SK284134B6

SK284134B6 - Deriváty sacharidov, farmaceutická kompozícia, ktorá ich obsahuje, a ich použitie

Info

Publication number: SK284134B6
Application number: SK736-2000A
Authority: SK
Inventors: Boeckel Constant Adriaan Anton Van; Maurice Petitou; Philippe Duchaussoy; Cornelia Maria Tromp; Johannes Egbertus Maria Basten
Original assignee: Sanofi-Synthelabo
Priority date: 1997-11-19
Filing date: 1998-11-16
Publication date: 2004-09-08
Also published as: SK7362000A3; AR017640A1; EP1032579B1; BRPI9804699B1; KR100518497B1; AU9324298A; EE04348B1; CN1177855C; CA2253113C; IL126893A0; HUP9802663A2; HUP9802663A3; ZA9810559B; CZ293639B6; CZ376198A3; HU226685B1; CN1222524A; BR9804699A; HU9802663D0; UA49089C2

Abstract

Opísaný je derivát sacharidu všeobecného vzorca (I), kde R1 je C1-4alkoxyskupina, R2, R3 a R4 sú nezávisle od seba C1-4alkoxyskupina alebo OSO3-, celkový počet sulfátových skupín je 4, 5 alebo 6 a zahnuté čiary predstavujú väzby buď nad, alebo pod rovinou šesťčlenného kruhu, na ktorý sú pripojené, alebo jeho farmaceuticky prijateľná soľ. Zlúčeniny majú antitrombotickú aktivitu a môžu sa použiť na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu trombózy a na inhibíciu proliferácie buniek hladkého svalstva.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka derivátov sacharidov, farmaceutickej kompozície, ktorá ich obsahuje a tiež použitia týchto derivátov sacharidov na výrobu liečiva.

Doterajší stav techniky

Heparín je bežne používaný antikoagulant z biologických zdrojov, ako je črevná sliznica. V prítomnosti heparínu sa veľmi urýchľuje deaktivácia trombínu antitrombínom III (AT-ΠΙ), pričom dochádza k zmenám konformácie tak heparínu, ako aj AR-ΠΙ, komplexáciou. Trombín riadi posledný krok pri kaskáde koagulácie krvi. Prvotnou funkciou trombínu je štiepenie fibrinogénu, pričom vznikajú fibrínové monoméry, ktoré tvoria pomocou zosietenia nerozpustný gél, fibrínovú zrazeninu.

Štruktúrne znaky heparínu, ktoré sú potrebné na interakciu s AT-ΠΙ sú predmetom rôznych výskumov. Existujú časti heparínového polyméru, ktoré majú nízku afinitu k AT-ΠΙ, zatiaľ čo o iných častiach sa ukázalo, že sú významnejšie na väzbu na ΑΤ-III. Štúdie fŕagmentovaného heparínu nakoniec vyústili do identifikácie pentasacharidového fragmentu, ktorý je minimálny vysokoafinitnou štruktúrou, ktorá sa viaže na AT-ΠΙ (pozri napríklad Physiological Reviews, 71 (2), 488/9, 1991). V tomto vysokoafinitnom fragmente je prítomných osem sulfátových skupín. Zistilo sa, že štyri z týchto sulfátových skupín sú zásadné pre väzbu na ΑΤ-III (Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry; Vol, 43; R.S.Tipson, D.Horton; Publ. Harcourt Brače Jovanovich; B Času (strany 51 - 127), par. 6), zatiaľ čo ostatné ďalej prispievajú k vyššej afinite. Toto zistenie sa potvrdilo pri syntetických analógoch pentasacharidového fragmentu (pozri napríklad Angew. Chem. 32, (12), 1671-1818,1993).

Identifikácia vysokoafinitného pcntasacharidového fragmentu inšpirovala prípravu jeho syntetických analógov. Ukázalo sa, že malé syntetické molekuly sacharidov glykozaminoglykánového typu sú účinné a selektívne anii-Xa inhibítory. Pozri napríklad Európsky patent 84,999. Nedávne patenty/patentové prihlášky ukazujú, že veľa rôznych variantov týchto molekúl má podobnú a dokonca vyššiu aktivitu a ďalšie zlepšené farmakologické vlastnosti, ako napríklad deriváty sacharidov príbuzné glykozaminoglykánu opísané v EP 529,715 a EP 454,220. Tieto deriváty sacharidov sú bez charakteristických funkčných skupín glykozaminoglykánov: voľné hydroxylová skupiny, N-sulfátové skupiny a N-acetylové skupiny. Ďalej všetky pentasacharidy opísané v týchto patentových prihláškach nesú najmenej sedem sulfátových skupín. V oblasti antitrombotických derivátov oligosacharidov sa všeobecne predpokladá, že je potrebných najmenej sedem sulfátových skupín na pentasacharidových zlúčeninách, aby sa dosiahla klinicky prijateľná hladina antitrombotickej aktivity.

Neočakávane sa však objavila trieda derivátov sacharidov príbuzných glykozaminoglykánu, ktoré majú len šesť sulfátových skupín a ktoré stále majú výraznú klinicky účinnú antitrombotickú aktivitu. Okrem toho zlúčeniny podľa predloženého vynálezu majú slabšie vedľajšie účinky. Napríklad sa znižuje nebezpečie krvácania a nízky obsah sulfátu v zlúčeninách nevyvoláva trombocytopéniu vyvolanú heparínom (HIT) [HIT je závažný vedľajší účinok, ktorý môže byť príčinou smrti pacienta]. Ďalej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu majú biologický polčas, ktorý umožňuje liečbu raz denne. Liečba raz denne je považovaná za výhodnejšiu ako napríklad liečba raz týždenne, pretože umožňuje rýchlu úpravu spôsobu liečenia, ak to stav pacienta vyžaduje. Tiež nemocničná logistika jc ľahšia pri liečbe raz denne, pretože na liečenie pacientov nie je potrebná komplexná dávkovacia schéma.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu majú neočakávaný a citlivo vyvážený farmakologický profil.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka derivátov sacharidov všeobecného vzorca (I)

D E F G H kde R¹ je alkoxyskupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka; R², R³ a R⁴ sú nezávisle od seba alkoxyskupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka alebo skupina OSO₃; celkový počet sulfátových skupín jc 4, 5 alebo 6; a zahnuté čiary sú väzby buď nad, alebo pod rovinu šesťčlenného kruhu, na ktorý sú pripojené; alebo ich farmaceutický prijateľných solí.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú vhodné na liečenie a prevenciu ochorení sprostredkovaných trombínom a súvisiacich s trombínom. Zahŕňajú veľa trombotických a protrombotických stavov, pri ktorých sa aktivuje koagulačná kaskáda, ktoré zahŕňajú hlbokú cievnu trombózu, pľúcnu embóliu, tromboflebitídu, arteriálnu oklúziu spôsobenú trombózou alebo embóliou, arteriálnu reoklúziu v priebehu alebo po angioplastike alebo trombolýze, restenózu nasledujúcu po arteriálnych poraneniach alebo inváznych kardiologických postupoch, postoperatívnu cievnu trombózu alebo embóliu, akútnu alebo chronickú aterosklerózu, mŕtvicu, infarkt myokardu, rakovinu a metastázy a neurodegeneratívne ochorenia. Deriváty sacharidov podľa predloženého vynálezu sa môžu tiež použiť ako inhibítory proliferácie buniek hladkých svalov a na liečenie angiogenézy, rakoviny a retrovírusových infekcií, ako je HIV.

Ďalej sa môžu zlúčeniny podľa predloženého vynálezu použiť ako antikoagulanty a antikoagulačné povlaky v mimotelových krvných obehoch, ak je to nutné pri dialýze a v chirurgii.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu tiež použiť ako in vitro alebo ex vivo antikoagulanty.

Výhodné deriváty sacharidov podľa predloženého vynálezu majú všeobecný vzorec (I), kde D jednotka má štruktúru

R¹ je metoxyskupina a R², R³ a R⁴ sú nezávisle od seba metoxyskupina alebo skupina OSO₃.

Výhodnejšími derivátmi sacharidov sú tie, kde R² je metoxyskupina. Zvlášť výhodnými derivátmi sacharidov sú tie, kde R³ je metoxyskupina. Najvýhodnejším derivátom sacharidu je ten, kde R⁴ je metoxyskupina.

Vo výraze alkoxyskupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka je alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka rozvetvená alebo nerozvetvená alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, ako je metylová skupina, etylová skupina, izopropylová skupina, íerc-butylová skupina a podobne. Najvýhodnejšou alkylovou skupinou je metylová skupina.

Protiióny, ktoré kompenzujú nabité skupiny, sú farmaceutický prijateľné protiióny, ako je vodík alebo výhodnejšie ióny alkalických kovov alebo ióny kovov alkalických zemín, ako je sodík, vápnik alebo horčík.

Deriváty sacharidov podľa predloženého vynálezu sa môžu pripraviť podľa známych spôsobov opísaných a používaných na syntézu oligosacharidov. V tomto ohľade je potrebné uviesť najmä už uvedený Európsky patent EP 529,715. Vhodný spôsob prípravy derivátov sacharidov všeobecného vzorca (I) sa vyznačuje tým, že zahŕňa spôsob, keď sa chránené monosacharidy, ktoré majú rôznu štruktúru, kondenzujú a získajú sa chránené disacharidy, po čom nasleduje:

(a) chránené disacharidy jedného typu sa kondenzujú na chránené disacharidy iného typu a získajú sa chránené tetrasacharidy, ktoré sa kondenzujú na chránený monosacharid a získa sa chránený pentasacharid; alebo (b) chránené monosacharidy sa kondenzujú na chránené disacharidy a získajú sa chránené trisacharidy, ktoré sa ďalej kondenzujú na chránené disacharidy a získajú sa chránené pentasacharidy;

potom sa ochranné skupiny odštiepia a voľné hydroxylová skupiny sa sulfátujú a získané zlúčeniny sa prípadne prevedú na farmaceutický prijateľné soli.

Monosacharidy sú D-glukóza, D-manóza, L-idóza, D-glukurónová kyselina alebo L-idurónová kyselina vhodne funkcionalizované požadovanými alkylovými skupinami alebo prechodne ochrannými skupinami. Vhodné ochranné skupiny sú odborníkom v tejto oblasti známe. Medzi výhodné ochranné skupiny patrí benzylová skupina a acetylová skupina pre hydroxylovú skupinu a benzylová skupina pre karboxylátové skupiny uránových kyselín. S takým istým úspechom sa môžu tiež použiť ďalšie ochranné skupiny, ako je benzoylová skupina, levulinylová skupina, alkoxyfenylová skupina, chlóracetylová skupina, tritylová skupina a podobne. Kondenzácia sacharidu sa uskutočňuje spôsobom, ktorý je odborníkom v tejto oblasti známy, napríklad odstránením ochrannej skupiny v polohe 1 donora glykozylu a/alebo aktiváciou tejto polohy (napríklad pomocou prípravy bromidu, pentenylu, fluoridu, tioglykozidu alebo derivátu trichlóracetamidu) a kondenzáciou aktivovaného donora glykozylu s prípadne chráneným akceptorom glykozylu.

Na liečenie cievnej trombózy alebo inhibíciu proliferácie buniek hladkého svalstva sa môžu zlúčeniny podľa predloženého vynálezu podávať enterálne alebo parenterálne a pri podávaní človekovi sa výhodná denná dávka pohybuje v rozsahu 0,001 až 10 mg na kg telesnej hmotnosti. V zmesi s farmaceutický vhodnými prísadami, ktoré sú opísané napríklad v štandardných odkazoch, Gennaro a sol., Remington’s Pharmaceutical Science (18 vydanie, Mack Publishing Company, 1990, pozri najmä časť 8: Pharmaceutical Preparations a Thcir Manufacture), sa môžu zlúčeniny stlačiť do pevných dávkovacích jednotiek, ako sú pilulky, tablety, alebo spracovať do toboliek alebo čapíkov. Pomocou farmaceutický vhodných kvapalín sa môžu zlúčeniny podľa predloženého vynálezu aplikovať tiež ako injekčné prostriedky vo forme roztokov, suspenzii, emulzii alebo spreja, napríklad nosného spreja.

Na prípravu dávkovacích jednotiek, napríklad tabliet, sa použijú bežné prísady, ako sú plnivá, farbivá, polyméme spojivá a podobne. Všeobecne sa môžu použiť farmaceu tický prijateľné prísady, ktoré nerušia funkciu aktívnych zlúčenín. Vhodné nosiče, s ktorými sa môžu prostriedky podávať, zahŕňajú laktózu, škrob, deriváty celulózy a podobne alebo ich zmesi, ktoré sa použijú vo vhodnom množstve.

Vynález je ďalej ilustrovaný pomocou príkladov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príprava príkladu 1 (zlúčenina 32) Syntéza GH disacharidu 16 (schéma 1+2) Zlúčenina 2

Zlúčenina 1 (60 g; komerčne dostupná) sa rozpustí v Ν,Ν-dimetylformamide (858 ml) spolu s benzylbromidom (50,5 ml). Zmes sa ochladí na +10 °C a prikvapká sa 20 % roztok hydroxidu sodného. Po 1 hodine miešania sa teplota zvýši na 20 °C a zmes sa mieša ďalších 20 hodín. Roztok sa potom naleje do zmesi ľadovej vody a toluénu a extrahuje sa. Organická vrstva sa odparí a surový produkt sa čistí pomocou kryštalizácie, pričom sa získa 30,0 g zlúčeniny 2. TLC: Rf = 0,60, toluén/etylacetát: 7/3 objemovo.

Zlúčenina 3

Zlúčenina 2 (26,4 g) sa rozpustí v Ν,Ν-dimetylformamide (211 ml) a ochladí sa v ľade. V dusíkovej atmosfére sa pridá hydroxid sodný (2,5 g). Potom sa prikvapká 4-metoxybenzylchlorid (13,3 g) a zmes sa mieša 1 hodinu pri teplote miestnosti. Zmes sa potom zriedi etylacetátom, premyje sa dvakrát vodou a odparí sa, pričom sa získa 40,7 g surovej zlúčeniny 3.

TLC: Rf = 0,80, toluén/etylacetát: 7/3 objemovo

Zlúčenina 4

Zlúčenina 3 (34,9 g) sa rozpustí v 60 % vodnej kyseline octovej a mieša sa 4 hodiny pri 60 °C. Zmes sa zriedi toluénom a odparí sa. Po čistení pomocou chromatografie sa získa 26,4 g zlúčeniny 4.

TLC: Rf = 0,07, toluén/etylacetát: 7/3 objemovo

Zlúčenina 5

Zlúčenina 4 (26,4 g) sa v dusíkovej atmosfére rozpustí v dichlórmetáne (263 ml). Pri teplote miestnosti sa pridá trimetyloxóniumtetrafluoroborát (11,6 g) a 2,6-diterc-butyl-4-metylpyridín (17,4 g). Po 4 hodinách sa zmes naleje do zmesi ľadu a vody a extrahuje sa dichlórmetánom. Organická vrstva sa premyje hydrogenuhličitanom sodným a odparí sa. Po čistení surového produktu pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 18,5 g zlúčeniny 5. TLC: Rf = 0,25, toluén/etylacetát: 7/3 objemovo

Zlúčenina 7

Zlúčenina 6 (3-metyl-l,2,4,6-tetraacetylidóza) (48,4 g) sa rozpustí v toluéne (175 ml). V dusíkovej atmosfére sa pridá etántiol (20 ml) a dietyiéterát fluoridu boritého (1M v toluéne; 134 ml). Po 1 hodine miešania sa pridá vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (400 ml) a zmes sa mieša ďalšiu hodinu. Zmes sa potom naleje do etylacetátu. Organická vrstva sa premyje dvakrát vodou a odparí sa. Po čistení pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 29,6 g zlúčeniny 7.

TLC: Rf = 0,45, toluén/etylacetát: 6/4 objemovo

Zlúčenina 8

Zlúčenina 5 (17,5 g) a zlúčenina 7 (28,2 g) sa v dusíkovej atmosfére rozpustí v toluéne (525 ml). Po pridaní práškových molekulových sít (4) sa reakčná zmes ochladí na

SK 284134 Β6

-20 °C. Za kontinuálneho pretekania dusíka sa prikvapká čerstvo pripravený 0,1 M roztok N-jódsukcínimidu (17,4 g) a trifluórmetánsulfónovej kyseliny (1,38 ml) v zmesi dioxán/dichlórmetán (1/1 objemovo). Po 10 minútach sa červená reakčná zmes filtruje a postupne sa premyje vodným roztokom tiosíranu sodného a vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného. Organická vrstva sa odparí vo vákuu a izoluje sa 30,0 g zlúčeniny 8.

TLC: Rf = 0,45, dichlórmetán/etylacetát: 8/3 objemovo

Zlúčenina 9

Zlúčenina 8 (30,0 g) sa rozpustí v 460 ml zmesi metanol/dioxán (1/1 objemovo) a na zmydelnenie sa pridá butanolát draselný. Po 15 minútach sa zmes neutralizuje pomocou Dowex 50WX8H⁺ a odparí sa vo vákuu. Po čistení pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 17,4 g zlúčeniny 9.

TLC: Rf = 0,25, dichlórmetán/metanol: 95/5 objemovo

Zlúčenina 10

V dusíkovej atmosfére sa zlúčenina 9 (17,4 g) rozpustí v N,N-dimetylformamide (77 ml). Pridá sa 1,2-dimetoxypropán (26 ml) a p-toluénsulfónová kyselina a zmes sa mieša 30 minút. Zmes sa zriedi vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a extrahuje sa etylacetátom a po odparení rozpúšťadla sa získa 19,7 g zlúčeniny 10. TLC: Rf = 0,45, dichlórmetán/metanol: 95/5 objemovo

Zlúčenina 11

Zlúčenina 10 (18,5 g) sa rozpustí v N,N-dimetylformamide (24,4 ml) a ochladí sa na 0 °C. V dusíkovej atmosfére sa pridá hydrid sodný (1,47 g; 60 % disperzie v oleji) a roztok metyljodidu (2,36 ml). Po 1 hodine sa prebytok hydridu sodného neutralizuje, zmes sa extrahuje dichlórmetánom a odparí sa, pričom sa získa 20,0 g zlúčeniny 11. TLC: Rf = 0,85, dichlórmetán/metanol: 95/5 objemovo

Zlúčenina 12

Zlúčenina 11 (18,4 g) sa rozpustí v dichlórmetáne (838 ml) a vode (168 ml). Pridá sa 2,3-dichlór-5,6-dikyano-1,4-benzochinón (7,1 g) a zmes sa mieša 18 hodín pri 4 °C. Zmes sa naleje do vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahuje sa dichlórmetánom. Po odparení organickej vrstvy sa získa 12,7 g zlúčeniny 12.

TLC: Rf = 0,40, dichlórmetán/metanol: 95/5 objemovo

Zlúčenina 13

Zlúčenina 12 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve pomocou takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 11.

TLC: Rf = 0,48, toluén/etylacetát: 1/1 objemovo

Zlúčenina 14

Po rozpustení zlúčeniny 13 (2,5 g) v kyseline octovej (14,6 ml) a vode (6,1 ml) sa zmes mieša pri teplote miestnosti cez noc. Po odparení s toluénom a čistení pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 1,9 g zlúčeniny 14. TLC: Rf= 0,31, etylacetát

Zlúčenina 15

K roztoku zlúčeniny 14 (1,7 g) v dichlórmetáne (9 ml), sa pridá 2,2,6,6-tetrametyl-l-piperidinyloxy (5 mg), nasýtený roztok hydrogenuhličitanu sodného (5,8 ml), bromid draselný (32 mg) a tetrabutylamóniumchlorid (42 mg). Zmes sa ochladí na 0 °C a v priebehu 15 minút sa pridá zmes nasýteného roztoku chloridu sodného (6,5 ml), nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (3,2 ml) a chlómanu sodného (1,3M, 7,3 ml). Po 1 hodine sa zmes zriedi vodou a extrahuje sa trikrát dichlórmetánom. Organická vrstva sa premyje soľankou, suší sa nad síranom horečnatým, filtruje sa a odparí sa do sucha, pričom sa získa 1,74 g surovej zlúčeniny 15.

TLC: Rf = 0,14, dichlórmetán/metanol: 9/1 objemovo Metyl-O-(benzyl-2,3-Di-O-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-( 1 ->4)-O-benzyl-3,6-Di-O-metyl-a-D-glukopyranozid 16

K roztoku 1,74 g zlúčeniny 15 v N,N-dimetylformamide sa v dusíkovej atmosfére pridá 1,68 ml benzylbromidu a 1,1 g hydrogenuhličitanu draselného. Po 90 minútach miešania sa k roztoku pridá voda a zmes sa extrahuje etylacetátom. Po odparení organickej vrstvy a čistení pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 1,64 g zlúčeniny 16. TLC: Rf = 0,50, toluén/etylacetát: 1/1 objemovo Syntéza EF-disacharidu 25 (schéma 2+3)

Zlúčenina 17

Zlúčenina 12 (10,5 g) sa rozpustí v suchom N,N-dimetylformamide (178 ml) a ochladí sa v dusíkovej atmosfére na 0 °C. Pridá sa hydrid sodný (1,91 g; 60 % disperzie v olcji) a potom sa prikvapká benzylbromid (3,3 ml). Po 30 minútach je reakcia skončená a prebytok hydridu sodného sa neutralizuje. Pridá sa voda a zmes sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Po odparení rozpúšťadla sa získa 13,6 g zlúčeniny 17.

TLC: Rf = 0,50, toluén/etylacetát: 1/1 objemovo

Zlúčenina 18

Zlúčenina 17 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve pomocou takého istého postupu, aký je opísaný na prípravu zlúčeniny vzorca 14.

TLC: Rf = 0,68, dichlórmetán/metanol: 9/1 objemovo

Zlúčenina 19

Zlúčenina 18 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve pomocou takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 15.

TLC: Rf = 0,14, dichlórmetán/metanol: 9/1 objemovo

Zlúčenina 20

Zlúčenina 19 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve pomocou takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 16.

TLC: Rf = 0,38, dichlórmetán/metanol: 85/15 objemovo

Zlúčenina 21

Zlúčenina 20 (9,9 g) sa rozpustí v 300 ml metanolu (suchého) a zohrieva sa v dusíkovej atmosfére do varu pod spätným chladičom. Prikvapká sa IM roztok metoxidu sodného (65,2 ml) a zmes sa mieša 3 hodiny. Teplota sa potom zníži na teplotu miestnosti a pridá sa IN roztok hydroxidu sodného (22,2 ml) a zmes sa mieša 90 minút. Zmes sa neutralizuje pomocou Dowex 50WX8H⁺ a rozpúšťadlo sa odparí do sucha, pričom sa získa surový zvyšok. V dusíkovej atmosfére sa pridá Ν,Ν-dimetylformamid (192 ml) a práškové molekulové sitá (4Ä). Pridá sa hydrogenuhličitan draselný (3,2 g) a benzylbromid (4,8 ml) a zmes sa mieša 5 hodín, potom sa pridá etylacetát a zmes sa premyje vodou. Po odparení rozpúšťadla a čistení surového produktu pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 6,19 g zlúčeniny 21 a 1,88 g zlúčeniny 20.

TLC: Rf = 0,74, dichlórmetán/metanol: 9/1 objemovo

Zlúčenina 22

Zlúčenina 21 (6,2 g) sa rozpusti v 40 ml dioxánu. Pridá sa levulínová kyselina (2,1 g), dicyklohexylkarbodiimid (3,75 g) a 4-dimetylaminopyridín (0,2 g) a zmes sa mieša 2 hodiny v dusíkovej atmosfére. Pridá sa éter a zrazenina sa odfiltruje. Organická vrstva sa premyje vodným roztokom hydrogensíranu draselného a odparí sa. Po kryštalizácii zo zmesi dietyléter/heptán sa získa 6,2 g zlúčeniny 22. TLC: Rf = 0,26, dichlórmetán/acetón: 95/5 objemovo

Zlúčenina 23

Zlúčenina 22 (6,1 g) sa v dusíkovej atmosfére rozpustí v anhydride kyseliny octovej (256 ml) a ochladí sa na -20 °C. V priebehu 30 minút sa prikvapká zmes kyseliny sírovej (4,9 ml) v anhydride kyseliny octovej (49 ml). Po 60 minútach sa pridáva octan sodný, pokiaľ nie je pH zmesi neutrálne. Pridá sa etylacetát a voda a organická vrstva sa odparí. Po čistení pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 4,2 g zlúčeniny 23.

TLC: Rf = 0,63, dichlórmetán/acetón: 9/1 objemovo

Zlúčenina 24

Zlúčenina 23 (4,2 g) sa rozpusti v tetrahydrofuráne (42 ml) a pridá sa piperidín (4,1 ml). Zmes sa mieša pri teplote miestnosti cez noc. Pridá sa etylacetát a zmes sa premyje 0,5N kyselinou chlorovodíkovou. Organická vrstva sa odparí a zvyšok sa čistí pomocou chromatografie na silikagéli, pričom sa získa 3,2 g zlúčeniny 24.

TLC: Rf = 0,33, dichlórmetán/etylacetát: 1/1 objemovo 0-(Benzyl-2,3-di-0-metyl-4-0-levulinoyl-B-D-glukopyranozyluronát)-( 1 —>4)-3-O-acetyl-2-O-benzyl-6-O-metyl-D-glukopyranozyl trichlóracetamidát 25

Zlúčenina 24 (1,59 g) sa v dusíkovej atmosfére rozpusti v dichlórmetáne. Pridá sa trichlóracetonitril (1,1 ml) a uhličitan cézny (72 mg) a zmes sa mieša 1 hodinu. Uhličitan cézny sa odfiltruje a filtrát sa odparí. Po čistení pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 1,57 g zlúčeniny 25. TLC: Rf = 0,60, toluén/etylacetát: 3/7 objemovo Syntéza EFGH-tetrasacharidu 27 (schéma 4)

Zlúčenina 26

Zmes zlúčeniny 16 (0,530 g) a zlúčeniny 25 (0,598 mg) sa súši pomocou spoločného odparenia so suchým toluénom a rozpustí sa v 8,2 ml suchého dichlórmetánu. Pridajú sa práškové molekulové sitá (4Ä) a zmes sa v dusíkovej atmosfére ochladí na -20 °C a mieša sa 30 minút. K získanej suspenzii sa pridá trimetylsilyltrifluórmetánsulfonát (15 % molárnych vzhľadom na zlúčeninu 25). Po 10 minútach miešania sa pridá hydrogenuhličitan sodný, zmes sa filtruje a pridá sa dichlórmetán a voda. Organická vrstva sa potom extrahuje, odparí a surový produkt sa čistí pomocou chromatografie na silikagéli, pričom sa získa 0,62 g zlúčeniny 26.

TLC: Rf = 0,47, toluén/etylacetát: 3/7 objemovo Metyl-O-(benzyl-2,4-di-O-dimetyl-B-D-glukopyranozyluronát)-( 1 ->4)-O-(3-O-acetyl-2-O-benzyl-6-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-O-(benzyl-2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-(l—>4)-2-O-benzyl-3,6-di-O-metyl-a-D-glukopyranozid 27

K roztoku zlúčeniny 26 (0,58 g) v pyridine sa pridá zmes 2,76 ml kyseliny octovej, 0,32 ml hydrátu hydrazínu v 2,1 ml pyridínu. Po 9 minútach sa pridá voda a dichlórmetán a organická vrstva sa premyje IN kyselinou chlorovodíkovou a vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného. Po čistení pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 0,27 g zlúčeniny 27.

TLC: Rf = 0,45, toluén/etylacetát: 3/7 objemovo Syntéza DEFGH-pentasacharidu 32 (schéma 4+5). Príklad I

Zlúčenina 29

Zmes zlúčeniny 27 (150 mg) a 76 mg zlúčeniny 28 (odkaz: Bioorganic and Medicinal Chemistry, vol. 2, č. 11, 1267-1280, 1994) sa suší spoločným odparením so suchým toluénom a rozpusti sa v 7,5 ml suchého dichlórmetánu. V dusíkovej atmosfére sa pridajú práškové molekulové sitá (4Ä) a zmes sa ochladí na -20 °C. Po 20 minútach miešania sa pridá trimetylsilyltrifluórmetánsulfonát (15 % molárnych vzhľadom na zlúčeninu 28). Po 30 minútach miešania sa pridá vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Zmes sa filtruje a organická vrstva sa premyje vodou. Po odparení rozpúšťadla sa získa surový produkt, ktorý sa čistí pomocou chromatografie na silikagéli, pričom sa získa 136 mg zlúčeniny 29.

TLC: Rf = 0,33, toluén/etylacetát: 4/6 objemovo

Zlúčenina 30

Zlúčenina 29 sa rozpustí v zmesi terc-butanolu (8 ml) a vody (1 ml). K roztoku sa pridá 122 mg 10 % paládia na aktívnom uhlí a zmes sa mieša cez noc vo vodíkovej atmosfére. Paládium na aktívnom uhlí sa odfiltruje a roztok sa odparí, pričom sa získa 84,5 mg zlúčeniny 30.

TLC: Rf = 0,49, etylacetát/pyridin/kyselina octová/voda: 13/7/1,6/4 objemovo

Zlúčenina 31

Zlúčenina 30 (84,5 mg) sa rozpustí v 5 ml 0,3N hydroxidu sodného a mieša sa 3 hodiny. Reakčná zmes sa potom neutralizuje 0,5N kyselinou chlorovodíkovou a odparí sa. Zvyšok sa odsolí na kolóne Sephadex G25 pomocou zmesi voda/acetonitril (9/1 objemovo) a prefiltruje sa cez krátku kolónu Dowex 50WX8H⁺. Po odparení sa izoluje 75,6 mg zlúčeniny 31.

TLC: Rf = 0,43, etylacetát/pyridin/kyselina octová/voda: 8/7/1,6/4 objemovo

Hexasodná soľ metyl O-(2,3,4-tri-O-metyl-6-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-O-(2,3-di-O-metyl-B-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l —>4)-O-(6-O-metyl-2,3-di-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-O-(2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-( 1 ->4)-3,6-di-O-metyl-2-O-sulfo-a-D-glukopyranozidu, 32

Zlúčenina 31 (30,6 mg) sa rozpustí v 2,15 ml N,N-dimetylformamide (destilovaný; suchý) a v dusíkovej atmosfére sa pridá komplex trietylamín oxid sírový (120 mg). Zmes sa mieša cez noc pri teplote 55 °C. Pridá sa suspenzia hydrogenuhličitanu sodného vo vode. Zmes sa mieša 1 hodinu pri teplote miestnosti a rozpúšťadlo sa odparí. Zvyšok sa rozpustí vo vode (2 ml) a odsolí sa na kolóne Sephadex G25 pomocou zmesi voda/acetonitril (9/1 objemovo). Izolovaný produkt sa eluuje na kolóne Dowex 50WX8H⁺ a získa sa 42,5 mg pentasacharidovej zlúčeniny 32.

[a]²⁰ _D = +56,8 (c=l, voda)

Chemické posuny anomémych protónov: 5,32, 5,22, 4,97, 4,89 a 4,24 ppm.

Príprava príkladu II (zlúčenina 38)

Syntéza EFGH-tetrasacharidu 34 (schéma 4)

Zlúčenina 33

Zlúčenina 25 a zlúčenina 20 sa kondenzujú podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 26. TLC: Rf = 0,47, toluén/etylacetát: 3/7, objemovo Metyl-O-(Benzyl 2,4-di-O-dimetyl-fi-D-glukopyranozyluronát)-(l->4)-O-(3-O-acetyl-2-O-benzyl-6-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l—>4)-O-(benzyl-2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-( 1 ->4)-2,3-di-O-benzyl-6-O-metyl-a-D-glukopyranozid 34

Zlúčenina 33 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve pomocou takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 27.

TLC: Rf = 0,39, heptán/etylacetát: 3/7, objemovo

Syntéza DEFGH-pentasacharidu 38 (schéma 4+5) (Príklad Π)

Zlúčenina 35

Zlúčenina 34 a zlúčenina 28 sa kondenzujú a získa sa zlúčenina uvedená v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 29.

TLC: Rf = 0,60, toluén/etylacetát: 3/7, objemovo

Zlúčenina 36

Zlúčenina 35 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 30.

TLC: Rf = 0,39, etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda: 13/7/1,6/4, objemovo

Zlúčenina 37

Zlúčenina 36 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 31.

TLC: Rf = 0,32, etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda: 13/7/1,6/4, objemovo

Hexasodná soľ metyl-O-(2,3,4-tri-O-metyl-6-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-( 1 -+4)-0-(2,3-di-O-metyl-B-D-glukopyranozylurónová kyselina)-( 1 ->4)-O-(6-O-metyl-2,3-di-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(l -+4)-0-(2.3-di-O-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-( 1 ^4)-6-O-mctyl-2,3-di-O-sulfo-a-D-glukopyranozidu, 3 8

Zlúčenina 37 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 32.

[ct]²⁰ _D =+53,6 (c = 1, voda)

Chemický posun anomémych protónov: 5,32, 5,23, 4,99, 4,9 a 4,23 ppm.

Príprava príkladu III (zlúčenina 56)

Syntéza GH-disacharidu 50 (schéma 1+2)

Zlúčenina 39

Zlúčenina 2 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 11.

TLC: Rf= 0,52, dichlórmetán/acetón: 98/2, objemovo

Zlúčenina 40

Zlúčenina 39 (32,0 g) sa rozpustí v metanole (538 ml). Pridá sa p-toluénsulfónová kyselina (1,57 g) a zmes sa mieša 1,5 hodiny pri teplote miestnosti. Po neutralizácii trietylamínom sa zmes odparí. Po čistení pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 11,9 g zlúčeniny 40.

TLC: Rf = 0,56, dichlórmetán/metanol: 9/1, objemovo

Zlúčenina 41

Zlúčenina 40 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 5.

TLC: Rf = 0,18, toluén/etylacetát: 7/3, objemovo

Zlúčenina 42

Zlúčenina 6 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 24.

Zlúčenina 43

Zlúčenina 42 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 25.

Zlúčenina 44

Kondenzácia zlúčeniny 43 so zlúčeninou 41 sa uskutoční za takých istých podmienok, ako sú opísané na prípravu zlúčeniny 26.

TLC: Rf = 0,28, toluén/etylacetát: 6/4, objemovo

Zlúčenina 45

Zlúčenina 44 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 9.

TLC: Rf = 0,09, toluén/etylacetát: 3/7, objemovo

Zlúčenina 46

Zlúčenina 45 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 10.

TLC: Rf = 0,52, etylacetát

Zlúčenina 47

Zlúčenina 46 (10,4 g) sa v dusíkovej atmosfére rozpustí v pyridíne (suchý) (102 ml). Pridá sa zmes anhydridu kyseliny octovej (34 ml) a pyridínu (suchý) (102 ml) a 10 mg 4-dimetylaminopyridínu. Po 1 hodine miešania pri teplote miestnosti sa reakčná zmes odparí a spoločne odparí so suchým toluénom, pričom sa získa 11,9 g zlúčeniny 47. TLC: Rf = 0,50, toluén/etylacetát: 1/1, objemovo

Zlúčenina 48

Po rozpustení zlúčeniny 47 (11,9 g) v metanole (90 ml) sa pridá 180 mg p-toluénsulfónovej kyseliny a zmes sa mieša cez noc pri teplote miestnosti. Zmes sa zriedi etylacetátom, premyje sa vodou (2x) a odparí sa. Po čistení surového produktu pomocou chromatografie na silikagéli sa získa 6,2 g zlúčeniny 48.

TLC: Rf = 0,28, toluén/etylacetát: 3/7, objemovo

Zlúčenina 49

Zlúčenina 48 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 15.

TLC: Rf = 0,24, dichlórmetán/metanol: 9/1, objemovo Metyl O-(benzyl 2-0-acetyl-3-0-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-(l->4)-2-0-benzyl-3,6-di-0-metyl-a-D-glukopyranozid 50

Zlúčenina 49 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 16.

TLC: Rf = 0,37, dichlórmetán/metanol: 9/1, objemovo Syntéza EFGH-tetrasacharidu 52 (schéma 4)

Zlúčenina 51

Zlúčenina 25 a zlúčenina 50 sa kondenzujú a získa sa zlúčenina uvedená v názve pomocou takého istého postupu, ako je uvedený na prípravu zlúčeniny 26.

TLC: Rf = 0,52, dichlórmetán/metanol: 98/2, objemovo Metyl-O-(Benzyl 2,4-di-0-dimetyl-6-D-glukopyranozyluronát)-( 1 -+4)-O-(3-O-acetyl-2-O-benzyl-6-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-O-(benzyl-2-O-acetyl-3 -O-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-(l-+4)-2-O-benzyl-3,6-di-O-metyl-a-D-glukopyranozid 52

Zlúčenina 51 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 27.

TLC: Rf = 0,26, dichlórmetán/metanol: 98/2, objemovo Syntéza DEFGH-pentasacharidu 56 (schéma 4+5) (Príklad III)

Zlúčenina 53

Zlúčenina 28 a zlúčenina 52 sa kondenzujú a získa sa zlúčenina uvedená v názve podľa takého istého postupu, ako je uvedený na prípravu zlúčeniny 29.

TLC: Rf = 0,63, dichlórmetán/metanol: 98/2, objemovo

Zlúčenina 54

Zlúčenina 53 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 30.

TLC: Rf = 0,51, dichlórmetán/metanol: 8/2, objemovo

Zlúčenina 55

Zlúčenina 54 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 31.

TLC: Rf = 0,32, etylacctát/pyridín/kyselina octová/voda: 10/7/1,6/4, objemovo

Heptasodná soľ metyl O-(2,3,4-tri-O-metyl-6-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-O-(2,3-di-O-metyl-B-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l—>4)-O-(6-O-metyl-2,3-di-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-O-(3-O-metyl-2-O-sulfo-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-(l—>4)-3,6-di-O-metyl-2-O-sulfo-a-D-glukopyranozidu, 5 6

Zlúčenina 55 sa prevedie na zlúčeninu uvedenú v názve podľa takého istého postupu, ako je opísaný na prípravu zlúčeniny 32.

[a]²⁰ _D = +50,2 (c = 1,05, voda)

Chemické posuny anomémych protónov: 5,32, 5,29 a 4,89 ppm.

Príprava príkladu IV (zlúčenina 80) Syntéza EF-disacharidu 66 (schéma 6)

Zlúčenina 58

Trietylamín (43 ml, 0,3 mol), 4-dimetylaminopyridín (156 mg, 1,3 mmol) a anhydrid kyseliny octovej (23 ml, 0,29 mol) sa pridá k roztoku zlúčeniny 57 (36,2 g, 0,128 mol) (Petroni a kol., Aust. J. Chem. 1988, 41, 91-102) v dichlórmetáne (360 ml). Po 30 minútach sa zmes postupne premyje 5 % vodným roztokom hydrogensíranu draselného, vodou, nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vodou a suší sa nad síranom sodným. Po odparení sa získa surový produkt 58: TLC Rf = 0,41, 3 : 1, cyklohexán/etylacetát.

Zlúčenina 59

Etanolamín (4,9 ml, 80 mmol) sa pri +4 °C pridá k roztoku surovej zlúčeniny 58 (11,8 g, 32 mmol) v tetrahydrofuráne (220 ml). Po 16 hodinách pri teplote +4 °C sa k skôr uvedenej zmesi pod argónovou atmosférou pridá trichlóracetonitril (65 ml, 644 mmol) a uhličitan draselný (8,3 g, 64,4 mmol). Po 16 hodinách pri teplote miestnosti sa roztok filtruje a odparí. Po čistení pomocou kolónovej chromatografie (4 : 1 cyklohexán/etylacetát) sa získa zlúčenina 59 s výťažkom 79 %: TLC: Rf = 0,49, 1 : 1 cyklohexán/etylacetát.

Zlúčenina 61

Roztok trimetylsilyltriílátu (0,04M v dichlórmetáne; 96 ml, 3,8 mmol) sa prikvapká pod argónom k studenému (-20 °C) roztoku donora imidátu 59 (11,93 g, 25 mmol) a akceptora 60 (9,2 g, 19,8 mmol) (P.J.Garegg, H.Hultberg Carbohydr. Res. 1961, 93, C10) v dichlórmetáne (190 ml) obsahujúcom 4Ä práškové molekulové sitá. Po 30 minútach sa pridá pevný hydrogenuhličitan sodný a roztok sa filtruje, premyje sa vodou, suší sa nad síranom sodným a odparí sa. Zvyšok sa kryštalizuje z dietyléteru a získa sa zlúčenina 62 (výťažok 82 %), teplota topenia 138 °C.

Zlúčenina 62

Sodík (373 mg, 0,65 mmol) sa pridá k roztoku zlúčeniny 61 (1 g, 1,3 mmol) v zmesi 2 : 1 metanol/dichlórmetán. Zmes sa mieša 1 hodinu pri teplote miestnosti a potom sa neutralizuje pomocou živice Dowex 50 H⁺, filtruje sa a odparí sa, pričom sa získa surový produkt 62.

Zlúčenina 63

Hydrid sodný (40,5 mg, 1,68 mmol) sa po častiach pridá k studenému (0 °C) roztoku surovej zlúčeniny 62 (950 mg) a metyljodidu (0,1 ml, 1,55 mmol) v dimetylformamide (9 ml). Po 2 hodinách pri teplote miestnosti sa pridá metanol a zmes sa naleje do vody. Produkt sa extrahuje etylacetátom, premyje sa vodou, suší sa nad síranom sodným a odparí sa. Po kolónovej chromatografii (3:1, cyklohexán/etylacetát) sa získa čistá zlúčenina 63 (výťažok 86 % zo zlúčeniny 62): teplota topenia 137 °C (dietyléter).

Zlúčenina 64

Roztok zlúčeniny 63 (1,16 g, 1,56 mmol) v zmesi 1 : 3 voda/metanol (40 ml) sa zohreje na 80 °C v prítomnosti p-toluénsulfónovej kyseliny (230 mg, 1,56 mmol). Po 3 hodinách sa zmes neutralizuje hydrogenuhličitanom sodným a odparí sa. Po kolónovej chromatografii (3 : 1 cyklohexán/acetón) sa získa zlúčenina 64 s výťažkom 89 %: TLC Rf = 0,28, 2 : 1 cyklohexán/acetón.

Metyl O-(benzyl 2,3-di-O-metyl-B-D-glukopyranozyluronát)-( 1 -+4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid 66

K roztoku zlúčeniny 64 (860 mg, 1,3 mmol) v dichlórmetáne (4 ml) sa pridá 2,2,6,6-tetrametyl-l-piperidinyloxy (2,3 mg), nasýtený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (2,5 ml), bromid draselný (13,5 mg) a tetrabutylamóniumchlorid (18 mg). K skôr uvedenému studenému (0 °C) roztoku sa pridá zmes nasýteného vodného roztoku chloridu sodného (2,8 ml), nasýteného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (1,4 ml) a chlóman sodný (1,3M, 3,2 ml). Po 1 hodine sa zmes extrahuje dichlórmetánom, premyje sa vodou, suší sa nad síranom sodným a odparí sa, pričom sa získa surová kyselina 65.

Surová kyselina v dimetylformamide reaguje s benzyl bromidom (1,6 ml, 13 mmol) a hydrogenuhličitanom draselným (650 mg, 6,5 mmol). Po 16 hodinách sa produkt extrahuje etylacetátom, premyje sa vodou, suší sa nad síranom sodným a odparí sa, pričom sa získa zlúčenina 66 s výťažkom 77 %.

Syntéza DEF-trisacharidu 70 (schéma 7)

Zlúčenina 67

Roztok trimetylsilyltriílátu (0,04M v dichlórmetáne; 1,88 ml, 0,075 mmol) sa pod argónom prikvapká k studenému (-20 °C) roztoku 6-O-acetyl-2,3,4-tri-O-metyl-D-glukopyranostrichlóracetimidátu 28 (290 mg, 0,711 mmol) (P. Westerduin a kol. Bioorg, Med. Chem. 1994, 2, 1267-83) a akceptora 66 (300 mg, 0,4 mmol) v dichlórmetáne (20 ml) obsahujúcemu 4Ä práškové molekulové sitá. Po 30 minútach sa pridá pevný hydrogenuhličitan sodný a roztok sa filtruje a odparí. Po kolónovej chromatografii (3 : 1 toluén/etylacetát) sa získa čistá zlúčenina 67 s výťažkom 56 %: TLC: Rf = 0,32, 3:2 toluén/etylacetát.

Zlúčenina 68

K roztoku zlúčeniny 67 (201 mg, 0,20 mmol) v anhydride kyseliny octovej (7,6 ml) sa pri -20 °C pridá zmes koncentrovanej kyseliny sírovej v anhydride kyseliny octovej (1,5 ml, 0,1 : 1 objemovo). Po 1 hodine miešania sa pridá octan sodný (780 mg). Zmes sa zriedi etylacetátom, premyje sa vodou, suší sa nad síranom sodným a odparí sa a po kolónovej chromatografíi (1:1 toluén/etylacetát) sa získa zlúčenina 68 (výťažok 82 %): TLC Rf = 0,32, 1 : 1 toluén/etylacetát.

Zlúčenina 69

Benzylamín (0,58 ml, 5,26 mmol) sa pridá k roztoku zlúčeniny 68 (125,4 mg) v tetrahydrofuráne (5 ml). Po 7 hodinách pri teplote miestnosti sa roztok premyje IM vodným roztokom kyseliny chlorovodíkovej, vodou, suší sa a odparí. Po chromatografíi (3 : 2 toluén/etylacetát) sa získa čistá zlúčenina 69 s výťažkom 75 %: TLC: Rf = 0,33, 2 : 3 toluén/etylacetát.

O-(6-O-acetyl-2,3,4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-( 1 ->4)-0-(benzy!-2,3-di-0-metyl-B-D-glukopyranozyluronát)-(l->4)-3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-D-glukopyranozyltrichlóracetimidát 70

Trichlóracetonitril (69 μΐ, 0,675 mmol), uhličitan cézny (66 mg, 0,202 mmol), sa pod argónom pridajú k roztoku zlúčeniny 69 (89,2 mg, 0,112 mmol) v dichlórmetáne (2 ml). Po 2 hodinách sa roztok filtruje a odparí. Po kolónovej chromatografíi zvyšku (1 : 1 toluén:etylacetát) sa získa zlúčenina 70 s výťažkom 88 %. TLC: Rf = 0,44, 1 : 1 toluén/etylacetát.

Syntéza GH-disacharidu 76 (schéma 2)

Metoxid sodný (570 mg, 106 mmol) sa pridá k roztoku zlúčeniny 71 (2,5 g, 3,53 mol) (M.Petitou a kol., J. Med. Chem. 1997,40, 1600-1607) v zmesi 1 : 1 metanol/dichlórmetán (35 ml). Po 2 hodinách sa pridáva živica Dowex 50 H⁺ do neutrálnej reakcie a zmes sa filtruje. Po odparení sa zvyšok čistí pomocou kolónovej chromatografie (2 : 1 cyklohexán/etylacetát) a získa sa zlúčenina 72 s výťažkom 100 %. TLC Rf = 0,32,2 : 1 cyklohexán/etylacetát.

Zlúčenina 73

Metyljodid (0,41 ml, 6,61 mmol) sa pri 0 °C pridá k roztoku zlúčeniny 72 (2 g, 3,3 mmol) a hydridu sodného (0,12 g, 5 mmol), v tetrahydrofuráne (20 ml). Po 2 hodinách sa prikvapká metanol a po 15 minútach sa produkt extrahuje dichlórmetánom. Roztok sa premyje vodou, suší sa nad síranom sodným a odparí sa. Po kolónovej chromatografii (5 : 1 cyklohexán/etylacetát) sa získa čistá zlúčenina 73 s výťažkom 89 %.

[a]_D + 12° (c - 1; dichlórmetán)

Zlúčenina 74

Vodný roztok kyseliny trifluóroctovej (70 %, 3,14 ml) sa pridá k roztoku zlúčeniny 73 (1,76 g, 2,84 mmol) v dichlórmetáne (16 ml). Po 50 minútach pri teplote miestnosti sa roztok zriedi dichlórmetánom, premyje sa studeným nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vodou a suší sa nad síranom sodným. Po odparení a kolónovej chromatografii (11:2 dichlórmetán/acetón) sa získa zlúčenina 74 s výťažkom 88 %.

[a]_D + 10° (c = 1; dichlórmetán)

Metyl O-(benzyl 2,3-di-O-metyl-a-L-idopyranozyluronát)-(1 —>4)-2,6-di-O-benzyl-3-O-metyl-a-D-glukopyranozid 76

K roztoku zlúčeniny 74 (1,39 g, 2,4 mmol) v tetrahydrofuráne (8 ml) sa pridá 2,2,6,6-tetrametyl-l-piperidinyloxy (37,4 mg), nasýtený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (14,4 ml), bromid draselný (120 mg) a tetrabutylamó niumchlorid (180 mg). K už uvedenému studenému (0 °C) roztoku sa pridá zmes nasýteného vodného roztoku chloridu sodného (2,8 ml), nasýteného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (1,4 ml) a chlómanu sodného (1,3M, 3,2 ml). Po 1 hodine sa zmes extrahuje dichlórmetánom, premyje sa vodou, suší sa nad síranom sodným a odparí sa, pričom sa získa surová kyselina 75.

Skôr uvedená surová kyselina 75 v dimetylformamide (31 ml) reaguje s benzylbromidom (2,84 ml, 23,9 mmol) a hydrogenuhličitanom draselným (1,2 g, 12 mmol). Po 16 hodinách sa produkt extrahuje etylacetátom, premyje sa vodou, suší sa nad síranom sodným. Po odparení a kolónovej chromatografii (3 : 2 cyklohexán : etylacetát) sa získa zlúčenina 76 s výťažkom 78 % vzhľadom na zlúčeninu 74: [<x]d + 7,3°(c= 1,1; dichlórmetán).

Syntéza DEFGH-pentasacharidu 80 (schéma 8) (Príklad IV)

Zlúčenina 77

Trimetylsilyltriflát (170 μΐ, 0,0068 mmol) sa pod argónom pridá k studenému (-20 °C) miešajúcemu sa roztoku imidátu 70 (91 mg, 0,097 mmol) a zlúčeniny 76 (66,2 mg, 0,097 mmol) v dichlórmetáne (2 ml) obsahujúcom 4Ä molekulové sitá. Po 30 minútach sa pridá pevný hydrogenuhličitan sodný (0,1 g) a miešanie pokračuje cez noc. Roztok sa filtruje, premyje sa vodou, suší sa a odparí. Po kolónovej chromatografii (2 : 1 cyklohexán/acetón) sa získa pentasacharid 77 s výťažkom 71,6 %: TLC: Rf = 0,4, 2 : 1 cyklohexán/acetón.

Oktasodná soľ metyl 0-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-( 1 —>4)-O-(2,3-di-0-metyl-B-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l->4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(l-»4)-0-(2,3-di-0-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-( 1 —>4)-3-O-metyl-2,6-di-O-sulfo-a-D-glukopyranozidu, 80

Roztok zlúčeniny 77 (50 mg, 0,032 mmol) v dimetylformamide (5 ml) sa mieša 16 hodín za slabého pretekania prúdu vodíka v prítomnosti 10 % paládia na uhlí (50 mg). Po filtrácii sa roztok odparí a získa sa zlúčenina 78.

K roztoku skôr uvedenej surovej zlúčeniny v metanole (26 ml) sa pridá vodný roztok hydroxidu sodného (5M, 0,46 ml). Po 5 hodinách sa do neutrálneho pH pridá Dowex 50H⁺. Roztok sa odparí a zvyšok sa nanesie na kolónu Sephadexu G25 za elúcie vodou. Po odparení frakcií sa získa surová zlúčenina 79.

K roztoku skôr uvedenej surovej zlúčeniny v dimetylformamide (6 ml) sa pridá komplex trietylamín/oxid sírový (174 mg, 0,96 mmol) a roztok sa zohrieva na 55 °C 20 hodín. Pridá sa hydrogenuhličitan sodný (0,33 mg rozpusteného vo vode) a roztok sa nanesie na kolónu Sephadex G25 (1,6 x 100 cm) ekvilibrovanú 0,2M chloridom sodným. Frakcie sa spoja, odparia a odsolia na takej istej silikagélovej filtračnej kolóne ekvilibrovanej vo vode. Po lyofilizácii sa potom získa pentasacharid 80 s výťažkom 95 % vzhľadom na zlúčeninu 77. [cc]_D + 49° (c = 1; voda).

Príklad V

Biologická aktivita zlúčenín podľa predloženého vynálezu sa môže určiť pomocou anti-faktor Xa testu

Aktivovaný faktor X (Xa) je faktor v koagulačnej kaskáde. Anti-Xa aktivita zlúčenín podľa predloženého vynálezu sa stanoví pomocou spektrofotometrického merania rýchlosti hydrolýzy chromogénneho substrátu s-2222 využívaného Xa. Tento test anti-Xa aktivity v pufrovanom systéme sa použije na stanovenie hodnoty IC₅₀ zlúčenín podľa predloženého vynálezu.

Referenčná zlúčenina: benzamidín

Testové médium: Tromethamin-NaCl-polyetylénglykol

6000 PTNP) pufor Vehikulum: TNP pufor

Solubilizácii sa môže pomôcť dimetylsulfoxidom, metanolom, etanolom, acetonitrilom alebo íerc-butylalkoholom, ktoré nepriaznivo neovplyvňujú priebeh testu pri koncentrácii do 1 % (pre dimetylsulfoxid) a 2,5 % (pre ďalšie rozpúšťadlá) vo výslednej reakčnej zmesi.

Technika: Činidlá

1. Tromethamin-NaCl(TN) pufor

Zloženie pufra:

Tromethamin (tris) 6,057 g (50 mmol)

NaCl 5,844 g (100 mmol)

Voda do 1 1 pH roztoku sa pomocou HCl (10 mmol.ľ¹) upraví na hodnotu 7,4 pri 37 °C.

2. TNP pufor

Polyetylénglykol 6000 sa rozpustí v TN pufri a získa sa koncentrácia 3 g.ľ¹

3. Roztok s-2222

Jedna vialka S-2222 (15 mg; Rabi Diagnostica, Švédsko) sa rozpustí v 10 ml vody a získa sa koncentrácia 1,5 mg.mľ¹ (2 mmol.ľ¹).

4. Roztok Xa

Bovinný faktor Xa human (71 nKat.vialka¹; Kabi Diagnostica) sa rozpustí v 10 ml TNP pufra a potom sa ďalej zriedi 30 ml TNP pufra a získa sa koncentrácia 1,77 nKat.mľ¹. Roztok sa pripraví čerstvý.

* - Všetky zložky sa použijú v analytickej čistote

- Na vodné roztoky sa použije ultračistá voda (Milli-Q kvalita)

Príprava testovanej a roztoku referenčnej zlúčeniny

Testovaná a referenčná zlúčenina sa rozpustí vo vode Milli-Q a získa sa zásobná koncentrácia 10’² mol.ľ¹. Každá koncentrácia sa postupne zriedi vehikulom a získa sa koncentrácia ΙΟ'³,10’⁴ a 10‘⁵ mol.ľ¹. Pri tomto teste sa použijú zriedené roztoky vrátane zásobného roztoku (výsledná koncentrácia v reakčnej zmesi: 3.10^-3; 10’³; 3.10'⁴; 10^-4; 3.10'⁵; 10’⁵; 3.10~⁶ a 10'⁶ mol.ľ¹).

Postup

Pri teplote miestnosti sa 0,075 ml a 0,025 ml roztoku testovanej zlúčeniny alebo referenčnej zlúčeniny, alebo vehikula striedavo pipetuje do jamiek mikrotitračnej doštičky a tieto roztoky sa zriedia 0,115 ml a 0,0165 ml TNP pufra. Do každej jamky sa pridá alikvotný diel 0,030 ml S-2222 a doštička sa predhreje a preinkubuje za trepania v inkubátore (Amersham) 10 minút pri 37 °C. Po preinkubácii sa začne hydrolýza S-2222 pridaním 0,030 ml roztoku trombínu do každej jamky. Doštička sa inkubuje (za trasenia 30 sekúnd) pri 37 °C. Po 1 minúte po začiatku inkubácie sa každé 2 minúty počas 90 minút meria absorbancia každej vzorky pri 405 nm s použitím odčítacieho zariadenia pre mikrotitračné doštičky (Twinreader plus, Flow Laboratories).

Všetky dáta sa zhromaždia v osobnom počítači IBM s použitím Lotus-Measure. Pre každú koncentráciu zlúčeniny (vyjadrené v mol.ľ¹ reakčnej zmesi) a blank sa vynesú absorbancie oproti reakčnému času v minútach.

Hodnotenie výsledkov

Na každú výslednú koncentráciu sa z výstupu testu vypočíta maximálna absorbancia. Hodnoty 1C_5O (finálna koncentrácia, vyjadrené v gmol.ľ¹, spôsobujúca 50 % inhibíciu maximálnej absorbancie blanku) sa vypočítajú s použitím transformačnej analýzy logit podľa Hafner a kol. (Arzneim.-Forsch./Drug Res. 1977; 27 (II): 1871-3).

Anti-faktor Xa aktivita:

Zlúčenina (príklad)	IC₅o(pg.ľ’)
32(1)	22
38(2)	12
56(3)	12
80(4)	<2

II o

Skratky:

(Ph = fenylová skupina; Me = metylová skupina; Ac = acetylová skupina; Im = trichlóracetimidylová skupina; Bn = benzylová skupina; Bz = benzoylová skupina; MBn = metoxybenzoylová skupina; Lev = levulinoylová skupina)

Claims

1. Derivát sacharidu všeobecného vzorca (I)

D E

F G kde

R¹ je alkoxyskupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka;

R², R³ a R⁴ sú nezávisle od seba alkoxyskupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka alebo skupina OSOf;

celkový počet sulfátových skupín je 4, 5 alebo 6;

a zahnuté čiary predstavujú väzby buď nad, alebo pod rovinu šesťčlenného kruhu, na ktorý sú pripojené;

alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.

2. Derivát sacharidu podľa nároku 1, kde jednotka D vo všeobecnom vzorci (I) má štruktúru λ

(D),

Schéma 8

R¹ je metoxyskupina; a R², R³ a R⁴ sú nezávisle od seba metoxyskupina alebo skupina OSO₃‘.

3. Derivát sacharidu podľa nároku 2, kde R² je metoxyskupina.

4. Derivát sacharidu podľa nároku 3, kde R³ je metoxyskupina.

5. Derivát sacharidu podľa nároku 4, kde R⁴ je metoxyskupina.

6. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje derivát sacharidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 a farmaceutický vhodné prísady.

7. Derivát sacharidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 na použitie ako liečivo.

8. Použitie derivátu sacharidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu trombózy alebo inhibíciu proliferácie buniek hladkého svalstva.