CN1243759C - 聚亚烷基氧改性的磷脂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及聚亚烷基氧改性的磷酯及其制备方法，特别是涉及生理活性物质的化学改性和乳化、或者脂质体等药物传递系统中可使用的聚亚烷基氧改性的磷酯及其制备方法和用途。本发明的目的在于提供含有氮原子的碱或单酰基磷酯等杂质含量少的、高纯度的聚亚烷基氧改性磷酯质及其制备方法和用途。进而，由于本发明的聚亚烷基氧改性的磷酯具有磷酯质的效果，在水溶液中也可溶解，所以可作为表面活性剂使用。

Description

聚亚烷基氧改性的磷脂及其制备方法
本发明所属技术领域
本发明涉及新颖实用的聚亚烷基氧(poly(alkylene oxide))改性的磷脂及其制备方法及用途，特别是涉及生理活性物质的化学改性和乳化、或者脂质体等药物传递系统中可使用的聚亚烷基氧改性的磷脂、其制备方法及用途。
与本发明相关的背景技术
近年，广泛进行抗癌剂等的脂质体制剂研究，为了利于提高药物在血中的滞留时间，脂质体的水溶性高分子改性研究正在广泛地展开。其中之一，就是使用脂质体改性聚亚烷基氧改性的磷脂质。由于在医药用途方面应用，希望尽量减少或避免杂质。
在脂质体改性聚亚烷基氧改性的磷脂质的合成反应中，例如作为催化剂大多使用三乙胺等含有氮的碱。此时，为了除去反应后存在的过量碱，需要将系统调节成酸性。在此工序中，脂质体改性聚乙二醇改性的磷脂质产生劣化，难以得到高纯度产品。
另外，三乙胺等含有氮的碱大多具有氨味或独特臭味。在操作环境中，优选不使用这样的碱。
对于聚亚烷基氧改性的磷脂质的合成方法，有M.C.Woodle(Biochimicaet Biophysica Acta，1105，193-200(1992)等，或S.Zalipsky(Bioconjugate Chem，4,296-299(1994))等的报道。具体地是在有机溶剂中，使用1，1’-羰基二咪唑或二琥珀酰亚胺碳酸酯将聚乙二醇的末端活性化后，在三乙胺等碱存在下与磷脂质反应，然后用逆向硅色谱或透析等精制，得到聚亚烷基氧改性的磷脂。
在此方法中，同样地在反应后，为了除去过量存在的三乙胺等的碱，需要将系统调节成酸性。此时，生成单酰基磷脂(一般称为溶血磷脂)。它生理毒性强，作为医药方面应用，例如在药物传递系统利用时成为问题。
另外，若在合成后的精制工序中进行逆向硅胶色谱或透析时，在从柱洗脱时，发生产品的劣化(生成上述的单酰基磷脂等)，或在透析中产品产生水解等问题。因此，难以得到高纯度产品，在工业上也有问题。
对于上述现有技术的方法，由于含有三乙胺等的碱，若要除去它，又产生溶血磷脂，所以难以得到高纯度品。另外，对于以往的方法，由于产品收率低或溶剂使用量大，也难以进工业化规模生产。
为此，希望研究出不含有三乙胺等的具有氮原子的碱或单酰基磷脂等杂质的、高纯度的聚亚烷基氧改性磷脂质的简单合成方法。
另外，磷脂可作为乳化剂或保湿剂，都具有优良的效果，不仅在医药行业而且将其配合在化妆品的研究也逐渐增加。在化装品行业，脂质体通过其他表面活性剂的添加的研究也逐渐增多。但是用于乳液及化装水时，因提高添加量而遇到溶解度问题。为此，必须提高本发明以外的表面活性剂用量。
发明详述
发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供含有氮原子的碱或单酰基磷脂等杂质含量少的、高纯度的聚亚烷基氧改性磷脂质及其制备方法和用途。
进而，由于本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂具有磷脂质的效果，在水溶液中也可溶解，所以可作为表面活性剂使用。
技术方案
本发明是以下的聚亚烷基氧改性的磷脂、其制备方法及其用途。
(1)单酰基磷脂质体的含量低于重量的3％、且具有氮原子的三乙胺含量低于重量的0.02％，可用下述式(1)表示的聚亚烷基氧改性的磷脂。
[化学结构式5]
(式(1)中，R1CO及R2CO分别独立地是碳原子数4～24的酰基、k是1～6、R3O是碳原子数2～4的氧化烯、n是碳原子数2～4的氧化烯的平均加成摩尔数，是10～800的数。M是氢原子、钠、或钾，X是碳原子数1～3的2价的烃基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)、p是0或1。p是0时，Y是氢原子或碳原子数1～4的烷基。p是1时，Y是氢原子、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基、或硫羟基。)
(2)上述(1)所述的聚亚烷基氧改性的磷脂，其中单酰基磷脂质体的含量低于重量的2％。
(3)上述(1)所述的聚亚烷基氧改性的磷脂，其中p是0时，Y是甲基，单酰基磷脂质体的含量低于重量的0.5％。
(4)具有下述工序(A)的聚亚烷基氧改性的磷脂的制备方法。工序(A)：在水溶液呈碱性的碱金属盐，且不含氮的固体盐存在下，在有机溶剂中使下述式(2)表示的聚亚烷基氧化合物的活性化体和用下述式(3)表示的磷脂质反应的工序。
[化学结构式6]
(式(2)中，R3O是碳原子数2～4的氧化烯、n是碳原子数2～4的氧化烯的平均加成摩尔数是10～800的数。X是碳原子数1～3的2价的烃基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)、p是0或1。p是0时，Y是氢原子或碳原子数1～4的烷基。p是1时，Y是氢原子、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基、或硫羟基。Z是赋予活性的基团，是对聚亚烷基氧化合物赋予和下述式(3)表示的磷脂质进行反应的活性的基团。)
[化学结构式7]
Figure C0210681300131
(式(3)中，R1CO及R2CO分别独立地是碳原子数4～24的酰基、k是1～6。)
(5)上述(4)所述的制备方法，其中R1CO及R2CO是碳原子数12～20的酰基。
(6)上述(4)或(5)所述的制备方法，其中p是0时，Y是甲基。
(7)上述(4)至(6)中任意一所述的制备方法，其中在工序(A)所使用的固体盐是碳酸钠、有机溶剂是甲苯或氯仿。
(8)上述(4)至(7)的任意一所述的制备方法，其中在工序(A)后，具有下述工序(B)。
工序(B)：使用醋酸乙酯或丙酮除去式(3)表示的磷脂。
(9)上述(4)至(8)的任意一所述的制备方法，其中在工序(A)后，具有下述工序(C)。
工序(C)：作为溶剂，使用醋酸乙酯和/或丙酮进行重结晶的工序。
(10)上述(9)所述的制备方法，其中在工序(C)中，还将至少一种选自由碳原子数5～8的脂肪族烃或醚组成的组中的化合物用作溶剂。
(11)上述(9)或(10)所述的制备方法，其中工序(C)是在工序(B)后进行的。
(12)上述(4)至(11)的任意一所述的制备方法，其中在工序(A)后，具有下述工序(D)。
工序(D)：使用吸附剂进行精制的工序。
(13)上述(12)所述的制备方法，其中在工序(D)中使用的吸附剂是含有碱土类金属氧化物、碱土类金属氢氧化物、铝、或者硅的吸附剂、或活性炭。
(14)上述(12)或(13)所述的制备方法，其中工序(D)是在工序(B)后进行。
(15)上述(4)～(14)的任意一个所述的制备方法，其中聚亚烷基氧改性的磷脂，单酰基磷脂质体的含量低于重量的3％且具有氮原子的碱的含量低于重量的0.02％的下述式(1)表示的化合物。
[化学结构式8]
(式(1)中，R1CO及R2CO分别独立地是碳原子数4～24的酰基、k是1～6、R3O是碳原子数2～4的氧化烯、n是碳原子数2～4的氧化烯的平均加成摩尔数是10～800的数；M是氢原子、钠、或钾，X是碳原子数1～3的2价的烃基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)、p是0或1；p是0时，Y是氢原子或碳原子数1～4的烷基；p是1时，Y是氢原子、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基、或硫羟基。)
(16)由上述(1)～(3)的任意一所述的聚亚烷基氧改性的磷脂组成的表面活性剂。
(17)由上述(1)～(3)的任意一所述的聚亚烷基氧改性的磷脂组成的脂质体形成剂。
(18)由上述(1)～(3)的任意一所述的聚亚烷基氧改性的磷脂组成的脂质体。
(19)由上述(1)～(3)的任意一所述的聚亚烷基氧改性的磷脂组成的生理活性物的亲两性化学改性剂。
本发明的具体实施方式
在用上述式(1)表示的本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂中，R1CO及R2CO是碳原子数4～24、优选的是12～20的酰基。该酰基通常源于脂肪酸。作为R1CO及R2CO的具体的物质，例如丁酸、异丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、十四酸、十六酸、棕榈烯酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、山俞酸、菜子酸、二十四磷酸等饱和及不饱和的直链或支链的脂肪酸的酰基。R1CO及R2CO可相同也可不同。
在上述式(1)中，用R3O表示的氧化烯是碳原子数2～4、优选的是2或3的氧化烯。作为R3O，例如可举出氧基亚乙基、氧基亚丙基、氧基三亚甲基、氧基亚丁基等。其中，优选的是氧基亚乙基、氧基亚丙基，特别优选的是氧基亚乙基。在分子内仅有n个的氧化烯存在，但此氧化烯可以是单独1种，也可以是2种以上组合，其组合没有限制。另外可以是嵌段式的，也可以是无规状。
在上述式(1)中，n表示氧化烯的平均加成摩尔数，是10～800、优选的是20～500的数。若n是10以上，在将本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂用于药物传递系统时，传输效果变高。另外，若n是800以下，在制造聚亚烷基氧改性的磷脂时，作为原料的上述式(2)的聚亚烷基氧的化合物的粘度并不明显上升，所以操作性好。
在上述式(1)中，M是氢原子、钠、或钾。用上述式(1)表示的本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂，也可以是其混合物。
与磷酸基部分形成盐的钠、或钾，通常是含在用于药剂等调制的生理食盐缓冲液中的，进而也可存在于生物体内的。因此，即使将本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂用于药物传递系统，在体内的毒性等问题少。M是钠或钾以外的金属离子时，例如钙或镁等二价金属离子时，由于会成为与磷脂质二分子缔合的结构，所以是不理想的。
在上述式(1)中，k是1至6的整数、较好是1至4，优选是2至4，最好是2。
在上述式(1)中，X是碳原子数1～3的2价的烃基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)。作为烃基，具体举例如-CH2-、-CH2-CH2-、-(CH3)3-、-CH(CH3)CH2-等。p是0或1。
在上述式(1)中，p是0时，Y是氢原子或碳原子数1～4的烷基。优选的是烷基。作为烷基，具体举例如甲基、乙基、丙基、丁基等。其中，优选的是甲基。
另外，p是1时，Y是氢原子、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基、或硫羟基，优选的是氨基。
作为Xp-Y，优选的是甲基、乙基、丙基、及氨基甲基，特别优选的是甲基。
本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂，其源于单酰基磷脂质体和溶剂残留物的具有氮原子的碱的杂质含量少。
存在于本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂中的单酰基磷脂质体的含量低于重量的3％、优选的是低于重量的2％、更优选的是低于重量的0.5％。
另外，对于具有氮原子的碱的含量是低于重量的0.02％、较好的是低于0.01％(重量)、最好是没有。
带氮原子的碱，源于三乙胺等溶剂的残留物的碱，至少具有一个氮原子。作为具有氮原子的碱，例如吡啶、三乙胺、二异丙胺、二甲基氨基吡啶、咪唑、二乙胺、二异丁胺、三-n-辛胺、二-2-乙基己胺等。特别是其中的三乙胺希望其毒性最小。另外，用式(3)表示的磷脂虽然具有氮原子，但由于在分子内中和，所以不适合作具有氮原子的碱。
本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂，由于作为生理毒性强的单酰基磷脂的含量少，且三乙胺等的具有氮原子的杂质含量少，所以对于机体的安全性高。
另外，本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂，由于含有机体内也存在的钠离子或钾离子的一价的金属离子，所以对于机体的安全性高。
由于对于机体的安全性这样高，所以可作为表面活性剂，特别是机体用的表面活性剂。特别是，可作为生理活性物质用的表面活性剂最适宜。
本发明的表面活性剂是含有本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂的表面活性剂。通常，对于含有表面活性剂的组成物等的全组分来讲，优选的是将聚亚烷基氧改性的磷脂配合0.01～30％(重量)使用、更优选的是配合成0.1～15％(重量)使用。另外，表面活性剂的使用量，根据表面活性剂的使用目的和组成的不同而适宜地选择。
用式(1)表示的聚亚烷基氧改性的磷脂，可使用1种或2种以上，也可与其他的表面活性剂并用。
本发明的表面活性剂适用于：1)用水或缓冲液等分散溶剂使不溶或难溶于水的物质乳化的乳化剂；2)用水或缓冲液等分散溶剂使不溶或难溶于水的物质溶解的增溶剂；3)用水或缓冲液等分散溶剂使不溶或难溶于水的物质分散的分散剂；4)向对象物质中导入亲水性基和疏水性基的亲两性化学改性剂等。
使用本发明的表面活性剂可以得到增溶剂、乳化剂、分散剂。
本发明的表面活性剂，可特别适宜作为增溶剂、乳化剂、分散剂使用时，乳化剂、增溶剂、分散剂，仅使用本发明的表面活性剂也可，其中含有乳化、增溶、分散剂等众所周知的其他成分也行。
增溶剂、乳化剂、分散剂的形式没有限制，都是将生理活性物质加入水或缓冲液等分散剂当中溶解的溶解液，使生理活性物质加入水或或缓冲液等分散剂当中分散的分散剂。
乳化液或助溶液的形态也没有限制。用本发明的表面活性剂形成的胶体溶液，也就是在其内部含有亲油性生理活性物质胶溶液。另外于水或缓冲液等分散剂中，利用本发明的表面活性剂和亲油性生理活性物质作用形成的分散粒子的胶质粒子，或大于此粒子存在的乳胶溶液。作为乳胶溶液，有分散粒子为10-30nm的高分子胶溶液。乳胶溶液无论是油相中混入生理活性物的水包油型(O/W)，或水相中混入生理活性物的多层水包油型(W/O/W)均可。
本发明的表面活性剂，由于具有来自氧化烯的亲水性和来自酰基的疏水性，所以可作为乳化剂或增溶化剂使用，并且保存稳定性优良。进而，由与机体细胞构成成分相同的磷脂质及毒性低的氧化烯组成，同时，由于机体毒性强的单酰基磷脂质的含量少，所以安全性高。通过使用含有这样的聚亚烷基氧改性的磷脂的乳化剂，例如可得到安全性高的生理活性物质的溶化液或增溶化液。
作为乳化或增溶化的对象物质，可举出生理活性物质、脂溶性物质等。
作为生理活性物质，具体地可举出酶、抗体、其他的蛋白质、糖、脂质、糖蛋白质、糖脂质、或激素等。
作为脂溶性物质，可举出磷脂质等的脂质、紫杉酚等的脂溶性药剂或者通常用于油相的高级醇、酯油、三甘油、生育酚、及高级脂肪酸等。
在不损失本发明效果的范围内，可以含有甘油、丙二醇等的多元醇、脂肪酸酯、防腐剂、抗氧剂等公知的其他成分。
使用本发明的表面活性剂，可以得到高分子胶粒溶液。含在高分子胶粒溶液中的高分子胶粒可用于脂溶性药剂的增溶化作用等。
作为含有本发明的聚亚烷基氧链的高分子表面活性剂使用时，就能得粒径为10-300nm的微粒存在的高分子胶溶液。
高分子胶可以仅使用前式(1)表示的高分子表面活性剂，也可加入其他公知的成分，如后述的前式(1)所述的介于反应性基之外的公知的高分子结合的表面活性剂。包含在高分子溶液中的高分子胶，可用于脂溶性药剂的增溶等。
与通常使用的表面活性剂的胶粒相比，本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂，如上述由于接近机体细胞构成成分，进而由于含有高分子的聚亚烷基氧链，所以调制的高分子胶粒溶液具有水合层，所以稳定性高、对于机体的毒性也低。
高分子胶粒，配合对象物质为0.05～2％％(重量)、本发明的表面活性剂对于总量，为0.2～0.8％(重量)。
用动态光散射测定得到的高分子胶粒的重量平均粒径是10～300nm、优选的是20～100nm。
乳化的调制是将对于水被乳化的对象物质和本发明的表面活性剂加热到30～90℃、优选的是45～85℃、最优选的是60～80℃进行均匀混练，再缓慢地加入水和缓冲液混合后得到乳化液，也可在水中加入其他溶解在水中的水溶性物质。
乳化液的调制也可如上述将油相和水相分开后混合，也可用均化器、超声器等将全部的成分进行混合。通常对象物质，对于总量配合成0.01～30％(重量)、优选的是0.1～10％(重量)使用，本发明的表面活性剂，对于总量配合成0.1～40％(重量)、优选的是0.5～10％(重量)使用。
增溶化液的配制是被溶解在水的对象物质和本发明的表面活性剂在通常室温、优选的是30～45℃下混合，向其中慢慢添加水或缓冲液相，进行混合得到增溶化液，此时也可向其中慢慢添加含有其他水溶性物质的水相。对于混合，使用均化器及超声器等。通常对象物质，对于总量配合成0.01～10％(重量)、优选的是0.1～5％(重量)使用，本发明的表面活性剂，对于总量配合成0.1～30％(重量)、优选的是1～10％(重量)使用。
本发明的式(1)的Y是氢原子以外的反应性官能团时，可将本发明的表面活性剂作为生理活性物质的两亲性化学改性剂使用。
两亲性化学改性剂，可以含有1种或2种以上的本发明的表面活性剂，进而可以含有用于生理活性物质的化学改性的公知的其他成分。
被化学改性的生理活性物质，只要是具有氨基、羧基、羟基、硫羟基等的官能团的就没有特别限制，例如可举出酶、抗体、其他的低聚物及多肽、蛋白质、糖、脂质、糖蛋白质、糖脂质、激素等。
在将本发明的表面活性剂作为生理活性物质的两亲性化学改性剂使用时，作为式(1)的Y，优选的是氨基、羧基、醛基及硫羟基。在具有氨基、羧基、醛基、及硫羟基时，可易于存在于生理活性物质中的官能团反应。例如Y是羧基时，通过与生理活性物质中的氨基形成CONH键，可在生理活性物质中导入聚亚烷基氧改性的磷脂骨架。
可将生理活性物质的两亲性化学改性剂作为增溶化液、乳化液、分散液、高分子胶粒溶液使用。例如使用本发明聚亚烷基氧改性的磷脂，用前述方法，调制高分子胶粒溶液，进而在Y是羧基等的反应性官能团时，通过与抗体蛋白质的氨基反应结合，可得到向靶部位投与的高分子胶粒制剂。
在将使用本发明的两亲性化学改性剂化学改性了的生理活性物质作为脂质体成分使用时，可将生理活性物质存在于脂质体表面上。例如生理活性物质是抗体的蛋白质时，可将生理活性物质作为靶细胞的配体使用，所以可将脂质体向靶细胞集中输送。
在作为生理活性物质的两亲性化学改性剂使用时，可作为增溶化液、乳化液、分散液、高分子胶粒溶液及脂质体溶液使用。
本发明的脂质体是由含有本发明聚亚烷基氧改性的磷脂的脂质体形成剂构成的脂质体。另外，也可含有用于形成脂质体膜的公知的其他脂质作为成分。
通常，优选的是对于磷脂质1摩尔将聚亚烷基氧改性的磷脂配合成0.002～0.2摩尔、优选的是配合成0.01～0.1摩尔使用。聚亚烷基氧改性的磷脂，对于脂质体的总组成，最好配合成1～20％(重量)使用。
使用本发明的脂质体形成剂得到的脂质体，可使用本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂和其他的脂质进行制造。
作为其他的脂质，可举出具有磷脂质、甾醇类、其他碳原子数8～22的饱和及不饱和的具有酰基的化合物。
其他的脂质也可以是含有磷脂酰胆碱的单独磷脂质，也可以是与其以外的脂质的混合脂质。
所说的磷脂质是指甘油磷脂质、鞘氨醇磷脂质、甘油糖脂质，所说的甾醇类是指胆固醇、二氢胆固醇、麦角甾醇、羊毛甾醇。
作为甘油磷脂质，可举出碳原子数4～24、优选的是12～20的饱和及不饱和的直链或支链的具有酰基的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸。另外，也可与蛋黄卵磷脂及大豆卵磷脂类的来自天然的混合脂质体使用。
碳原子数4～24的酰基，可举出来自辛酸、癸酸、月桂酸、十四酸、十六酸、棕榈烯酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、山俞酸等的酰基。
其他的脂质，具体地也可以例如是由以下所示的组成比的混合脂质构成的。
磷脂酰胆碱/胆固醇/磷脂酰甘油是20～90/10～60/2～40摩尔％、优选的是30～60/20～50/15～25摩尔％。
可以用公知的方法制造由本发明的脂质体形成剂得到的脂质体。
例如，作为一般的Bangahm法将原料的脂质溶解到可溶解的有机溶剂中，使用蒸发器等除去溶剂后，形成脂质薄膜，在相转移点以上的温度下水合乳化后，用超声波处理得到脂质体溶液。另外，将上述原料的脂质进行水合，使用均化器等在相转移点以上的温度下乳化后，使用聚碳酸酯的膜进行加压过滤的方法(HopeM.Jetal，Biochimica et Biophysica Acta，812，55(1985))得到脂质体溶液，另外，得到的脂质体即使是多层脂质体或单层脂质体都可调节成适当的粒径。优选的是粒径60～300nm、更优选的是90～200nm的单层脂质体。
本发明的脂质体形成剂由于含有本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂，所以作为脂质体溶液，保存稳定性优良，同时，机体毒性强的单酰基磷脂质的含量少，例如三乙胺等的含有氮的杂质的含量少，所以对于机体是安全的。为此，通过使用本发明的脂质体形成剂，可得到可作为安全性高的药物传递系统利用的脂质体。
作为脂质体溶液保存稳定性优良的理由，可推测如下。由于单酰基磷脂质比二酰磷脂质的疏水性低，所以容易从脂质体表面脱离。为此，单酰基磷脂质的含量多的以往的脂质体，单酰基磷脂质从脂质体表面脱离，脂质体表面的水合层减少，所以脂质体粒子发生凝集引起相分离容易造成不稳定。与此相反，本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂，由于单酰基体含量少，所以难以发生从脂质体表面脱离的磷脂质。为此，脂质体溶液的保存稳定性优良。
对于本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂的合成法，作为催化剂不使用三乙胺等的含有氮的碱。因此，在聚亚烷基氧改性的磷脂中不残存有害的碱，可得到对于机体安全且纯度高的聚亚烷基氧改性的磷脂。
本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂，可通过以下的工序(A)制造。
工序(A)：在水溶液显示碱性的碱金属盐，且不含氮的固体盐存在下，在有机溶剂中使上述式(2)表示的聚亚烷基氧化合物的活性化体和用上述式(3)表示的磷脂质反应的工序。
在工序(A)使用的上述式(2)表示的聚亚烷基氧化合物及用上述式(3)表示的磷脂质中，R1CO、R2CO、R3O、k、n、X、p及Y与上述式(1)说明的相同。
在用上述式(2)表示的聚亚烷基氧化合物中，Z是赋予活性的基团，是对于聚亚烷基氧化合物赋予和上述式(3)表示的磷脂质的反应活性的基团，含有电子吸引基、其他的基。作为这样的基团，具体举例有咪唑、4-硝基苯基氧基、苯并三唑基、氯、甲氧基、乙氧基、丙氧基、羰氧基-N-2-吡咯烷酮基、羰基-2-氧代嘧啶基、N-琥珀酰亚胺基氧基、五氟苯甲酰基等。其中，优选的是咪唑、4-硝基苯基氧基、苯并三唑基、氯、N-琥珀酰亚胺基氧基，特别优选的是4-硝基苯基氧基。
用上述式(3)表示的磷脂质，可以是天然磷脂质，也可以是合成磷脂质。作为具体的例子，例如可举出大豆及大豆加氢磷脂酰乙醇胺、蛋黄及蛋黄加氢磷脂酰乙醇胺等的天然及合成磷脂酰乙醇胺等。作为用上述式(3)表示的磷脂质，优选的是k是2的磷脂酰乙醇胺。
在工序(A)中使用的固体盐是水溶液显示碱性的碱金属盐，是不含氮的固体盐。作为固体盐，只要可将用式(2)表示的聚亚烷基氧化合物的活性化体和式(3)的磷脂质的氨基结合的化合物都可使用。
具体地，固体盐是溶解在水中作成水溶液时的pH显示碱性的物质。优选的是pH是7.1～13的、更优选的是7.1～11的。作为固体盐，优选的是含有钠或钾的固体盐。作为固体盐，可举出碳酸盐、磷酸盐、醋酸盐等。具体地是碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、醋酸钠、醋酸钾等。其中，优选的是碳酸氢钠、碳酸钠，特别优选的是碳酸钠。
固体盐的使用量，优选的是用上述式(2)表示的聚亚烷基氧化合物的0.1～1000倍摩尔。若是1000倍摩尔以下，由于容易搅拌，所以是理想的。固体盐的使用量，特别优选的1～500倍摩尔。
使用的式(2)的聚亚烷基氧化合物的活性化体和式(3)的磷脂质的加入量，希望摩尔比越接近1∶1越好，但优选的是磷脂质过剩地设定。具体地，聚亚烷基氧化合物的活性化体和磷脂质的摩尔比是1∶1～1∶5、优选的是1∶1.1～1∶2，最好的是1∶1。
在磷脂质过剩时，在后述的工序中，可从生成物除去。另一方面，在聚亚烷基氧化合物过剩时，在反应终了后残存未反应的聚亚烷基氧化合物。此时，在聚亚烷基氧化合物的分子量是约100～约3000时，通过将残存的聚亚烷基氧化合物重结晶或晶析等的方法除去。但是，往往有时会使聚亚烷基氧改性的磷脂的收率降低。另一方面，在聚亚烷基氧化合物的分子量是约3000以上时，残存的聚亚烷基氧化合物大多难以除去。此时，难以得到高纯度的聚亚烷基氧改性的磷脂，所以前述摩尔比不够理想。
本发明的制备方法，可在上述固体盐存在下使上述式(2)表示的聚亚烷基氧化合物和上述式(3)表示的磷脂质反应。可是，根据情况，本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂可使磷脂质的活性化体和聚亚烷基氧化合物反应而得到。
用于工序(A)反应的有机溶剂，只要是没有羟基的官能团的就没有什麽限制地使用。例如可以举出醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯及甲苯等非质子性溶剂。这些中优选的是甲苯、氯仿。乙醇等的具有羟基的有机溶剂，由于与上述(2)所示的聚亚烷基氧化合物的活性化体的末端基反应，所以是不合适的。二氯甲烷等在反应性上虽然没有问题，但是由于沸点低，在操作上是不适宜的。
工序(A)的反应温度是30～90℃，优选的是40～80℃。反应时间是1小时以上。优选的是2～10小时以上。
用上式(2)表示的聚亚烷基氧化合物和用上式(3)表示的磷脂质反应，可以得到用上述式(1)表示的本发明聚亚烷基氧改性的磷脂。
在工序(A)中，用上式(2)表示的聚亚烷基氧化合物的末端是氨基、羧基、和硫羟基，特别是末端为氨基时，最好是将这些基团保护后再进行反应。例如对于氨基可用叔丁氧羰基或9-芴基甲基羰基等的保护基，对于羧基可用甲基酯化后进行保护，对于硫羟基可用S-t-丁基硫基等的保护基进行保护。
从工序(A)得到的反应液过滤固体盐后，将滤液浓缩或加入到弱溶剂中后，采用结晶化等的方法，可以高纯度且高收率地得到上述式(1)表示的本发明聚亚烷基氧改性的磷脂质。用于过滤所使用的滤材，只要是可以除去被处理液中的杂质就没有什麽特别的限制，通常可以使用保留粒子细孔径为1～10μm耐溶剂性的纸、玻璃等各种材质的过滤器。对于过滤方法没有特别的限制，例如可以使用减压过滤、加压过滤、离心过滤等的方法。
另外，通过调节从工序(A)得到的滤液的pH值，可以将聚亚烷基氧改性的磷脂质变换成前式(1)的磷酸基部的M是氢的氢型、及M是钠或钾的碱性盐型。
将得到的聚亚烷基氧改性的磷脂质或含有聚亚烷基氧改性的磷脂质的工序(A)的溶液通过下述的工序(B)～(D)可以得到更高纯度的聚亚烷基氧改性的磷脂质。另外工序(B)～(D)最好是通过上述的过滤从工序(A)的反应液除去固体盐后进行。
在工序(B)，是将工序(A)得到的结晶溶解在有机溶剂时，作为杂质而存在的过剩的磷质脂进行除去的工序。
使用的有机溶剂，可以使用溶解作为目的物的聚亚烷基氧改性的磷脂质，但是最好是不溶解过剩存在磷质脂的溶剂或者磷质脂溶解度低的溶剂。作为有机溶剂优选的是醋酸乙酯或丙酮，特别优选的是丙酮。
工序(B)的溶解温度优选的是0～80℃，特别优选的是20～70℃。有机溶剂的使用量，对于结晶是1～100重量倍，优选的是2～50重量倍。
从工序(B)溶液过滤不溶物后，将滤液浓缩或加入到弱溶剂中后，采用结晶化等的方法，可以高纯度且高收率地得到用上述式(1)表示的本发明聚亚烷基氧改性的磷脂质。
只是将得到的滤液进行冷却也可以进行结晶，但是根据溶剂的种类，有可能用上述式(1)表示的本发明聚亚烷基氧改性的磷脂质不能充分地析出，残存在溶液中而降低了收率。
另外，也可以通过蒸馏除去有机溶剂进行结晶化，在蒸馏出有机溶剂时，最好是在80℃以下的减压下进行。有机溶剂的蒸馏出温度超过80℃时，可能引起用上述式(1)表示的本发明聚亚烷基氧改性的磷脂质分解等的不需要的副反应。
另外，如上所述，通过调节从工序(B)得到的滤液的pH值，可以将聚亚烷基氧改性的磷脂质变换成氢型或碱性盐型。
工序(B)可以在工序(A)后进行，也可以在下述的工序(C)、工序(D)任何一个前进行，也可以在工序(C)和/或工序(D)后进行。
工序(B)得到的结晶可以直接地作为本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂质，也可以进一步精制。
在本发明的方法中，工序(A)后，最好通过下述工序(C)和/或(D)除去工序(A)中由于作为原料式(2)所示的聚亚烷基氧化合物的活性体生成的赋予活性的基团Z所生成的化合物。工序(C)(D)，分别在工序(A)后，可以在工序(B)前或后，工序(C)和(D)哪一个在前都可以，但是，最好在工序(B)后进行工序(C)(D)，另外，最好在工序(C)后进行工序(D)。
工序(C)中，溶解工序(A)得到的结晶，通过冷却或加入弱溶剂，析出的结晶以除去源于Z的化合物，进行精制。
在工序(C)中使用的溶剂，最好是能溶解工序(A)得到的结晶，通过冷却能析出聚亚烷基氧改性的磷脂质结晶的溶剂、或通过加入弱溶剂可以使聚亚烷基氧改性的磷脂质结晶化的溶剂。特别优选的是结晶析出时，使作为目的物的聚亚烷基氧改性的磷脂质进行结晶化，使源于Z化合物溶解的溶剂。
在工序(C)中使用的溶剂量，对于结晶是1～100重量倍，优选的是2～50重量倍。
在工序(C)中，重结晶后可进行冷却，或者使用弱溶剂进行结晶化。最好是冷却到10℃以下时，可以充分地进行结晶化，可以良好的收率得到结晶。
也可以蒸馏出溶剂后进行结晶。蒸馏出溶剂时，最好是在80℃以下减压下进行。有机溶剂的蒸馏出温度超过80℃时，就可能产生上述式(1)表示的聚亚烷基氧改性的磷脂质的酰基分解的不希望的副反应。
工序(C)的具体方法，可以举出以下的方法。
1)溶解在醋酸乙酯、丙酮选出的至少一种溶剂中后，通过冷却析出聚亚烷基氧改性的磷脂质的结晶。
2)溶解在醋酸乙酯、丙酮选出的至少一种溶剂中后，通过使用醚或碳原子数为5～8的脂肪族烃析出聚亚烷基氧改性的磷脂质的结晶。
3)溶解在醋酸乙酯、丙酮选出的至少一种溶剂和醚或碳原子数为5～8的脂肪族烃的组合溶剂后，通过冷却析出聚亚烷基氧改性的磷脂质的结晶。
以上的方法中，特别优选的是1)的使用醋酸乙酯溶解后，冷却，进行结晶化的方法。
在工序(C)中使用的上述碳原子数为5～8的脂肪族烃没有特别的限制。可以举出例如，戊烷、异戊烷、新戊烷、己烷、异己烷、3-甲基戊烷、新己烷、2，3-二甲基丁烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基-己烷、3-乙基戊烷、2，2-二甲基戊烷、2，3-二甲基戊烷、3，3-二甲基戊烷、2，3，3-三甲基丁烷、辛烷、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、4-甲基庚烷、3-乙基己烷、2，2-二甲基己烷、2，3-二甲基己烷、2，4-二甲基己烷、2，5-二甲基己烷、3，3-二甲基己烷、3，4-二甲基己烷、2-甲基-3-乙基戊烷、3-甲基-3-乙基戊烷、2，2，3-三甲基戊烷、2，2，4-三甲基戊烷、2，2，3，3-四甲基丁烷等。其中优选的是己烷或庚烷。
进行工序(C)时，想进一步提高纯度时，通过数次重复工序(C)的操作可以得到纯度更加优良的聚亚烷基氧改性的磷脂质。
由工序(C)得到的结晶可以直接地作为本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂质，也可以进而提供给其他的精制工序。
在工序(D)中，结晶溶解在溶剂中后，通过添加吸附剂后搅拌的方法，可以除去源于Z的化合物。另外在工序(D)中，也可以使用过滤工序(A)得到的反应液后的滤液来进行。
工序(D)中所使用的溶剂，优选的是醋酸乙酯、氯仿、甲苯、丙酮等。这些中特别优选的是醋酸乙酯。
使用吸附剂后的处理温度是10～85℃，优选的是40～70℃，时间是10分钟～5小时，优选的是30分钟～3小时。
可以用加热溶解工序(A)得到的结晶，进行吸附剂处理的方法，但是在上述温度下由于结晶不溶解的情况和溶液粘度高的情况多，所以最好是用稀释醋酸乙酯等的溶解本发明聚亚烷基氧改性的磷脂质的溶剂后，进行处理。处理温度低于10℃时，有时聚亚烷基氧改性的磷脂质析出，在除去吸附剂时，聚亚烷基氧改性的磷脂质也被一起除去，所以收率下降，是不理想的。另外超过85℃时，存在微量水分时，在吸附剂处理中可能引起聚亚烷基氧改性的磷脂质的加水分解。
吸附剂的使用量，对于处理结晶的100重量份是0.1～200重量份，优选的是1～50重量份，吸附剂的量是0.1～200重量份时，可以充分有效地除去源于Z的化合物。
在工序(D)中不进行吸附剂处理，用过滤等的方法除去吸附剂后，可以用冷却的方法或者使用弱溶剂进行结晶化。优选的是冷却到10℃以下进行的话可以充分地进行结晶，可以得到良好的收率。
除去吸附剂后，可以在蒸馏出溶剂后进行结晶化，但是在蒸馏出溶剂时最好是在80℃以下的减压条件下进行。有机溶剂的蒸馏出温度超过80℃时就有可能引起上述式(1)所示的聚亚烷基氧改性的磷脂质的酰基分解的不需要的副反应。
在工序(D)中使用的吸附剂，是含有碱土类金属氧化物、碱土类金属氢氧化物、铝或硅的吸附剂或者活性碳，例如含有氢氧化铝、氧化铝、氧化镁、氢氧化镁、氧化硅等的吸附剂、活性炭等。含有这些化合物的市售品可以举出协和200、协和300、协和500、协和600、协和700、协和1000、协和2000(协和化学工业(株)制、商标)、特密克斯AD300、特密克斯AD500、特密克斯AD700(富田制药(株)制、商标)等。可以单独使用一种吸附剂，也可以两种以上组合使用。
在工序(D)中得到的结晶也可以直接作为本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂质，也可以不结晶工序(D)的滤液，进一步用吸附剂处理，进而，进行结晶。
利用以上制备方法，副产品单酰基磷脂质的含量少，而且用以前方法使用溶剂从最终生成物中去除是困难的，为此拥有残在最终生成物中氮原子碱等不纯物少，可容易地、高收率地制造，具有氮原子的杂质含量少的高纯度的聚亚烷基氧改性的磷脂质。
发明的效果
本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂是新颖而且是有用的化合物。本发明的聚亚烷基氧改性的磷脂中单酰基磷脂质和具有氮原子的杂质含量少，是对机体的安全性高的高纯度的聚亚烷基氧改性磷脂，所以适用于表面活性剂，特别适用于乳化剂、增溶剂、高分子胶形成剂、分散剂、两亲性化学改性剂，以及脂质体形成剂等。
本发明的制备方法中，将上述式(2)表示的聚亚烷基氧化合物和用式(3)表示的磷脂质溶解在水中时，在显示碱性的碱金属盐且不含有氮的固体盐的存在下，在有机溶剂中进行反应。因此，可高收率地制造单酰基磷脂质体的含量少，具有氮原子的杂质含量少的高纯度的聚亚烷基氧改性的磷脂。
实施例
以下根据本发明的实施例进行说明。各例中的百分比，只要没有特别说明，都是重量百分比。
实施例1
(1)单甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下述式4的合成)
[化学结构式9]
Figure C0210681300331
(n＝45，M＝H，Na)
聚氧亚乙基甲基醚(poly(oxyethylene mono methyl ether))(分子量2000，20g，10mmol)，加入甲苯(80ml)，在110℃下回流，脱水一小时。冷却到50℃后，加入1，1’-羰基二咪唑(1.95g，12mmol)，反应2小时，得到活性体。接着，加入碳酸钠(42.4g，400mmol)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(11.22g，15mmol)升温到65℃后，反应8小时。
过滤碳酸钠后，向滤液加入己烷(300ml)，进行结晶化。过滤结晶后(该结晶1g作为样品，将其作为工序(A)的样品①，以下同样地得到样品②～⑥)，向结晶中加入丙酮(80ml)升温到50℃。用玻璃过滤器进行过滤，除去杂质。向滤液加入己烷(160ml)，析出结晶，冷却到5℃，而后过滤结晶(工序B中的样品②)。
向结晶中加入醋酸乙酯(400ml)在65℃下溶解，搅拌30分钟后，冷却到5℃。过滤析出的结晶(工序(C)中的样品③)。同样地再进行醋酸乙酯工序的操作(工序(C)中的样品④)。
用醋酸乙酯(400ml)溶解结晶后，加入吸附剂协和#2000(5g)、协和#700(0.8g)，在65℃下，搅拌一小时。过滤吸附剂后冷却到5℃，结晶化(样品⑤)。过滤结晶后，同样地，再一次进行吸附剂处理。用己烷洗涤结晶后，过滤、干燥，得到目的化合物14.6g(收率52.2％)(工序(D)中的样品⑥)。最终得到的结晶的纯度是98.4％。
各步骤中生成物的分析通过使用硅胶板的薄层色谱(TLC)进行。展开溶剂是使用氯仿和甲醇的混合比为85∶15重量比的混合溶剂，用碘蒸汽发色后，与已知量的标准物质比较，进行含有物质的定量。
同样，也可以重量混合比为65∶25∶4∶0.1的氯仿、甲醇、水、氨水的混合溶剂为展开剂进行薄层层析(TLC)。
前者，作为可以定量的杂质溶血磷脂、游离的磷脂质、游离的聚乙二醇衍生物、三乙胺，后者可以定量聚亚烷基氧改性的磷脂质中的磷酸部的三乙胺盐中的三乙胺量。
用这些方法求出的纯度结果表示在表1中。
另一方面，为了测定含有在各工序物质中的源于Z的化合物量，也对于样品①～⑥进行分析。减压下干燥样品①～⑥后，分别在试管中取50mg，用乙醇稀释全量到5g，进行溶解。用分光光度计测定来自1，1’-羰基二咪唑(CDI)的248nm的吸光度。从各个样品的测定值求出各工序中的来自1，1’-羰基二咪唑的化合物的除去率，得到的各个除去率分别表示在表2中。
从表2的结果可以确认，在各工序中源于Z的化合物减少，聚亚烷基氧改性的磷脂质得到了精制。最终含有0.02％程度的来自1，1’-羰基二咪唑的化合物，但是，这种程度的值，作为杂质的含有量是可以忽视的量。
实施例2
(2)单甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下述式5的合成)
[化学结构式10]
Figure C0210681300351
(n＝45，M＝H，Na)
在反应器中加入在聚氧亚乙基甲基醚(分子量2000，50g，25mmol)、碳酸钠(53g，500mmol)及甲苯(200ml)，升温到75℃。添加对硝基苯基氯甲酸酯(12.6g，62.5mmol)后，反应9小时，得到活性体。冷却到65℃后，加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(28.1g，37.5mmol)，反应7.5小时。
过滤碳酸钠后，向滤液加入己烷(500ml)，冷却到5℃后，过滤析出的结晶。向结晶中加入丙酮(200ml)，升温到50℃后，用玻璃过滤器进行过滤，除去杂质(工序B)。
向滤液中加入己烷(500ml)，冷却到5℃。过滤析出结晶后，供给工序(C)。在工序(C)中，加入醋酸乙酯(750ml)在65℃下溶解，搅拌30分钟后，冷却到5℃。过滤析出的结晶。同样地再进行一次使用醋酸乙酯工序(C)的操作。
用醋酸乙酯(750ml)溶解结晶后，加入吸附剂协和#2000(12g)、协和#700(1g)，在60℃下，搅拌一小时。过滤吸附剂后，冷却到5℃，过滤析出结晶(工序(D))。同样地，进行二次工序(D)的用吸附剂处理。
用己烷(300ml)洗涤结晶后，过滤、干燥，得到目的化合物38.2g(收率54.6％)，纯度是99.5％纯度的结果表示在表1中。
实施例3
(3)单甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下述式6的合成)
[化学结构式11]
Figure C0210681300361
(n＝113，M＝H，Na)
在反应器中加入聚氧亚乙基甲基醚(分子量5000，20g，4mmol)、碳酸钠(17.0g，160mmol)及甲苯(75ml)，升温到75℃。添加对硝基苯基氯甲酸酯(2.7g，13.2mmol)后，反应9小时，得到活性体。冷却到65℃后，加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(4.5g，6mmol)，反应6小时。
过滤碳酸钠后，向滤液加入己烷(200ml)，过滤析出的结晶。向结晶中加入丙酮(150ml)，加热到50℃后，用玻璃过滤器除去杂质(工序(B))。
加入己烷(300ml)，析出结晶。过滤后向结晶中加入醋酸乙酯(400ml)，在65℃下溶解，搅拌30分钟后，冷却到5℃。过滤析出的结晶(工序(C))。同样地再进行二次使用醋酸乙酯工序(C)的操作。
用醋酸乙酯(360ml)溶解结晶后，加入吸附剂协和#2000(4g)、协和#700(0.2g)，在65℃下，搅拌一小时。过滤吸附剂后冷却到5℃，过滤析出结晶(工序(D))。同样地，进行二次用吸附剂的工序(D)的处理。
用己烷(90ml)洗涤结晶后，过滤、干燥，得到目的化合物15.2g(收率65.4％)，纯度是98.4％，纯度的结果表示在表1中。
实施例4
(4)单甲基聚氧乙烯氨基甲酰二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(下述式7的合成)
[化学结构式12]
(n＝113，M＝H，Na)
在反应器中加入聚氧亚乙基甲基醚(分子量5000，20g，4mmol)、碳酸钠(33.9g，320mmol)及甲苯(75ml)，升温到75℃。添加对硝基苯基氯甲酸酯(2.82g，14mmol)后，反应9小时，得到活性体。冷却到65℃后，加入二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(3.2g，6mmol)，反应5小时。
过滤碳酸钠后，向滤液加入己烷(200ml)，冷却到5℃，过滤析出的结晶，得到结晶。向结晶中加入丙酮(150ml)，加热到50℃后，用玻璃过滤器除去杂质(工序(B))。
向溶液中加入己烷(300ml)，析出结晶。过滤后向得到的结晶中加入醋酸乙酯(400ml)，在65℃下溶解，搅拌30分钟后，冷却到5℃。过滤析出的结晶(工序(C))。进而进行二次使用醋酸乙酯工序(C)的处理。
用醋酸乙酯(360ml)溶解结晶后，加入吸附剂协和#2000(4g)、协和#700(0.2g)。过滤吸附剂后冷却到5℃，过滤析出结晶(工序(D))。同样地，进行二次用吸附剂的工序(D)的处理。
用己烷(90ml)洗涤结晶后，过滤、干燥，得到目的化合物15.2g(收率65.6％)，纯度是98.5％，纯度的结果表示在表1中。
比较例1
吡啶二硫丙酰氨基聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的合成
(1)将吡啶二硫丙酰氨基  聚乙二醇  琥珀酰亚胺碳酸酯(1g，0.42mmol)溶解在氯仿(10ml)中，加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(0.36g，0.44mmol)，接着加入三乙胺(0.33ml，2.37mmol)。在40℃下，搅拌混合物10分钟。在减压下，用蒸发器浓缩溶液后，加入乙腈(50ml)，将此溶液在4℃下冷藏一夜。接着进行离心分离，分离出透明的溶液。溶液经蒸发器浓缩后得到干燥结晶。收量是1.15g。收率是90.8％。纯度的结果表示在表3中。
表3所示的游离三乙胺的含有量及游离碱的含有量，在薄层色谱(TLC)的点中，可以定量到5％，但在此以上丧失定量性，因此对于超过5％的，用＞5表示。
比较例2
(2)单甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的合成
向聚氧亚乙基甲基醚(分子量2000，20g，10mmol)中加入苯(75ml)，回流，脱水。加入羰基二咪唑(1.78g，11mmol)回流2小时。加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(7g，9.36mmol)及三乙胺(3.1ml，22mmol)回流20小时。用蒸发器浓缩反应液得到粗提物。
此粗提物用C-18逆相硅胶色谱精制。C-18逆相硅胶使用(Bio-Gel  A-1.5m)，洗脱液使用乙醇/水＝4/1。收量是5.0g。收率是18％。纯度的结果表示在表3中。
比较例3
(3)单甲基聚氧乙烯氨基甲酰  1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺的合成
将聚氧亚乙基甲基醚(分子量2000，5g，2.5mmol)溶解在氯仿/甲苯＝50/2(wt/wt)(25ml)中后，加入三光气(0.89g，3mmol)，在40℃下反应3小时。向该溶液中加入乙醚(75ml)，使之沉淀。过滤沉淀物后，干燥，得到单甲基聚氧乙烯氯甲酸酯(4.7g，91％)。
将单甲基聚氧乙烯氯甲酸酯(4g，1.94mmol)及1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(1.65g，2.3mmol)溶解在氯仿(20ml)中，加入三乙胺(0.39ml，2.76mmol)，在60℃下反应3小时。
过滤出杂质后，用蒸发器浓缩反应液。向残渣中加入水(20ml)溶解，加入0.1N盐酸(5.0ml)将水溶液酸化。向水溶液中加入二氯甲烷(25ml)进行萃取。同样地重复二次萃取，向合并的萃取液中加入硫酸钠(30g)，脱水。过滤出硫酸钠后，用蒸发器浓缩。用硅胶柱色谱精制残渣，得到目的化合物1.5g。收率是28％。纯度的结果表示在表3中。
比较例4
(4)叔丁氧羰基酰肼聚氧乙烯琥珀酰磷脂酰乙醇胺的合成
将叔丁氧羰基酰肼聚氧乙烯琥珀酰碳酸酯(1g，0.42mmol)溶解在氯仿(6ml)中后，加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(0.292g，0.39mmol)及三乙胺(0.144ml，1.04mmol)，在45℃下反应10分钟。
向反应液中加入醋酸(0.06ml，1.05mmol)，用蒸发器浓缩。向残渣中加入水(7.5ml)溶解后，用蒸发器蒸馏出少量的氯仿后。将反应液加入到Spectrapor CE透析管(MWCO  30万)，用50mM的生理盐水(1500ml×3)在4℃下进行透析(8-16小时/1次透析)。进而，用离子交换水透析后，用0.2μm的灭菌的过滤器过滤。冷冻干燥后，得到目的物。收量是0.55g，收率是43.3％。纯度的结果表示在表3中。
表1
  实施例1   实施例2   实施例3   实施例4
  纯度*1   98.4   99.5   98.4   98.5
  收率   52.2   54.6   65.4   68.6
  溶血磷脂含量       *2   0.1   0.1   0.3   0.1
  游离PE含量         *3   0   0   0   0
  游离PEG衍生物含量  *4   1.4   0.3   1.2   1.3
  游离三乙胺含量     *5   0   0   0   0
  游离盐中三乙胺含量 *6   0   0   0   0
表2
  样品   CDI衍生物除去率(％)
  ①→②   27
  ②→③   65
  ③→④   40
  ④→⑤   81
  ⑤→⑥   85
表3
  比较例1   比较例2   比较例3   比较例4
  纯度                *1   ＜84.5   ＜85.6   ＜84.3   ＜82.6
  收率   90.8   18   28   43.3
  溶血磷脂含量        *2   3.0   6.0   8   10
  游离PE含量          *3   1.0   0.2   0.5   0.3
  游离PEG衍生物含量   *4   1.5   3.0   2   1.8
  游离三乙胺含量      *5   ＞5   0.2   0.2   0.3
  游离盐中三乙胺含量  *6   ＞5   ＞5   0.0   ＞5
表1，表3的注释：
*1  纯度1：上述式1表示的聚亚烷基氧改性的磷脂质的纯度(单位％)
*2  溶血磷脂含有量：单乙酰基磷脂质体的含有量(单位％)
*3  游离PE含有量：未反应的磷脂质体的含有量(单位％)
*4  游离PEG衍生物含有量：聚乙二醇及该衍生物的含有量(单位％)
*5  游离三乙胺含有量：三乙胺含有量(单位％)
*6  游离盐中的三乙胺含有量：磷酸三乙胺盐中的三乙胺含有量(单位％)
从表1、表3的结果可以看出实施例的制备方法与比较例比较，溶血磷脂和三乙胺等的杂质含有量少，可以高纯度地制造聚亚烷基氧改性的磷脂质。
实施例5
使用实施例3的单甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺作成乳液。即在表4构成的基材中，将含有乳化剂的油相部加热到60℃均一的溶解后，在该温度下一边搅拌一边加入水相部而作成的。
表4
  油相部：十六烷醇凡士林三十碳烷硬脂酸流动石蜡聚环氧乙烷(5摩尔)单油酸酯单甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺生育酚香料防腐剂 2.0wt％2.0wt％5.0wt％0.2wt％10.0wt％1.5wt％1.0wt％0.02wt％适量适量
  水相部：丙二醇精制水 5.0wt％残余
制作的乳液在40℃下保存一个月后，用下述的标准评价乳化的状态。其结果表示在表6中。
3：稳定的状态
2：稍微不均匀的状态
1：乳油化或分离的状态
另外，将刚刚制作好的乳液涂敷在皮肤上，进行感官试验。感官评价是由5人的专门参加者来进行的。评价的方法，是将上臂洗净后涂敷试样，对刚刚涂敷后及经过一夜后的皮肤刺激的评价，分别用以下的三个阶段进行记分，5人的合计分数表示在表6中。
3：普通，完全没有异常
2：有异样感，稍微有痒感
1：有痒感，皮肤发红
实施例6
使用实施例2的单甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺作成脂膏。即在表5构成的基材中，将含有乳化剂的油相部加热到60℃均一的溶解后，在该温度下一边搅拌一边加入水相部而作成的。
表5
  油相部：十六烷醇蜂蜡凡士林三十碳烷单硬脂酸甘油硬脂酸聚环氧乙烷(8摩尔)聚环氧丙烷(1摩尔)硬脂酰醚单甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺香料防腐剂 2.0wt％6.0wt％5.0wt％34.0wt％2.0wt％0.5wt％1.5wt％1.0wt％适量适量
  水相部：丙二醇精制水 2.0wt％残余
对制作的脂膏与实施例5进行同样的评价，其结果表示在表6中。
比较例5及比较例6
使用比较例3的的单甲基聚氧乙烯氨基甲酰  二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，与实施例5及实施例6进行同样的试验，其结果表示在表6中。
表6
  使用化合的种类          皮肤刺激性   40℃保存一个月后的乳化状态
  立即涂敷后   一夜后
  实施例5实施例6   实施例3实施例3   1515   1314   33
  实施例5实施例6   实施例2实施例2   1312   108   21
实施例7
脂质体溶液稳定性的评价
将二棕榈酰磷脂酰胆碱(1.92g，2.64mmol)、胆固醇(0.45g，1.32mmol)、实施例2得到的单甲基聚氧乙烯氨基甲酰  二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(0.42g，0.15mmol)加入到梨型的烧瓶内，加入氯仿50ml使其溶解，用辊筒蒸发器脱溶剂，在烧瓶内壁形成脂质的薄膜。减压下充分除去溶剂，加入pH7的磷酸缓冲生理食盐水溶液30ml后，分散，进而，用超声波洗涤器进行5分钟的处理，作成脂质体溶液。
得到的脂质体溶液在室温下放置一个月。一个月后的脂质体溶液的分散状态，用目测没有看到变化，是均匀的脂质体溶液。
比较例7
使用比较例2得到的单甲基聚氧乙烯氨基甲酰  二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，与实施例7进行同样的评价，其结果，脂质体溶液不均匀，脂质粒子沉淀下来。
实施例8
使用羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰  二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的天冬酰胺酶的改性
将与实施例3相同得到的羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰  二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(5g、0.86mmol)溶解在氯仿50ml中，添加N-羟基琥珀酰亚胺(0.15g、1.29mmol)，添加溶解在少量的氯仿中的二环己基碳酰亚胺(0.27g、1.29mmol)在室温下搅拌2小时。然后，在过滤除去不溶物的溶液中添加乙醚，过滤析出的结晶而得到。在减压下除去溶剂，用于以下的工序。
将天冬酰胺酶0.1g溶解在pH7.4的磷酸缓冲液生理盐水液50ml中，添加由上述得到的琥珀酰亚胺羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，在5℃下搅拌4小时。将此反应液，对于pH7.4、4℃的磷酸缓冲液生理食盐水液进行透析除去未反应物，然后冻结干燥，得到羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺与天冬酰胺酶结合了的干燥品。
实施例9
使用羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的大豆加氢磷脂酰胆碱的高分子胶粒溶液的配制
将大豆加氢磷脂酰胆碱(0.1g、0.13mmol)和与实施例3相同地得到的羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(1g、0.17mmol)添加到蒸馏水(5ml)中搅拌混合。将蒸馏水(95ml)慢慢添加到均匀的混合溶液中进行搅拌，得到均匀的、透明的高分子胶粒溶液。使用粒度测定装置(NICOMP Model370：野崎产业株式会社制)测定粒度分布。其结果平均粒径是35nm。
将得到的高分子胶粒溶液在室温下放置1个月。1个月后的高分子胶粒溶液的状态是目测看不到变化而没有沉淀物的均匀的脂质体溶液。

Claims (34)

1.单酰基磷脂质体的含量低于重量的3％、且具有氮原子的碱基的含量低于重量的0.02％的下述式(1)表示的聚亚烷基氧改性的磷脂，
[化学结构式1]
Figure C021068130002C1
式(1)中，R1CO及R2CO分别独立地是碳原子数4～24的酰基；k是1～6；R3O是碳原子数2～4的氧化烯；n是碳原子数2～4的氧化烯的平均加成摩尔数，是10～800的数；M是氢原子、钠、或钾；X是碳原子数1～3的2价的烃基或-C(＝O)(CH2)q-，其中，q是1～4；p是0或1，p是0时，Y是氢原子或碳原子数1～4的烷基，p是1时，Y是氢原子、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基或硫羟基。
2.根据权利要求1所述的聚亚烷基氧改性的磷脂，其中单酰基磷脂质体的含量低于重量的2％。
3.根据权利要求1所述的聚亚烷基氧改性的磷脂，其中p是0、Y是甲基、单酰基磷脂质体的含量是低于重量的0.5％。
4.一种根据权利要求1-3的所述聚亚烷基氧改性的磷脂的制备方法，其中包括下述工序(A)；
工序(A)：在碱金属盐存在下，在有机溶剂中使下述式(2)表示的聚亚烷基氧化合物的活性化体和用下述式(3)表示的磷脂质反应的工序，其中所述碱金属盐为不含氮的固体盐，且其水溶液呈碱性，
[化学结构式2]
Figure C021068130003C1
式(2)中，R3O是碳原子数2～4的氧化烯、n是碳原子数2～4的氧化烯的平均加成摩尔数，是10～800的数；X是碳原子数1～3的2价的烃基或-C(＝O)(CH2)q-，其中，q是1～4；p是0或1，p是0时，Y是氢原子或碳原子数1～4的烷基，p是1时，Y是氢原子、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基或硫羟基；Z是赋予活性的基团，是对聚亚烷基氧化合物赋予和下述式(3)表示的磷脂质进行反应的活性的基团；
[化学结构式3]
式(3)中，R1CO及R2CO分别独立地是碳原子数4～24的酰基、k是1～6。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中R1CO及R2CO是碳原子数12～20的酰基。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其中p是0、Y是甲基。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其中在所述工序(A)中使用的固体盐是碳酸钠，有机溶剂是甲苯或氯仿。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其中在所述工序(A)后，并具有下述工序(B)，
工序(B)：使用醋酸乙酯或丙酮除去所述式(3)表示的磷脂。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(C)，
工序(C)：使用醋酸乙酯和/或丙酮作为溶剂进行重结晶的工序。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(C)，
工序(C)：使用醋酸乙酯和/或丙酮作为溶剂进行重结晶的工序。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其中在所述工序(C)中，还将至少一种选自由碳原子数5～8的脂肪族烃和醚组成的组中的化合物用作溶剂。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其中在所述工序(C)中，还将至少一种选自由碳原子数5～8的脂肪族烃和醚组成的组中的化合物用作溶剂。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其中所述工序(C)是在所述工序(B)后进行。
14.根据权利要求4所述的制备方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(D)，
工序(D)：使用吸附剂进行精制的工序。
15.根据权利要求8所述的制备方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(D)，
工序(D)：使用吸附剂进行精制的工序。
16.根据权利要求9所述的制备方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(D)，
工序(D)：使用吸附剂进行精制的工序。
17.根据权利要求10所述的制备方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(D)，
工序(D)：使用吸附剂进行精制的工序。
18.根据权利要求11所述的制备方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(D)，
工序(D)：使用吸附剂进行精制的工序。
19.根据权利要求12所述的制备方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(D)，
工序(D)：使用吸附剂进行精制的工序。
20.根据权利要求13所述的制备方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(D)，
工序(D)：使用吸附剂进行精制的工序。
21.根据权利要求14所述的制备方法，其中在所述工序(D)中使用的吸附剂是含有碱土类金属氧化物、碱土类金属氢氧化物、铝、或者硅的吸附剂，或活性炭。
22.根据权利要求15所述的制备方法，其中在所述工序(D)中使用的吸附剂是含有碱土类金属氧化物、碱土类金属氢氧化物、铝、或者硅的吸附剂，或活性炭。
23.根据权利要求16所述的制备方法，其中在所述工序(D)中使用的吸附剂是含有碱土类金属氧化物、碱土类金属氢氧化物、铝、或者硅的吸附剂，或活性炭。
24.根据权利要求17所述的制备方法，其中在所述工序(D)中使用的吸附剂是含有碱土类金属氧化物、碱土类金属氢氧化物、铝、或者硅的吸附剂，或活性炭。
25.根据权利要求18所述的制备方法，其中在所述工序(D)中使用的吸附剂是含有碱土类金属氧化物、碱土类金属氢氧化物、铝、或者硅的吸附剂，或活性炭。
26.根据权利要求19所述的制备方法，其中在所述工序(D)中使用的吸附剂是含有碱土类金属氧化物、碱土类金属氢氧化物、铝、或者硅的吸附剂，或活性炭。
27.根据权利要求20所述的制备方法，其中在所述工序(D)中使用的吸附剂是含有碱土类金属氧化物、碱土类金属氢氧化物、铝、或者硅的吸附剂，或活性炭。
28.根据权利要求15所述的制备方法，其中所述工序(D)是在所述工序(B)后进行。
29.根据权利要求17所述的制备方法，其中所述工序(D)是在所述工序(B)后进行。
30.根据权利要求18所述的制备方法，其中所述工序(D)是在所述工序(B)后进行。
31.根据权利要求20所述的制备方法，其中所述工序(D)是在所述工序(B)后进行。
32.根据权利要求4所述的制备方法，其中聚亚烷基氧改性的磷脂，单酰基磷脂质体的含量低于重量的3％，且具有氮原子的碱的含量低于重量的0.02％的下述式(1)表示的化合物，
[化学结构式1]
Figure C021068130007C1
式(1)中，R1CO及R2CO分别独立地是碳原子数4～24的酰基、k是1～6、R3O是碳原子数2～4的氧化烯、n是碳原子数2～4的氧化烯的平均加成摩尔数是10～800的数；M是氢原子、钠、或钾；X是碳原子数1～3的2价的烃基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)；p是0或1；p是0时，Y是氢原子或碳原子数1～4的烷基；p是1时，Y是氢原子、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基或硫羟基。
33.含有权利要求1～3任何一项所述的聚亚烷基氧改性的磷脂的表面活性剂。
34.含有权利要求1～3任何一项所述的聚亚烷基氧改性的磷脂的脂质体。
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