CZ376198A3

CZ376198A3 - Deriváty uhlohydrátů a farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ376198A3
Application number: CZ983761A
Authority: CZ
Inventors: Boeckel Constant Adriaan Anton Van; Maurice Petitou; Philippe Duchaussoy; Johannes Egbertus Maria Basten; Cornelia Maria Dreef-Tromp
Original assignee: Akzo Nobel N. V.; Sanofi
Priority date: 1997-11-19
Filing date: 1998-11-19
Publication date: 1999-06-16
Also published as: NO310723B1; NO985365D0; ES2198081T3; SK7362000A3; NO985365L; KR100518497B1; KR19990045312A; BR9804699A; AU9324298A; SK284134B6; CZ293639B6; ATE239030T1; ID21287A; BRPI9804699B1; EE04348B1; EP1032579B1; EE200000301A; HUP9802663A2; RU2210573C2; IL126893A0

Description

Deriváty uhlohydrátů a farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká uhlohydrátových derivátů, farmaceutických prostředků s jejich obsahem a použití uvedených uhlohydrátových derivátů pro výrobu farmaceutického prostředku.

Dosavadní stav techniky

Heparin je běžně používaný antikoagulant z biologických zdrojů, jako je střevní sliznice. V přítomnosti heparinu se značně urychlí 10 inaktivace trombinu antitrombinem III (AT-III), přičemž při tvorbě komplexu probíhají změny v konformaci heparinu i AT-III. Trombin řídí poslední krok v kaskádě koagulace krve. Primární funkcí trombinu je štěpení fibrinogenu za vytvoření fibrinových monomerů, které zesítěním vytvářejí nerozpustný gel, fibrinovou sraženinu.

is Strukturní změny heparinu, které jsou nutné pro interakce s ATIII, byly mnohokrát zkoumány. V heparinovém polymeru jsou části, které mají pouze nízkou afinitu pro AT-III, zatímco bylo zjištěno, že jiné části jsou pro vazbu na AT-III důležitější. Studie fragmentovaného heparinu nakonec vedly k identifikaci pentasacharidového fragmentu,

2o kterému je připisována minimální struktura s vysokou afinitou, která se váže na AT-III (viz např. Physiological Reviews, 71 (2), 488/9, 1991). V tomto fragmentu s vysokou afinitou je přítomno osm sulfátových skupin. Bylo zjištěno, že pro vazbu na AT-III jsou nezbytné čtyři tyto sulfátové skupiny (Advances in Carbohydrate Chemistry and

2s Biochemistry; díl. 43; ed. R. S. Tipson, D. Horton; vyd. Harcourt Brace Jovanovich; B. Času (str. 51-127), odst. 6), zatímco další čtyři sulfátové skupiny přispívají k vyšší afinitě. Tato zjištění byla potvrzena t

u syntetických analogů pentasacharidového fragmentu (viz např. Angew. Chem. 32 (12), 1671-1818, 1993).

Identifikace pentasacharidového fragmentu s vysokou afinitou inspirovala k přípravě jeho syntetických analogů. Bylo zjištěno, že silné a selektivní inhibitory anti-Xa jsou malé syntetické uhlohydrátové molekuly glykosaminoglykanového typu (viz například evropský patent 84,999. Pozdější patenty/patentové přihlášky ukázaly, že mnoho variant těchto molekul má podobné a ještě vyšší aktivity a dále zlepšené farmakologické vlastnosti, jako je tomu u uhlohydrátových ío derivátů příbuzných s glykosylaminoglykanem popisovaných v EP 529,715 a EP 454,220. Tyto uhlohydrátové deriváty nemají charakteristické funkční skupiny glykosaminoglykanů: volné hydroxylové skupiny, N-sulfátové a N-acetylové skupiny. Navíc všechny pentasacharidy popisované v naposledy uváděných is patentových přihláškách nesou alespoň sedm sulfátových skupin. V oblasti oligosacharidových derivátů s antitrombotickými účinky se tedy obecně předpokládalo, že pro získání klinicky přijatelné míry antitrombotické aktivity je zapotřebí alespoň sedm sulfátových skupin v pentasacharidových sloučeninách.

Podstata vynálezu

Neočekávaně však byla nyní nalezena třída uhlohydrátových derivátů příbuzných s glykosaminoglykany, která má pouze čtyři až šest sulfátových skupin a stále má výraznou klinicky účinnou z» antitrombotickou aktivitu. Navíc tyto sloučeniny podle vynálezu mají méně vedlejších účinků. Je například sníženo riziko spojené s krvácením a nízký obsah sulfátů ve sloučeninách nevyvolává heparinem indukovanou trombocytopenii (HIT) [HIT je vážný vedlejší účinek, který může být příčinou smrti pacienta]. Navíc mají sloučeniny

3o podle vynálezu biologický poločas, který dovoluje jednodenní léčení.

Jednodenní léčení může být považováno za výhodnější než například týdenní léčení, neboť umožňuje rychlé přizpůsobení, jestliže to vyžaduje stav pacienta. Rovněž systém podávání v nemocnicích je snadnější při použití jednodenního ošetření, protože není pro léčbu s pacientů potřeba komplexního dávkovacího schématu.

Sloučeniny podle vynálezu tedy mají neočekávaný a jemně vyvážený farmakologický profil.

kde R¹ je (1-4C)alkoxy; R², R³ a R⁴ jsou nezávisle (1-4C)aikoxy nebo OSO₃'; celkový počet sulfátových skupin je 4, 5 nebo 6; a skládané čáry znamenají vazby buď nad nebo pod rovinu 6-členného kruhu, ke kterému jsou připojeny; nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro léčení a prevenci trombinem podmíněných a s trombinem spojených onemocnění. Sem patří řada trombotických a protrombotických stavů, ve kterých je aktivována koagulační kaskáda, které zahrnují bez omezení trombózu hlubokých žil, plicní embólii, tromboflebitidu, uzávěru tepen z trombózy nebo embólie, reokluzi tepen v průběhu nebo po angioplastice nebo trombolýze, restenózu po poranění tepen

2s nebo invázívních kard i o logických postupech, pooperační žilní trombózu nebo embólii, akutní nebo chronickou aterosklerózu, mrtvici, infarkt myokardu, rakovinu a metastázy a neurodegenerativní onemocnění. Deriváty uhlohydrátů podle vynálezu mohou být také použity jako inhibitory proliferace buněk hladkého svalstva a pro □o léčení angiogeneze, rakoviny a retrovirálních infekcí jako je HIV.

«· · * ·

-4«· · ·»··

Sloučeniny podle vynálezu mohou být dále použity jako antikoagulanty a povlaky antikoagulantú v mimotělních krevních obězích, nutných při dialýze a chirurgii.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být použity také jako 5 antikoagulanty in vitro nebo ex vivo.

Výhodné uhlohydrátové deriváty podle vynálezu mají vzorec I, kde jednotka O má strukturu

R¹ je methoxy; a R², R³ a R⁴ jsou nezávisle methoxy nebo OSO₃'.

Výhodnější uhlohydrátové deriváty jsou deriváty, kde skupina R²is je methoxy. Ve zvláště výhodných uhlohydrátových derivátech skupina R³ je methoxy. Nejvýhodnějším uhlohydrátovým derivátem je derivát, ve kterém skupina R⁴ je methoxy.

Ve skupině (1-4C)alkoxy je (1-4C)alkylová skupina větvená nebo přímá alkylová skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, jako je methyl,

2D ethyl, izopropyl, t-butyl apod. Nejvýhodnější alkylovou skupinou je methyl.

Protiionty (counter-ions) kompenzující nabité skupiny jsou farmaceuticky přijatelné protiionty jako vodík nebo výhodněji ionty alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin jako sodík, vápník nebo

2s hořčík.

Uhlohydrátové deriváty podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny známými popsanými metodami, které se používají při syntéze oligosacharidů. V tomto ohledu je třeba zvláště jmenovat výše uvedený evropský patent EP 529,715. Vhodný způsob přípravy

- 5 uhlohydrátových derivátů vzorce I je charakterizován postupem, při kterém se vážou chráněné monosacharidy s rozdílnými strukturami za vzniku chráněných disacharidů a potom se:

(a) chráněné disacharidy jednoho typu vážou na chráněné disacharidy dalšího typu za vzniku chráněných tetrasacharidů, přičemž tyto tetrasacharidy se vážou na chráněný monosacharid za poskytnutí chráněných pentasacharidů;

(b) chráněné monosacharidy se vážou na chráněné disacharidy za poskytnutí chráněných trisacharidů, které se dále vážou na chráněné disacharidy za poskytnutí chráněných pentasacharidů;

a potom se odštěpí ochranné skupiny a sulf a tují se volné hydroxylové skupiny a získaná sloučenina se popřípadě převede na farmaceuticky přijatelnou sůl.

Monosacharidy jsou D-glukóza, D-mannóza, L-idóza, kyselina is D-glukuronová nebo L-iduronová, vhodně funkcionalizované požadovanými alkylovými skupinami nebo dočasnými ochrannými skupinami.

Vhodné ochranné skupiny jsou v oboru dobře známy. Vhodnými ochrannými skupinami jsou například benzyl a acetyl pro hydroxylové

2o skupiny a benzyl pro karboxylátové skupiny a uronové kyseliny. Se stejným úspěchem mohou být použity jiné ochranné skupiny jako je benzoyl, levulinyl, alkoxyfenyl, chloracetyl, trityl apod. Vazba sacharidu se provádí v oboru známým způsobem, např. odstraněním ochranné skupiny v poloze 1 glykosylového donoru a/nebo aktivace této polohy (výrobou např. derivátu jako je bromid, pentenyl, fluorid, thioglykosid nebo trichtoracetimid) a vazba aktivovaného glykosylového donoru s případně chráněným akceptorem glykosylu.

Pro léčení žilní trombózy nebo pro inhibici proliferace buněk hladkého svalstva mohou být sloučeniny podle vynálezu podávány enterálně nebo parenterálně, u člověka s výhodou v denní dávce φ φφ φ φφφ·· φφ «· φ φ φ φφφφ φ • φ · φφ φφφ φφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφ

-60,001 - 10 mg na kg tělesné hmotnosti. Ve směsi s farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami, např. jak se popisuje ve standardní referenční příručce Gennaro a další, Remingtonů Pharmaceutical Sciences (18th ed, Mack Publishing Company, 1990, viz zvláště část 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture), Mohou být sloučeniny lisovány do pevných dávkovačích jednotek, jako jsou pilulky a tablety nebo mohou být zpracovány do kapslí nebo čípků. Pomocí farmaceuticky vhodných kapalin mohou být sloučeniny také podávány jako injekční preparáty ve formě roztoku, suspenze, emulze io nebo jako sprej, například nosní sprej.

Pro výrobu dávkovačích jednotek jako jsou např. tablety se předpokládá použití běžných pomocných látek jako jsou plniva, barviva, polymerní pojivá apod. Obecně může být použita jakákoliv farmaceuticky přijatelná pomocná látka, která neinterferuje s funkcí aktivních sloučenin.

Vhodnými nosiči, které mohou být podávány v těchto prostředcích, jsou laktóza, škrob, deriváty celulózy apod. nebo jejich směsi použité ve vhodných množstvích.

Vynález je dále ilustrován následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Výroba příkladu I (sloučenina 321 Syntéza disacharidu GH 16 (schéma 1+2)

Sloučenina 2

Sloučenina 1 (60 g; komerčně dostupná) byla rozpuštěna v N,Ndimethylformamidu (858 mi) spolu s benzylbromidem (50,5 ml). Po ochlazení na +10 °C byl po kapkách přidán 20 % vodný roztok hydroxidu sodného. Po míchání 1 hod byla teplota zvýšena na 20 °C a směs byla míchána dalších 20 hod. Roztok byl potom vlit do směsi «44 * · « 4 44 . « 44 * 4 · 4444 4 • 44 4 4 444 ··· 44 444 4444 44 *4

- 7 ledové vody a toluenu a extrahován. Organická vrstva byla koncentrována a surový produkt čištěn krystalizací za poskytnutí

30,0 g sloučeniny 2.

TLC: Rf = 0,60, toluen/ethylacetát: 7/3, obj.

Sloučenina 3

Sloučenina 2 (26,4 g) byla rozpuštěna v N.N-dimethylformamidu (211 ml) a ochlazena v ledu. V atmosféře dusíku byl přidán hydrid sodný (2,5 g). Potom byl po kapkách přidán 4-methoxybenzylchlorid io (13,3 g) a směs byla míchána 1 hod při pokojové teplotě. Směs byía potom zředěna ethylacetátem, promyta vodou (2x) a koncentrována za získání 40,7 g surové sloučeniny 3.

TLC: Rf = 0,80, toluen/ethylacetát: 7/3, obj.

Sloučenina 4

Sloučenina 3 (34,9 g) byla rozpuštěna v 60 % vodné kyselině octové a míchána 4 hod při 60 °C. Směs byla zředěna toluenem a koncentrována. Čištění chromatografií na silikagelu poskytlo 26,4 g sloučeniny 4.

TLC: Rf 0,07, toluen/ethyl acetát: 7/3, obj.

Sloučenina 5

Sloučenina 4 (26,4 g) byla rozpuštěna v dichlormethanu (263 ml) v atmosféře dusíku. Při pokojové teplotě byly přidány trimethyloxonium tetrafluoroborát (11,6g) a 2,6-di-t-butyl-4methylpyridin (17,4 g). Po 4 hod byla směs vlita do ledové vody a extrahována dichlormethanem. Organická vrstva byla promyta hydrogenuhličitanem sodným a odpařena. Čištění surového produktu chromatografií na silikagelu poskytlo 18,5 g sloučeniny 5.

·* · · « * · · * · • « · · · • 9· ·· ·······

-8• · ♦ · • 9

9« «

TLC: Rf 0,25, toluen/ethyl acetát: 7/3, obj.

Sloučenina 7

Sloučenina 6 (3-methyl-1,2,4,6-tetraacetylidóza) (48,4 g) byla rozpuštěna v toluenu (175 ml). V atmosféře dusíku byly přidány ethanthiol (20 ml) a diethyletherát fluoridu boritého (1M v toluenu; 134 mt). Po míchání 1 hod byl přidán vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (400 ml) a směs byla míchána další hodinu. Směs byla potom vlita do ethylacetátu. Organická vrstva byla dvakrát promyta vodou a io koncentrována. Čištění chromatografií na-silikagelu poskytlo 29,6 g sloučeniny 7.

TLC: RF = 0,45, toluen/ethylacetát: 6/4, obj.

Sloučenina 8

Sloučenina 5 (17,5 g) a sloučenina 7 (28,2 g) byly rozpuštěny v toluenu (525 ml) v atmosféře dusíku. Po přidání práškových molekulárních sít (4 A) byla reakční směs ochlazena na -20 °C. Po kapkách byl za trvalého probublávání dusíku přidán čerstvě připravený 0,1M roztok N-jodsukcinimidu (17,4 g) a kyseliny

2o trifluormethansulfonové (1,38 ml) ve směsi dioxan/dichlormethan (1/1 obj.). Po 10 min byla červená reakční směs zfiltrována a promyta vodným roztokem thiosíranu sodného a vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Organická vrstva byla koncentrována ve vakuu a bylo izolováno 30,0 g sloučeniny 8.

TLC: Rf = 0,45, dichlormethan/ethylacetát: 8/3, obj.

Sloučenina 9

Sloučenina 8 (30,0 g) byla rozpuštěna v 460 ml směsi methanol/dioxan (1/1, obj.) a pro zmýdelnění byl přidán butanoát «9 9 9 · 9 «

9 • 44 ··

-944 · 9 9 · 9 9 4 9

4· *49 4 · *

4 9 4 9

444 44*9 94 94 draselný. Po 15 min byla směs neutralizována iontoměničem Dowex 50WX8H*-forma a koncentrována ve vakuu. Čištění za použití chromatografie na silikagelu poskytlo 17,4 g sloučeniny 9.

TLC: Rf = 0,25, dichlormethan/methanol: 95/5, obj.

s

Sloučenina 10

V atmosféře dusíku byla rozpuštěna sloučenina 9 (17,4g) v N,Ndimethylformamidu (77 ml). Byl přidán 1,2-dimethoxypropan (26 ml) a kyselina ρ-toluensulfonová a směs byla míchána 30 min. Zředění , io směsi vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a extrakce ethylacetátem poskytla po odpaření rozpouštědla 19,7 g sloučeniny to.

TLC: Rf = 0,45, dichlormethan/methanol: 95/5, obj.

Sloučenina 11

Sloučenina 10 (18,5 g) byla rozpuštěna v N,Ndimethylformamidu (24,4 ml) a ochlazena na 0 °C. V atmosféře dusíku byly přidány hydrid sodný (1,47 g; 60 % disperze v oleji) a jodmethan (2,36 mi). Po 1 hod byl neutralizován nadbytek hydridu sodného, směs byla extrahována dichlormethanem a koncentrována za poskytnutí 20,0 g sloučeniny 11.

TLC: Rf = 0,85, dichlormethan/methanol: 95/5, obj.

Sloučenina 12

Sloučenina 11 (18,4 g) byla rozpuštěna v dichlormethanu (838 ml) a vodě (168 ml). Byl přidán 2,3-dichIor-5,6-dikyano-1,4benzochinon (7,1 g) a směs byla míchána 18 hod při 4 °C. Směs byla vlita do vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahována ··· ···· » · · • ·· • · · • · ··

- 10dichlormethanem. Koncentrace organické vrstvy poskytla 12,7 g sloučeniny 12.

TLC: Rf = 0,40, dichlormethan/methanol: 95/5, obj.

Sloučenina 13

Sloučenina 12 byla převedena na v názvu uvedenou sloučeninu stejným způsobem jako byl popsán pro výrobu sloučeniny 11.

TLC; Rf = 0,48, toluen/ethyl acetát: 1/1, obj.

¹⁰ Sloučenina 14

Po rozpuštění sloučeniny 13 (2,5 g) v kyselině octové (14,6 ml) a vodě (6,1 ml) byla směs míchána pres noc při pokojové teplotě. Společné odpaření s toluenem a čištění chromatografií na silikagelu poskytlo 1,9 g sloučeniny 14.

TLC: Rf = 0,31, ethylacetátu, obj.

Sloučenina 15

K roztoku sloučeniny 14 (1,7 g) v dichlormethanu (9 ml) byl přidán 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (5 mg), nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného (5,8 ml), bromid draselný (32 mg) a tetrabutylamoniumchlorid (42 mg). Směs byla ochlazena na 0 °C a v průběhu 15 min byl přidáván nasycený roztok chloridu sodného (6,5 ml) a nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného (3,2 ml) a roztok chlornanu sodného (1,3M; 7,3 ml). Po 1 hod míchání byla směs zředěna vodou a extrahována (třikrát) dichlormethanem. Organická vrstva byla promyta roztokem soli, sušena nad síranem hořečnatým, filtrována a odpařena dosucha za poskytnutí 1,74 g surové sloučeniny

15.

« · ·*· ··♦·

-11 TLC: Rf = 0,14, dichlormethan/methanol: 9/1, obj.

Methyl O-(benzvt 2.3-di-0-methvl-a-L-Ídopyranosvluronát)-f1 ->4)-2-Obenzyl-3,6-di-O-methvl-ct-D-glukopyranosid 16.

s K roztoku 1,74 g sloučeniny 15 v Ν,Ν-dimethylformamidu bylo v atmosféře dusíku přidáno 1,68 ml benzylbromidu a 1,1 g hydrogenuhličitanu draselného. Po míchání roztoku 90 min byla přidána voda a směs byla extrahována ethylacetátem. Po odpaření organické vrstvy a čištění chromatografií na silikagelu bylo izolováno io 1,64 g sloučeniny 16.

TLC: Rf = 0,50, toluen/ethyl acetát: 1/1, obj.

Syntéza disacharidu EF 25 (schéma 2+3)

Sloučenina 17

Sloučenina 12 (10,5 g) byla rozpuštěna v suchém Ν,Νdimethylformamidu ( 178 ml), ochlazena na 0 ”C v atmosféře dusíku. Byl přidán hydrid sodný (1,91 g; 60 % disperze v oleji), po kterém byl po kapkách přidán benzylbromid (3,3 ml). Po 30 min byla reakce u konce a nadbytek hydridu sodného byl neutralizován. Byla přidána

2o voda a směs byla extrahována dvakrát ethylacetátem. Odpaření rozpouštědla poskytlo 13,6 g sloučeniny 17.

TLC: Rf = 0,50, toluen/ethylacetát: 1/1, obj.

Sloučenina 18

Sloučenina 17 byla převedena na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými postupy jako byly popsány při výrobě sloučeniny 14.

TLC: Rf = 0,68, dichlormethan/methanol: 9/1, obj.

• ·'

-12• · · « · · 4 • · « « · · « · · «·« 4 * • · · · · ·«· ·<·« ·· ♦·

Sloučenina 19

Sloučenina 18 byla převedena na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými postupy jak bylo popsáno při výrobě sloučeniny 15.

TLC; Rf = 0,14, dichlormethan/methanol; 9/1, obj.

s

Sloučenina 20

Sloučenina 19 byla převedena na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými postupy jak bylo popsáno při výrobě sloučeniny 16.

TLC: Rf = 0,38, dichlormethan/methanol; 85/15, obj............

Sloučenina 21

Sloučenina 20 (9,9 g) byla rozpuštěna v 300 ml methanolu (suchého) a vařena pod zpětným chladičem v atmosféře dusíku. Byl přidán 1M roztok methoxidu sodného (65,2 ml) po kapkách a směs byla míchána 3 hod. Směs byla potom ochlazena na pokojovou teplotu a byl přidán 1N hydroxid sodný (22,2 ml) a míchání probíhalo dalších 90 min. Neutralizace iontoměničem Dowex 50WXBH* forma a odpaření rozpouštědel poskytlo surový zbytek.

V atmosféře dusíku byl přidán Ν,Ν-dimethylformamid (192 ml) a

2o prášková molekulová síta (4 A). Potom byl přidán hydrogenuhličitan draselný (3,2 g) a benzylbromid (4,8 ml) a směs byla míchána 5 hod, potom byl přidán ethylacetát a směs byla promyta vodou. Odpaření rozpouštědla a čištění surového produktu chromatografií na silikagelu poskytlo 6,19 g sloučeniny 21 a 1,88 g zpětně získané sloučeniny 20.

TLC: Rf = 0,74, dichlormethan/methanol: 9/1, obj.

Sloučenina 22

Sloučenina 21_ (6,2 g) byla rozpuštěna v 40 mi dioxanu. Byly přidány kyselina levulinová (2,1 g), dicyklohexylkarbodiimid (3,75 g) a

4-dimethylaminopyridin (0,2 g) a směs byla míchána 2 hod s v atmosféře dusíku. Byl přidán ether (95 ml) a sraženina byla odfiltrována. Organická vrstva a byla promyta vodným hydrogensíranem draselným a koncentrována. Krystalizace ze směsi diethylether/heptan poskytla 6,2 g sloučeniny 22.

TLC: Rf = 0,26, dichiormethan/aceton : 95/5, obj.

Sloučenina 23

Sloučenina 22 (6,1 g) byla rozpuštěna v anhydridu kyseliny octové (256 ml) v atmosféře dusíku a ochlazena na -20 °C. Po kapkách byla v průběhu 30 min přidána směs kyseliny sírové (4,9 ml) v acetanhydridu (49 ml). Po 60 min byl přidáván octan sodný až do dosažení neutrálního pH. Byly přidány ethylacetát a voda a organická vrstva byla zakoncentrována. Čištění chromatografií na silikagelu poskytlo 4,2 g sloučeniny 23.

TLC: Rf = 0,63, dichiormethan/aceton : 9/1, obj.

Sloučenina 24

Sloučenina 23 (4,2 g) byla rozpuštěna v tetrahydrofuranu (42 ml) a byl přidán piperidin (4,1 ml). Směs byla míchána přes noc při pokojové teplotě. Byl přidán ethylacetát a směs byla promyta 0,5N kyselinou chlorovodíkovou. Organická vrstva byla koncentrována a zbytek čištěn chromatografií na silikagelu za získání 3,2 g sloučeniny 24.

TLC: Rf = 0,33, dichlormethan/ethyl aeetát: 1/1, obj.

« · · · · ··«···· t * · · · · φ·· ·· *·· **» >· *·

-14 0-(benzyl-2,3-di-0-methvl-4-0-levulinovl-3-D-glukopvranosvluronát)(1->4l-3-O-acetvl-2-O-benzvl-6-O-nnethvl-D-glukopvranosvl trichloracetimidát 25

Sloučenina 24 (1,59 g) byla rozpuštěna v dichlormethanu v atmosféře dusíku. Byl přidán trichioracetonitril (1,1 ml) a uhličitan česný (72 mg) a směs byla míchána 1 hod. Uhličitan česný byl odfiltrován a filtrát zakoncentrován. Čištění chromatografií na silikagelu poskytlo 1,57 g sloučeniny 25.

TLC: Rf = 0,60, toluen/ethyl acetát: 3Z7, obj.

Syntéza tetrasacharidu EFGK 27 (schéma 41

Sloučenina 26

Směs sloučeniny 16 (0,530 mg) a sloučeniny 25 (0,598 mg) byla sušena společným odpařením se suchým toluenem a rozpuštěna v 8,2 ml suchého dichlormethanu. Byla přidána prášková molekulární síta (4 A) a směs byla ochlazena na -20 °C v atmosféře dusíku a míchána 30 min. K výsledné suspenzi byl přidán trimethylsilyl trifluormethansulfonát (15 mol % vzhledem ke sloučenině 25). Po 10 min míchání byl přidán hydrogenuhličitan sodný, směs byla zfiltrována a byla přidána voda a dichlormethan. Organická vrstva byla potom extrahována, koncentrována a surový produkt čištěn chromatografií na silikagelu, za poskytnutí 0,62 g sloučeniny 26.

TLC; Rf = 0,47, toluen/ethylacetát: 3/7, obj.

-15Β

Β

Β »»* • Β » Β Β

Β ·

ΒΒ

Β » Β «

ΒΒΒ»

Β

ΒΒ

Β Β

ΒΒ

Methyl-O-(benzvl 2,4-di-O-dimethyl-B-D-glukoDvranosvlurQnát)-(1->4)O-(3-O-acetvl-2-O-benzyl-6-Q-methyl-a-D-glukopyranosyl)-(1->4)-O(benzyl 2.3-di-0-methyl-ot-L-idopyranosvluronát)-f1->4)-2-0-benzvl3.6-di-O-methvl-q-D-glukopvranosid 27

K roztoku sloučeniny 26 (0,58 g) v pyridinu byla přidána směs

2,76 ml kyseliny octové, 0,32 ml hydrátu hydrazinu v 2,1 ml pyridinu. Po 9 min byla přidána voda a dichlormethan a organická vrstva byla promyta 1N kyselinou chlorovodíkovou a vodným hydrogenuhličitanem sodným. Čištění chromatografií na silikagelu poskytlo 0,27 g w sloučeniny 27.

TLC: Rf “ 0,45, toluen/ethylacetát: 3/7, obj.

Syntéza pentasacharidu DEFGH 32 (schéma 4+51 PŘÍKLAD I

Sloučenina 29

Směs sloučeniny 27 (150 mg) a 76 mg sloučeniny 28 (Ref:

Bioorganic & Medicinal Chemistry, díl 2, no 11, 1267 - 1280, 1994) byla sušena společným odpařením se suchým toluenem a rozpuštěna v 7,5 ml suchého dichlormethanu. V atmosféře dusíku byla přidána prášková molekulární síta (4 A) a směs ochlazena na -20 °C. Po ao míchání 20 min byl přidán trimethylsilyl trifluormethansulfonát (15 mol % vzhledem ke sloučenině 28). Po 30 min míchání byl přidán vodný hydrogenuhličitan sodný. Směs byla zfiltrována a organická vrstva byla promyta vodou. Koncentrace rozpouštědla poskytla surový produkt, který byl čištěn chromatografií na silikagelu za získání 136 mg sloučeniny 29.

TLC: Rf = 0,33, toluen/ethylacetát: 4/6, obj.

Μ * · 9 « « • ·0

-160 0* • 00 00

Sloučenina 30

Sloučenina 29 byla zředěna ve směsi t-butanoiu (8 ml) a vody (1 ml). K roztoku bylo přidáno 122 mg 10 % paladia na aktivním uhlí a směs byla míchána přes noc v atmosféře vodíku. Paladium na aktivním uhlí bylo odfiltrováno a roztok byl koncentrován za získání

84,5 mg sloučeniny 30.

TLC: Rf = 0,49, ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda : 13/7/1,6/4, obj.

Sloučenina 31 ··· ...........

Sloučenina 30 (84,5 mg) byla rozpuštěna v 5 ml 0,3N hydroxidu sodného a míchána 3 hod. Reakční směs byla potom neutralizována 0,5N kyselinou chlorovodíkovou a odpařena. Zbytek byl odsolen na koloně Sephadex G25 s eluentem voda/acetonitril : 9/1 (obj.) a protlačen krátkou kolonou iontoměniče Dowex 50WXBH*-forma. Po odpaření bylo izolováno 75,6 mg sloučeniny 31.

TLC: Rf = 0,43, ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda : 8/7/1,6/4, obj.

Methyl 0-(2,3,4-trí-0-methvl-6-0-sulfo-ct-D-glukopyranosvD-(1->4)-0(2.3-di-0-methvl-B-D-glukopvranosvluronová kyselina)-(1->4)-0-(6-0methyl 2,3-di-0-sulfo-a-D-qlukopvranosvl)-(1->4)-Q-(2,3-dÍ-0-methvla-L-idopvranosyluronová)-(1->4)-3,6-di-0-methvl-2-0-sulfo-ct-Dqlukopyranosid, hexasodná sůl 32

Sloučenina 31 (30,6 mg) byla rozpuštěna v 2,15 ml N,Ndimethylformamidu (destilovaný; suchý) a v atmosféře dusíku byl přidán komplex triethylamin oxid sírový (120 mg). Směs byla míchána přes noc při 55 °C. Byla přidána suspenze hydrogenuhličitanu sodného ve vodě. Směs byla míchána 1 hod při pokojové teplotě a

rozpouštědlo bylo odpařeno. Zbytek byl rozpuštěn ve vodě (2 ml) a odsolen na koloně Sephadex G25 s eluentem voda/acetonitril : 9/1 (obj.). Izolovaný produkt byl eluován na koloně Dowex 50WX8Na⁺vodou za získání 42,5 mg pentasacharidové sloučeniny 32.

[<x]²⁰d =+56,8 (c = 1, H₂O)

Anomerní chemické posuny protonů: 5,32, 5,22, 4,97, 4,89 a 4,24 ppm.

¹⁰ Vvroba příkladu II (sloučenina 38)

Syntéza tetrasacharidu EFGH 34 (schéma 4)

Sloučenina 33

Sloučenina 25 a sloučenina 20 byly spojeny za poskytnutí v názvu uvedené sloučeniny stejnými postupy jak bylo popsáno pro přípravu sloučeniny 26.

TLC: Rf = 0,47, toluen/ethylacetát: 3/7, obj.

Methyl-O-fbenzyl 2,4-di-O-dimethvi-B-D-glukopyranosvluronát)-(1-»4)Q-fS-O-acetvI^-O-benzyl-e-O-methyl-ct-D-glukopyranosyD-d-^-O20 (benzyl 2.3-di-0-methyl-ot-L-idopvranosyluronát)-(1->4)-2.3-di-0benzvl-6-Q-methyl-a-D-glukopvranosid 34

Sloučenina 33 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejným postupem jak bylo popsáno pro přípravu sloučeniny 27.

TLC: Rf = 0,39, heptan/ethylacetát: 3/7, obj.

• ·· · • · * * * * · *·♦ · * ····**·♦ ··· ·· ······· ·* ··

-18Svntéza pentasacharidu DEFGH 38 (schéma 4+5) (PŘÍKLAD II)

Sloučenina 35

Sloučenina 34 a sloučenina 28 byly spojeny za poskytnutí v názvu uvedené sloučeniny stejnými způsoby jak bylo popsáno pro přípravu sloučeniny 29.

TLC: Rf = 0,60, toluen/ethylacetát: 3/7, obj.

Sloučenina 36

Sloučenina 35 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými způsoby jak bylo popsáno pro přípravu sloučeniny 30.

TLC: Rf = 0,39, ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda : 13/7/1,6/4, obj.

Sloučenina 37

Sloučenina 36 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými postupy jak bylo popsáno pro přípravu sloučeniny 31.

TLC: Rf = 0,32, ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda : 13/7/1,6/4, obj.

Methyl O-(2.3.4-tri-O-methvl-6-O-sulfo-a-D-glukopvranosyl)-ť1->4)-O(Z^-di-O-methyl-B-D-glukopyranosvluronová kyselina)-(1->4)-0-(6-0methvl-2,3-di-O-sulfo-a-D-qlukopvranosvl)-(1^4)-O-(2,3-di-O-methyla-L-idopyranosyluronová)-(1->4)-6-0-methvl-2,3-di-0-sulfo-<x-Dqlukopyranosid, heptasodná sůl 38

Sloučenina 37 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu s použitím stejných postupů jak bylo popsáno pro přípravu sloučeniny 32.

* ·· · * · · · · · « · · · '* «0« ♦ · ·«··*«

- 19[a]²⁰o =+53,6 (c = 1,H₂0)

Anomerní chemický posun protonů; 5,32, 5,23, 4,99, 4,9 a 4,23 ppm.

Výroba příkladu III (sloučenina 561

Syntéza disacharidu GH 50 (schéma 1+2)

Sloučenina 39

......Sloučenina 2 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu io stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny H.

TLC: Rf = 0,52, díchlormethan/aceton : 98/2 obj.

Sloučenina 40

Sloučenina 39 (32,0 g) byla rozpuštěna v methanolu (538 ml). 15 Byla přidána kyselina p-toluenesulfonová (1,57 g) a směs byla míchána 1,5 hod při pokojové teplotě. Po neutralizaci triethylaminem byla směs koncentrována. Čištění chromatografii na silikagelu poskytlo 11,9 g sloučeniny 40.

TLC: Rf = 0,56, dichlormethan/methanol: 9/1, obj.

2Q

Sloučenina 41

Sloučenina 40 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými postupy jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 5.

TLC: Rf = 0,18, toluen/ethylacetát: 7/3, obj.

Sioučenina 42

Sloučenina 6 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 24.

s Sloučenina 43

Sloučenina 42 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 25.

Sloučenina 44 io Vazebná reakce sloučeniny 43 se sloučeninou 41 byla provedena za stejných podmínek jak bylo popsáno pro sloučeninu 26.

TLC: Rf = 0,28, toluen/ethylacetát: 6/4, obj.

Sloučenina 45

Sloučenina 44 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 9.

TLC: Rf = 0,09, toluen/ethylacetát: 3/7, obj.

Sloučenina 46

Sloučenina 45 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 10.

TLC: Rf = 0,52, ethylacetát

Sloučenina 47

Sloučenina 46 (10,4 g) byla rozpuštěna v pyridinu (suchém) (102 ml) v atmosféře dusíku. Byla přidána směs acetanhydridu (34 ml) a pyridinu (suchého) (102 ml) a 10 mg 4-dimethylaminopyrídinu. Po * ·· · · · « ·· • · ·· Β * · · Β · * ·

Β · · · ♦ · Β · • f· ·♦ ··· ···« ·Β 41 míchání 1 hod při pokojové teplotě byla reakční směs koncentrována a společně odpařena se suchým toluenem za poskytnutí 11,9 g sloučeniny 47.

TLC; Rf = 0,50, toluen/ethylacetát: 1/1, obj.

Sloučenina 48

Po rozpuštění sloučeniny 47 (11,9 g) v methanolu (90 ml), bylo přidáno 180 mg kyseliny p-toluensulfonové a směs byla míchána přes noc při pokojové teplotě. Směs byla zředěna ethylacetátem, promyta io vodou (2 x) a koncentrována. Čištění surového produktu chromatografií na silikagelu poskytlo 6,2 g sloučeniny 48.

TLC: R-0,28, toluen/ethylacetát: 3/7, obj.

Sloučenina 49 is Sloučenina 48 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 15.

TLC: Rf = 0,24, dichlormethan/methanol: 9/1, obj.

Methyl O-(benzvl 2-Q-acetvl-3-Q-methvl-a-L-idopyranosyluronát)20 (1^4)-2-O-benzyl-3,6-di-O-methvl-a-D-qlukopvranQSid 50

Sloučenina 49 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 16.

TLC: Rf = 0,37, dichlormethan/methanol; 9/1, obj.

-22• •ftftft • · · β * ♦ «· • ft · ft ft • « ·· *·

Syntéza tetrasacharidu EFGH 52 (schéma 4)

Sloučenina 51

Sloučenina 25 a sloučenina 50 byly spojeny za poskytnutí v názvu uvedené sloučeniny stejnými způsoby jak bylo popsáno pro s přípravu sloučeniny 26.

TLC: Rf = 0,52, dichlormethan/methanol: 98/2, obj.

Methyl-Ó-(benzvl 2,4-di-0-dimethvl-B-D-glukopyranosvluronát)-(1->4)CH3-O-acetyl-2-O-benzyl-6-O-methyl-g-P-glukopyranosyl)-(1->4)-O· io (benzvl 2-Q-acetyl-3-O-methyl-a-L-idopyranosyluronát)-( 1 ->4)-2-Obenzvl-3.6-di-O-methvl-a-D-glukopyranosid 52

Sloučenina 51 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 27.

TLC: Rf = 0,26, dichlormethan/methanol: 98/2, obj.

Syntéza pentasacharidu DEFGH 56 (schéma 4+5) (PŘÍKLAD III)

Sloučenina 53

Sloučenina 28 a sloučenina 52 byly spojeny za poskytnutí v názvu uvedené sloučeniny stejnými postupy jak bylo popsáno pro přípravu sloučeniny 29.

TLC: Rf = 0,63, dichlormethan/methanol: 98/2, obj.

Sloučenina 54

Sloučenina 53 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu 25 stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 30.

TLC: Rf = 0,51, dichlormethan/methanol: 8/2, obj.

-23• «

• »

Sloučenina 55

Sloučenina 54 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 31..

TLC: Rf = 0,32, ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda : 10/7/1,6/4, obj.

Methyl Q-(2.3,4-tri-0-methYl-6-0-sulfo-cc-D-glukopyranosvB-(1->4)-0(2.3-di-0-methvl-B-D-glukopyranosyluronová kyselina)-(1->4)-0-(6-0methvl-2.3-di-O-sulfo-a-D-qlukopyranosvB-f1 ->4)-0-(3-0-me_thyl-2-0sulfo-a-L-idopvranosvluronová)-(1-»4)-3.6-di-0-methvÍ-2-0-sulfo-a-Dqlukopyranosid, heptasodná sůl 56

Sloučenina 55 byla přeměněna na v názvu uvedenou sloučeninu stejnými způsoby jak bylo popsáno pro výrobu sloučeniny 32.

[a]²⁰D = +50,2 (c = 1,05, H₂O)

Anomerní chemické posuny protonů: 5,32, 5,29 a 4,89 ppm.

Výroba příkladu IV (sloučenina 80)

Syntéza disacharidu EF 66 (schéma 6)

Sloučenina 58

Et₃N (43 ml, 0,3 mol), 4-dimethylaminopyridin (156 mg,

1,3 mmol) a AC2O (23 ml, 0,29 mol) byly přidány k roztoku 57 (36,2 g, 0,128 mol) (Petroni a další, Aust. J. Chem. 1988, 41, 91 - 102) v CH₂CI₂ (360 ml). Po 30 min byla směs postupně promyta 5 % vodným KHSO₄, H₂O, nasycena vodným NaHCO₃, H₂O a sušena (Na₂SO₄). Odpaření poskytlo surovinu 58: TLC, R_f 0,41, 3:1 cyklohexan/EtOAc.

i *· ~ · * · · *·

4* 4« · φ « φφφφ φ ♦·· 4 « ΦΦ·

4·4 .Φ* ΦΦΦ Φφφφ φφ φφ·

-24Sloučenina 59

Ethanolamin (4,9 ml, 80 mmol) byl přidán, při +4 °C, k roztoku surové 58 (11,8 g, 32 mmol) v THF (220 ml). Po 16 h byly v atmosféře s argonu při +4 °C přidány k uvedené směsi trichloracetonitril (65 ml, 644 mmol) a K₂CO₃ (8,3 g, 64,4 mmol). Po 16 h při pokojové teplotě byl roztok filtrován a zakoncentrován. Chromatografie na koloně (4:1 cyklohexan/EtOAc) poskytla 59 v 79 % výtěžku: TLC R_f 0,49, 1:1 cyklohexan/EtOAc.

,10 ............ ; ... .....

Sloučenina 61

Roztok trimethylsilyl trťflátu (0,04M v CH₂CI₂; 96 ml, 3,8 mmol) byl v atmosféře argonu po kapkách přidán k ochlazenému (-20 °C) roztoku donoru imidátu 59 (11,93 g, 25 mmol) a akceptoru 60 (9,2 g,

19,8 mmol) (P. J. Garegg, H. Hultberg, Karbohydr. Res. 1961, 93,

C10) v CH₂CI₂ (190 ml) obsahujícím prášková molekulová síta 4 A.. Po 30 min byl přidán pevný NaHCO₃ a roztok byl zfiitrován, promyt vodou, sušen (Na₂SO₄) a zakoncentrován. Zbytek krystalizovaný v Et₂O poskytl 61 (82 % výtěžek). Teplota tání: 138 °C.

Sloučenina 62

Sodík (373 mg, 0,65 mmol) byl přidán k roztoku sloučeniny 61. (1 g, 1,3 mmol) v 2:1 methanol/CH₂CI₂ (ml). Směs byla míchána 1 h při pokojové teplotě a potom neutralizována pryskyřicí Dowex 50 H+, filtrována a zakoncentrována za získání surové sloučeniny 62.

Sloučenina 63

NaH (40,5 mg, 1,68 mmol) byl po částech přidáván k ochlazenému (0 °C) roztoku surové 62 (950 mg,) a Mel (0,1 ml, 1,55

-25Β « «

Φ · · >· φ φ φ mmol) v DMF (9 ml). Po 2 h při pokojové teplotě byl přidán MeOH a směs byla vlita do H₂O. Produkt byl extrahován EtOAc, promyt H₂O, sušen (Na₂S0₄) a zakoncentrován. Kolonová chromatografie (3:1 cyklohexan/EtOAc) zbytku poskytla čistou 63 (86 % výtěžek z 62):

teplota tání 137 °C (Et₂0).

Sloučenina 64

Roztok 63 (1,16 g, 1,56 mmol) v 1:3 H₂O/MeOH (40 mi) byl zahříván při 80 °C v přítomnosti kyseliny p-toluensulfonové (230 mg, io 1,56 mmol).Po 3 h byla směs neutralizována NaHCO₃ a zakoncentrována. Kolonová chromatografie (3:1 cyklohexan/aceton) zbytku poskytla 64 (89 % výtěžek): TLC R_f 0,28, 2:1.

cyklohexan/aceton.

i5 Methyl O-(benzyl 2.3-di-0-methvl-(3-D-glukopvranosyluronát)-(1-»4)2.3.6- tri-O-benzyl-ct-D-qlukopvranosid 66.

K roztoku 64 (860 mg, 1,3 mmol) v CH₂CI₂ (4 ml) byly přidány

2.2.6.6- tetramethyl-1-piperidinyloxy (2,3 mg), nasycený vodný roztok NaHCO₃ (2,5 ml), KBr (13,5 mg) a tetrabutylamonium chlorid (18 mg).

K uvedenému ochlazenému (0 °C) roztoku byla přidána směs roztoků nasyceného vodného NaCl (2,8 ml), nasyceného vodného NaHC0₃(1,4 ml) a NaOCI (1,3 M, 3,2 ml). Po 1 h byla směs extrahována CH₂CI_2> promyta H₂O, sušena (Na₂SO₄) a koncentrována za získání surové kyseliny 65.

Výše uvedená surová kyselina v DMF byla smísena s BnBr (1,6 ml, 13 mmol) a KHCO₃ (650 mg, 6,5 mmol). Po 16 h byl produkt extrahován ĚtOAc, promyt H₂O, sušen (Na₂SO₄) a koncentrován za získání 66 v 77 % výtěžku.

Η β 9 • ·* • * « · • 9 • 99 9 β »

9999

-269 9 9 9

9 9 · • 99 9 9 9

9 4

9 ·9

Syntéza trisacharidu DEF 70 (schéma 7)

Sloučenina 67

Roztok trimethylsilyl triflátu (0.04M v CH₂CI₂; 1,88 ml, 0,075 mmol) byl v atmosféře argonu po kapkách přidáván k s ochlazenému -20 °C roztoku trichloracetimidátu 6-O-acetyl-2,3,4-tri-Omethyl-D-glukopyranózy 28 (290 mg, 0,711 mmol) (P. Westerduin a další, Bioorg. Med. Chem. 1994, 2, 1267 - 83) a akceptoru 66 (300 mg, 0,4 mmol) v CH₂CI₂ (20 ml) obsahujícím prášková molekulová síta 4 A. Po 30 min byl přidán pevný NaHCO₃ a roztok byl io zfiltrován a zakoncentrován. Kolonová chromatograf ie (3:1 toluen/EtOAc) zbytku poskytla čistou 67 (56 % výtěžek): TLC R_r 0,32,

3:2 toluen/EtOAc.

Sloučenina 68 is K roztoku 67 (201 mg, 0,20 mmol) v acetanhydridu (7,6 ml) při

-20 °C byla přidána směs koncentrované kyseliny sírové v acetanhydridu (1,5 ml, 0,1:1 obj.). Po míchání 1 h byl přidán octan sodný (780 mg). Směs byla zředěna EtOAc, promyta H₂O, sušena (Na₂SO₄) a koncentrována za získání po chromatografií na koloně (1:1 toluen/EtOAc), látky 68 (82 % výtěžek): TLC R, 0,32, 1:1 toluen/EtOAc.

Sloučenina 69

Benzylamín (0,58 ml, 5,26 mmol) byl přidán k roztoku 68 25 (125,4 mg) v THF (5 ml). Po 7 h při pokojové teplotě byl roztok promyt

1M vodným HCI, H₂O, sušen a zakoncentrován. Kolonová chromatografie (3:2 toluen/EtOAc) poskytla čistou 69 (75 % výtěžek): TLC R_f 0,33, 2:3 toluen/EtOAc. ’ ' '

4 4 4 4 · 4 4 4 4 4

4 4 4 • ·

4> 4

-η O-(6-O-acetvl-2.3.4-tri-O-methvl-a-D-glukopyranosvl)-(1->4)-O-(benzvl

2.3-di-0-methvl-B-D-glukopvranosvluronát)-f1->4)-3,6-di-0-acetyl-2O-benzyl-D-glukopyranosvl trichloracetimidát 70.

Trichloracetonitril (69 μΙ, 0,675 mmol) a uhličitan česný (66 mg, 5 0,202 mmol), byly v atmosféře argonu přidány k roztoku 69 (89,2 mg,

0112 mmol) v CH2CI2 (2 ml). Po 2 h byl roztok zfiltrován a zakoncentrován. Kolonová chromatografie zbytku (1:1 toluen/EtOAc) poskytla 70 (88 % výtěžek): TLC R_f0,44, 1:1 toluen/EtOAc.

Syntéza disacharidu GH 76 (schéma 21

Sloučenina 72

Methoxid sodný (570 mg, 106 mmol) byl přidán k roztoku sloučeniny 71 (2,5 g, 3,53 mol) (M. Petitou a další J. Med. Chem, 1997, 40, 1600 - 1607) v 1:1 methanol/CH₂CI₂ (35 ml). Po 2 h byla is přidána pryskyřice Dowex 50 H⁺ až do neutralizace a směs byla zfiltrována. Po zakoncentrování poskytla kolonová chromatografie zbytku (2:1 cyklohexan/EtOAc) látku 72 (100 % výtěžek): TLC R_f 0,32,

2:1 cyklohexan/EtOAc.

Sloučenina 73

Mel (0,4 I ml, 6,61 mmol) byl přidán při 0 ^eC k roztoku 72 (2 g,

3,3 mmol), a NaH (0,12 g, 5 mmol), v THF (20 ml). Po 2 h byl po kapkách přidán MeOH a po 15 min byl produkt extrahován CH2CI2. Roztok byl promyt H₂O, sušen (Na₂SO₄), a zakoncentrován. Kolonová chromatografie (5:1 cyklohexan/EtOAc) poskytla 73 (89 % výtěžek): [a]o +12° (c I; CH₂CI₂).

• ·* ♦ * · · ♦

Sloučenina 74

Vodná CF3COOH (70%, 3,14 ml) byla přidána k roztoku 73 (1,76 g, 2,84 mmol) v CH₂CI₂ (16 ml). Pa 50 min při pokojové teplotě byl roztok zředěn CK₂CI₂, promyt chladným nasyceným vodným roztokem NaHCO3, H₂0 a sušen (Na₂ŠO₄).Po zakoncentrování a kolonové chromatografií (11:2 CH₂CI₂/aceton) zbytku byla získána 74 v 88 % výtěžku): [cc]_D +10° (c 1; CH₂CI₂).

Methyl O-(benzyl 2.3-di-O-methvl-a-L-idopvranosvluronát)-(1->4)-2,610 . di-O-benzvl-3-O-methvl-a-D-qlukopyranosid 76,

K roztoku 74 (1,39 g, 2,4 mmol) v THF (8 ml) byl přidán 2,2,6,6tetramethyl-lpiperidinyloxy (37,4 mg), nasycený vodný NaHCO₃(14,4 ml), KBr (120 mg) a tetrabutylamonium chlorid (180 mg). K uvedenému ochlazenému (0 °C) roztoku byla přidána směs roztoku nasyceného vodného NaCI (2,8 ml), nasyceného vodného NaHCCh (1,4 ml) a NaOCI (1,3M, 3,2 ml). Po 1 h byla směs extrahována CH₂CI₂, promyta H₂O, sušena (Na₂SO₄) a koncentrována za získání surové kyseliny 75.

Získaná surová kyselina 75 v DMF (31 ml) byla smísena s BnBr (2,84 ml, 23,9 mmol) a KHCO₃ (1,2 g, 12 mmol). Po 16 h byl produkt extrahován EtOAc, promyt H₂O, sušen (Na₂SO₄). Po zakoncentrování a kolonové chromatografií (3:2 cyklohexan/EtOAc) zbytku byla získána 76 (78 % výtěžek z 74): [a]_D +7,3° (c 1,1; CH₂CI₂).

Syntéza pentasacharidu ĎEFGH 80 (schéma 8) (PŘÍKLAD IV)

Sloučenina 77

Trimethylsilyl triflát (170 μΙ, 0,0068 mmol) byl přidán pod argonem k míchanému ochlazenému (-20 “C) roztoku imidátu 70 (91 mg, 0,097 mmol), a 76 (66,2 mg, 0,097 mmol), v CH₂CI₂ (2 ml)

-29obsahujícímu molekulová síta 4 A. Po 30 min byl přidán pevný

NaHC0₃ (0,1 g) a míchání pokračovalo přes noc. Roztok byl zfiltrován, promyt K₂O, sušen a zakoncentrován. Kolonová chromatograf ie (2:1 cyklohexan/aceton) poskytla pentasacharid 77 (71,6 % výtěžek): TLC

R_f 0,4, 2:1 cyklohexan/aceton.

• » ·»· • *

44·· 44

Methyl Q-(2.3,4-tri-O-methvl-6-O-sulfo-a-D-glukopvranosvl)-(1->4)-O(2.3’di-Q-methvl-g-D-glukopyranosvluronová kyselina)-(1->4)-0’ (2.3,6-tri-O-sulfo-a-D-qlukopyranosyl)-f1->4)O-(2.3-di-O-methyl-a-Lidopyranosyluronová kvselina)-(1->4)-3-0-methvl-2,6-di-0-sulfo-q-Dglukopyranosid, oktasodná sůl 80,

Roztok 77 (50 mg, 0,032 mmol) v DMF (5 ml) byl míchán v průběhu 16 h v mírném proudu H₂ v přítomnosti katalyzátoru 10 % Pd/C (50 mg). Po zfiltrování byl roztok zakoncentrován za získání 78.

Vodný NaOH (5M, 0,46 ml) byl přidán k roztoku výše uvedené surové sloučeniny v MeOH (26 ml). Po 5 h byl přidán Dowex 50 H⁺ až do dosažení neutrálního pH. Roztok byl zakoncentrován a zbytek byl převrstven na kolonu Sephadex G 25 eluovanou H₂O. Zakoncentróvání spojených frakcí poskytlo surovou 79.

Komplex Et₃N/SO₃ (174 mg, 0,96 mmol) byl přidán k roztoku uvedené sloučeniny v DMF (6 ml) a roztok byl zahříván při 55 °C 20 h. Potom byl přidán NaHCO₃ (0,33 mg rozpuštěno v H₂O) a roztok byl převrstven na kolonu Sephadex G 25 (1,6 x 100 cm) ekvilibrovanou v 0,2M NaCI. Frakce byly spojeny, koncentrovány a odsoleny na stejné koloně pro gelovou filtraci a ekvilibrovány v H₂O. Lyofilizace potom poskytla pentasacharid 80 (95 % výtěžek z 77): [a]_D +49° (c 1; H₂O).

-30Příklad V

Biologická účinnost sloučenin podle předkládaného vynálezu může být stanovena v testu antifaktoru Xa

Aktivovaný faktor X (Xa) je faktor v koagulační kaskádě. Anti-Xa 5 aktivita sloučenin podle předkládaného vynálezu byla testována spektrofotometrickým měřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu s-2222 faktorem Xa. Tento test na aktivitu anti-Xa v systému pufru byl použit pro určení hodnoty IC₅o testované sloučeniny.

Referenční sloučenina: benzamidin

Testovací médium: tromethamin-NaCI-polyethylenglýkol 6000 (TNP) pufr

Vehikulum: TNP pufr

Rozpouštění muže být usnadněno dimethylsulfoxidem, methanolem, ethanolem, acetonitrilem nebo terc.-butylalkoholem, které nemají nepříznivé účinky až do koncentrace 1 % (pro DMSO) a 2,5 % (pro jiná rozpouštědla) v hotové reakční směsi.

Použitá technika: Reagencie*

1. Tromethamín-NaCI (TN) pufr Složení pufru:

Tromethamin (Tris) 6,057 g (50 mmol)

NaCl

5,844 g (100 mmol)

Voda do pH roztoku je nastaveno na 7,4 při 37 °C pomocí HCI(10 mmol.r¹).

2. TNP pufr

V » V « W » - - • · · »· · · * *·* ·· · '· «♦· ···· ·· ··

- 31 Polyethylenglykol 6000 je rozpuštěn v TN pufru za poskytnutí koncentrace 3 g.f*.

3. Roztok S-2222

Jedna lahvička S-2222 (15 mg; Kabi 5 Diagnostica, Švédsko) se rozpustí v 10 ml vody za získání koncentrace 1,5 mg.ml'¹ (2 mmol.l'¹).

4. Roztok Xa

Bovinní faktor Xa Human (71 nKatlahv.'¹; io ... Kabi Diagnostica) je rozpuštěn v 10 ml TNP pufru a potom dále zředěn 30 ml TNP pufru za získání koncentrace 1,77 nKatml*¹. Ředění je třeba provést těsně před pokusem.

* - Všechny použité složky jsou kvality pro analýzu.

- Pro přípravu vodných roztoků se použije ultračistá voda (kvality Milli-Q).

Příprava roztoků testovací a referenční sloučeniny

Testované referenční sloučeniny se rozpustí ve vodě Milli-Q za 2o získání zásobních koncentrací 10'² mol.l'¹. Každá koncentrace se postupně ředí vehikulem na koncentrace 10'³, 10⁴ a 10'⁵ mol.l'¹. Při testu se použijí ředění včetně zásobního roztoku (konečné koncentrace v reakční směsi: 3.10'³; 10'³; 3.10*⁴; 10'⁴; 3.10'⁵; 10'⁵;

3.10θ a 10*⁶ mol.l'¹).

Postup

Při pokojové teplotě se pipetuje testovaná sloučenina 0,075 ml a referenční sloučenina 0,025 ml střídavě do jamek mikrotitrační destičky a roztoky se zředí 0,115 ml, popřípadě 0,0165 ml pufru TNP.

fc *

Do každé jamky se přidá alikvot 0,030 ml roztoku S-2222, destička se předehřeje a předinkubuje za třepání v inkubátoru (Amersham) 10 min při 37 °C. Po předinkubaci se zahájí hydrolýza S-2222 přídavkem 0,030 ml roztoku trombinu do každé jamky. Destička se inkubuje (s třepáním po dobu 30 s) při 37 °C. Počínaje první minutou inkubace se měří každé 2 min absorbance každého vzorku při 405 nm po dobu 90 min s použitím přístroje pro odečítání kinetiky na mikrotitračních destičkách (Twinreader plus, Flow Laboratories).

Všechna data se shromažďují v osobním počítači IBM s použitím programu LOTUS-MEASURE. Pro každou sloučeninu a pro blank se vynesou koncentrace (vyjádřené v mol.1'¹ reakční směsi) proti době reakce v minutách.

Vyhodnocení naměřených hodnot: Pro každou konečnou koncentraci byla z vynesených výsledků vypočtena maximální absorbance. Hodnota IC₅o (konečná koncentrace, vyjádřená v pmol.l'¹, způsobující 50 % inhibici maximální absorbance blanku) byla vypočtena s použitím metody transformace logit podle: Hafner a další (Arzneim.-Forsch./Drug Res. 1977; 27(ll): 1871-3).

Aktivita anti-faktoru Xa

Sloučenina (příklad)	ICso (pg.r¹)
32(1)	22
38(2)	12
56(3)	12
80(4)	<2


'· « *	• 0 ·	0 0
• · · ·	• « · * ·	« ·
0 0 ·	0 0	• «
• 0 0 «0		« 0

Zkratky (Ph = fenyl; Me = methyl; Ac = acetyl; Im = trichloracetimidyl; Bn = benzyl; Bz = benzoyl; Mbn = 4-methoxybenzyl; Lev = levulinoyl)

Schéma 1

3: R=MBn 39: R=CH₃

6: Rj=OAc 7· P .eSFthvI

3:R=MBn

4l:R=CH₃

4: R^MBn 40: Ř-CH₃

42: R,=OH ’

43: R₍=OIm

7.43 j^OCHj

AcO Γ Γ OCKj

OAe OB·

8: R=MBn 44: R=CH₃ • · ♦· • * · • * * • 4 ·

- 34 Schéma 2

G H

9: Rj=H, Ř₂=CH₃. R₃=MBn

14: Ri=R₂’R₃=CH₃18: Ri^aR2=CH3, R3=Bn 45: R,=H, R2^S*R3=CH₃48: R(³Ac, R2=R3“CH3 74: R1³R3^s,CH₃, R^Bn

10: R,=H. R^CHj, R₃=MBn 11: R,-R₂=CH₃. R₃=MBn 12: R,=R₂=CH_3tR₃=H 13: Rj⁼R2⁼R3—CH₃17: R,=R₂=CH₃, R₃—Bn 44: R/H. R₂=R₃=CH₃47: Rj=Ač* R₂=R₃=CH₃71: Rj=Bz, R₂=Bn, R₃-CH₃72: R,=H, R₂=Bn. R₃=CH₃73: R,=R₃=CH₃. R₂-Bn

15: R,=R₂=R₃=CH₃19: R,=R₂=CH₃. R₃=Bn 49: R,=Ac, R₃=R₃=CH₃75: R,=R₃=CH₃. R₂=Bn

16: R,=R₂=R₃=CH₃20: R,-R₂=CH₃. Rj=Bn 50: R,=Ac, R₂=R₃=CH₃76: R,-R₃-CH₃.R2“Bn

35Schéma 3

LevO

23: R=Ac 24: R=H 25: R=ím

-36Schéma 4

16: Ri-R₂=»R₃=CH₃20: Rj—R₂ ⁼CH3, R3=Bn 50: Rj^aAc, R2=R₃-CH₃

OCHj o

o

29: R, =R₂=R₃=CHj 35: R,-R₂»CH₃; R₃=Bn 53: RpAc, R₂=R₃“CH₃ ·· 9

-37Schéma 5

29,35,53

54: Rj^Ac, Rj=R₃ ⁼CH₃

32: R,=R_z=R₃=CH₅ (Příklad I) 38: R,=R₂=CH₃, Rj=SO₃' (příklad II) 56: Ri³ SO3', R₂=R₃“CH₃ (příklad III) • · ·' · « • · · ♦ ·« • · · ··** * ·« · · · * »····♦· «» ··

4« ·

38Schéma 6

61: R=Ac 62: R=H 63: R=CH₃

65: R-H

66: R=Bn

-39Schéma 7

D Ε f

BBB

BBB ΒΒΒΒ * * · Β * BBB

Β BBB β Β

Β Β Β

Β Β ΒΒ

D Ε F

' r

• *

9

4

4 4

49

4

9 4

4 49

94·9499

444

- 40 O Λ ouuenia ο

D Ε F

G Η

(Příklad IV) Zastupuje:

• · * ·

» • ·« ► fcfc · • fc

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY kde R¹ je (1-4C)alkoxy;

R², R³ a R⁴ jsou nezávisle (1-4C)alkoxy nebo OSO₃‘;

10 celkový počet sulfátových skupin je 4, 5 nebo 6;

a skládané čáry znamenají vazby burf nad rovinu nebo pod rovinu šestičlenného kruhu, ke kterému jsou připojeny; nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

i5
2. Uhlohydrátové deriváty podlé nároku 1, kde jednotka D vzorce

R¹ je methoxy; a R², R³ a R⁴ jsou nezávisle methoxy nebo OSOí.
3. Uhlohydrátové deriváty podle nároku 2, kde R² znamená methoxy.

• ·0 0

0 0 0 0 • 0 0 0 0 • 0 0 • 0

-42* 0 · i · • 0 0 0

0 · · · 0 0
4. Uhlohydrátové deriváty podle nároku 3, kde R³ znamená methoxy.

s
5, Uhlohydrátové deriváty podle nároku 4, kde R⁴ znamená methoxy.

$
6. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje uhlohydrátový derivát podle některého, z nároků io 1 až 5 a farmaceuticky přijatelné pomocné látky.
7. Uhlohydrátový derivát podle některého z nároků 1 až 5 pro použití v lékařství.

15 8. Použití uhlohydrátového derivátu podle některého z nároků 1 až 5 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci trombózy nebo inhibice proliferace buněk hladkého svalstva.