CN109134553B - 抗凝血的五糖类化合物及其制备方法和医药用途 - Google Patents
抗凝血的五糖类化合物及其制备方法和医药用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及式I所示的抗凝血化合物及其盐、其制备方法以及其在制备预防和/或治疗与血液凝固障碍相关的疾病的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及用作抗凝血剂的五糖类化合物,其制备方法以及其在抗凝血方面的医药用途。
背景技术
血栓栓塞性疾病是一类严重危害人类健康的疾病,其发病率高居各种疾病之首,近年来还有渐增之势。其主要分为动脉血栓和静脉血栓。静脉血栓常见于深静脉,临床表现为血栓形成的局部疼痛肿胀、远端血液回流障碍以及血栓脱落后引起的栓塞导致脏器功能障碍。动脉血栓形成是从动脉血管壁动脉粥样硬化病变与血小板激活开始的,可导致严重的心血管疾病如急性心肌梗死、脑卒中等。治疗方法包括抗凝血治疗、抗血小板治疗及溶栓治疗等,而抗凝血治疗是目前临床上预防和治疗血栓栓塞性疾病的核心和基础。
肝素是传统的抗凝血药物,是糖胺聚糖家族中的一种多糖。临床上使用的包括普通肝素和低分子量肝素。肝素通过附着至抗凝血酶(AT)的特定结合域而诱发AT的构象发生变化,进而抑制凝血因子Xa的活性。研究表明,肝素结合AT并抑制凝血因子Xa的最小结构单元是一个独特的五糖序列。
到目前为止,已有多篇文献公开了通过化学全合成制备得到具有抗血栓形成和抗凝血活性的五糖化合物。如美国专利US4818816、Carbohydrate Research 1987(167):67-75报道的磺达肝癸钠,其是基于肝素抗凝血酶结合五糖序列的第一代合成类似物,属于间接凝血因子Xa抑制剂。磺达肝癸钠在大鼠体内的半衰期约为0.7小时(iv),在人体内的半衰期约为17小时。该品自2002年在美国上市以来,已在多个国家上市,临床上用于治疗和预防深部静脉血栓栓塞事件发生,推荐剂量为2.5mg,每日一次,皮下注射给药。尽管磺达肝癸钠临床表现出色,但是其合成难度极大,生产成本高昂,从而增加患者的经济负担。
美国专利US5378829报道了用烷氧基基团和O-磺酸根基团取代磺达肝癸钠结构中的N-磺酸根基团和羟基基团而形成的一类五糖,如依达肝素钠(Idraparinux)。由于五糖单元上引入烷氧基基团和O-磺酸根基团,制备模式得以大大简化。其在大鼠体内半衰期为9.2小时(iv),在人体内的半衰期延长至120小时,出血风险增加,止步于临床III期试验。
WO9936428报道了通过用亚烷基桥替换O-烷基并锁定G单元L-艾杜糖醛酸的构型而制备的一类五糖化合物。这些化合物具有有效的抗凝血因子Xa活性并对AT具有强亲和力。
WO9925720公开了一类具有4~6个硫酸根的五糖化合物。硫酸根基团的减少并未降低抗血栓形成的活性,也不会导致肝素诱发的血小板减少。
WO0224754公开了与生物素或生物素衍生物共价连接的一类五糖化合物。生物素或其衍生物的引入并没有改变五糖的药物活性,有利的是该类化合物还具有在紧急状态下迅速被抗生物素蛋白解剂中和从而抑制其抗凝血活性的优点。
WO2012172104公开了一类半衰期短的高活性五糖化合物。通过改变D单元的取代基来调控烷基化/O-硫酸化五糖的半衰期。
抗凝血药物的半衰期是非常重要的药代动力学参数。临床中在发生出血的情况下需要尽可能快地关闭抗凝血作用,而半衰期过长将导致出血风险增加。而对于某些血栓栓塞性疾病,如肺栓塞、深静脉栓塞、非ST段抬高心肌梗死等,适当地延长抗凝血剂的半衰期却是更有利的。
另一方面,抗凝血药物研发的核心是安全性问题,如何有效避免出血倾向、降低出血风险是抗凝血药物的开发所面临的挑战。
发明内容
一方面,本发明提供了式I所示的为阴离子形式的五糖化合物、其酸及其盐:
其中,R1选自H,SO3 -,或C1~C4烷基;
R2选自H或SO3 -。
优选地,R1选自H,SO3 -,或Me。
优选地,所述式I所示的五糖化合物的阴离子形式选自如下结构:
其中R1为C1~C4烷基。
更优选地,所述式I所示的五糖化合物的阴离子形式选自如下结构:
其中R1为C1~C4烷基。
本发明还包括酸形式的式I所示的五糖化合物,在酸形式中-COO-和-OSO3 -官能团分别是-COOH形式和-OSO3H形式。本发明还包括盐形式的式I所示的五糖化合物,其选自钠盐、钾盐、钙盐或铵盐,优选钠盐或钾盐。
另一方面,本发明提供了制备式I-1~I-3所示的五糖化合物的方法,其包括:
(1)将式DE所示的二糖与式FGH3所示的三糖反应制备式DEFGH0,
其中,Ra为Ac,Bn,C1~C4烷基;
(2)将式DEFGH0脱除苄基以制备式DEFGH1,
其中,Rc为Ac,H,C1~C4烷基;
(3)将式DEFGH1发生硫酸化反应制备式DEFGH2,
其中,Rd为Ac,SO3 -,C1~C4烷基;
(4)将式DEFGH2水解制备式I-1~I-3。
再一方面,本发明提供了制备式I-4~I-6所示的五糖化合物的方法,其包括
(1)将式DE所示的二糖与式FGH4所示的三糖反应制备式DEFGH0-1,
其中,Ra为Ac,Bn,C1~C4烷基;
(2)将式DEFGH0-1脱除苄基以制备式DEFGH1-1,
其中,Rc为Ac,H,C1~C4烷基;
(3)将式DEFGH1-1发生硫酸化反应制备式DEFGH2-1,
其中,Rd为Ac,SO3 -,C1~C4烷基;
(4)将式DEFGH2-1水解制备式I-4~I-6。
还一方面,本发明还提供了用于制备式I所示的五糖化合物、其酸及其盐的如下中间体
其中,Ra为Ac,Bn,C1~C4烷基,优选Ra为Ac,Bn,甲基;
其中,Rc为Ac,H,C1~C4烷基,优选Ac,H,甲基;
其中,Rd为Ac,SO3 -,C1~C4烷基,优选Ac,SO3 -,甲基。
还一方面,本发明还涉及药物组合物,其包含作为活性成分的式I所示的五糖化合物、其酸或其盐以及一种或多种药用辅料。
在每个单位剂量中,本发明的式I所示的五糖化合物、其酸或其盐为0.1~100mg,优选0.5~50mg。
所述药物组合物可通过口服或胃肠道外途径给药,胃肠道外途径给药包括但不限于静脉内注射、肌内注射和皮下注射。
对于口服途径给药,本发明的药物组合物通常以片剂、胶囊剂、溶液的形式提供。片剂可以包含本发明的式I所示的五糖化合物、其酸或其盐以及药学上可接受的赋形剂。所述赋形剂包括但不限于稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、着色剂或防腐剂。稀释剂可选自淀粉、乳糖;崩解剂可选自玉米淀粉、海藻酸;粘合剂可选自淀粉、聚维酮、明胶;润滑剂可选自硬脂酸镁、滑石粉、硬脂酰富马酸钠。胶囊剂包括硬胶囊剂和软胶囊剂。在硬胶囊剂中,作为活性成分的本发明的式I所示的五糖化合物、其酸或其盐与稀释剂混合,在软胶囊剂中,本发明的式I所示的五糖化合物、其酸或其盐与水或油如花生油或橄榄油混合。
对于胃肠道外途径给药,本发明的药物组合物可以通过静脉内注射、肌内注射或皮下注射给药。其通常以无菌水溶液或混悬液或冻干粉末提供,并调节合适的pH和等渗性。另外,可任选辅料如甘露醇、纤维素衍生物、卵磷脂。优选的给药途径是皮下注射给药。
另一方面,本发明还涉及式I所示的五糖化合物、其酸或其盐在制备用于预防和/或治疗与凝血机制障碍相关的疾病或疾病状态的药物中的用途。
再一方面,本发明还涉及用于预防和/或治疗与血液凝固障碍相关的疾病和疾病状态的方法,其包括向有需要的个体给予本发明的式I所示的五糖化合物、其酸或其盐或本发明的药物组合物。
还一方面,本发明还涉及用于预防和/或治疗与血液凝固障碍相关的疾病和疾病状态的本发明的式I所示的五糖化合物、其酸或其盐或本发明的药物组合物。
所述与凝血机能障碍相关的疾病或疾病状态的实例包括但不限于静脉血栓形成,尤其是深静脉血栓形成,动脉血栓形成、血栓性静脉炎、肺栓塞、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞或中风,以及由血栓形成或栓塞引起的动脉堵塞、血管成形术或血栓溶解过程中或之后的动脉再堵塞、术后静脉血栓形成或栓塞、急性或慢性动脉硬化,ST段、非ST段抬高心肌梗死。在血液透析和外科手术中,本发明的化合物还可用于体外血液循环中的抗凝血剂。还可将本发明的化合物用于实体器官移植相关的缺血性再灌注损伤的预防。
本发明的五糖类化合物具有如下优势:(1)其较磺达肝癸钠具有更强的抗凝血因子Xa活性,使用剂量更小和副作用更小;(2)其较磺达肝癸钠具有更长的体内半衰期,可以达到每2~3天给药一次,尤其适合肺栓塞、深静脉栓塞、非ST段抬高心肌梗死患者的治疗;(3)在初步的安全性评估中,其对出血倾向几乎无显著影响,显示出重要的潜在应用价值;(4)其制备方法大大简化,制造成本低,显著降低了原料药的开发成本,适合于大规模的工业化生产。
具体实施方式
本申请的发明人经过深入研究,合成了通式I所示的五糖类化合物,并进行了生物学实验研究,发现本发明的五糖类化合物具有高的抗凝血因子Xa活性以及合适的体内消除半衰期,特别适合用作抗凝血剂。
定义
除非有相反陈述,下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义:
“烷基”指饱和的脂族烃基团,包括直链或支链的饱和一价烃基,所述烃基具有所示出的碳原子数。如术语“C1~C4烷基”包括C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基,合适的烷基基团包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基。
权利要求书和说明书中所使用的简称其含义见下表:
Bz | 苯甲酰基 |
Bn | 苄基 |
Ac | 乙酰基 |
DMAP | 4-二甲氨基吡啶 |
DBU | 1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯 |
TEMPO | 2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物 |
BAIB | 碘苯二乙酯 |
TCCA | 三氯异氰尿酸 |
TMSOTf | 三氟甲磺酸三甲基硅酯 |
Dowex | 离子交换树脂 |
Sephadex | 葡聚糖凝胶 |
制备方法:
下面更具体地描述本发明的五糖化合物的制备方法,但这些具体的制备方法不对本发明的范围构成任何限制。此外,反应条件如反应物、溶剂、碱、所用化合物的量、反应温度、反应时间等不限于下面的实例。
本发明的五糖化合物还可以任选地将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便制得,这样的组合可由本领域的技术人员容易地进行。
第一部分 单糖D环的合成
合成路线:
a)苯甲醛,浓硫酸;b)硫酸二甲酯,KOH,乙腈;c)三氟化硼乙醚,三乙基硅烷;d)苄基溴,氢氧化钾;e)醋酸,硫酸,水;f)三氯乙腈,DBU,二氯甲烷
化合物D1-D6的制备:
参考Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2009,19(14),3875-3879。
第二部分 单糖E环的制备
合成路线:
a)硫酸二甲酯,KOH,四氢呋喃,b)三氟醋酸,水,c)对甲苯磺酸吡啶盐,苯甲醛二甲缩醛,d)乙酸乙酯,醋酐,三乙胺,DMAP,e)三氟化硼乙醚,对甲氧基苯酚,f)甲醇钠,甲醇,g)制备E7:氢氧化钾,苄溴,制备E8:氢氧化钾,硫酸二甲酯,h)醋酸,水,i)TEMPO,BAIB,二氯甲烷,水,j)碘甲烷,碳酸氢钾,乙腈
化合物E1-E4的制备:
参考Tetrahedron,2012,68(36),7386-7399。
化合物E5的制备:
将E4(366g)和对甲氧基苯酚130g溶于366ml无水二氯甲烷中,室温下注入三氟化硼乙醚280g,反应2h后加4升二氯甲烷稀释,用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭,然后分液,有机相用无水硫酸钠干燥,浓缩,得E5(387g),收率90%。
化合物E6的制备:
将中间体E5(86g)溶于860ml甲醇,加入甲醇钠2.7g,室温搅拌反应1h后加冰醋酸中和至中性,减压蒸干,残余物加二氯甲烷1L、水1洗涤,分液、旋干有机相得E6(77.6g),收率100%。
化合物E7的制备:
将E6(38.8g)溶于400ml乙腈,加氢氧化钾12g,10℃下滴加溴苄18g,反应4h后加甲醇50ml回流1h,然后减压旋干,残余物加乙酸乙酯1L、水1L萃取洗涤,有机相减压旋干得粗品50g,粗品用40ml乙酸乙酯、120ml石油醚重结晶得E7(45g),收率94%。
化合物E8的制备:
将E6(38.8g)溶于400ml乙腈,加氢氧化钾23g,10℃下滴加硫酸二甲酯18.9g,反应4h后减压旋干,残余物加乙酸乙酯1、水1L萃取洗涤,有机相减压旋干得粗品48g,粗品用30ml乙酸乙酯、120ml石油醚重结晶得E8(36.4g),收率91%。
化合物E9的制备:
将E5(98.5g)溶于430ml醋酸,加入水86g,70℃搅拌反应1h后55℃减压旋干,加水1L、乙酸乙酯1L,用碳酸钠调至pH=7,然后分液得到有机相,有机相减压蒸干得E9粗品80g,石油醚:乙酸乙酯=1∶1柱层析得纯品70.5g,收率90%。
化合物E10的制备:
将E7(45g)溶于450ml醋酸,加入水90g,70℃搅拌反应1h后55℃减压旋干,加水1L、乙酸乙酯1L,用碳酸钠调至pH=7,然后分液得到有机相,有机相减压蒸干得E10粗品40g,石油醚:乙酸乙酯=1∶1柱层析得纯品33.7g,收率92%。
化合物E11的制备:
将E8(36g)溶于450ml醋酸,加入水90g,70℃搅拌反应1h后55℃减压旋干,加水1L、乙酸乙酯1L,用碳酸钠调至pH=7,然后分液得到有机相,有机相减压蒸干得E11粗品38g,石油醚:乙酸乙酯=1∶1柱层析得纯品26.7g,收率95%。
化合物E12的制备:
将E9(68.4g)和TEMPO 0.63g加入二氯甲烷342ml和水342ml中,一次性加入碘苯二乙酯86g,剧烈搅拌下室温反应45min,然后加30%亚硫酸钠水溶液200ml淬灭。水相用乙酸乙酯萃取5次(500ml×5),有机相用无水硫酸钠干燥,减压蒸干得E12(57.6g,收率80%)。
化合物E13的制备:
将E10(33g)和TEMPO 0.27g加入二氯甲烷330ml和水330ml中,一次性加入碘苯二乙酯37g,剧烈搅拌下室温反应45min,然后加30%亚硫酸钠水溶液100ml淬灭。水相用乙酸乙酯萃取5次(300ml×5),有机相用无水硫酸钠干燥,减压蒸干得E13(28g,收率81%)。
化合物E14的制备:
将E11(26g)和TEMPO 0.27g加入二氯甲烷260ml和水260ml中,一次性加入碘苯二乙酯37g,剧烈搅拌下室温反应45min,然后加30%亚硫酸钠水溶液100ml淬灭。水相用乙酸乙酯萃取5次(300ml×5),有机相用无水硫酸钠干燥,减压蒸干得E14(25g,收率88%)。
化合物E15的制备:
将E12(57.6g)溶于乙腈576ml,加入碳酸钾33.5g和碘甲烷34.5g,搅拌反应8h,反应完加三乙胺10ml淬灭,饱和食盐水洗涤三次(200ml×3),使pH=7~8,减压旋干有机相。石油醚:乙酸乙酯=2∶1柱层析纯化得50g,收率85%。
化合物E16的制备:
将E13(28g)溶于乙腈280ml,加入碳酸钾9.6g和碘甲烷10g,搅拌反应8h,反应完加三乙胺5ml淬灭,饱和食盐水洗涤三次(100ml×3),使pH=7~8,减压旋干有机相。石油醚:乙酸乙酯=2∶1柱层析纯化得25g,收率87%。
化合物E17的制备:
将E14(25g)溶于乙腈250ml,加入碳酸钾10.5g和碘甲烷11g,搅拌反应8h,反应完加三乙胺5ml淬灭,饱和食盐水洗涤三次(100ml×3),使pH=7~8,减压旋干有机相。石油醚:乙酸乙酯=2∶1柱层析纯化得23.5g,收率90%。
第三部分 单糖F环和H环的制备
合成路线1:
a)硫酸,苯甲醛,DMF,b)苄溴,氢氧化钾,乙腈,c)三乙基硅烷,三氟化硼乙醚,二氯甲烷,d)醋酸,硫酸,水,e)醋酐,三乙胺,DMAP,乙酸乙酯,f)哌啶,四氢呋喃,g)三氯乙腈,DBU,二氯甲烷
化合物F1(H1)-F3(H3)的制备:
参考Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2009,19(14),3875-3879。
化合物F4的制备:
将F3(464g)加入醋酸2.3kg和水464g的混合溶液,加入硫酸46g,100℃反应1h。反应完减压蒸干,得F4(427.5g,收率95%)。
化合物F5的制备:
将F4(400g)加入乙酸乙酯溶解,加入三乙胺200ml,滴加醋酐200ml,反应1h后加碳酸钠水溶液中和,乙酸乙酯萃取,减压蒸干得F5(475g,收率100%)。
化合物F6的制备:
将F5(450g)加入四氢呋喃溶解,加入哌啶143g,反应6h后加醋酸中和,减压旋蒸,残余物用乙酸乙酯溶解、水洗,减压蒸干有机相得373g,收率90%。
化合物F7的制备:
将F6(350g)加入二氯甲烷溶解,加入三氯乙腈400g和DBU 10g,反应1h后旋干,柱层析得F7(406g,收率90%)。
合成路线2:
a)硫酸,苯甲醛,DMF,b)苄溴,氢氧化钾,乙腈,c)醋酸,水,d)吡啶,苯甲酰氯,e)醋酐,三乙胺,DMAP,乙酸乙酯,f)硝酸铈铵,乙腈、甲苯、水,g)三氯乙腈,DBU,二氯甲烷
化合物F8-F10的制备:
参考Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2009,19(14),3875-3879。
化合物F11的制备:
将F10(1.49kg)加入醋酸3L/水600ml,搅拌反应1h后减压旋蒸干,得F11(1.21kg,收率96%)。
化合物F12的制备:
将F11(1.21kg)用吡啶溶解,0℃滴加苯甲酰氯130g,反应4h后加饱和碳酸氢钠水溶液析晶,滤饼烘干得F12(1.39kg,收率95%)。
化合物F13的制备:
将F12(1.39kg)加入乙酸乙酯10L,加入醋酐250g和三乙胺250g,室温反应1h后用水洗涤,减压旋干得F13(1.49kg,收率100%)。
化合物F14的制备:
将F13(1.49kg)加入乙腈10L\甲苯5L\水5L,加入硝酸铈铵1kg,室温反应1h后用乙酸乙酯萃取,减压旋干得F14(1.12kg,收率91%)。
化合物F15的制备:
将F14(506g)用二氯甲烷溶解,加入三氯乙腈400g和DBU 10g,反应1h后旋干,柱层析得F7(598g,收率92%)。
第四部分:单糖G环的合成
合成路线:
a)硫酸二甲酯,KOH,四氢呋喃,b)磷钼酸,硅胶,水,乙腈,c)三水合磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、水、TEMPO、NaClO2、KBr、TCCA,d)碘甲烷,碳酸钾,乙腈,e)三氟甲磺酸酐,吡啶,f)三氟醋酸钠,DMSO,水,g)三氟醋酸,水,h)碘甲烷,碳酸钾,h)醋酐,三乙胺,DMAP,乙酸乙酯,j)三氟甲磺酸钕,k)三氯乙腈,DBU,二氯甲烷
化合物G1的制备:
参照E1的合成。
化合物G2的制备:
将G1(1.5kg)溶于乙腈9.72kg,加硅胶0.36kg、磷钼酸0.036kg和水0.8kg,室温搅拌16h,滤去硅胶,用碳酸钠水溶液中和至pH=7,滤液减压旋蒸,残余物加水、乙酸乙酯萃取,减压蒸干得G2(1.15kg,收率90%)。
化合物G3的制备:
将G2(1.15kg)溶于四氢呋喃10L,加入三水合磷酸氢二钾500g、磷酸二氢钾500g、水1.5kg、TEMPO 20g、NaClO2 300g、KBr 50g和TCCA 500g,反应1h后加无水亚硫酸钠淬灭,然后减压旋干,残余物用乙酸乙酯洗涤,有机相减压旋干得G3(1.1kg,收率90%)。
化合物G4的制备:
将G3(1.1kg)溶于乙腈6.0kg,加入1.22kg碳酸钾和碘甲烷0.73kg,室温搅拌反应8h,反应完毕后,加入三乙胺淬灭碘甲烷并抽滤,减压旋干得G4(929g,收率80%)。
化合物G5的制备:
将G4(885g)加入吡啶1L和乙腈5L,滴加三氟甲磺酸酐950g,滴加完毕反应1h,然后加冰水析晶并抽滤,滤饼用二氯甲烷溶解,然后二氯甲烷相用水洗、干燥,减压旋干得G5(1280g,收率96%)。
化合物G6的制备:
将G5(1280g)和三氟醋酸钠1kg溶于DMSO 10L\水1L,搅拌8h后加乙酸乙酯萃取,减压旋干得G6(808g,收率95%)。
化合物G7的制备:
将G6(808g)加入三氟醋酸2L、加入水200ml,搅拌1h后减压旋干得G7(547g,收率80%)。
化合物G8的制备:
将G7(547g)加入二氯甲烷5L、DMAP 50g和三乙胺1.15kg,然后0℃下滴加醋酐1.15kg,反应0.5h后加水洗涤,二氯甲烷相减压旋干得G8(815g,收率95%)。
化合物G9的制备:
将G8(810g)加入甲醇12L,加入三氟甲磺酸钕60g,搅拌12h后浓缩,柱层析得G9(605g,收率85%)。
化合物G10的制备:
将G9(605g)加入二氯甲烷6kg,加入三氯乙腈1.2kg和DBU 45g,反应1h后旋干,柱层析,得G10(801g,收率90%)。
第五部分 二糖DE的合成
合成路线:
a)TMSOTf,二氯甲烷,b)硝酸铈铵,c)三氯乙腈,DBU,二氯甲烷
化合物DE1的制备:
取D6(40g)和E15(25g)溶于无水二氯甲烷,在氮气保护下滴加TMSOTf1g,-20℃反应1h后加三乙胺淬灭,减压旋干,柱层析得DE1α异构体38g,收率85%。
化合物DE2的制备:
取D6(70g)和E16(50g)溶于无水二氯甲烷,在氮气保护下滴加TMSOTf1.5g,-20℃反应1h后加三乙胺淬灭,减压旋干,柱层析得DE2α异构体73g,收率86%。
化合物DE3的制备:
取D6(52g)和E17(30g)溶于无水二氯甲烷,在氮气保护下滴加TMSOTf1g,-20℃反应1h后加三乙胺淬灭,减压旋干,柱层析得DE3α异构体46g,收率82%。
化合物DE4的制备:
将DE1(38g)加入乙腈0.4L\甲苯0.2L\水0.2L,加入硝酸铈铵50g,室温反应1h后乙酸乙酯萃取,减压旋干得DE4(28.7g,收率90%)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.35-7.29(m,5H),6.1(d,J=3.6Hz,1H),5.6(dd,J=9.2,3.4Hz,1H),4.9(dd,J=9.2,3.4Hz,1H),4.65–4.54(m,3H),4.27-4.18(m,3H),4.08(m,1H),3.77(m,2H),3.65–3.1(m,18H),2.14(d,J=9.3Hz,3H).MS(ESI):581.7[M+Na]+
化合物DE5的制备:
将DE2(73g)加入乙腈0.9L\甲苯0.4L\水0.4L,加入硝酸铈铵100g,室温反应1h后乙酸乙酯萃取,减压旋干得DE5(56g,收率90%)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.36-7.26(m,10H),5.9(d,J=3.6Hz,1H),5.6(dd,J=9.2,3.4Hz,1H),4.65–4.54(m,5H),4.32(s,1H),4.27(d,J=3.0Hz,1H),4.08(dd,J=5.6,3.4Hz,1H),3.77(m,3H),3.65–3.1(m,17H),3.36(m,,2H).MS(ESI):629.7[M+Na]+
化合物DE6的制备:
将DE3(46g)加入乙腈0.9L\甲苯0.4L\水0.4L,加入硝酸铈铵100g,室温反应1h后乙酸乙酯萃取,减压旋干得DE6(35g,收率91%)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.34-7.29(m,5H),5.69(d,J=3.6Hz,1H),5.6(dd,J=9.2,3.4Hz,1H),4.65–4.61(m,3H),4.32(s,1H),4.23(d,1H),4.00(m,1H),3.80-3.77(m,3H),3.70(s,3H),3.61(d,2H),3.50(d,1H),3.41(m,15H).MS(ESI):553.3[M+Na]+
化合物DE7的制备:
将DE4(28.7g)加入二氯甲烷0.6kg,加入三氯乙腈40g和DBU 4g,反应1h后旋干,柱层析,得DE7(29g,收率80%)。
化合物DE8的制备:
将DE5(56g)加入二氯甲烷1kg,加入三氯乙腈100g和DBU 10g,反应1h后旋干,柱层析,得DE8(59g,收率85%)。
化合物DE9的制备:
将DE6 35g加入二氯甲烷0.7kg,加入三氯乙腈100g和DBU 10g,反应1h后旋干,柱层析,得DE9(38g,收率85%)。
第六部分 三糖FGH的合成
合成路线:
a)TMSOTf,二氯甲烷,b)甲醇钠,甲醇,c)TMSOTf,二氯甲烷,d)碳酸钾,甲醇
化合物GH0的制备:
将G10(631g)和H3(465g)加入无水二氯甲烷中,0℃下滴加TMSOTf 23g,反应1h后加三乙胺淬灭,柱层析,得GH0(677g,收率90%)。
化合物GH1的制备:
将GH0(377g)加入甲醇4L中,加入碳酸钾70g,反应4h后旋干,加水、乙酸乙酯萃取洗涤,蒸干得GH1(319g,收率90%)。
化合物FGH1的制备:
将F7(232g)和GH1(185)g加入无水二氯甲烷,0℃下滴加TMSOTf 23g,反应1h后加三乙胺淬灭,柱层析,得FGH1(262g,收率85%)。
化合物FGH2的制备:
将F15(237g)和GH1(185)g加入无水二氯甲烷,0℃下滴加TMSOTf 23g,反应1h后加三乙胺淬灭,柱层析,得FGH2(265g,收率85%)。
化合物FGH3的制备:
将FGH1(262g)加入甲醇3L,加入碳酸钾40g,反应4h后旋干,加水、乙酸乙酯萃取洗涤,蒸干得FGH3(227g,收率90%)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.34-7.29(m,30H),5.99(d,J=3.6Hz,1H),5.60(m,2H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,1H),4.88(s,1H),4.64–4.62(m,13H),4.23-4.19(m,2H),4.00(m,1H),3.80-3.77(m,3H),3.70(s,3H),3.61(d,2H),3.50(d,1H),3.40(d,6H),3.36(s,1H),2.02(s,3H).MS(ESI):1165.5[M+Na]+
化合物FGH4的制备:
将FGH2(265g)加入甲醇3L,加入碳酸钾40g,反应4h后旋干,加水、乙酸乙酯萃取洗涤,蒸干得FGH4(230g,收率90%)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06-7.55(m,5H),7.34-7.29(m,25H),5.99(d,J=3.6Hz,1H),5.69(dd,J=6.9,3.6Hz,1H),5.60(dd,J=9.1,3.4Hz,1H),5.50(dd,J=9.0,3.4Hz,1H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,1H),4.88(s,1H),4.65–4.61(m,11H),4.49(s,1H),4.24-4.23(m,3H),4.19(m,2H),4.00(m,1H),3.80-3.77(m,4H),3.70(s,3H),3.61(d,2H),3.50(d,1H),3.40(d,6H),3.36(s,1H),2.02(s,3H).MS(ESI):1179.5[M+Na]+
实施例1 五糖I-1的制备
合成路线:
化合物DEFGH10的制备:
将DE7(29g)和FGH3(47g)加无水二氯甲烷溶解,0℃下滴加TMSOTf 1g,反应1h后加三乙胺淬灭,柱层析,得DEFGH10(59g,收率85%)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.34-7.29(m,35H),5.99(d,J=8Hz,,1H),5.60(m,3H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,2H),4.64–4.62(m,16H),4.23-4.19(m,4H),4.00(m,3H),3.80-3.77(m,6H),3.70(s,6H),3.61(d,3H),3.50(d,3H),3.41(d,15H),3.36(m,3H),2.02(s,3H).MS(ESI):1705.7[M+Na]+
化合物DEFGH11的制备:
将DEFGH10(59g)溶于无水甲醇,加入10%钯碳,氢气常压下还原24h后过滤,旋干,得DEFGH11(36.9g,收率100%)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.99(d,J=3.6Hz,1H),5.60(d,1H),5.40(m,2H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,2H),4.77(d,2H),4.71(d,2H),4.64–4.62(m,2H),4.23-4.19(m,4H),3.94(m,4H),3.90(m,3H),3.81-3.76(m,5H),3.70(d,6H),3.57(d,3H),3.51-3.50(m,4H),3.41-3.40(m,18H),3.39(m,2H),2.02(s,6H).MS(ESI):1075.4[M+Na]+
化合物DEFGH12的制备:
将DEFGH11(3.6g)加入N,N-二甲基甲酰胺溶解,加入过量三氧化硫三乙胺盐,50℃反应24h后,加饱和碳酸氢钠水溶液淬灭,减压浓缩。凝胶柱(Sephadex G-25)分离,淋洗剂(水/乙腈=4/1,v/v)。钠型离子交换树脂柱(DOWEX-50Na),纯水淋洗,减压浓缩,得到无色固体DEFGH12(5.6g,收率92%)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.99(d,J=8Hz,,1H),5.60(d,1H),5.54(m,2H),5.24-5.17(m,6H),4.64–4.62(m,2H),4.23-4.19(m,7H),3.96-3.94(m,6H),3.80(m,2H),3.70(d,6H),3.50-3.40(m,20H),2.02(s,6H).MS(ESI):860.6[(M-2Na)/2]-
化合物I-1的制备:
将DEFGH12(5.6g)加入4N NaOH水溶液,室温反应24h后减压浓缩。凝胶柱(Sephadex G-25)分离,淋洗剂(水/乙腈=4/1,v/v)。钠型离子交换树脂柱(DOWEX-50Na),纯水淋洗,减压浓缩,得到无色固体DEFGH13(4.8g,收率90%)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.60(d,J=3.6Hz,1H),5.54(dd,2H),5.40(d,2H),5.24-5.17(m,4H),4.77(d,2H),4.63(d,2H),4.23-4.21(m,5H),4.10(m,2H),3.96-3.94(m,6H),3.80(m,2H),3.60(m,2H),3.50-3.40(m,21H).MS(ESI):825.9[(M-2Na)/2]-
实施例2 五糖I-2的制备
合成路线:
制备方法:
参照实施例1的方法,以DE8和FGH3为原料发生反应,再经氢解反应脱除苄基、发生硫酸化反应和水解反应后制得五糖I-2。
化合物DEFGH40:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.34-7.29(m,35H),5.99(d,J=8Hz,,1H),5.60(m,3H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,1H),4.64–4.62(m,18H),4.23-4.19(m,3H),4.00(m,3H),3.80-3.77(m,8H),3.70(s,6H),3.61(d,3H),3.50(d,3H),3.41(d,15H),3.36(m,3H),2.02(s,3H).MS(ESI):1705.7[M+Na]+
化合物DEFGH41:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.99(d,J=3.6Hz,1H),5.60(d,1H),5.40(m,3H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,1H),4.77(d,3H),4.71(d,2H),4.64–4.62(m,2H),4.23-4.19(m,3H),4.10(m,1H),3.94(m,3H),3.90(m,4H),3.80-3.76(m,5H),3.70(d,6H),3.60-3.50(m,8H),3.41-3.40(m,18H),3.30(m,2H),2.02(s,3H).MS(ESI):1033.4[M+Na]+
化合物DEFGH42:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.99(d,J=8Hz,,1H),5.60(d,1H),5.54(m,3H),5.24-5.17(m,6H),4.64–4.62(m,2H),4.23-4.19(m,6H),3.96-3.94(m,6H),3.80(m,2H),3.74(m,1H),3.70(d,6H),3.50-3.40(m,21H),2.02(s,3H).MS(ESI):889.9[(M-2Na)/2]-
五糖I-2:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.60(d,J=3.6Hz,1H),5.54(dd,3H),5.40(d,1H),5.24-5.17(m,4H),4.77(d,1H),4.63(d,2H),4.23-4.21(m,5H),4.10(m,2H),3.96-3.94(m,6H),3.80(m,2H),3.74(m,1H),3.60(m,2H),3.50-3.40(m,21H).MS(ESI):876.9[(M-2Na)/2]-
实施例3 五糖I-3(R1=甲基)的制备
合成路线:
制备方法:
参照实施例1的方法,以DE9和FGH3为原料发生反应,再经氢解反应脱除苄基、发生硫酸化反应和水解反应,制得五糖I-3。
化合物DEFGH50:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.34-7.29(m,35H),5.99(d,J=8Hz,,1H),5.60(m,4H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,1H),4.64–4.62(m,16H),4.23-4.19(m,3H),4.00(m,3H),3.80-3.77(m,8H),3.70(s,6H),3.61(d,3H),3.50(d,3H),3.41(d,18H),3.36(m,3H),2.02(s,3H).MS(ESI):1677.7[M+Na]+
化合物DEFGH51:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.99(d,J=3.6Hz,1H),5.60(d,2H),5.40(m,2H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,1H),4.77(d,2H),4.71(d,2H),4.64–4.62(m,2H),4.23-4.19(m,3H),3.94(m,4H),3.90(m,3H),3.81-3.76(m,7H),3.70(d,6H),3.57(d,3H),3.50(m,1H),3.41-3.40(m,21H),3.30(m,2H),2.02(s,3H).MS(ESI):1047.4[M+Na]+
化合物DEFGH52:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.99(d,J=8Hz,,1H),5.60(d,2H),5.54(m,2H),5.24-5.17(m,5H),4.64–4.62(m,2H),4.23-4.19(m,6H),3.96-3.94(m,6H),3.80(m,4H),3.70(d,6H),3.50-3.40(m,24H),2.02(s,3H).MS(ESI):846.0[(M-2Na)/2]-
化合物I-3:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.60(d,J=3.6Hz,2H),5.54(dd,2H),5.40(d,1H),5.24-5.17(m,4H),4.77(d,1H),4.63(d,2H),4.23-4.21(m,5H),4.10(m,1H),3.96-3.94(m,3H),3.80(m,4H),3.60(m,2H),3.50-3.40(m,24H).MS(ESI):832.9[(M-2Na)/2]-
实施例4 五糖I-4的制备
合成路线:
制备方法:
参照实施例1的方法,以DE7和FGH4为原料发生反应,再经氢解反应脱除苄基、发生硫酸化反应和水解反应,制得五糖I-4。
化合物DEFGH20-1:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06-7.67(m,5H),7.33-7.30(m,30H),5.99(d,J=8Hz,,2H),5.60(m,3H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,2H),4.64–4.62(m,14H),4.25-4.19(m,6H),4.00(m,2H),3.80-3.77(m,6H),3.70(s,6H),3.61-3.35(d,7H),3.41(d,18H),2.02(s,3H).MS(ESI):1719.7[M+Na]+
化合物DEFGH21-1:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06-7.67(m,5H),5.99(d,J=8Hz,2H),5.60(d,1H),5.40(m,2H),5.17(dd,J=8.0,3.4Hz,2H),4.77(d,2H),4.71(d,2H),4.64–4.62(m,2H),4.49-4.19(d,6H),3.94(m,2H),3.90(m,4H),3.81-3.76(m,4H),3.70(d,6H),3.57(d,3H),3.51-3.50(m,4H),3.41-3.40(m,18H),3.30(m,2H),2.02(s,6H).MS(ESI):1179.4[M+Na]+
化合物DEFGH22-1:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06-7.67(m,5H),5.99(d,J=8Hz,,1H),5.60(d,1H),5.54(m,2H),5.24-5.17(m,6H),4.64–4.62(m,2H),4.49-4.19(m,8H),3.96-3.94(m,4H),3.70(m,6H),3.70(d,6H),3.50-3.40(m,21H),2.02(s,6H).MS(ESI):861.0[(M-2Na)/2]-
化合物I-4:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.60(d,J=3.6Hz,1H),5.54(dd,2H),5.40(d,2H),5.24-5.17(m,4H),4.77(d,2H),4.63(d,2H),4.23-4.21(m,4H),4.10(m,2H),3.96-3.94(m,5H),3.80(m,3H),3.60-3.50(m,5H),3.44-3.40(m,20H).MS(ESI):775.0[(M-2Na)/2]-
实施例5 五糖I-5的制备
合成路线:
制备方法:
参照实施例1的方法,以DE8和FGH4为原料发生反应,再经氢解反应脱除苄基、发生硫酸化反应和水解反应,制备五糖I-5。
化合物DEFGH30-1:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06-7.67(m,5H),7.33-7.30(m,30H),5.99(d,J=8Hz,,2H),5.60(m,3H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,2H),4.64–4.62(m,14H),4.25-4.19(m,6H),4.00(m,2H),3.80-3.77(m,6H),3.70(s,6H),3.61-3.35(d,7H),3.41(d,18H),2.02(s,3H).MS(ESI):1719.7[M+Na]+
化合物DEFGH31-1:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06-7.67(m,5H),5.99(d,J=8Hz,2H),5.60(d,1H),5.40(m,2H),5.17(dd,J=8.0,3.4Hz,2H),4.77(d,2H),4.71(d,2H),4.64–4.62(m,2H),4.49-4.19(d,6H),3.94(m,2H),3.90(m,4H),3.81-3.76(m,4H),3.70(d,6H),3.57(d,3H),3.51-3.50(m,4H),3.41-3.40(m,18H),3.30(m,2H),2.02(s,6H).MS(ESI):1179.4[M+Na]+
化合物DEFGH32-1:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06-7.67(m,5H),5.99(d,J=8Hz,,1H),5.60(d,1H),5.54(m,2H),5.24-5.17(m,6H),4.64–4.62(m,2H),4.49-4.19(m,8H),3.96-3.94(m,4H),3.70(m,6H),3.70(d,6H),3.50-3.40(m,21H),2.02(s,6H).MS(ESI):861.0[(M-2Na)/2]-
化合物I-5:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.60(d,J=3.6Hz,1H),5.54(dd,2H),5.40(d,2H),5.24-5.17(m,4H),4.77(d,2H),4.63(d,2H),4.23-4.21(m,4H),4.10(m,2H),3.96-3.94(m,5H),3.80(m,3H),3.60-3.50(m,5H),3.44-3.40(m,20H).MS(ESI):775.0[(M-2Na)/2]-
实施例6 五糖I-6(R1=甲基)的制备
合成路线:
制备方法:
参照实施例1的方法,以DE9和FGH4为原料发生反应,再经氢解反应脱除苄基、发生硫酸化反应和水解反应,制备五糖I-6。
化合物DEFGH60-1:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06-7.50(m,5H),7.33-7.30(m,30H),5.99(d,J=8Hz,,2H),5.60(m,4H),5.17(dd,J=9.0,3.4Hz,1H),4.64–4.62(m,14H),4.49-4.19(m,5H),4.00(m,2H),3.80-3.77(m,8H),3.70(s,6H),3.61-3.42(d,5H),3.41(d,21H),3.36(d,2H),2.02(s,3H).MS(ESI):1691.7[M+Na]+
化合物DEFGH61-1:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06-7.55(m,5H),5.99(d,J=8Hz,1H),5.60(d,2H),5.40(m,2H),5.17(dd,J=8.0,3.4Hz,1H),4.77(d,2H),4.71(d,2H),4.64–4.62(m,2H),4.49-4.10(m,8H),3.94(m,2H),3.90(m,4H),3.81-3.79(m,6H),3.70(d,6H),3.60-3.50(m,5H),3.41-3.40(m,21H),3.30(m,2H),2.02(s,3H).MS(ESI):1141.4[M+Na]+
化合物DEFGH62-1:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.06-7.55(m,5H),5.99(d,J=8Hz,,1H),5.60(d,2H),5.54(m,2H),5.24-5.17(m,4H),4.64-4.62(m,2H),4.49-4.19(m,8H),3.96-3.94(m,4H),3.80(d,4H),3.70(d,6H),3.50-3.40(m,24H),2.02(s,3H).MS(ESI):847.0[(M-2Na)/2]-
化合物I-6:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.60(d,2H),5.54(dd,2H),5.40(d,1H),5.30-5.24(m,4H),4.77(s,1H),4.63(d,2H),4.23-4.21(m,4H),4.10(m,1H),3.96-3.94(m,5H),3.80-3.74(m,5H),3.60-3.44(m,6H),3.41-3.40(m,21H).MS(ESI)782.0[(M-2Na)/2]-
实施例7 生物学试验
本发明的五糖化合物的生物学活性测试可以采用本领域技术人员公知的方法进行测定。可以理解的是,下述测试方法对本发明的范围不构成任何限制。
1.AT III结合KD值测定
采用荧光测量法,使用Perkin Elmer LS-50型荧光分光光度计;激发λ280nm,发射λ338nm;配备恒温样品室,在37℃下,连续搅拌。将五糖化合物加入2mL Tris-HCl缓冲液(0.01M,pH值7,0.15M NaCl,和5-60n人AT-Ⅲ)试管。
AT-Ⅲ-五糖复合物的比例与浓度的计算按1∶1反应来计量,解离常数KD的测定采用Scatchard分析。结果为平均值±SEM,n=3。
2.抗凝血因子Xa活性的测定
本发明的五糖化合物通过激活抗凝血酶AT III来抑制凝血因子Xa。抗Xa活性测定采用抗Xa酰胺分解AT III法(即生色底物法)。在37℃下,凝血因子Xa(在20mM Tris/马来酸盐缓冲液中,浓度为7.5nkat/毫升,pH=7.4,NaCl 150mM;100μL),AT III(在20mM Tris/马来酸盐缓冲液中,浓度为0.5单位/毫升,pH=7.4,NaCl 150mM;100μL)和本发明的五糖(在20mM Tris/马来酸盐缓冲液中,浓度为0.5单位/毫升,pH=7.4,NaCl 150mM;100μL)培养2分钟。然后加入S-2222培养基(Bz-异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸pNA;1mM在50mM Tris-HCl缓冲液中,pH=8.4,175mM NaCl、EDTA 27.5mM;100μL)来测量残余的凝血因子Xa。2分钟后加入50%的乙酸水溶液(100μL)停止反应,在405nm处测量吸光度。然后计算抑制的百分比,公式:抑制%=100×(对照缓冲液的A405-样品的A405)/对照缓冲液的A405;与校准过的标准比较,使用Excel 2015软件测定化合物的活性。结果为平均值±SEM,n=3。
3.半衰期(T1/2)测定
在静脉内给药后,于雄性Wistar大鼠中对本发明的五糖化合物的药代动力学进行研究,给药剂量为100nmol/Kg。给药后在多个时间点采集血样,将9体积的血样与1体积的0.129M柠檬酸钠溶液混合并立即冰浴冷却,使样品在低温下接受3000Xg离心10分钟,并在-20℃下冻存。通过凝血因子Xa活性来测定每毫升血浆中化合物的浓度。对于各化合物,由浓度相对于时间的曲线来计算清除半衰期。
结果如下表所示:
化合物 | AT III结合K<sub>D</sub>值(nM) | 抗Xa因子活性(units/mg) | 半衰期(T<sub>1/2</sub>,h) |
I-1 | 28±3 | 1300±38 | 1.6±0.1 |
I-2 | 26±2 | 1050±22 | 1.5±0.1 |
I-3 | 26±1 | 1000±32 | 1.4±0.1 |
I-4 | 24±3 | 990±33 | 1.7±0.1 |
I-5 | 25±2 | 1400±45 | 1.9±0.1 |
I-6 | 27±2 | 900±29 | 2.0±0.1 |
磺达肝癸钠 | 55±3 | 845±23 | 0.6±0.1 |
上表数据显示,本发明的五糖化合物具有强效的抗Xa活性,与磺达肝癸钠相比,本发明的五糖化合物的抗Xa活性是其1~1.6倍;并且本发明的五糖化合物的半衰期较磺达肝癸钠更长。
4.出血影响试验
将雄性Wistar大鼠(体重18-22g)随机分为6个试验组、空白组和对照组,每组12只。6个试验组分别静脉内注射五糖I-1、I-2、I-3、I-4、I-5和I-6,对照组静脉内注射磺达肝癸钠,空白组静脉内注射生理盐水。每组再分为四个小组,分别以1mg/Kg、3mg/Kg、10mg/kg和15mg/kg的剂量给药,本发明的五糖化合物以其钠盐计。给药1h后,将大鼠的尾巴剪下约5mm并浸入40mL蒸馏水中,37℃下恒温搅拌90min。采用分光光度分析法测定水中血红蛋白的量,检测波长为540nm,制备标准曲线,计算出血量。结果取平均值±SD,n=3。
上表结果显示,在高的给药剂量下,本发明的五糖化合物对出血倾向的影响显著小于阳性对照磺达肝癸钠。
Claims (13)
4.根据权利要求1-3中任一项所述的酸及其盐,其中R1为甲基。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的酸及其盐,其为钠盐、钾盐、钙盐或铵盐。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的酸及其盐,其为钠盐、钾盐。
10.药物组合物,其包含作为活性成分的权利要求1~6中任一项所述的酸或其盐及任选的药学上可接受的辅料。
11.根据权利要求10所述的药物组合物,其含有0.1mg~100mg的活性成分。
12.权利要求1~6中任一项所述的酸或其盐或权利要求10-11中任一项所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与血液凝固障碍相关的疾病和疾病状态的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途,所述疾病和疾病状态为深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、由血栓形成或栓塞引起的动脉堵塞、术后静脉血栓形成或栓塞、肺栓塞和非ST段抬高心肌梗死。
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