (32,0 g) se disolvió en
metanol (538 ml). Se añadió ácido p-toluenosulfónico
(1,57 g) y la mezcla se agitó durante 1,5 horas a la temperatura
ambiente. Tras la neutralización con trietilamina la mezcla se
concentró. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice
dio 11,9 g del compuesto 40.
TLC: Rf = 0,56, diclorometano/metanol: 9/1,
v/v.
Compuesto
41
El compuesto 40 se convirtió en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 5.
TLC: Rf = 0,18, tolueno/acetato de etilo: 7/3,
v/v.
Compuesto
42
El compuesto 6 se convirtió en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 24.
\newpage
Compuesto
43
El compuesto 42 se convirtió en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 25.
Compuesto
44
La reacción de acoplamiento del compuesto
43 con el compuesto 41 se realizó en las mismas
condiciones descritas para el compuesto 26.
TLC: Rf = 0,28, tolueno/acetato de etilo: 6/4,
v/v.
Compuesto
45
El compuesto 44 se convirtió en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 9.
TLC: Rf = 0,09, tolueno/acetato de etilo: 3/7,
v/v.
Compuesto
46
El compuesto 45 se convirtió en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 10.
TLC: Rf = 0,52, acetato de etilo
Compuesto
47
El compuesto 46 (10,4 g) se disolvió en
piridina (seca) (102 ml) en atmósfera de nitrógeno. Se añadió una
mezcla de anhídrido acético (34 ml) y piridina (seca) (102 ml) y 10
mg de 4-dimetilaminopiridina. Después de agitar
durante 1 hora a la temperatura ambiente la mezcla de reacción se
concentró y se evaporó simultáneamente con tolueno seco para dar
11,9 g del compuesto 47.
TLC: Rf = 0,50, tolueno/acetato de etilo: 1/1,
v/v
Compuesto
48
Tras disolver el compuesto 47 (11,9 g) en
metanol (90 ml), se añadieron 180 mg de ácido
p-toluenosulfónico y la mezcla se agitó durante la
noche a la temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con acetato de
etilo, se lavó con agua (2X) y se concentró. La purificación del
producto bruto mediante cromatografía en gel de sílice dio 6,2 g del
compuesto 48.
TLC: Rf = 0,28, tolueno/acetato de etilo: 3/7,
v/v
Compuesto
49
Se convirtió el compuesto 48 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 15.
TLC: Rf = 0,24, diclorometano/metanol: 9/1,
v/v
Se convirtió el compuesto 49 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 16.
TLC: Rf = 0,37, diclorometano/metanol: 9/1,
v/v
Compuesto
51
Se acoplaron el compuesto 25 y el
compuesto 50 para dar el compuesto del título según los
mismos procedimientos descritos para la preparación del compuesto
26.
TLC: Rf = 0,52, diclorometano/metanol: 98/2,
v/v
Se convirtió el compuesto 51 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 27.
TLC: Rf = 0,26, diclorometano/metanol: 98/2,
v/v
Compuesto
53
Se acoplaron el compuesto 28 y el
compuesto 52 para dar el compuesto del título según los
mismos procedimientos descritos para la preparación del compuesto
29.
TLC: Rf = 0,63, diclorometano/metanol: 98/2,
v/v
Compuesto
54
Se convirtió el compuesto 53 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 30.
TLC: Rf = 0,51, diclorometano/metanol: 8/2,
v/v
Compuesto
55
Se convirtió el compuesto 54 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 31.
TLC: Rf = 0,32, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua: 10/7/1,6/4, v/v
Se convirtió el compuesto 55 en el
compuesto del título según los mismos procedimientos descritos para
la preparación del compuesto 32.
[\alpha]^{20}_{D} = +50,2 (c=1,05,
H_{2}O)
Desplazamiento químico de protones anoméricos:
5,32, 5,29 y 4,89 ppm.
Preparación del ejemplo IV (compuesto
80)
Compuesto
58
Se añadieron Et_{3}N (43 ml, 0,3 moles),
4-dimetilamino-piridina (156 mg, 1,3
mmoles) y Ac_{2}O (23 ml, 0,29 moles) a una solución de 57
(36,2 g, 0,128 moles) (Petroni y col. Aust. J. Chem. 1.988, 41,
91-102) en CH_{2}Cl_{2} (360 ml). Al cabo de 30
minutos la mezcla se lavó sucesivamente con KHSO_{4} acuoso al 5%,
H_{2}O, NaHCO_{3} acuoso saturado, H_{2}O y se secó
(Na_{2}SO_{4}). La evaporación dio 58 bruto. TLC: Rf
0,41, ciclohexano/EtOAc 3:1.
Compuesto
59
Se añadió etanolamina (4,9 ml, 80 mmoles) a 4ºC a
una solución de 58 bruto (11,8 g, 32 mmoles) en THF (220 ml).
Al cabo de 16 horas a 4ºC, se añadieron tricloroacetonitrilo (65 ml,
644 mmoles) y K_{2}CO_{3} (8,3 g, 64,4 mmoles) en argón a la
mezcla anterior. Al cabo de 16 horas a la temperatura ambiente, la
solución se filtró y se concentró. La cromatografía en columna
(ciclohexano/EtOAc 4:1) proporcionó 59 con un rendimiento del
79%: TLC: Rf 0,49, ciclohexano/EtOAc 1:1.
Compuesto
61
Una solución de triflato de trimetilsililo (0,04
M en CH_{2}Cl2; 96 ml, 3,8 mmoles) se añadió gota a gota, en
argón, a una solución enfriada (-20ºC) del imidato donador 59
(11,93 g, 25 mmoles) y el aceptor 60 (9,2 g, 19,8 mmoles)
(P.J. Garegg, H. Hultberg Carbohydr. Res. 1.961, 93, C10) en
CH_{2}Cl_{2} (190 ml) conteniendo tamices moleculares en polvo
de 4 \ring{A}. Al cabo de 30 minutos se introdujo NaHCO_{3}
sólido, y la solución se filtró, se lavó con agua, se seco
(Na_{2}SO_{4}) y se concentró. El residuo cristalizado en
Et_{2}O dio 61 (rendimiento 82%). p.f. 138ºC.
Compuesto
62
Se añadió sodio (373 mg, 0,65 mmoles) a una
solución del compuesto 61 (1 g, 1,3 mmoles) en
metanol/CH_{2}Cl_{2} (ml) 2:1. La mezcla se agitó durante 1 hora
a la temperatura ambiente, y después se neutralizó con resina Dowex
50 H^{+}, se filtró y se concentró para proporcionar 62
bruto.
Compuesto
63
Se añadió NaH en porciones (40,5 mg, 1,68 mmoles)
a una solución enfriada (0ºC) de 62 bruto (950 mg), y MeI
(0,1 ml, 1,55 mmoles) en DMF (9 ml). Al cabo de 2 horas a la
temperatura ambiente, se introdujo MeOH, y la mezcla se vertió en
H_{2}O. El producto se extrajo con EtOAc, se lavó con H_{2}O, se
secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. La cromatografía en columna
(ciclohexano/EtOAc 3:1) del residuo dio 63 puro (rendimiento
86% a partir de 62): p.f. 137ºC (Et_{2}O)
Compuesto
64
Una solución de 63 (1,16 g, 1,56 mmoles)
en H_{2}O/MeOH 1:3 (40 ml) se calentó a 80ºC en presencia de ácido
p-toluenosulfónico (230 mg, 1,56 mmoles). Al cabo
de 3 horas, la mezcla se neutralizó con NaHCO_{3} y se concentró.
La cromatografía en columna (ciclohexano/acetona 3:1) del residuo
dio 64 (rendimiento 89%): TLC Rf 0,28, ciclohexano/acetona
2:1.
A una solución de 64 (860 mg, 1,3 mmoles)
en CH_{2}Cl_{2} (4 ml) se añadieron
2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi
(2,3 mg), NaHCO_{3} acuoso saturado (2,3 ml), KBr (13,5 mg) y
cloruro de tetrabutilamonio (18 mg). A la solución enfriada (0ºC)
anterior se añadió la mezcla de soluciones de NaCl acuosa saturada
(2,8 ml), NaHCO_{3} acuosa saturada (1,4 ml) y NaOCl (1,3 M, 3,2
ml). Al cabo de 1 hora, la mezcla se extrajo con CH_{2}Cl_{2},
se lavó con H_{2}O, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró
para dar el ácido 65 bruto.
El ácido bruto anterior en DMF se trató con BnBr
(1,6 ml, 13 mmoles) y KHCO_{3} (650 mg, 6,5 mmoles). Al cabo de
16 horas, el producto se extrajo con EtOAc, se lavó con H_{2}O,
se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró para dar 66 con un
rendimiento del 77%.
Compuesto
67
Una solución de triflato de trimetilsililo (0,04
M en CH_{2}Cl_{2}, 1,88 ml, 0,075 mmoles) se añadió gota a
gota, en argón, a una solución enfriada (-20ºC) de
tricloroacetimidato de
6-O-acetil-2,3,4-tri-O-metil-D-glucopiranosa
28 (290 mg, 0,711 mmoles) (P. Westerduin y col. Bioorg. Med.
Chem. 1.994, 2, 1267-83) y aceptor 66 (300
mg, 0,4 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (20 ml) conteniendo tamices
moleculares en polvo 4 \ring{A}. Al cabo de 30 minutos se
introdujo NaHCO_{3}, y la solución se filtró y se concentró. La
cromatografía en columna (tolueno/EtOAc 3:1) del residuo dio
67 puro (rendimiento 56%):
TLC Rf = 0,32, tolueno/acetato de etilo 3:2
Compuesto
68
A una solución de 67 (201 mg, 0,20 mmoles)
en anhídrido acético (7,6 ml) a -20ºC se añadió una
mezcla de ácido sulfúrico concentrado en anhídrido acético (1,5 ml,
0,1:1 v/v). Después de agitar 1 hora se añadió acetato de sodio (780
mg). La mezcla se diluyó con EtOAc, se lavó con H_{2}O, se secó
(Na_{2}SO_{4}) y se concentró para dar, tras la cromatografía en
columna (tolueno/EtOAc 1:1), 68 (rendimiento 82%):
TLC Rf = 0,32, tolueno EtOAc 1:1.
Compuesto
69
Se añadió bencilamina (0,58 ml, 5,26 mmoles) a
una solución de 68 (125,4 mg) en THF (5 ml). Al cabo de 7
horas a la temperatura ambiente la solución se lavó con HCl acuoso 1
M, H_{2}O, se secó, y se concentró. La cromatografía en columna
(tolueno/EtOAc 3:2) proporcionó 69 puro (rendimiento
75%):
TLC Rf = 0,33, tolueno/EtOAc 2:3.
Se añadieron tricloroacetonitrilo (69 \mul,
0,675 mmoles), y carbonato de cesio (66 mg, 0,202 mmoles) en argón
a una solución de 69 (89,2 mg, 0112 mmoles) en
CH_{2}Cl_{2} (2 ml). Al cabo de 2 horas la solución se filtró y
se concentró. La cromatografía en columna del residuo (tolueno/EtOAc
1:1) proporcionó 70 (rendimiento 88%):
TLC Rf = 0,44, tolueno/EtOAc 1:1.
Compuesto
72
Se añadió metóxido de sodio (570 mg, 106 mmoles)
a una solución del compuesto 71 (2,5 g, 3,53 moles) (M.
Petitou y col. J. Med. Chem. 1.997, 40, 1600-1607)
en metanol/CH_{2}Cl_{2} 1:1 (35 ml). Al cabo de 2 horas se
introdujo resina Dowex 50 H^{+} hasta la neutralización y se
filtró. Tras la concentración, la cromatografía en columna
(ciclohexano/EtOAc 2:1) del residuo dio 72 (rendimiento
100%):
TLC Rf = 0,32, ciclohexano/EtOAc 2:1.
Compuesto
73
Se añadió MeI (0,41 ml, 6,61 mmoles), a 0ºC, a
una solución de 72 (2 g, 3,3 mmoles), y se introdujo NaH
(0,12 g, 5 mmoles), en THF (20 ml). Al cabo de 2 horas, se introdujo
MeOH gota a gota, y después de 15 minutos el producto se extrajo con
CH_{2}Cl_{2}. La solución se lavó con H_{2}O, se secó
(Na_{2}SO_{4}), y se concentró. La cromatografía en columna
(ciclohexano/EtOAc 5:1) dio 73 puro (rendimiento 89%):
[\alpha]_{D}+12º (c 1; CH_{2}Cl_{2}).
Compuesto
74
Se añadió CF_{3}COOH (70%, 3,14 ml) a una
solución de 73 (1,76 g, 2,84 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (16
ml). Al cabo de 50 minutos a la temperatura ambiente la solución se
diluyó con CH_{2}Cl_{2}, se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado
frío, H_{2}O, y se secó (Na_{2}SO_{4}). Tras la concentración,
la cromatografía en columna (CH_{2}Cl_{2}/acetona 11:2) del
residuo rindió 74 con un rendimiento del 88%):
[\alpha]_{D}+10º (c 1; CH_{2}Cl_{2}).
A una solución de 74 (1,39 g, 2,4 mmoles)
en THF (8 ml) se añadieron
2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi
(37,4 mg), NaHCO_{3} acuoso saturado (14,4 ml), KBr (120 mg) y
cloruro de tetrabutilamonio (180 mg). A la solución anterior
enfriada (0ºC) se añadió la mezcla de soluciones NaCl acuosa
saturada (2,8 ml), NaHCO_{3} acuosa saturada (1,4 ml) y NaOCl (1,3
M, 3,2 ml). Al cabo de 1 hora, la mezcla se extrajo con
CH_{2}Cl_{2}, se lavó con H_{2}O, se secó (Na_{2}SO_{4}) y
se concentró para dar el ácido bruto 75.
El ácido bruto 75 anterior en DMF (31 ml)
se trató con BnBr (2,84 ml, 23,9 mmoles) y KHCO_{3} (1,2 g, 12
mmoles). Al cabo de 16 horas, el producto se extrajo con EtOAc, se
lavó con H_{2}O, se secó (Na_{2}SO_{4}). Tras la
concentración, la cromatografía en columna (ciclohexano/EtOAc 3:2)
del residuo dio 76 (rendimiento 78% a partir de 74):
[\alpha]_{D}+7,3º (c 1,1; CH_{2}Cl_{2}).
Compuesto
77
Se añadió triflato de trimetilsililo (170 \mul,
0,0068 mmoles) en argón a una solución agitada, enfriada (-20ºC) de
imidato 70 (91 mg, 0,097 mmoles), y 76 (66,2 mg, 0,097
mmoles), en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) conteniendo tamices moleculares
4 \ring{A}. Al cabo de 30 minutos, se introdujo NaHCO_{3} (0,1
g), y la agitación se prolongó durante la noche. La solución se
filtró, se lavó con H_{2}O, se secó, y se concentró. La
cromatografía en columna (ciclohexano/acetona 2:1) proporcionó el
pentasacárido 77 (rendimiento 71,6%):
TLC Rf = 0,4 (ciclohexano/acetona 2:1).
Una solución de 77 (50 mg, 0,032 mmoles)
en DMF (5 ml) se agitó durante 16 horas en una corriente débil de
H_{2} en presencia de catalizador de Pd/C al 10% (50 mg). Tras la
filtración, la solución se concentró para dar 78.
Se añadió NaOH acuoso (5 M, 0,46 ml) a una
solución del compuesto bruto anterior en MeOH (26 ml). Al cabo de 5
horas se introdujo Dowex 50 H^{+} hasta alcanzar un pH neutro. La
solución se concentró, y el residuo se dispuso en capas sobre la
parte superior de una columna Sephadex G 25 eluída con H_{2}O. La
concentración de las fracciones reunidas dio 79 bruto.
Se añadió Et_{3}N/SO_{3} (174 mg, 0,96
mmoles) a una solución del compuesto anterior en DMF (6 ml), y la
solución se calentó a 55ºC durante 20 horas. Después se introdujo
NaHCO_{3} (0,33 mg disueltos en H_{2}O), y la solución se
dispuso en capas sobre la parte superior de una columna Sephadex G
25 (1,6 x 100 cm) equilibrada en NaCl 0,2 M. Las fracciones fueron
reunidas, concentradas, y desaladas en la misma columna de
filtración en gel, equilibrada en H_{2}O. La liofilización dio
después el pentasacárido 80 (rendimiento 95% a partir de
77): [\alpha]_{D}+49º (c 1; H_{2}O).
El factor X activado (Xa) es un factor de la
cascada de coagulación. La actividad anti-Xa de los
compuestos de la presente invención fue evaluada midiendo
espectrofotométricamente la velocidad de hidrólisis del sustrato
cromogénico s-2222 ejercida por Xa. Este análisis
para la actividad anti-Xa en un sistema tampón fue
utilizado para evaluar el valor CI_{50} del compuesto de
ensayo.
Compuesto de referencia:
benzamidina
Medio de ensayo: tampón
trometamina-NaCl-polietilenglicol
6000
(TNP)
- Vehículo:
- tampón TNP
- La solubilización puede estar ayudada por dimetilsulfóxido, metanol, etanol, acetonitrilo o alcohol t-butílico que notienen efectos adversos a concentraciones de hasta el 1% (para el DMSO) y el 2,5 % (para los otros disolventes) en la mezcla de reacción final.
- Técnica:
- Reactivos*
- 1. Tampón trometamina-NaCl (TN)
- Composición del
tampón
\\
Trometamina (Tris)\hskip1cm
6,057 g\hskip1cm
(50 mmoles)\\
NaCl\hskip3cm
5,844 g\hskip1cm
(100 mmoles)\\
Agua hasta\hskip2,2cm
1 litro\\
El pH de la solución se ajustó a 7,4 a 37ºC con HCl (10 mmoles\cdotl^{-1})
- 2. Tampón TNP
- Se disuelve polietilenglicol 6000 en tampón TN para dar una concentración de 3 g\cdotl^{-1}
- 3. Solución de S-2222
- Se disuelve un vial de S-2222 (15 mg; Kabi Diagnóstica, Suecia) en 10 ml de agua para dar una concentración de 1,5 mg\cdotml^{-1} (2 mmoles\cdotl^{-1}).
- 4. Solución de Xa
- Se disuelve Bovin Factor Xa Human (71 nKat\cdotvial^{-1}, Kabi Diagnostica) en 10 ml de tampón TNP y después se diluye adicionalmente con 30 ml de tampón TNP para dar una concentración de 1,77 nKat\cdotml^{-1}. La dilución debe estar recién preparada.
- *-Todos los
ingredientes utilizados son de calidad analítica
\\
- Para las soluciones acuosas se utiliza agua ultrapura (calidad Milli-Q).
Los compuestos de ensayo y de referencia se
disuelven en agua Milli-Q para dar concentraciones
de partida de 10^{-2} moles\cdotl^{-1}. Cada concentración es
diluida por etapas con el vehículo para dar concentraciones de
10^{-3}, 10^{-4} y 10^{-5} moles\cdotl^{-1}. Las
diluciones, incluyendo la solución de partida se utilizan en el
análisis (concentraciones finales en la mezcla de reacción:
3\cdot10^{-3}; 10^{-3}; 3\cdot10^{-4}; 10^{-4};
3\cdot10^{-5}; 10^{-5}; 3\cdot10^{-6} y 10^{-6}
moles\cdotl^{-1}, respectivamente).
\newpage
A la temperatura ambiente se pipetean
alternativamente 0,075 ml y 0,025 ml de soluciones de compuesto de
ensayo o compuesto de referencia o vehículo en pocillos de una
placa de microtitulación y estas soluciones de diluyen con 0,115 ml
y 0,0165 ml de tampón TNP, respectivamente.
Se añade una alícuota de 0,030 ml de solución de
S-2222 a cada pocillo y la placa se
pre-calienta y se pre-incuba con
sacudimiento en una incubadora (Amersham) durante 10 minutos a 37ºC.
Tras la pre-incubación la hidrólisis de
S-2222 se inicia mediante la adición de 0,030 ml de
solución de trombina a cada pocillo. La placa se incuba (con
sacudimiento durante 30 segundos) a 37ºC. Empezando al cabo de 1
minuto de incubación, se mide la absorbancia de cada muestra a 405
nm cada 2 minutos durante un período de 90 minutos utilizando un
lector de placa de microtitulación cinético (Twinreader plus, Flow
Laboratories).
Todos los datos se recogen en un ordenador
personal IBM utilizando LOTUS-MEASURE.
Para cada concentración de compuesto (expresada
en moles\cdotl^{-1} de mezcla de reacción) y para el blanco la
absorbancia se traza versus el tiempo de reacción en minutos.
Para cada concentración final se calculó la
absorbancia máxima a partir de la gráfica del análisis. El valor
CI_{50} (concentración final, expresada en
\mumol\cdotl^{-1}, que ocasionaba una inhibición del 50% de la
absorbancia máxima del blanco) fue calculado utilizando el análisis
de transformación logit según Hafner y col.
(Arzneim-Forsch/Drug Res. 1.977; 27(II):
1871-3).
Actividad anti-factor
Xa
| Compuesto (ejemplo) | CI_{50} (\mug\cdotl^{-1}) |
| 32(1) | 22 |
| 38(2) | 12 |
| 56(3) | 12 |
| 80(4) | < 2 |
(Ph = fenilo; Me = metilo; Ac = acetilo; Im =
tricloroacetimidilo; Bn = bencilo; Bz = benzoilo; Mbn =
4-metoxibencilo; Lev = levulinoílo)
(Esquema 1 pasa a página
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ESQUEMA
1
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2
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3
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5
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7
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8
Claims (8)
1. Un derivado carbohidratado que tiene la
fórmula I
donde R^{1} es alcoxi
C_{1}-C_{4};
R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente
alcoxi C_{1}-C_{4} o OSO_{3}^{-};
el número total de grupos sulfato es de 4, 5 ó
6;
y las líneas retorcidas representan enlaces o
bien por encima o bien por debajo del plano del anillo de seis
miembros al cual están anclados;
o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
2. El derivado carbohidratado de la
reivindicación 1, donde la unidad D de la fórmula I tiene la
estructura
R^{1} es metoxi, y R^{2}, R^{3} y R^{4}
son independientemente metoxi o OSO_{3}^{-}.
3. El derivado carbohidratado de la
reivindicación 2, donde R^{2} es metoxi.
4. El derivado carbohidratado de la
reivindicación 3, donde R^{3} es metoxi.
5. El derivado carbohidratado de la
reivindicación 4, donde R^{4} es metoxi.
6. Una composición farmacéutica que comprende el
derivado carbohidratado de una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 5 y coadyuvantes farmacéuticamente adecuados.
7. El derivado carbohidratado de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en terapia.
8. El uso del derivado carbohidratado de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la fabricación de un
medicamento para tratar o prevenir la trombosis o inhibir la
proliferación de las células de la musculatura lisa.
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