CN1177855C - 糖类衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有式I的糖类衍生物，其中R¹为(1-4C)烷氧基；R²、R³和R⁴独立为(1-4C)烷氧基或OSO₃ ^-；硫酸根的总数为4、5或6；曲线代表连接在六元环上的在该环平面以上或以下的键；或一种其药理学上可接受的盐。本发明化合物具有抗血栓形成活性，可用于治疗或预防血栓形成，用于抑制平滑肌细胞增生。

Description

糖类衍生物

本发明涉及一种糖类衍生物、含有该糖类衍生物的药物组合物以及所述糖类衍生物在药物制备中的用途。

肝素是一种来自肠粘膜等生物来源的常用抗凝血剂。在肝素的存在下，大大促进了抗凝血酶III(AT-III)对凝血酶的灭活作用，该灭活作用涉及肝素与AT-III的构象在进行配合作用时发生改变。凝血酶对血液凝结过程的最后一步具有调节作用。凝血酶的主要功能是分解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体，后者通过交联作用形成不溶性凝胶，即纤维蛋白凝血块。

肝素的结构特征是与AT-III相互作用所需的，人们对此已开展了大量研究。肝素聚合物的一部分对AT-III仅表现出较低的亲和性，而其他部分被发现对与AT-III结合更具重要意义。对肝素碎片所进行的研究最终鉴定出一种五糖碎片是与AT-III结合的最小高亲和性结构(例如参见《生理学评论》71(2)，488/9，1991)。在这个高亲和性碎片中，存在有八个硫酸根。发现有四个硫酸根对与AT-III结合来说是必要的(《糖化学与生物化学进展》43卷；R.S.Tipson，D.Horton编；Harcourt Brace Jovanovich出版；B.Casu(51-127页)段6)，而其他硫酸根进一步提高了亲和性。该发现在五糖碎片的合成类似物中得到了证实(例如参见《应用化学》32(12)，1671-1818，1993)。

高亲和性五糖碎片的鉴定促成了其合成类似物的制备。小的葡糖氨基聚糖型合成糖分子被发现是有效的和选择性的抗Xa抑制剂。例如参见欧洲专利84999。后来提交的专利/专利申请显示，许多这些分子的变型具有相似的、甚至是更高的活性，且进一步提高了药理学性质，例如EP529715和EP454220中公开的与葡糖氨基聚糖有关的糖类衍生物。这些糖类衍生物缺乏葡糖氨基聚糖的特征性官能团：游离羟基、N-硫酸根和N-乙酰基。而且，所有这些后来的专利申请所公开的五糖都具有至少七个硫酸根。因此，在抗血栓形成的低聚糖衍生物领域，一般认为为得到临床上可接受的抗血栓形成活性水平，需要五糖化合物至少具有七个硫酸根。

不过出乎意料的是，现已发现一类与葡糖氨基聚糖有关的糖类衍生物，尽管只有四至六个硫酸根，却仍显示出临床有效的抗血栓形成活性。此外，本发明化合物几乎不表现出副作用。例如减少了出血的危险，化合物的硫酸含量低也不会引起肝素诱发的血小板减少(HIT)(HIT是一种严重的副作用，可导致患者死亡)。而且，本发明化合物所具有的生物半衰期可允许每日一次治疗。可以认为每日一次治疗比例如每周一次治疗更为有利，因为如果患者需要迅速适应医疗方法时，每日一次治疗可作到这一点。由于患者的治疗不需要复杂的剂量方案，每日一次治疗也使医院后勤更感轻松。

因此，本发明化合物在药理学的一个侧面显示出出人意料而又非常和谐的作用。

本发明因此涉及具有式I的糖类衍生物，

其中R¹为(1-4C)烷氧基；R²、R³和R⁴独立为(1-4C)烷氧基或OSO₃ ^-；硫酸根的总数是4、5或6；曲线代表连接在六元环上的在该环平面以上或以下的键；或一种其药理学上可接受的盐。

本发明化合物可用于治疗和预防以凝血酶为媒介的和与凝血酶有关的疾病，包括大量凝血过程被激活的血栓形成与前血栓形成状态，包括但不限于深静脉血栓形成、肺栓塞、血栓性静脉炎、由血栓形成或栓塞引起的动脉堵塞、血管成形术或血栓溶解过程中或之后的动脉再堵塞、动脉损伤或侵入型心脏病学手术后的再狭窄、术后静脉血栓形成或栓塞、急性或慢性动脉硬化、中风、心肌梗塞、癌与转移和神经变性疾病。本发明的糖类衍生物也可用作平滑肌细胞增生的抑制剂，用于治疗血管生成、癌和反向病毒感染，如HIV。

在血液透析和外科手术中的必要情况下，本发明化合物进一步可用作体外血液回路中的抗凝血剂和抗凝血包衣。

按照本发明的优选的糖类衍生物具有式I，其中的D单元具有下式结构：

R¹为甲氧基；R²、R³与R⁴独立为甲氧基或OSO₃ ^-。

更优选的糖类衍生物中R²为甲氧基。特别优选的糖类衍生物中R³为甲氧基。最优选的糖类衍生物中R⁴为甲氧基。

术语(1-4C)烷氧基中，(1-4C)烷基是具有1至4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基及诸如此类。最优选的烷基是甲基。

均衡带电部分的反离子是药学上可接受的反离子，如氢，或更优选为碱金属或碱土金属离子，如钠、钙或镁。

按照本发明的糖类衍生物可按照如低聚糖的合成所述和所用的熟知方法进行制备。关于这一点，特别要参考前文提到的欧洲专利EP529715。式I糖类衍生物的适当的制备方法特征在于这样一种方法，其中具有不同结构的被保护的单糖偶合，得到被保护的二糖，其后：

(a)一种类型的被保护的二糖与另一种类型的被保护的二糖偶合，得到被保护的四糖，该四糖与被保护的单糖偶合，得到被保护的五糖；或者

(b)被保护的单糖与被保护的二糖偶合，得到被保护的三糖，后者进一步与被保护的二糖偶合，得到被保护的五糖；

其后，保护基团断开，游离羟基硫酸化，其后，所得化合物可任选转化为药学上可接受的盐。

单糖为D-葡萄糖、D-甘露糖、L-艾杜糖、D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸，用所需烷基或被临时保护基团适当官能化。适当的保护基团是本领域所熟知的。优选的保护基团包括保护羟基的苄基和乙酰基和保护糖醛酸羧酸根的苄基。用其他保护基团，例如苯甲酰基、乙酰丙酰基(levulinyl)、烷氧基苯基、氯乙酰基、三苯甲游基及诸如此类，也可获得同样的有益效果。糖进行偶合的方式是本领域已知的，例如糖基-供体的1-位的去保护作用，和/或该位置的活化作用(例如通过得到溴化物、戊烯基、氟化物、硫代糖苷或三氯乙酰亚胺衍生物)以及使活化的糖基-供体与一种可选被保护的糖基-受体偶合。

在治疗静脉血栓形成或抑制平滑肌细胞增生时，本发明化合物可以肠内给药或胃肠外给药，用于人的每日剂量优选为0.001-10mg/kg体重。与药学上适用的助剂混合后，化合物可被压制成固体剂型单元，如丸剂、片剂，或被制成胶囊或栓剂，该助剂例如标准参考书Gennaro等著《Remington药物科学》所述(第18版，Mack出版公司，1990，尤其参阅第8部分：“药物制剂及其制备”)。借助于药学上适用的液体，化合物也能作为注射剂以溶液、悬液、乳液的形式给药，或作为喷雾剂给药，例如鼻腔喷雾剂。在制备剂型单元、例如片剂时，考虑使用常规的添加剂，例如填充剂、着色剂、聚合粘合剂及诸如此类。一般来说，任何药学上可接受的添加剂只要不影响活性化合物的作用，都是可用的。组合物可与之给药的适当的载体包括适量的乳糖、淀粉、纤维素衍生物及诸如此类，或它们的混合物。

通过下列实施例进一步说明本发明。

实施例

实施例I(化合物32)的制备

GH二糖16的合成(流程1+2)

化合物2

将化合物1(60g；可从商业上得到)溶于N，N-二甲基甲酰胺(858ml)和苄基溴(50.5ml)。冷却至+10℃后，滴加20％氢氧化钠水溶液。搅拌1小时后，升温至20℃，混合物再搅拌20小时。然后将溶液倾入冰水与甲苯的混合物中，萃取。有机层浓缩，粗产物用结晶法精制，得到30.0g化合物2。

TLC：Rf＝0.60，甲苯/乙酸乙酯：7/3，v/v

化合物3

将化合物2(26.4g)溶于N，N-二甲基甲酰胺(211ml)，在冰中冷却。在氮气氛下加入氢化钠(2.5g)。然后滴加4-甲氧基苄基氯(13.3g)，混合物在室温下搅拌1小时。混合物然后用乙酸乙酯稀释，用水洗涤(2×)，浓缩，得到40.7g粗化合物3。

TLC：Rf＝0.80，甲苯/乙酸乙酯：7/3，v/v

化合物4

将化合物3(34.9g)溶于60％含水乙酸，在60℃下搅拌4小时。混合物用甲苯稀释，浓缩。硅胶色谱法精制得到26.4g化合物4。

TLC：Rf＝0.07，甲苯/乙酸乙酯：7/3，v/v

化合物5

在氮气氛下，将化合物4(26.4g)溶于二氯甲烷(263ml)。在室温下加入四氟硼酸三甲基氧鎓盐(11.6g)和2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶(17.4g)。4小时后，将混合物倾入冰水中，用二氯甲烷萃取。有机层用碳酸氢钠洗涤，蒸发。粗产物用硅胶色谱法精制，得到18.5g化合物5。

TLC：Rf＝0.25，甲苯/乙酸乙酯：7/3，v/v

化合物7

将化合物6(3-甲基-1，2，4，6-四乙酰基-艾杜糖)(48.4g)溶于甲苯(175ml)。在氮气氛下，加入乙硫醇(20ml)和二乙醚三氟化硼(1M甲苯溶液；134ml)。搅拌1小时后，加入含水碳酸氢钠(400ml)，混合物再搅拌一小时。然后将混合物倾入乙酸乙酯中。有机层用水洗涤两次，浓缩。硅胶色谱法精制得到29.6g化合物7。

TLC：Rf＝0.45，甲苯/乙酸乙酯：6/4，v/v

化合物8

在氮气氛下，将化合物5(17.5g)和化合物7(28.2g)溶于甲苯(525ml)。加入粉碎的分子筛(4)后，反应混合物冷却至-20℃。在连续氮流下，滴加新制备的N-碘代琥珀酰亚胺(17.4g)与三氟甲磺酸(1.38ml)在二噁烷/二氯甲烷(1/1v/v)中的0.1M溶液。10分钟后，将红色反应混合物过滤，连续用含水硫代硫酸钠和含水碳酸氢钠洗涤。有机层在真空中浓缩，分离得到30.0g化合物8。

TLC：Rf＝0.45，二氯甲烷/乙酸乙酯：8/3，v/v

化合物9

将化合物8(30.0g)溶于460ml甲醇/二噁烷(1/1，v/v)，加入丁醇钾进行皂化。15分钟后，混合物用Dowex50WX8H⁺型离子交换树脂中和，在真空中浓缩。硅胶色谱法精制得到17.4g化合物9。

TLC：Rf＝0.25，二氯甲烷/甲醇：95/5，v/v

化合物10

在氮气氛下，将化合物9(17.4g)溶于N，N-二甲基甲酰胺(77ml)。加入1，2-二甲氧基丙烷(26ml)和对甲苯磺酸，混合物搅拌30分钟。混合物用含水碳酸氢钠稀释，用乙酸乙酯萃取，蒸发溶剂后得到19.7g化合物10。

TLC：Rf＝0.45，二氯甲烷/甲醇：95/5，v/v

化合物11

将化合物10(18.5g)溶于N，N-二甲基甲酰胺(24.4ml)，冷却至0℃。在氮气氛下加入氢化钠(1.47g；60％油分散液)和碘代甲烷(2.36ml)。1小时后，中和过量的氢化钠，混合物用二氯甲烷萃取，浓缩得到20.0g

化合物11。

TLC：Rf＝0.85，二氯甲烷/甲醇：95/5，v/v

化合物12

将化合物11(18.4g)溶于二氯甲烷(838ml)和水(168ml)。加入2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(7.1g)，混合物在4℃下搅拌18小时。将混合物倾入含水碳酸氢钠中，用二氯甲烷萃取。有机层浓缩得到12.7g化合物12。

TLC：Rf＝0.40，二氯甲烷/甲醇：95/5，v/v

化合物13

按照与化合物11的制备所述相同的方法，将化合物12转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.48，甲苯/乙酸乙酯：1/1，v/v

化合物14

将化合物13(2.5g)溶于乙酸(14.6ml)和水(6.1ml)后，混合物在室温下搅拌过夜。与甲苯共蒸发，用硅胶色谱法精制，得到1.9g化合物14。

TLC：Rf＝0.31，乙酸乙酯，v/v

化合物15

向化合物14(1.7g)的二氯甲烷(9ml)溶液中加入2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧(5mg)、饱和碳酸氢钠溶液(5.8ml)、溴化钾(32mg)和氯化四丁基铵(42mg)。将混合物冷却至0℃，在15分钟内，加入饱和氯化钠溶液(6.5ml)、饱和碳酸氢钠溶液(3.2ml)和次氯酸钠(1.3M；7.3ml)的混合物。搅拌1小时后，混合物用水稀释，用二氯甲烷萃取(3次)。有机层用盐水洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并蒸发至干，得到1.74g粗化合物15。

TLC：Rf＝0.14，二氯甲烷/甲醇：9/1，v/v

甲基O-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸苄基酯)-(1→4)-2-O-苄基-3，6-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖苷16

在氮气氛下，向1.74g化合物15的N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入1.68ml苄基溴和1.1g碳酸氢钾。溶液搅拌90分钟后，加入水，混合物用乙酸乙酯萃取。蒸发有机层并用硅胶色谱法精制后，分离得到1.64g化合物16。

TLC：Rf＝0.50，甲苯/乙酸乙酯：1/1，v/v

EF-二糖25的合成(流程2+3)

化合物17

在氮气氛下，将化合物12(10.5g)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(178ml)，冷却至0℃。加入氢化钠(1.91g；60％油分散液)，然后滴加苄基溴(3.3ml)。30分钟后反应完全，中和过量的氢化钠。加入水，混合物用乙酸乙酯萃取。蒸发溶剂，得到13.6g化合物17。

TLC：Rf＝0.50，甲苯/乙酸乙酯：1/1，v/v

化合物18

按照与化合物14的制备所述相同的方法，将化合物17转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.68，二氯甲烷/甲醇：9/1，v/v

化合物19

按照与化合物15的制备所述相同的方法，将化合物18转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.14，二氯甲烷/甲醇：9/1，v/v

化合物20

按照与化合物16的制备所述相同的方法，将化合物19转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.38，二氯甲烷/甲醇：85/15，v/v

化合物21

将化合物20(9.9g)溶于300ml甲醇(无水)，在氮气氛下回流。滴加甲醇钠的1M溶液(65.2ml)，搅拌3小时。然后将温度冷却至室温，加入1N氢氧化钠(22.2ml)，搅拌90分钟。用Dowex 50WX8H⁺型离子交换树脂中和，蒸发溶剂，得到粗残余物。

在氮气氛下，加入N，N-二甲基甲酰胺(192ml)和粉碎的分子筛(4)。加入碳酸氢钾(3.2g)和苄基溴(4.8ml)，混合物搅拌5小时，然后加入乙酸乙酯，混合物用水洗涤。蒸发溶剂和用硅胶色谱法精制粗产物后，得到6.19g化合物21和1.88g回收的化合物20。

TLC：Rf＝0.74，二氯甲烷/甲醇：9/1，v/v

化合物22

将化合物21(6.2g)溶于40ml二噁烷。加入乙酰丙酸(2.1g)、二环己基碳化二亚胺(3.75g)和4-二甲氨基吡啶(0.2g)，混合物在氮气氛下搅拌2小时。加入乙醚(95ml)，滤出沉淀。有机层用含水硫酸氢钾洗涤，浓缩。从二乙醚/庚烷中结晶，得到6.2g化合物22。

TLC：Rf＝0.26，二氯甲烷/丙酮：95/5，v/v

化合物23

在氮气氛下将化合物22(6.1g)溶于乙酸酐(256ml)，冷却至-20℃。在30分钟内滴加硫酸(4.9ml)在乙酸酐(49ml)中的混合物。60分钟后，加入乙酸钠，直至混合物的pH为中性。加入乙酸乙酯和水，有机层浓缩。硅胶色谱法精制得到4.2g化合物23。

TLC：Rf＝0.63，二氯甲烷/丙酮：9/1，v/v

化合物24

将化合物23(4.2g)溶于四氢呋喃(42ml)，加入哌啶(4.1ml)。混合物在室温下搅拌过夜。加入乙酸乙酯，混合物用0.5N盐酸洗涤。有机层浓缩，残余物用硅胶色谱法精制，得到3.2g化合物24。

TLC：Rf＝0.33，二氯甲烷/乙酸乙酯：1/1，v/v

O-(2，3-二-O-甲基-4-O-乙酰丙酰-β-D-吡喃葡糖醛酸苄基酯)-(1→4)-3-O-乙酰-2-O-苄基-6-O-甲基-D-吡喃葡糖基三氯乙亚胺酸酯(trichloroacetimidate)25

在氮气氛下将化合物24(1.59g)溶于二氯甲烷。加入三氯乙腈(1.1ml)和碳酸铯(72mg)，混合物搅拌1小时。滤出碳酸铯，浓缩滤液。用硅胶色谱法精制，得到1.57g化合物25。

TLC：Rf＝0.60，甲苯/乙酸乙酯：3/7，v/v

EFGH-四糖27的合成(流程4)

化合物26

将化合物16(0.530mg)与化合物25(0.598mg)的混合物与无水甲苯共蒸发进行干燥，再溶于8.2ml无水二氯甲烷。加入粉碎的分子筛(4)，混合物在氮气氛下冷却至-20℃，搅拌30分钟。向所得悬浮液中加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(相对于化合物25为15mol％)。搅拌10分钟后，加入碳酸氢钠，混合物过滤，加入水和二氯甲烷。有机层萃取、浓缩，粗产物用硅胶色谱法精制，得到0.62g化合物26。

TLC：Rf＝0.47，甲苯/乙酸乙酯：3/7，v/v

甲基-O-(2，4-二-O-二甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸苄基酯)-(1→4)-O-(3-O-乙酰-2-O-苄基-6-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸苄基酯)-(1→4)-2-O-苄基-3，6-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖苷27

向化合物26(0.58g)的吡啶溶液中加入2.76ml乙酸、0.32ml水合肼在2.1ml吡啶中的混合物。9分钟后，加入水和二氯甲烷，有机层用1N盐酸和含水碳酸氢钠洗涤。用硅胶色谱法精制，得到0.27g化合物27。

TLC：Rf＝0.45，甲苯/乙酸乙酯：3/7，v/v

DEFGH-五糖32的合成(流程4+5)例I

化合物29

将化合物27(150mg)与76mg化合物28(参照《生物有机与医药化学》2卷11期，1267-1280，1994)的混合物与无水甲苯共蒸发进行干燥，再溶于7.5ml无水二氯甲烷。在氮气氛下加入粉碎的分子筛(4)，混合物冷却至-20℃。搅拌20分钟后，加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(相对于化合物28为15mol％)。搅拌30分钟后，加入含水碳酸氢钠。混合物过滤，有机层用水洗涤。浓缩溶剂得到粗产物，用硅胶色谱法精制，得到136mg化合物29。

TLC：Rf＝0.33，甲苯/乙酸乙酯：4/6，v/v

化合物30

将化合物29稀释在叔丁醇(8ml)与水(1ml)的混合物中。向该溶液中加入122mg的10％钯/碳，混合物在氮气氛下搅拌过夜。过滤钯/碳，浓缩溶液，得到84.5mg化合物30。

TLC：Rf＝0.49，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水：13/7/1.6/4，v/v

化合物31

将化合物30(84.5mg)溶于5ml的0.3N氢氧化钠，搅拌3小时。反应混合物然后用0.5N盐酸中和，并蒸发。残余物用水/乙腈：9/1(v/v)在Sephadex G25型柱上脱盐，再通过Dowex 50WX8H⁺型离子交换树脂的短柱。蒸发后，分离得到75.6mg化合物31。

TLC：Rf＝0.43，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水：8/7/1.6/4，v/v甲基O-(2，3，4-三-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸)-(1→4)-O-(6-O-甲基-2，3-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸)-(1→4)-3，6-二-O-甲基-2-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，六钠盐32

将化合物31(30.6mg)溶于2.15ml N，N-二甲基甲酰胺(蒸馏过的；无水)，在氮气氛下加入三乙胺三氧化硫配合物(120mg)。混合物在55℃下搅拌过夜。加入碳酸氢钠的水悬浮液。混合物在室温下搅拌1小时，蒸发溶剂。将残余物溶于水(2ml)，用水/乙腈：9/1(v/v)在SephadexG25型柱上脱盐。分离的产物在Dowex 50WX8Na⁺离子交换树脂柱上用水洗脱，得到42.5mg五糖化合物32。

[α]²⁰ _D＝+56.8(c＝1，H₂O)

异头质子化学位移：5.32，5.22，4.97，4.89和4.24ppm。

例II(化合物38)的制备

EFGH四糖34的合成(流程4)

化合物33

化合物25与化合物20按照与化合物26的制备所述相同的方法偶合，得到目标化合物。

TLC：Rf＝0.47，甲苯/乙酸乙酯：3/7，v/v

甲基-O-(2，4-二-O-二甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸苄基酯)-(1→4)-O-(3-O-乙酰-2-O-苄基-6-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸苄基酯)-(1→4)-2，3-二-O-苄基-6-O-甲基-α-D-吡喃葡糖苷34

按照与化合物27的制备所述相同的方法，将化合物33转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.39，庚烷/乙酸乙酯：3/7，v/v

DEFGH-五糖38的合成(流程4+5)(例II)

化合物35

化合物34与化合物28按照与化合物29的制备所述相同的方法偶合，得到目标化合物。

TLC：Rf＝0.60，甲苯/乙酸乙酯：3/7，v/v

化合物36

按照与化合物30的制备所述相同的方法，将化合物35转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.39，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水：13/7/1.6/4，v/v

化合物37

按照与化合物31的制备所述相同的方法，将化合物36转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.32，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水：13/7/1.6/4，v/v

甲基O-(2，3，4-三-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸)-(1→4)-O-(6-O-甲基-2，3-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸)-(1→4)-6-O-甲基-2，3-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，七钠盐38

按照与化合物32的制备所述相同的方法，将化合物37转化为目标化合物。

[α]²⁰ _D＝+53.6(c＝1，H₂O)

异头质子化学位移：5.32，5.23，4.99，4.9和4.23ppm。

例III(化合物56)的制备

GH二糖50的合成(流程1+2)

化合物39

按照与化合物11的制备所述相同的方法，将化合物2转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.52，二氯甲烷/丙酮：98/2，v/v

化合物40

将化合物39(32.0g)溶于甲醇(538ml)。加入对甲苯磺酸(1.57g)，混合物在室温下搅拌1.5小时。用三乙胺中和后，混合物浓缩。用硅胶色谱法精制，得到11.9g化合物40。

TLC：Rf＝0.56，二氯甲烷/甲醇：9/1，v/v

化合物41

按照与化合物5的制备所述相同的方法，将化合物40转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.18，甲苯/乙酸乙酯：7/3，v/v

化合物42

按照与化合物24的制备所述相同的方法，将化合物6转化为目标化合物。

化合物43

按照与化合物25的制备所述相同的方法，将化合物42转化为目标化合物。

化合物44

在与化合物26所述相同的条件下进行化合物43与化合物41的偶合反应。

TLC：Rf＝0.28，甲苯/乙酸乙酯：6/4，v/v

化合物45

按照与化合物9的制备所述相同的方法，将化合物44转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.09，甲苯/乙酸乙酯：3/7，v/v

化合物46

按照与化合物10的制备所述相同的方法，将化合物45转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.52，乙酸乙酯

化合物47

在氮气氛下，将化合物46(10.4g)溶于吡啶(无水)(102ml)。加入乙酸酐(34ml)、吡啶(无水)(102ml)和10mg 4-二甲氨基吡啶的混合物。在室温下搅拌1小时后，反应混合物浓缩，用无水甲苯共蒸发，得到11.9g化合物47。

TLC：Rf＝0.50，甲苯/乙酸乙酯：1/1，v/v

化合物48

将化合物47(11.9g)溶于甲醇(90ml)后，加入180mg对甲苯磺酸，混合物在室温下搅拌过夜。混合物用乙酸乙酯稀释，用水洗涤(2x)，浓缩。粗产物用硅胶色谱法精制，得到6.2g化合物48。

TLC：Rf＝0.28，甲苯/乙酸乙酯：3/7，v/v

化合物49

按照与化合物15的制备所述相同的方法，将化合物48转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.24，二氯甲烷/甲醇：9/1，v/v甲基O-(2-O-乙酰-3-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸苄基酯)-(1→4)-2-O-苄基-3，6-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖苷50

按照与化合物16的制备所述相同的方法，将化合物49转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.37，二氯甲烷/甲醇：9/1，v/v

EFGH-四糖52的合成(流程4)

化合物51

化合物25与化合物50按照与化合物26的制备所述相同的方法偶合，得到目标化合物。

TLC：Rf＝0.52，二氯甲烷/甲醇：98/2，v/v甲基-O-(2，4-二-O-二甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸苄基酯)-(1→4)-O-(3-O-乙酰-2-O-苄基-6-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2-O-乙酰-3-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸苄基酯)-(1→4)-2-O-苄基-3，6-二-O-甲基-α-D-吡喃葡糖苷52

按照与化合物27的制备所述相同的方法，将化合物51转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.26，二氯甲烷/甲醇：98/2，v/v

DEFGH-五糖56的合成(流程4+5)(例III)

化合物53

化合物28与化合物52按照与化合物29的制备所述相同的方法偶合，得到目标化合物。

TLC：Rf＝0.63，二氯甲烷/甲醇：98/2，v/v

化合物54

按照与化合物30的制备所述相同的方法，将化合物53转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.51，二氯甲烷/甲醇：8/2，v/v

化合物55

按照与化合物31的制备所述相同的方法，将化合物54转化为目标化合物。

TLC：Rf＝0.32，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水：10/7/1.6/4，v/v

甲基O-(2，3，4-三-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸)-(1→4)-O-(6-O-甲基-2，3-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(3-O-甲基-2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸)-(1→4)-3，6-二-O-甲基-2-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，七钠盐56

按照与化合物32的制备所述相同的方法，将化合物55转化为目标化合物。

[α]²⁰ _D＝+50.2(c＝1.05，H₂O)

异头质子化学位移：5.32，5.29和4.89ppm。

例IV(化合物80)的制备

EF-二糖66的合成(流程6)

化合物58

向化合物57(36.2g，0.128mol)(Petroni等《澳大利亚化学杂志》(Aust.J.Chem.)1988，41，91-102)的二氯甲烷(360ml)溶液中加入三乙胺(43ml，0.3mol)、4-二甲氨基吡啶(156mg，1.3mmol)和Ac₂O(23ml，0.29mol)。30分钟后，混合物连续用5％含水硫酸氢钾、水、饱和含水碳酸氢钠、水洗涤，干燥(硫酸钠)。蒸发得到粗化合物58：TLC，R_f0.41，3∶1环己烷/乙酸乙酯。

化合物59

在+4℃下，向粗化合物58(11.8g，32mmol)的THF(220ml)溶液中加入乙醇胺(4.9ml，80mmol)。在+4℃下16小时后，在氩气下向上述混合物中加入三氯乙腈(65ml，644mmol)和碳酸钾(8.3g，64.4mmol)。在室温下16小时后，过滤溶液并浓缩。经柱色谱法(4∶1环己烷/乙酸乙酯)得到化合物59，产率79％：TLC，R_f0.49，1∶1环己烷/乙酸乙酯。

化合物61

在氩气下，向冷却(-20℃)的含有4粉碎的分子筛的供体亚胺酸酯59(11.93g，25mmol)和受体60(9.2g，19.8mmol)(P.J.Garegg，H.Hultberg《碳水化合物研究》1961，93，C10)的二氯甲烷(190ml)溶液中滴加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯的溶液(0.04M的二氯甲烷溶液；96ml，3.8mmol)。30分钟后，加入固体碳酸氢钠，将溶液过滤，用水洗涤，干燥(硫酸钠)，浓缩。残余物在二乙醚中结晶，得到化合物61(产率82％)。熔点：138℃。

化合物62

向化合物61(1g，1.3mmol)的2∶1甲醇/二氯甲烷(ml)溶液中加入钠(373mg，0.65mmol)。混合物在室温下搅拌1小时，然后用Dowex 50H⁺型离子交换树脂中和，过滤，浓缩，得到粗化合物62。

化合物63

向冷却(0℃)的粗化合物62(950mg)与甲基碘(0.1ml，1.55mmol)的DMF(9ml)溶液中分次加入氢化钠(40.5mg，1.68mmol)。在室温下2小时后，加入甲醇，将混合物倾入水中。产物用乙酸乙酯萃取，用水洗涤，干燥(硫酸钠)，浓缩。残余物经柱色谱法(3∶1环己烷/乙酸乙酯)得到纯化合物63(来自化合物62的产率为86％)：熔点137℃(二乙醚)。

化合物64

在对甲苯磺酸(230mg，1.56mmol)的存在下，将化合物63(1.16g，1.56mmol)的1∶3水/甲醇(40ml)溶液在80℃下加热。3小时后，混合物用碳酸氢钠中和，浓缩。残余物经柱色谱法(3∶1环己烷/丙酮)得到化合物64(产率89％)：TLC，R_f0.28，2∶1环己烷/丙酮。

甲基O-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸苄基酯)-(1→4)-2，3，6-三-O-苄基-α-D-吡喃葡糖苷66

向化合物64(860mg，1.3mmol)的二氯甲烷(4ml)溶液中加入2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧(2.3mg)、饱和含水碳酸氢钠(2.5ml)、溴化钾(13.5mg)和四丁基氯化铵(18mg)。向上述冷却(0℃)的溶液中加入饱和含水氯化钠溶液(2.8ml)、饱和含水碳酸氢钠溶液(1.4ml)和次氯酸钠溶液(1.3M，3.2ml)的混合物。1小时后，混合物用二氯甲烷萃取，用水洗涤，干燥(硫酸钠)，浓缩，得到粗酸65。

上述粗酸的DMF溶液用BnBr(1.6ml，13mmol)和碳酸氢钾(650mg，6.5mmol)处理。16小时后，产物用乙酸乙酯萃取，用水洗涤，干燥(硫酸钠)，浓缩，得到化合物66，产率为77％。

DEF-三糖70的合成(流程7)

化合物67

在氩气下，向冷却(-20℃)的含有4粉碎的分子筛的6-O-乙酰-2，3，4-三-O-甲基-D-吡喃葡萄糖三氯乙亚胺酸酯28(290mg，0.711mmol)(P.Westerduin等《生物有机与医药化学》1994，2，1267-83)与受体66(300mg，0.4mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液中滴加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯溶液(0.04M的二氯甲烷溶液；1.88ml，0.075mmol)。30分钟后加入固体碳酸氢钠，溶液过滤、浓缩。残余物经柱色谱法(3∶1甲苯/乙酸乙酯)得到纯化合物67(产率56％)：TLC R_f0.32，3∶2甲苯/乙酸乙酯。

化合物68

在-20℃下，向化合物67(201mg，0.20mmol)的乙酸酐(7.6ml)溶液中加入浓硫酸在乙酸酐中的混合物(1.5ml，0.1∶1v/v)。搅拌1小时后，加入乙酸钠(780mg)。混合物用乙酸乙酯稀释，用水洗涤，干燥(硫酸钠)，浓缩，柱色谱法精制(1∶1甲苯/乙酸乙酯)后得到化合物68(产率82％)：TLC R_f0.32，1∶1甲苯/乙酸乙酯。

化合物69

向化合物68(125.4mg)的THF(5ml)溶液中加入苯甲胺(0.58ml，5.26mmol)。在室温下7小时后，溶液用1M含水盐酸、水洗涤，干燥，并浓缩。经柱色谱法精制(3∶2甲苯/乙酸乙酯)后得到化合物69(产率75％)：TLC R_f0.33，2∶3甲苯/乙酸乙酯。

O-(6-O-乙酰-2，3，4-三-O-甲基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸苄基酯)-(1→4)-3，6-二-O-乙酰-2-O-苄基-D-吡喃葡糖基三氯乙亚胺酸酯70

在氩气下，向化合物69(89.2mg，0.112mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入三氯乙腈(69μl，0.675mmol)和碳酸铯(66mg，0.202mmol)。2小时后，将溶液过滤，浓缩。残余物经柱色谱法(1∶1甲苯/乙酸乙酯)得到化合物70(产率88％)：TLC R_f0.44，1∶1甲苯/乙酸乙酯。

GH-二糖76的合成(流程2)

化合物72

向化合物71(2.5g，3.53mmol)(M.Petitou等《医药化学杂志》1997，40，1600-1607)的1∶1甲醇/二氯甲烷(35ml)溶液中加入甲醇钠(570mg，106mmol)。2小时后，加入Dowex 50H⁺型离子交换树脂直至中和，再过滤。浓缩后，残余物经柱色谱法(2∶1环己烷/乙酸乙酯)得到化合物72(产率100％)：TLC R_f0.32，2∶1环己烷/乙酸乙酯。

化合物73

在0℃下，向化合物72(2g，3.3mmol)与氢化钠(0.12g，5mmol)的THF(20ml)溶液中加入甲基碘(0.41ml，6.61mmol)。2小时后，滴加甲醇，15分钟后，产物用二氯甲烷萃取。溶液用水洗涤，干燥(硫酸钠)，浓缩。柱色谱法(5∶1环己烷/乙酸乙酯)得到纯化合物73(产率89％)：[α]_D+12°(c 1；二氯甲烷)。

化合物74

向化合物73(1.76g，2.84mmol)的二氯甲烷(16ml)溶液中加入含水三氟乙酸(70％，3.14ml)。在室温下50分钟后，溶液用二氯甲烷稀释，用冷饱和含水碳酸氢钠、水洗涤，干燥(硫酸钠)。浓缩后，残余物经柱色谱法(11∶2二氯甲烷/丙酮)得到化合物74(产率88％)：[α]_D+10°(c1；二氯甲烷)。

甲基O-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸苄基酯)-(1→4)-2，6-二-O-苄基-3-O-甲基-α-D-吡喃葡糖苷76

向化合物74(1.39g，2.4mmol)的THF(8ml)溶液中加入2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧(37.4mg)、饱和含水碳酸氢钠(14.4ml)、溴化钾(120mg)和四丁基氯化铵(180mg)。向上述冷却(0℃)的溶液中加入饱和含水氯化钠溶液(2.8ml)、饱和含水碳酸氢钠溶液(1.4ml)和次氯酸钠溶液(1.3M，3.2ml)的混合物。1小时后，混合物用二氯甲烷萃取，用水洗涤，干燥(硫酸钠)，浓缩，得到粗酸75。

上述粗酸75的DMF(31ml)溶液用BnBr(2.84ml，23.9mmol)和碳酸氢钾(1.2g，12mmol)处理。16小时后，产物用乙酸乙酯萃取，用水洗涤，干燥(硫酸钠)。浓缩后，残余物经柱色谱法(3∶2环己烷/乙酸乙酯)得到化合物76(来自化合物74的产率为78％)：[α]_D+7.3°(c 1.1；二氯甲烷)。

DEFGH-五糖80的合成(流程8)(例IV)

化合物77

在氩气下，向搅拌、冷却(-20℃)的含有4分子筛的亚胺酸酯70(91mg，0.097mmol)与76(66.2mg，0.097mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(170μL，0.0068mmol)。30分钟后，加入固体碳酸氢钠(0.1g)，搅拌过夜。溶液过滤，用水洗涤，干燥，浓缩。柱色谱法(2∶1环己烷/丙酮)得到五糖77(产率71.6％)：TLC Rf0.4，2∶1环己烷/丙酮。

甲基O-(2，3，4-三-O-甲基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)-(1→4)-O-(2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸)-(1→4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷，八钠盐80

在10％Pd/C催化剂(50mg)的存在下，在弱H₂气流下将化合物77(50mg，0.032mmol)的DMF(5ml)溶液搅拌16小时。过滤后，浓缩溶液，得到化合物78。

向上述粗化合物的甲醇(26ml)溶液中加入含水氢氧化钠(5M，0.46ml)。5小时后，加入Dowex 50H⁺型离子交换树脂，直至pH为中性。将溶液浓缩，残余物在Sephadex G25柱顶部分层，用水洗脱。将汇集的部分浓缩，得到粗化合物79。

向上述化合物的DMF(6ml)溶液中加入三乙胺/三氧化硫配合物(174mg，0.96mmol)，将溶液在55℃下加热20小时。然后加入碳酸氢钠(0.33mg，溶于水)，溶液在Sephadex G25柱(1.6×100cm)顶部分层，预先将柱在0.2M氯化钠中平衡。将各部分汇集起来，浓缩，在相同的凝胶过滤柱上脱盐，预先将柱在水中平衡。冷冻干燥后得到五糖80(来自化合物77的产率为95％)：[α]_D+49°(c 1；水)。

实施例V

抗Xa因子分析法可测定本发明化合物的生物活性

活化的X因子(Xa)是一种凝血过程中的因子。用分光光度法测量因Xa作用而产生的发色底物s-2222的水解速率，借此评价本发明化合物的抗Xa活性。在一种缓冲体系中进行的该抗Xa活性的分析方法用于评价供试化合物的IC₅₀值。

参照化合物：苯甲脒

试验培养基：缓血酸胺-NaCl-聚乙二醇6000(TNP)缓冲剂

媒介物：TNP缓冲剂

二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇有助于增溶作用，且在最终反应混合物中的浓度高达1％(对DMSO来说)和2.5％(对其他溶剂来说)没有副作用。

工艺： 试剂 ^*

1·缓血酸胺-NaCl(TN)缓冲剂

缓冲剂的组成：

   缓血酸胺(Tris)    6.057g(50mmol)

   NaCl              5.844g(100mmol)

   水                至1升

在37℃下用HCl(10mmol/l)调溶液pH为7.4。

2·TNP缓冲剂

将聚乙二醇6000溶于TN缓冲剂，所得浓度为3g/l。

3·S-2222溶液

将一小瓶S-2222(15mg；瑞典Kabi Diagnostica)溶于10ml水，所得浓度为1.5mg/ml(2mmol/l)。

4·Xa溶液

将牛Xa因子人(71nKat/小瓶；Kabi Diagnostica)溶于10ml TNP缓冲剂，然后进一步用30ml TNP缓冲剂稀释，所得浓度为1.77nKat/ml。稀溶液必须是新近制备的。

^* -所用全部组分纯度为分析级

   -水溶液用水为超高纯水(Milli-Q质量)。

供试化合物溶液和参照化合物溶液的制备

将供试化合物和参照化合物溶于Milli-Q水，所得原料浓度为10^-2mol/l。每种浓度用媒介物逐步稀释，所得浓度为10^-3、10^-4和10^-5mol/l。将该稀溶液、包括原料溶液用于分析(反应混合物中的最终浓度分别为：3×10^-3；10^-3；3×10^-4；10^-4；3×10^-5；10^-5；3×10^-6和10^-6mol/l)。

方法

在室温下，将0.075ml和0.025ml供试化合物或参照化合物溶液或媒介物用移液管交替移入微量滴定盘的小池中，这些溶液分别用0.115ml和0.0165ml TNP缓冲剂稀释。向每池中加入一等分的0.030mlS-2222溶液，将微量滴定盘预加热，并在37℃下边振摇边在恒温箱(Amersham)中预恒温10分钟。预恒温后，向每池中加入0.030ml凝血酶溶液，使S-2222开始水解。将微量滴定盘在37℃下恒温(振摇30秒)。从恒温1分钟后开始，每2分钟测量每个样品在405纳米时的吸收度，测量90分钟，所用仪器为动态微量滴定盘读数器(Twinreaderplus，Flow Laboratories)。

用LOTUS-MEASURE将全部数据收集在IBM个人计算机中。对每种化合物浓度(以mol/l反应混合物表示)和空白，将吸收度对反应时间(分钟)作图。

反应评价：对每种最终浓度，由分析图计算最大吸收度。按照Hafner等人的方法(《药物研究》。1977；27(II)：1871-3)，用洛吉变换分析法计算IC₅₀值(引起空白最大吸收度的50％抑制作用的最终浓度，以μmol/l表示)。

抗Xa因子活性

化合物(实施例)	IC50(μg/l)
		32(1)	22
38(2)	12
		56(3)	12
80(4)	＜2

缩写

(Ph＝苯基；Me＝甲基；Ac＝乙酰基；Im＝三氯乙亚胺酰基；Bn＝苄基；Bz＝苯甲酰基；Mbn＝4-甲氧基苄基；Lev＝乙酰丙酰基)

流程1

流程2

9：R₁＝H，R₂＝CH₃，R₃＝MBn14：R₁＝R₂＝R₃＝CH₃18：R₁＝R₂＝CH₃，R₃＝Bn45：R₁＝H，R₂＝R₃＝CH₃48：R₁＝Ac，R₂＝R₃＝CH₃74：R₁＝R₃＝CH₃，R₂＝Bn

10：R₁＝H，R₂＝CH₃，R₃＝MBn11：R₁＝R₂＝CH₃，R₃＝MBn12：R₁＝R₂＝CH₃，R₃＝H13：R₁＝R₂＝R₃＝CH₃17：R₁＝R₂＝CH₃，R₃＝Bn46：R₁＝H，R₂＝R₃＝CH₃47：R₁＝Ac，R₂＝R₃＝CH₃71：R₁＝Bz，R₂＝Bn，R₃＝CH₃72：R₁＝H，R₂＝Bn，R₃＝CH₃73：R₁＝R₃＝CH₃，R₂＝Bn

15：R₁＝R₂＝R₃＝CH₃19：R₁＝R₂＝CH₃，R₃＝Bn49：R₁＝Ac，R₂＝R₃＝CH₃75：R₁＝R₃＝CH₃，R₂＝Bn

16：R₁＝R₂＝R₃＝CH₃20：R₁＝R₂＝CH₃，R₃＝Bn50：R₁＝Ac，R₂＝R₃＝CH₃76：R₁＝R₃＝CH₃，R₂＝Bn

流程3

流程4

流程5

流程6

流程7

流程8

Claims (7)

1·一种具有式I的糖类衍生物

其中R¹为C_1-4-烷氧基；

R²、R³和R⁴独立为C_1-4-烷氧基或OSO₃ ^-；

硫酸根的总数为4、5或6；

曲线代表连接在六元环上的在该环平面以上或以下的键；

或一种其药理学上可接受的盐。

2·权利要求1的糖类衍生物，其中式I的D单元具有如下结构

R¹为甲氧基；R²、R³和R⁴独立为甲氧基或OSO₃ ^-。

3·权利要求2的糖类衍生物，其中R²为甲氧基。

4·权利要求3的糖类衍生物，其中R³为甲氧基。

5·权利要求4的糖类衍生物，其中R⁴为甲氧基。

6·一种药物组合物，含有权利要求1至5任一项的糖类衍生物和药学上适用的助剂。

7·权利要求1至5任一项的糖类衍生物在用于治疗或预防血栓形成或抑制平滑肌细胞增生的药物制备中的用途。