JP4710109B2 - ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途 - Google Patents
ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4710109B2 JP4710109B2 JP2000227544A JP2000227544A JP4710109B2 JP 4710109 B2 JP4710109 B2 JP 4710109B2 JP 2000227544 A JP2000227544 A JP 2000227544A JP 2000227544 A JP2000227544 A JP 2000227544A JP 4710109 B2 JP4710109 B2 JP 4710109B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- carbon atoms
- polyalkylene oxide
- phospholipid
- modified phospholipid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Polyethers (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規かつ有用なポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途に関し、特に生理活性物質の化学修飾や乳化、あるいはリポソームなどドラッグデリバリーシステムに使用可能なポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年抗癌剤等のリポソーム製剤の研究が広く行われてきており、その血中滞留性を向上する目的でリポソームの水溶性高分子修飾が盛んに行われている。その一つとして、リポソーム修飾用ポリエチレンオキシド修飾リン脂質が用いられている。
これらは酸性リン脂質であるが、通常酸性リン脂質の体内投与、すなわち緩衝液に溶解するまでの保存安定性を考慮した場合、酸性基が塩で中和されていない酸性タイプの場合、サンプルのｐＨが低くなり加水分解等を起こし易く分解物を生じる。ナトリウム等で中和した方が酸性タイプのものよりも保存安定性は高い。しかし、酸性タイプを中和しナトリウム塩タイプにする場合、その工程において劣化することがあり高純度品を得ることが困難であった。このためナトリウム塩のもので、純度の高いものが望まれていた。
【０００３】
ポリエチレンオキシド修飾リン脂質の製造方法としては、今までT. M. Allen（Biochimica et Biophysica Acta, 1066, 29-36(1991)らやV. P. Torchilinら（Biochimica et Biophysica Acta, 1195, 11-20(1994)）が報告しているように、クロロホルム等の有機溶媒中でトリエチルアミン等の塩基性触媒存在下で、ポリエチレンオキシド化合物またはそのカラム精製品と、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質と反応させ、その後カラムクロマトにて混合溶媒系で溶出分画して精製しポリエチレンオキシド修飾リン脂質を得る方法がある。また、特公平４−７３５３号に記載されているように、１，１−カルボニルジイミダゾールを用いてポリエチレンオキシド酸化合物をリン脂質に反応させる方法がある。この方法は、カラム精製等を２回行うため工程が長い。これら従来の方法では、確かに高純度品が得られるが、収率等の効率が悪く使用溶媒量も多く、工業的生産への展開は困難である。また、このカラム精製法を用いて製造した場合、酸性タイプの高純度品を得ることは可能であるが、ナトリウム等で中和したタイプの高純度品を得ることは困難である。
【０００４】
同様の方法にて合成し緩衝液中で透析または限外濾過を行って、ナトリウム塩型のポリエチレンオキシド修飾リン脂質を得る報告がある。この方法では透析中に加水分解を起こしモノアシルリン脂質体を生成し、高純度品を得ることは困難である。
モノアシルリン脂質は一般にはリゾリン脂質と言われ、リン脂質のリゾ体は生体毒性が強く、また生理活性があると報告されている。ドラッグデリバリーシステムとして利用される際、この問題は重視され医薬用途では問題である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来の問題点を解決するため、保存安定性に優れ、しかもモノアシルリン脂質体等の不純物の含有量が少なくて高純度である新規かつ有用なポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、次のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途である。
（１） 下記工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含む方法で製造されたポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であって、モノアシルリン脂質体の含有量が３重量％以下である下記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
（Ａ）：下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、脱水縮合剤の存在下に、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させるか、または
下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させる工程
（Ｂ）：工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９に調整する工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）の後に脱水剤を用いて脱水する工程
（Ｄ）：工程（Ｃ）の後に炭素数５〜９の脂肪族炭化水素またはエーテルを用いて精製を行う工程
【化４】
（式（１）中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、Ｒ3は炭素数１〜８の２価の炭化水素基、ｍは０または１、Ｒ4Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。Ｍはナトリウムイオンまたはカリウムイオン、ｒは２〜４、Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ2)ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。）
【化５】
（式（２）および（３）中、Ｒ 1 およびＲ 2 はそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、Ｒ 3 は炭素数１〜８の２価の炭化水素基、ｍは０または１、Ｒ 4 Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。ｒは２〜４、Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ 2 )ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。）
（２） ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が、工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の順で行った後、さらに下記工程（Ｅ）、（Ｆ）の順で行って製造されたものである上記（１）記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
（Ｅ）：アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤を用いて精製を行う工程
（Ｆ）：クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒と、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒とを用いて精製を行う工程
（３） ｐが０、Ｙがメチル基であり、モノアシルリン脂質体の含有量が０．５重量％以下である上記（１）または（２）記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
（４） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む界面活性剤。
（５） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含むリポソーム形成剤。
（６） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の両親媒性化学修飾剤。
（７） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の乳化剤。
（８） 下記工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含む上記（１）または（３）記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法。
（Ａ）：下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、脱水縮合剤の存在下に、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させるか、または
下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させる工程
（Ｂ）：工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９に調整する工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）の後に脱水剤を用いて脱水する工程
（Ｄ）：工程（Ｃ）の後に炭素数５〜９の脂肪族炭化水素またはエーテルを用いて精製を行う工程
【化６】
（式（２）および（３）中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、Ｒ3は炭素数１〜８の２価の炭化水素基、ｍは０または１、Ｒ4Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。ｒは２〜４、Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ2)ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。）
（９） Ｒ1およびＲ2が炭素数１２〜２０のアシル基である上記（８）記載の製造方法。
（１０） ｐが０、Ｙがメチル基である上記（８）または（９）記載の製造方法。
（１１） 工程（Ａ）で使用する緩衝液がリン酸緩衝液または炭酸緩衝液、有機溶媒がクロロホルム、トルエンまたは酢酸エチルである上記（８）ないし（１０）のいずれかに記載の製造方法。
（１２） 工程（Ｃ）で使用する脱水剤が無機ナトリウム塩または無機カリウム塩の無水物である上記（８）ないし（１１）のいずれかに記載の製造方法。
（１３） 工程（Ｄ）の後に、下記工程（Ｅ）を行う上記（８）ないし（１２）のいずれかに記載の製造方法。
（Ｅ）：アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤を用いて精製を行う工程
（１４） 工程（Ｄ）または工程（Ｅ）の後に、下記工程（Ｆ）を行う上記（８）ないし（１３）のいずれかに記載の製造方法。
（Ｆ）：クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒と、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒とを用いて精製を行う工程
（１５） 工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の順で行った後、さらに工程（Ｅ）、（Ｆ）の順で行う上記（１４）記載の製造方法。
（１６） 工程（Ｆ）を行った後、工程（Ｅ）を行う上記（１４）記載の製造方法。
（１７） モノアシルリン脂質体の含有量が２重量％以下である上記（８）ないし（１６）のいずれかに記載の製造方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質において、Ｒ1およびＲ2は炭素数４〜２４、好ましくは１２〜２０のアシル基である。このアシル基は通常脂肪酸に由来する。Ｒ1およびＲ2の具体的なものとしては、例えば酪酸、イソ酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、リグノセリン酸などの飽和および不飽和の直鎖または分岐の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。Ｒ1およびＲ2は同じであっても異なっていてもよい。炭素数が２４を越える場合、水相への分散が悪く反応性が下がる。また炭素数が４より少ない場合、精製工程での結晶性が悪く最終純度が低くなるおそれがある。
【０００８】
前記式（１）においてＲ3は炭素数１〜８、好ましくは２〜５、さらに好ましくは２または３の２価の炭化水素基であり、直鎖状、分枝状または環状のいずれでもよい。また飽和でも不飽和でもよい。具体的なものとしては−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−(ＣＨ2)3−、−(ＣＨ2)4−、−(ＣＨ2)5−、−(ＣＨ2)6−、−ＣＨ＝ＣＨ−、フェニレン基などが挙げられる。ｍは０または１であり、好ましくは１である。
【０００９】
前記式（１）においてＲ4Ｏで表されるオキシアルキレン基は炭素数２〜４、好ましくは２または３のオキシアルキレン基であり、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基などが挙げられる。これらの中ではオキシエチレン基、オキシプロピレン基が好ましく、特にオキシエチレン基が好ましい。分子内にはｎの数だけオキシアルキレン基が存在するが、このオキシアルキレン基は１種単独であってもよいし、２種以上が組み合わされていてもよく、その組み合わせ方に制限はない。またブロック状であってもランダム状であってもよい。ただし、全オキシアルキレン基に対するオキシエチレン基の比率が低い場合は水溶性が低下する可能性があるので、全オキシアルキレン基に対するオキシエチレン基の比率は５０〜１００モル％であるのが好ましい。
【００１０】
前記式（１）においてｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数を表し、１０〜８００、好ましくは２０〜５００の数である。ｎが１０より小さいと、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をドラッグデリバリーシステムに使用した場合の効果が小さい。また８００より大きいと、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を製造する際、前記式（２）のポリアルキレンオキシド化合物と式（３）のリン脂質との反応性が低下するほか、前記式（２）のポリアルキレンオキシド化合物の粘度が上昇して作業性が低下するため好ましくない。
【００１１】
前記式（１）においてＭはナトリウムイオンまたはカリウムイオンの一価の金属陽イオンである。前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、リン酸基部分がナトリウムイオンまたはカリウムイオンと塩を形成しているので、−２０℃の冷凍保存時はもちろん、室温で保存しても、さらには輸送の際などに４０℃前後の状態に置かれても加水分解を起こしにくく保存安定性に優れている。なお、Ｍが水素イオンである場合は加水分解を起こし易く保存安定性が悪い。
【００１２】
リン酸基部分と塩を形成するナトリウムイオンまたはカリウムイオンは、通常薬剤等の調製に用いる生理食塩緩衝液中に含まれ、さらに生体内にも存在するため、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をドラッグデリバリーシステムに使用しても体内での毒性等の問題も少ない。Ｍがナトリウムイオンまたはカリウムイオン以外の金属イオン、例えばカルシウムまたはマグネシウム等の二価金属イオンの場合は、リン脂質２分子が会合した構造等をとるため、緩衝液等への溶解性がかなり低くなることから好ましくない。
【００１３】
前記式（１）においてｒは２〜４の整数であり、好ましくは２である。
前記式（１）においてＸは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ2)ｑ−（ここでｑは１〜４）である。炭化水素基の具体的なものとしては−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−(ＣＨ2)3−などが挙げられる。ｐは０または１である。
【００１４】
前記式（１）においてｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であり、好ましくはアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等が挙げられる。これの中ではメチル基が好ましい。
またｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基であり、好ましくはアミノ基である。
Ｘp−Ｙとしてはメチル基、エチル基、プロピル基およびアミノメチル基が好ましく、特にメチル基が好ましい。
【００１５】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は保存安定性が高く、かつモノアシルリン脂質体等の不純物の含有量が少ない。本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のモノアシルリン脂質体の含有量は３重量％以下、好ましくは２重量％以下、より好ましくは０．５重量％以下であり、さらに好ましくは実質的に含有されない。このように本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は生体毒性が強いとされているモノアシルリン脂質の含有量が少く、生体に対する安全性の高い高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であるので、界面活性剤、好ましくは生体用の界面活性剤として利用することができる。より具体的には、リポソーム形成剤、生理活性物質の両親媒性化学修飾剤および乳化剤などとして好適に利用することができる。
【００１６】
なお本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質と類似するリン脂質として、ポリオキシアルキレン鎖がジカルボン酸を介さないで直接リン脂質に結合したリン脂質誘導体が知られているが、このリン脂質誘導体はリン酸基周辺の水素結合が弱く界面活性剤として用いる場合に安定性に劣ることがある。界面活性剤、特にリポソーム形成剤として用いる場合、両親媒性のバランスの点から、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が最も利用範囲が広い。
【００１７】
本発明のリポソーム形成剤は前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含むリポソーム形成剤であり、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質だけからなるものであってもよいし、リポソーム膜の形成に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、レシチン、その他のリン脂質、コレステロールなどが挙げられる。
【００１８】
本発明のリポソーム形成剤は、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含んでいるので、リポソーム溶液として保存安定性に優れるとともに、生体毒性が強いモノアシルリン脂質の含有量が少ないので安全であり、このため本発明のリポソーム形成剤を使用することにより安全性の高いドラッグデリバリーシステムとして利用することができるリポソームを得ることができる。
【００１９】
リポソーム溶液として保存安定性に優れる理由としては、次のことが推測される。モノアシルリン脂質はジアシルリン脂質に比べて疎水性が低いので、リポソーム表面から脱離しやすい。このためモノアシルリン脂質の含有量が多いリポソームはモノアシルリン脂質がリポソーム表面から脱離してリポソーム表面の水和層が減少するので、リポソーム粒子の凝集が起こり相分離を起こして不安定となりやすい。これに対して本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はモノアシル体含有量が少ないので、リポソーム表面からのリン脂質の脱離が起こりにくく、このためリポソーム溶液の保存安定性に優れている。
【００２０】
リポソーム溶液として保存安定性に優れる理由としては、次のことが挙げられる。ポリアルキレンオキシド修飾モノアシルリン脂質含有量が高い場合、この化合物は親油性が低いため疎水性が下がり、リポソーム表面から遊離する場合がある。その結果リポソーム表面の水和層が減少し、リポソーム粒子の凝集が起こり相分離を起こし不安定となる。本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、モノアシル体含有量が低くリポソーム溶液とした場合、保存安定性に優れたものができる。
【００２１】
本発明の生理活性物質の化学修飾剤は前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の化学修飾剤であり、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質だけからなるものであってもよいし、生理活性物質の化学修飾に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。
【００２２】
化学修飾する生理活性物質はアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などの官能基を有するものであれば特に限定されず、例えば酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモンが挙げられる。
【００２３】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を生理活性物質の化学修飾剤として使用する場合、式（１）のＹとしてはアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基およびチオール基が好ましい。このような基を有する場合、生理活性物質中に存在する官能基と容易に反応させることができる。例えば、Ｙがカルボキシル基の場合、生理活性物質中のアミノ基とＣＯＮＨ結合を形成させることにより、生理活性物質にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質骨格を導入することができる。このようにして化学修飾された生理活性物質は、リポソーム成分として用いる場合リポソーム表面に存在させることができ、例えば生理活性物質が抗体のタンパク質の場合には標的細胞のリガンドとして用いることができるので、リポソームを標的細胞へ集中して輸送することができる。
【００２４】
本発明の生理活性物質の乳化剤は前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の乳化剤であり、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質だけからなるものであってもよいし、生理活性物質の乳化に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、オキシアルキレン基に由来する親水性と、アシル基に由来する疎水性とを有しているので乳化剤として使用することができ、しかも保存安定性に優れている。さらに、生体細胞構成成分と同等のリン脂質および毒性の低いオキシアルキレン基からなるとともに、生体毒性が強いモノアシルリン脂質の含有量が少ないので安全性が高い。このため、このようなポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む乳化剤を使用することにより、例えば安全性の高い生理活性物質の乳化物を得ることができる。具体的には、酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質またはホルモンなどの生理活性物質の乳化物を得ることができる。
【００２６】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は前記工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）により容易に製造することができる。
工程（Ａ）で使用する前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物および前記式（３）で示されるリン脂質において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4Ｏ、ｎ、Ｘ、pおよびＹは前記式（１）で説明したものと同じである。
【００２７】
工程（Ａ）で使用する前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物は公知の方法により製造することができる。例えば、後述するように、式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物とジカルボン酸無水物とを反応させることにより容易に製造することができる。
【００２８】
前記式（３）で示されるリン脂質は天然リン脂質でも合成リン脂質でもよく、例えば大豆および大豆水添ホスファチジルジエタノールアミン、卵黄および卵黄水添ホスファチジルジエタノールアミン等の天然および合成ホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。前記式（３）で示されるリン脂質としては、ｒが２であるホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００２９】
工程（Ａ）で使用する脱水縮合剤としては、式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物のカルボキシル基と、式（３）のリン脂質の官能基とを脱水縮合させて結合させることができる化合物が制限なく使用できる。このような脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイミド誘導体が挙げられる。脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミドが好ましい。
脱水縮合剤の使用量は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の１．０５〜５倍モル、好ましくは１．５〜２．５倍モルであるのが望ましい。さらに、反応率を上げる場合は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドを反応系中に前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物に対して０．１〜２倍モル加えることが好ましい。
【００３０】
工程（Ａ）の反応に使用する緩衝液はナトリウムまたはカリウムを含む緩衝液であり、例えばナトリウムまたはカリウムをカウンターイオンとする緩衝液である。緩衝液のｐＨは５〜１３、好ましくはｐＨが８〜１１であるのが望ましい。緩衝液の具体的なものとしては、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液およびホウ酸緩衝液などが挙げられる。これらの中ではリン酸緩衝液が好ましい。緩衝液中に含まれるナトリウムおよび／またはカリウムの量は前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の１．５〜１０倍モル、好ましくは２〜５倍モルであるのが望ましい。
【００３１】
工程（Ａ）の反応に使用する有機溶媒は、水酸基等の官能基を有しないものであれば特に制限なく使用することができる。例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼンおよびトルエンなどが挙げられる。これらの中ではクロロホルムおよびトルエンが好ましい。エタノールなどの水酸基を有する有機溶媒は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の末端のカルボキシル基と反応するので好ましくない。ジクロロメタン等でも反応性には問題はないが、低沸点であるため作業上好ましくない。
工程（Ａ）の反応は前記緩衝液と有機溶媒との混合媒体中で行う。緩衝液と有機溶媒との混合割合は有機溶媒１００容量部に対して緩衝液０．１〜５０容量部、好ましくは１〜１０容量部とするのが望ましい。
【００３２】
工程（Ａ）の反応の反応温度は３０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は１時間以上、好ましくは２〜８時間とするのが望ましい。３０℃より低温では反応率が低く、９０℃より高温では反応に用いる前記式（３）で示されるリン脂質のアシル基が加水分解するおそれがあるので好ましくない。
【００３３】
このようにして前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と前記式（３）で示されるリン脂質ジカルボン酸無水物とを反応させることにより、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が得られる。ただし、この段階では前記式（１）のＭが水素原子である水素タイプのリン脂質が含まれている場合が多い。工程（Ａ）終了後は、反応液をそのまま次の工程（Ｂ）に供することができる。
【００３４】
本発明の製造方法は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、上記のように前記脱水縮合剤の存在下に反応させることができるが、別な方法として、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、前記式（３）で示されるリン脂質とを反応させることもできる。上記活性化エステル誘導体は、例えば前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、活性化剤とを前記脱水縮合剤の存在下に反応させることにより得ることができる。
【００３５】
上記活性化剤としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ，Ｎ′−ジコハク酸イミドカーボネート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウム・メチルサルフェート、イソブチルクロロホルメートなどが挙げられる。これらの中ではＮ−ヒドロキシコハク酸イミドが好ましい。
【００３６】
前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と活性化剤との反応は、ジカルボン酸無水物との反応と同様、脱水縮合剤の存在下でカルボン酸と反応しない溶媒、例えばクロロホルム、トルエン等の反応溶媒中で、反応温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜５５℃で活性化剤をポリアルキレンオキシド化合物の溶液に分散撹拌することにより行うことができる。
例えば、活性化剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを使用した場合、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物のカルボキシル基と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドのイミド基が反応し、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物のカルボキシル基側末端にＮ−ヒドロキシコハク酸イミドが結合した活性化エステル誘導体が得られる。
【００３７】
工程（Ａ）において、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の末端がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基、特にアミノ基の場合にはこれらの基を保護して反応に供するのが好ましい。例えば、アミノ基の場合にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基または９−フルオレニルメチルカルボニル基等の保護基を付け、カルボキシル基の場合にはメチル基等によりエステル化して保護し、またチオール基の場合にはＳ−ｔ−ブチルスルフィド基等の保護基を付けて保護するのが好ましい。
【００３８】
工程（Ｂ）では工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９、好ましくはｐＨは６．５〜８に調整する。このとき使用するアルカリとしては、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムなどが挙げられる。アルカリは通常水溶液の状態で使用され、工程（Ａ）の混合媒体に用いた緩衝液の塩水溶液、水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液が挙げられる。ただし、工程（Ａ）の終了後、反応液のｐＨが６．５〜８の場合はｐＨ調整を行わなくてもよい。
【００３９】
工程（Ａ）で得られた反応液をｐＨ調整することにより、水素タイプのものが本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質に変換される。
工程（Ｂ）の終了後は、反応液を貧溶媒または非溶媒に投入して結晶化するなどの公知の方法により、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度かつ高収率で得ることができる。得られたポリアルキレンオキシド修飾リン脂質または工程（Ｂ）の反応液を、下記のような精製工程で精製することにより、さらに高純度の目的物を得ることができる。
【００４０】
工程（Ｃ）では、工程（Ｂ）の反応液を脱水剤を用いて脱水する。脱水は工程（Ｂ）の反応液に脱水剤を添加することにより行うことができる。工程（Ｂ）の反応液は緩衝液と有機溶媒との混合液であるが、脱水することにより水が除去され、有機溶媒の単一な液が得られる。これにより次工程（Ｄ）での溶媒精製において、優れた収率および純度を得ることができる。
【００４１】
工程（Ｃ）で用いる脱水剤は、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質および工程（Ａ）で用いた有機溶媒と反応しない公知の脱水剤が使用できるが、無機ナトリウム塩または無機カリウム塩の無水物が好ましく、特に無水硫酸ナトリウムが好ましい。脱水剤としてナトリウムおよびカリウム以外の無機塩、例えば硫酸マグネシウムなどの２価の金属塩を用いると、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のリン酸基のカウンターイオンが１価の金属塩から２価の塩に置き換わり、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の水への溶解性が低下し、ドラッグデリバリー基材として使用する際問題となるので好ましくない。
【００４２】
工程（Ｄ）を行う前には、濾過などにより工程（Ｂ）の反応液または工程（Ｃ）の反応液から不溶物を除去するのが好ましい。工程（Ｂ）の反応液を濾過する場合は未反応のリン脂質、工程（Ｃ）の反応液を濾過する場合は未反応のリン脂質に加えて脱水に用いた無機脱水剤、さらに工程（Ａ）で用いた緩衝液の塩が不溶となり析出した塩が除去される。濾過に使用するろ材は、被処理液の不溶物を除去することができるものであれば特に制限はなく、通常は保留粒子細孔径が１〜１０μｍで耐溶媒性を有する紙、ガラスなど各種の材質のフィルターを使用することができる。濾過方法には制限なく、例えば減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過などの方法を用いることができる。
【００４３】
工程（Ｄ）では、工程（Ｃ）の反応液またはこれを濾過した濾過液に、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素またはジエチルエーテルなどのエーテルを加え、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶化を行う。
【００４４】
炭素数５〜８の脂肪族炭化水素の添加量は、工程（Ｄ）の被処理液に対して１〜５０倍容量であり、好ましくは２〜５倍容量であるのが望ましい。炭素数５〜８の脂肪族炭化水素の量が、被処理液の容量より少ない場合、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が十分に析出せず溶液中に残存する恐れがある。結晶化を行う際、室温で問題なく行うことができるが、１０℃以下に冷却して行えば濾過速度も早く、良好な収率で結晶が得られる。
【００４５】
工程（Ｄ）の処理により、過剰のジシクロヘシキルカルボジイミドなどの脱水縮合剤を除去できるが、他の精製工程でも除去できるので、さらに精製を行なう場合は蒸留等により有機溶媒を除去して結晶化してもよい。有機溶媒を除去する場合、８０℃以下で減圧下で行うことが望ましい。有機溶媒の留去温度が８０℃を越えると、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のアシル基が加水分解するなど望ましくない副反応が起こる恐れがある。
【００４６】
工程（Ｄ）で得られた結晶を本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、さらに精製に供することもできる。
【００４７】
本発明の方法において、工程（Ｄ）の後に工程（Ｅ）を行うことにより、工程（Ｄ）の前処理で除去できなかった、緩衝液として用いた過剰なナトリウム、カリウム等の式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質に結合していない遊離塩類を吸着除去することができる。工程（Ｅ）は、工程（Ｄ）の後に工程（Ｆ）を行いその後に行ってもよい。
【００４８】
工程（Ｅ）では、工程（Ｄ）で得られた結晶をそのまま用い、加温して液状として処理してもよく、その結晶を酢酸エチル、クロロホルム、トルエン等の水分含有量が低く、かつ式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を溶解する溶媒に溶解し、この溶液に吸着剤を添加して撹拌するなどの方法により行うこともできる。
【００４９】
工程（Ｅ）で用いる吸着剤としては、アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤であり、例えば水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化ケイ素等を含有する吸着剤などが挙げられる。これらの化合物を含有する吸着剤の市販品としては、キョーワード２００、キョーワード３００、キョーワード５００、キョーワード６００、キョーワード７００、キョーワード１０００、キョーワード２０００（協和化学工業（株）製、商標）、トミックス−ＡＤ３００、トミックス−ＡＤ５００、トミックス−ＡＤ７００（冨田製薬（株）製、商標）などが挙げられる。吸着剤は１種単独で使用することもできるし、２種以上を組み合せて使用することもできる。
【００５０】
吸着剤を用いて処理する時の温度は１０〜８５℃、好ましくは４０〜７０℃、時間は１０分〜５時間、好ましくは３０分〜２時間とするのが望ましい。工程（Ｄ）で得られた結晶をそのまま処理してもよいが、上記温度で結晶が溶解しない場合や溶液の粘度が高い場合が多く、トルエンまたはクロロホルムなどの本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を溶解する有機溶媒にて希釈して処理して行う。処理する温度が１０℃未満では本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が析出する場合があり、吸着剤を除去する場合にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質も除去され収率が下がるので好ましくない。また８５℃以上では工程（Ｃ）で完全に除去できず、微量の水分が存在する場合、吸着剤処理中にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の加水分解等が起こる可能性がある。吸着剤の使用量は処理する結晶または溶液１００重量部に対して０．１〜１５重量部、好ましくは０．５〜７．５重量部とするのが望ましい。吸着剤量が上記下限値より少ないと過剰の遊離の塩を充分に除去することができず、上限値より多いと吸着剤の除去が困難であり主成分の収率が下がる。
【００５１】
工程（Ｅ）の終了後は、濾過などの方法により吸着剤を除去し、得られた分離液（以下、工程（Ｅ）の処理液という場合がある）を貧溶媒または非溶媒を用いて再結晶させることができる。これにより得られた結晶を本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、工程（Ｅ）の処理液をさらに精製に供することもできる。
【００５２】
本発明の方法において、工程（Ｆ）では、工程（Ｅ）の処理液に炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の貧溶媒ないし非溶媒を加えることにより結晶化し、得られた結晶にクロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒を加えて溶解し、エーテル、アセトンまたは炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を用いて晶析を行う。
【００５３】
工程（Ｆ）で使用する前記炭素数５〜８の脂肪族炭化水素には特に制限はなく、例えば、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ヘキサン、イソヘキサン、３−メチルペンタン、ネオヘキサン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、３−エチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、３，３−ジメチルペンタン、２，３，３−トリメチルブタン、オクタン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、３−エチルヘキサン、２，２−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン、２，４−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチルヘキサン、３，３−ジメチルヘキサン、３，４−ジメチルヘキサン、２−メチル−３−エチルペンタン、３−メチル−３−エチルペンタン、２，２，３−トリメチルペンタン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，２，３，３−テトラメチルブタンなどを挙げることができる。これらの中でヘキサンおよびヘプタンが好ましい。
【００５４】
工程（Ｆ）を行うにあたり、さらに純度を上げたい場合、アセトン、酢酸エチル、または炭素数１〜３のアルコールから選ばれる溶媒および炭素数５〜８の脂肪族炭化水素からなる溶媒の２種類以上を組み合わせて溶媒として用いて溶解し不溶物を除去した後工程（Ｆ）を行うことにより、純度の優れたポリアルキレンオキサイド修飾リン脂質を得ることができる。この際、アセトン、酢酸エチル、または炭素数１〜３のアルコールから選ばれる溶媒を、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキサイド修飾リン脂質に対して１〜２０倍重量添加し３０〜８５℃で溶解し、不溶物を濾過して除去する。不溶物を除去した後、５０℃以下に冷却した後炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を添加し、３５℃以下に冷却、好ましくは１５℃以下に冷却する。この際８０℃以上で溶解すると、リン脂質のアシル基が分解し、モノアシル体が生じる恐れがある。モノアシルリン脂質は生体に投与する上で問題がある。また、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を添加し冷却する際、４０℃以上では前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が十分に析出せず回収率が低くなる恐れがある。
【００５５】
上記のようにして製造することにより、有毒なモノアシルリン脂質の含有量が少なく、またそれ以外の不純物の含有量も少なく高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を容易に高収率で得ることができる。
【００５６】
なお、工程（Ａ）の出発原料となる前記式（２）で示されポリアルキレンオキシド化合物は、例えば式（４）
ＨＯ−(Ｒ4Ｏ)n−Ｘp−Ｙ …（４）
（式（４）中、Ｒ4Ｏ、ｎ、Ｘ、pおよびＹは前記式（１）と同じである。）
で示されるポリアルキレンオキシド化合物とジカルボン酸無水物とを、塩基性触媒の存在下に反応させることにより製造することができる。
【００５７】
上記ジカルボン酸無水物としては、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、テレフタル酸の無水物などを挙げることができる。これらの中ではコハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびピメリン酸の無水物が好ましく、特にコハク酸またはグルタル酸の無水物が好ましい。ジカルボン酸無水物としては、分子内無水物、分子間無水物のいずれを用いてもよい。
【００５８】
上記塩基性触媒は特に制限なく使用できる。例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジンなどが挙げられ、好ましくは酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムである。トリエチルアミンおよびジメチルアミノピリジンを用いる場合は、工程（Ａ）の前に触媒を除去して用いる必要がある。
反応は通常反応溶媒を用いて行われるが、この場合反応溶媒としては前記式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物およびジカルボン酸無水物と反応する溶媒以外のものが制限なく使用できる。例えばクロロホルム、トルエン、テトラヒドロフランおよびアセトニトリル等が挙げられる。アルコールは前記ジカルボン酸無水物と反応するので好ましくない。
【００５９】
反応は反応温度３０〜１８０℃、好ましくは６０〜１３０℃、より好ましくは８０〜１２０℃、反応時間１〜２０時間、好ましくは３〜１０時間とするのが望ましい。３０℃より低温では反応率が低く、１８０℃より高温では末端活性基が分解するおそれがあるので好ましくない。
カルボン酸無水物の量は、前記式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物が有する水酸基１モルに対して１〜３倍モル、好ましくは１．０２〜１．５倍モルとするのが望ましい。
【００６０】
このようにして前記式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物とジカルボン酸無水物とを反応させることにより、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物が得られる。反応終了後は、反応液にヘキサン等の脂肪族炭化水素などを添加して反応生成物を結晶化させ、この結晶を次の工程（Ａ）に供することができる。
【００６１】
【発明の効果】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は新規かつ有用である。本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は保存安定性が高く、モノアシルリン脂質体等の不純物の含有量が少なく生体に対する安全性の高い高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であるので、リポソーム形成剤、生理活性物質の化学修飾剤および生理活性物質の乳化剤などとして好適に利用することができる。
【００６２】
本発明の製造方法は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、脱水縮合剤の存在下に、ナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液と有機溶媒との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させるか、または前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、ナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液と有機溶媒との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させる工程（Ａ）と、工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９に調整する工程（Ｂ）と、工程（Ｂ）の後に脱水剤を用いて脱水する工程（Ｃ）と、工程（Ｃ）の後に炭素数５〜９の脂肪族炭化水素またはエーテルを用いて精製を行う工程（Ｄ）とを含んでいるので、上記ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を簡単に効率よく、しかも高純度に製造することができる。
【００６３】
【実施例】
実施例１
（１）モノメチルポリオキシエチレン（分子量５０００）サクシンイミジルグルタレートの合成
モノメトキシポリオキシエチレン（平均分子量５０００）５０ｇ（０．０１ｍｏｌ）にリン酸ナトリウムを０．０５ｇ（０．４ｍｍｏｌ）を加えて、１００℃に加温し均一にした後、無水グルタル酸を１．２５ｇ（０．０１１ｍｏｌ）加え、１１０℃で８時間反応を行った。冷却後イソプロピルアルコール２００ｍＬを加えて、モノメチルポリオキシエチレングルタレートの結晶を得た。その結晶にトルエン１５０ｍＬを添加して４０℃で加温溶解した後、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド１．２４ｇ（０．０１１ｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド４．２５ｇ（０．０２１ｍｏｌ）を添加し、４０℃で２時間反応した。反応後濾過し、下記式（５）で示される粗メチルポリオキシエチレンサクシンイミジルグルタレート活性化体４８ｇを得た。
【化５】
【００６４】
（２）モノメチルポリオキシエチレングルタリル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１４．９６ｇ（０．０２ｍｏｌ）にトルエン７５ｍＬを加えて６０℃に加温し、リン脂質トルエン溶液を得た。またリン酸水素ニナトリウム７．２ｇ（０．０５ｍｏｌ）に蒸留水７．５ｍＬと３０％水酸化ナトリウム水溶液０．７５ｍＬとを加えて加温溶解し、リン酸緩衝液を得た。このリン酸緩衝液を前記リン脂質トルエン溶液に添加し、６０℃で撹拌しリン脂質緩衝混合液を得た。このリン脂質緩衝混合液に、前記式（５）の粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルグルタレート活性化体を添加し、６０℃で５時間反応を行った。反応後０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に中和した。その後、硫酸ナトリウム１５０ｇを添加して１時間撹拌し、脱水を行った。
【００６５】
脱水工程後濾過にて不溶物を除去し、ろ液にヘキサンを４００ｍＬ添加し１時間撹拌し、結晶を析出させた。この結晶を濾過にて得た。得られた粗結晶を酢酸エチル１００ｍＬに５０℃で加温溶解し、吸着剤としてキョーワードＫＷ＃７００およびキョーワードＫＷ＃１０００をそれぞれ０．５ｇ加えて３０分間撹拌した。吸引濾過にてキョーワードを除去し、得られたろ液にヘキサン５０ｍＬを添加して結晶析出させた。この結晶を濾過により得た。その結晶にアセトン３００ｍＬを加えて５０℃で加温溶解し、熱時濾過して未反応のリン脂質を不溶物として除去した。その後１５℃以下に冷却し、結晶を析出させた。この結晶を濾過して得た。得られた結晶に酢酸エチル１８０ｍＬを加えて６０℃に加温して溶解し、その後１５℃以下に冷却し、結晶を析出させた。この結晶を濾過して採取した。加温溶解時に不溶物がある場合は、濾過にて除去し次の工程に進んだ。さらに得られた結晶を再度同様に酢酸エチル２００ｍＬに加温溶解し、ヘキサン１００ｍＬを加えて析出した結晶を濾過して最終純度９８％の結晶５０ｇを得た。ポリオキシエチレン活性化体を基準として収率は９０．８％であった。結果を表１にまとめる。
なお参考例として中和後脱水工程を行わず、ヘキサンを添加し結晶化行った場合、純度８７％の結晶５２ｇが得られ、収率は９４．５％であった。
【００６６】
生成物の分析は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５重量比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。
【００６７】
実施例２
モノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量２０００）ジラウロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
モノメトキシポリオキシエチレン（平均分子量２０００）２０ｇ（０．０１ｍｏｌ）にリン酸ナトリウムを０．０５ｇ（０．４ｍｍｏｌ）加えて、１００℃に加温し均一にした後、無水コハク酸を１．１ｇ（０．０１１ｍｏｌ）を加え、１００℃で６時間反応を行い、実施例１の（１）と同様の方法で粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート活性化体を得た。
一方、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン１１．６ｇ（０．０２ｍｏｌ）を用いて、実施例１と同様の条件にてリン脂質緩衝混合液を調製した。
【００６８】
このリン脂質緩衝混合液に、前記粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート活性化体を添加し、６０℃で５時間反応を行った。反応後、実施例１と同様の条件にて精製し最終結晶１８ｇを得た。純度は９８％であった。ポリオキシエチレン活性化体を基準として収率は６９．２％であった。結果を表１にまとめる。
【００６９】
実施例３
モノアミノエチルポリオキシエチレン（分子量３４００）グルタリルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
モノアミノエチルポリオキシエチレン（平均分子量３４００）は、３．４ｇ（０．００１ｍｏｌ）の末端アミノ基をProc. Natl. Acad. Sci. 69, 730(1972)記載の方法に従って、無水物を用いてｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基で保護し、もう片末端を実施例１の（１）の方法に従ってサクシンイミジルグルタレート活性化し、粗ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護アミノエチルポリオキシエチレン（分子量３４００）サクシンイミジルグルタレート活性化体を調製した。
一方、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１．１６ｇ（０．００２ｍｏｌ）を用いて、実施例１と同様の条件にてリン脂質緩衝混合液を調製した。
【００７０】
このリン脂質緩衝混合液に、前記粗ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護アミノエチルポリオキシエチレン（分子量３４００）サクシンイミジルグルタレート活性化体を添加し、４５℃で５時間反応を行った。反応後、キョーワードＫＷ＃７００を０．１ｇおよびキョーワードＫＷ＃１０００を０．０５ｇ加えて３０分間撹拌した。吸引濾過にてキョーワードを除去し、２．５Ｍ塩酸のアセトニトリル溶液を添加し、３０分間室温にて撹拌し保護基を加水分解して外し、水酸化ナトリウム水溶液にて中和した。中和した溶液にキョーワードＫＷ＃７００を０．１ｇおよびキョーワードＫＷ＃１０００を０．０５ｇを加えて３０分間撹拌した後、濾過して不溶物を除去しろ液の溶媒を除去した。アセトンおよび酢酸エチルを用いた晶析については、実施例１と同様の条件にて精製し最終結晶２ｇを得た。純度は９０％であった。モノアミノエチルポリオキシエチレンを基準として収率は５２．０％であった。結果を表１にまとめる。
【００７１】
実施例４
モノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
実施例２と同様の方法でモノメトキシポリオキシエチレン（平均分子量５０００）５０ｇ（０．０１ｍｍｏｌ）をモノメトキシポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート活性化体とし、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１５．０ｇ（０．０２ｍｏｌ）と反応させ、さらに同様に精製しモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを得た。純度９８．５％の最終結晶５３ｇを得、ポリオキシエチレン活性化体を基準として９１．０％の収率となった。結果を表２にまとめる。
【００７２】
実施例５
モノメチルポリオキシエチレングルタリル（分子量５０００）ジドコサノイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジドコサノイルホスファチジルエタノールアミン１４．９６ｇ（０．０２ｍｏｌ）にトルエン７５ｍＬを加えて６０℃に加温しリン脂質トルエン溶液を得た。また炭酸ナトリウム５．３ｇ（０．０５ｍｏｌ）に蒸留水７．５ｍＬと３０％水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍＬとを加えて加温溶解し、炭酸緩衝液を得た。この炭酸緩衝液を前記リン脂質トルエン溶液に添加し６０℃で撹拌しリン脂質緩衝混合液とした。
【００７３】
このリン脂質緩衝混合液に、実施例１で調製した粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルグルタレート活性化体を添加し、６０℃で５時間反応を行った。反応後ｐＨが下がっている場合は、０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７に中和した後、硫酸ナトリウム１５０ｇ添加し１時間撹拌し脱水を行った。その後実施例１と同様の方法にて精製を行い最終純度９５％の結晶４８ｇを得た。ポリオキシエチレン活性化体を基準として８７．２％の収率となった。結果を表２にまとめる。
【００７４】
比較例１
モノメチルポリオキシエチレン（平均分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１４９．６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）にクロロホルム１０ｍＬを加えて撹拌しリン脂質クロロホルム溶液とした。その溶液にモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート３．０６ｇ（０．６ｍｍｏｌ）を添加し、さらにトリエチルアミン０．０１ｇ（０．７ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩反応を行った。反応後窒素ブローにてクロロホルムを除去し、得られた残渣を０．１４５Ｍの塩化ナトリウム水溶液に再溶解し未反応のモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネートを加水分解した。その溶液を、生理食塩水で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ−１．５ｍカラムに展開し生理食塩水で溶出した。排除体積中のポリオキシエチレン修飾ホスファチジルエタノールアミンミセルを含むフラクションを採取し、水に対して５日間透析した後、凍結乾燥にて結晶１９５ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として収率は３５．５％であり、純度は９４％であった。
【００７５】
上記の方法で得られる主成分は、生理食塩水および水中でのｐＨが５〜６であるため、リン酸基の部分が中和されていないＨタイプも含まれる。すべてをナトリウム塩とするため次の中和工程を行った。
得られた結晶１９５ｍｇをメタノール１．９５ｍＬに溶解し、撹拌しながらｐＨが７〜８となるまで０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液約０．１５ｍＬを添加した。その後エバポレーターを用いて濃縮し、ヘキサン５ｍＬを加え濾過して析出した結晶を得た。得られたナトリウム塩タイプの収率は２８％であり、純度は８５％となった。結果を表３にまとめる。
【００７６】
比較例２
モノメチルポリオキシエチレン（平均分子量１９００）サクシニル水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミンの合成
比較例モノメチルポリオキシエチレンサクシネート（平均分子量１９００）１９ｇ（１０ｍｍｏｌ）を四塩化炭素に溶解し、その溶液に無水コハク酸５ｇ（５０ｍｍｏｌ）を添加し７５℃に加温し一晩撹拌した。反応後濾過して余剰の無水コハク酸を除去した。この乾燥試料を容積比９５／５／０．８の塩化エチレン／メタノール／濃アンモニア水混合溶媒に溶解し、同溶液で平衡化したケイ酸カラムに展開した。溶離溶媒のメタノール含有量を上げることにより、溶出してくるサクシニルエチレングリコールフラクションを分取し、溶媒除去して乾燥品を得た。
【００７７】
モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート６３８ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ）をベンゼン１１ｍＬに溶解し、１，１−カルボニルジイミダゾール３１５ｍｇ（２．１６ｍｍｏｌ）を添加し４０℃に加温した。この溶液に水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン５９４．４ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を加え、その後脱溶媒を行い全量３ｍＬまで濃縮し、６５℃で３時間反応を行った。反応後エバポレーターにて脱溶媒し、得られた試料をけい酸クロマトグラフィーで精製し、溶出してくるポリオキシエチレン修飾ホスファチジルエタノールアミン含有フラクションを分取し、溶媒を除去して純度９５％の乾燥品３２４ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として収率は１５％であった。
【００７８】
上記の方法で得られた主成分は水素（Ｈ）タイプであり、ナトリウム塩へ置換を行うために、比較例１と同様の方法にてナトリウム塩とした。得られたナトリウム塩タイプの純度９１％であり、収率は１２％であった。結果を表３にまとめる。
【００７９】
比較例３
比較例２と同様の方法で得られたモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート（平均分子量１９００）６３８ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ）をベンゼン１１ｍＬに溶解し、１，１−カルボニルジイミダゾール３１５ｍｇ（２．１６ｍｍｏｌ）を添加し４０℃に加温した。この溶液に水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン５９４．４ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を加え、その後脱溶媒を行い全量３ｍＬまで濃縮し、６５℃で３時間反応を行った。反応後エバポレーターにて脱溶媒し、クロロホルムと０．２Ｍ塩酸を用いて２相分離を行った。下層を採取し４回水相にて洗浄抽出し、脱溶媒し乾燥品とした。得られた試料を容積比９５／５／０．８の塩化エチレン／メタノール／濃アンモニア水混合溶媒に溶解し、同溶液で平衡化したケイ酸カラムに展開した。溶離溶媒のメタノール含有量を上げることにより、溶出してくるポリオキシエチレン修飾ホスファチジルエタノールアミン含有フラクションを分取し、溶媒を除去して乾燥品８００ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として３７．２％の収率であり、純度は９４％であった。
【００８０】
上記の方法で得られた主成分はアンモニウム塩であり、ナトリウム塩へ置換を行うために、まず陽イオン強酸性樹脂を用いてアンモニウムイオンを除去し、比較例１と同様の方法にてナトリウム塩とした。得られたナトリウム塩タイプの純度は８５％であり、収率は３０％であった。結果を表３にまとめる。
【００８１】
比較例４
モノメチルポリオキシエチレングルタリル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１４９．６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）にクロロホルム１０ｍＬを加えて撹拌しリン脂質クロロホルム溶液とした。その溶液にモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート３．０６ｇ（０．６ｍｍｏｌ）を添加し、さらにトリエチルアミン０．０１ｇ（０．７ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩撹拌し反応を行った。反応後窒素ブローにてクロロホルムを除去し、得られた残渣を水に分散しその溶液を、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｏｒ ＣＥ３０００００ＭＷ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、水に対して５日間透析した。その後凍結乾燥し結晶１９５ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として２５％の収率であり、純度は８５％であった。
【００８２】
上記の方法で得られる主成分は、透析水中でのｐＨが５〜６であるため、リン酸基の部分が中和されていないＨタイプおよびトリエチルアミンタイプも含まれる。トリエチルアミンは毒性が高く、すべてをナトリウム塩とするため比較例３と同様の処理を行いナトリウムタイプとした。得られたナトリウム塩タイプの収率は１８％であり純度は８０％となった。結果を表３にまとめる。
【００８３】
【表１】
表１
【００８４】
【表２】
表２
【００８５】
【表３】
表３
【００８６】
表１〜表３の注
＊１ Ｎａ塩純度：前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の純度、単位ｗｔ％
＊２ リゾ体含有量：モノアシルリン脂質体の含有量、単位ｗｔ％
＊３ フリーＰＥ含有量：未反応のリン脂質の含有量、単位ｗｔ％
＊４ フリーPEG誘導体含有量：単位ｗｔ％
＊５ フリー塩含有量：リン酸塩、その他の塩の含有量、単位ｗｔ％
【００８７】
表１〜表３の結果から、実施例の製造方法は比較例に比べて、高純度のＮａ塩を高収率で製造することができることがわかる。
【００８８】
実施例６
モノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのナトリウムタイプと水素タイプ（Ｈ）の保存安定性の比較
実施例４で得たモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのナトリウムタイプと、対照品となる水素タイプ（Ｈ）とについて、下記の条件にて主成分含有量の経時変化を実施例１のＴＬＣにより測定した。結果を表４に示す。
条件
・保存条件：−３０℃、４℃、２０℃、４０℃
・サンプル形態：粉末（空気存在下、褐色瓶）
【００８９】
【表４】
表４ 純度変化（主成分含有量％）
注） 保存率は保存開始時の含有量に対する保存期間経過後の含有量の割合である。
【００９０】
表４の結果からわかるように、実施例のナトリウムタイプのものは、低温で保存した場合はもちろん、室温より高い温度で長期間保存した場合にも、保存安定性に優れていることがわかる。これに対して、比較例の水素タイプのものは含有量が経時的に大きく減少し、特に保存温度が高い場合に純度が大きく減少することがわかる。４０℃で保存した場合、実施例のナトリウムタイプの保存率は６か月後も９７．１％であるのに対し、比較例の水素タイプの保存率は１週間後で７０．０％であり、保存期間が２５倍以上になっているにもかかわらず、実施例の保存率はなおも高い値を示している。
【００９１】
実施例７
実施例３のモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用して乳液を作製した。すなわち、表５の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、撹拌しながら水相部を同温度で添加した。
【００９２】
【表５】
表５
【００９３】
作製した乳液を４０℃で一か月保存した後、乳化状態を下記の基準により評価した。結果を表７に示す。
３：安定な状態
２：やや不均一な状態
１：クリーミングまたは分離している状態
【００９４】
また、作製した直後の乳液を皮膚に塗布し、官能試験を行った。官能評価は５人の専門パネラーで行った。評価方法は、上腕部を洗浄した後に試料を塗布し、塗布直後および一晩経過後の皮膚刺激についての評価を下記３段階評価でそれぞれ行った。５人の合計点を表７に記す。
３：普通である。全く異常がない。
２：違和感がある。少し痒みを感じる。
１：痒みがある。皮膚に発赤を認める。
【００９５】
実施例８
実施例３のモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用してクリームを作製した。すなわち、表６の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、撹拌しながら水相部を同温度で添加した。
【００９６】
【表６】
表６
【００９７】
作製したクリームについて実施例７と同様の評価を行った。結果を表７に示す。
【００９８】
比較例５および６
比較例２のモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いて実施例７および実施例８と同様の試験を行った。結果を表７に示す。
【００９９】
【表７】
表７
【０１００】
実施例９
リポソーム溶液の安定性評価
ジパルミトイルホスファチジルコリン１．９２ｇ（２．６４ｍｍｏｌ）、コレステロール０．４５ｇ（１．３２ｍｍｏｌ）、実施例４で得たモノメチルポリオキシエチレン（分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン０．８６ｇ（０．１５ｍｍｏｌ）をナス型フラスコに入れ、クロロホルム５０ｍＬを加えて溶解し、ロータリーエバポレーターにて脱溶剤し、フラスコ内壁に脂質の薄膜を形成した。減圧下にて溶剤除去を十分に行い、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水液３０ｍＬを加えて分散し、さらに超音波洗浄器にて５分間処理を行いリポソーム溶液とした。
得られたリポソーム溶液を室温にて１か月間放置した。１か月後のリポソーム溶液の分散状態は、目視では変化が認められず、均一なリポソーム溶液であった。
【０１０１】
比較例７
比較例１で得たモノメチルポリオキシエチレンサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いて、実施例９と同様の評価を行った。その結果、リポソーム溶液は均一ではなく、脂質粒子が沈降していた。
【０１０２】
実施例１０
カルボキシメチルポリオキシエチレン（平均分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いたアスパラギナーゼの修飾
実施例２と同様にして得られたカルボキシメチルポリオキシエチレンサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン５ｇをクロロホルム５０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．１２ｇを添加し、少量のクロロホルムに溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド０．２５ｇを添加して室温にて２時間撹拌した。その後濾過して不溶物を除去した溶液にジエチルエーテルを添加し、析出した結晶を濾過して得た。減圧にて溶剤を除去し、次の工程に用いた。
アスパラギナーゼ０．１ｇをｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水液５０ｍＬに溶解し、上記で得られたサクシンイミジルカルボキシメチルポリオキシエチレンサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを添加し、５℃で４時間撹拌した。この反応液を、ｐＨ７．４、４℃のリン酸緩衝生理食塩水液に対して透析して未反応物を除去し、その後凍結乾燥し、カルボキシメチルポリオキシエチレン（平均分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンがアスパラギナーゼに結合した乾燥品を得た。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規かつ有用なポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途に関し、特に生理活性物質の化学修飾や乳化、あるいはリポソームなどドラッグデリバリーシステムに使用可能なポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年抗癌剤等のリポソーム製剤の研究が広く行われてきており、その血中滞留性を向上する目的でリポソームの水溶性高分子修飾が盛んに行われている。その一つとして、リポソーム修飾用ポリエチレンオキシド修飾リン脂質が用いられている。
これらは酸性リン脂質であるが、通常酸性リン脂質の体内投与、すなわち緩衝液に溶解するまでの保存安定性を考慮した場合、酸性基が塩で中和されていない酸性タイプの場合、サンプルのｐＨが低くなり加水分解等を起こし易く分解物を生じる。ナトリウム等で中和した方が酸性タイプのものよりも保存安定性は高い。しかし、酸性タイプを中和しナトリウム塩タイプにする場合、その工程において劣化することがあり高純度品を得ることが困難であった。このためナトリウム塩のもので、純度の高いものが望まれていた。
【０００３】
ポリエチレンオキシド修飾リン脂質の製造方法としては、今までT. M. Allen（Biochimica et Biophysica Acta, 1066, 29-36(1991)らやV. P. Torchilinら（Biochimica et Biophysica Acta, 1195, 11-20(1994)）が報告しているように、クロロホルム等の有機溶媒中でトリエチルアミン等の塩基性触媒存在下で、ポリエチレンオキシド化合物またはそのカラム精製品と、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質と反応させ、その後カラムクロマトにて混合溶媒系で溶出分画して精製しポリエチレンオキシド修飾リン脂質を得る方法がある。また、特公平４−７３５３号に記載されているように、１，１−カルボニルジイミダゾールを用いてポリエチレンオキシド酸化合物をリン脂質に反応させる方法がある。この方法は、カラム精製等を２回行うため工程が長い。これら従来の方法では、確かに高純度品が得られるが、収率等の効率が悪く使用溶媒量も多く、工業的生産への展開は困難である。また、このカラム精製法を用いて製造した場合、酸性タイプの高純度品を得ることは可能であるが、ナトリウム等で中和したタイプの高純度品を得ることは困難である。
【０００４】
同様の方法にて合成し緩衝液中で透析または限外濾過を行って、ナトリウム塩型のポリエチレンオキシド修飾リン脂質を得る報告がある。この方法では透析中に加水分解を起こしモノアシルリン脂質体を生成し、高純度品を得ることは困難である。
モノアシルリン脂質は一般にはリゾリン脂質と言われ、リン脂質のリゾ体は生体毒性が強く、また生理活性があると報告されている。ドラッグデリバリーシステムとして利用される際、この問題は重視され医薬用途では問題である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来の問題点を解決するため、保存安定性に優れ、しかもモノアシルリン脂質体等の不純物の含有量が少なくて高純度である新規かつ有用なポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、次のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途である。
（１） 下記工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含む方法で製造されたポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であって、モノアシルリン脂質体の含有量が３重量％以下である下記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
（Ａ）：下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、脱水縮合剤の存在下に、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させるか、または
下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させる工程
（Ｂ）：工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９に調整する工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）の後に脱水剤を用いて脱水する工程
（Ｄ）：工程（Ｃ）の後に炭素数５〜９の脂肪族炭化水素またはエーテルを用いて精製を行う工程
【化４】
【化５】
（２） ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が、工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の順で行った後、さらに下記工程（Ｅ）、（Ｆ）の順で行って製造されたものである上記（１）記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
（Ｅ）：アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤を用いて精製を行う工程
（Ｆ）：クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒と、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒とを用いて精製を行う工程
（３） ｐが０、Ｙがメチル基であり、モノアシルリン脂質体の含有量が０．５重量％以下である上記（１）または（２）記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
（４） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む界面活性剤。
（５） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含むリポソーム形成剤。
（６） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の両親媒性化学修飾剤。
（７） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の乳化剤。
（８） 下記工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含む上記（１）または（３）記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法。
（Ａ）：下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、脱水縮合剤の存在下に、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させるか、または
下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させる工程
（Ｂ）：工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９に調整する工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）の後に脱水剤を用いて脱水する工程
（Ｄ）：工程（Ｃ）の後に炭素数５〜９の脂肪族炭化水素またはエーテルを用いて精製を行う工程
【化６】
（９） Ｒ1およびＲ2が炭素数１２〜２０のアシル基である上記（８）記載の製造方法。
（１０） ｐが０、Ｙがメチル基である上記（８）または（９）記載の製造方法。
（１１） 工程（Ａ）で使用する緩衝液がリン酸緩衝液または炭酸緩衝液、有機溶媒がクロロホルム、トルエンまたは酢酸エチルである上記（８）ないし（１０）のいずれかに記載の製造方法。
（１２） 工程（Ｃ）で使用する脱水剤が無機ナトリウム塩または無機カリウム塩の無水物である上記（８）ないし（１１）のいずれかに記載の製造方法。
（１３） 工程（Ｄ）の後に、下記工程（Ｅ）を行う上記（８）ないし（１２）のいずれかに記載の製造方法。
（Ｅ）：アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤を用いて精製を行う工程
（１４） 工程（Ｄ）または工程（Ｅ）の後に、下記工程（Ｆ）を行う上記（８）ないし（１３）のいずれかに記載の製造方法。
（Ｆ）：クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒と、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒とを用いて精製を行う工程
（１５） 工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の順で行った後、さらに工程（Ｅ）、（Ｆ）の順で行う上記（１４）記載の製造方法。
（１６） 工程（Ｆ）を行った後、工程（Ｅ）を行う上記（１４）記載の製造方法。
（１７） モノアシルリン脂質体の含有量が２重量％以下である上記（８）ないし（１６）のいずれかに記載の製造方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質において、Ｒ1およびＲ2は炭素数４〜２４、好ましくは１２〜２０のアシル基である。このアシル基は通常脂肪酸に由来する。Ｒ1およびＲ2の具体的なものとしては、例えば酪酸、イソ酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、リグノセリン酸などの飽和および不飽和の直鎖または分岐の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。Ｒ1およびＲ2は同じであっても異なっていてもよい。炭素数が２４を越える場合、水相への分散が悪く反応性が下がる。また炭素数が４より少ない場合、精製工程での結晶性が悪く最終純度が低くなるおそれがある。
【０００８】
前記式（１）においてＲ3は炭素数１〜８、好ましくは２〜５、さらに好ましくは２または３の２価の炭化水素基であり、直鎖状、分枝状または環状のいずれでもよい。また飽和でも不飽和でもよい。具体的なものとしては−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−(ＣＨ2)3−、−(ＣＨ2)4−、−(ＣＨ2)5−、−(ＣＨ2)6−、−ＣＨ＝ＣＨ−、フェニレン基などが挙げられる。ｍは０または１であり、好ましくは１である。
【０００９】
前記式（１）においてＲ4Ｏで表されるオキシアルキレン基は炭素数２〜４、好ましくは２または３のオキシアルキレン基であり、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基などが挙げられる。これらの中ではオキシエチレン基、オキシプロピレン基が好ましく、特にオキシエチレン基が好ましい。分子内にはｎの数だけオキシアルキレン基が存在するが、このオキシアルキレン基は１種単独であってもよいし、２種以上が組み合わされていてもよく、その組み合わせ方に制限はない。またブロック状であってもランダム状であってもよい。ただし、全オキシアルキレン基に対するオキシエチレン基の比率が低い場合は水溶性が低下する可能性があるので、全オキシアルキレン基に対するオキシエチレン基の比率は５０〜１００モル％であるのが好ましい。
【００１０】
前記式（１）においてｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数を表し、１０〜８００、好ましくは２０〜５００の数である。ｎが１０より小さいと、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をドラッグデリバリーシステムに使用した場合の効果が小さい。また８００より大きいと、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を製造する際、前記式（２）のポリアルキレンオキシド化合物と式（３）のリン脂質との反応性が低下するほか、前記式（２）のポリアルキレンオキシド化合物の粘度が上昇して作業性が低下するため好ましくない。
【００１１】
前記式（１）においてＭはナトリウムイオンまたはカリウムイオンの一価の金属陽イオンである。前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、リン酸基部分がナトリウムイオンまたはカリウムイオンと塩を形成しているので、−２０℃の冷凍保存時はもちろん、室温で保存しても、さらには輸送の際などに４０℃前後の状態に置かれても加水分解を起こしにくく保存安定性に優れている。なお、Ｍが水素イオンである場合は加水分解を起こし易く保存安定性が悪い。
【００１２】
リン酸基部分と塩を形成するナトリウムイオンまたはカリウムイオンは、通常薬剤等の調製に用いる生理食塩緩衝液中に含まれ、さらに生体内にも存在するため、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をドラッグデリバリーシステムに使用しても体内での毒性等の問題も少ない。Ｍがナトリウムイオンまたはカリウムイオン以外の金属イオン、例えばカルシウムまたはマグネシウム等の二価金属イオンの場合は、リン脂質２分子が会合した構造等をとるため、緩衝液等への溶解性がかなり低くなることから好ましくない。
【００１３】
前記式（１）においてｒは２〜４の整数であり、好ましくは２である。
前記式（１）においてＸは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ2)ｑ−（ここでｑは１〜４）である。炭化水素基の具体的なものとしては−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−(ＣＨ2)3−などが挙げられる。ｐは０または１である。
【００１４】
前記式（１）においてｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であり、好ましくはアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等が挙げられる。これの中ではメチル基が好ましい。
またｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基であり、好ましくはアミノ基である。
Ｘp−Ｙとしてはメチル基、エチル基、プロピル基およびアミノメチル基が好ましく、特にメチル基が好ましい。
【００１５】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は保存安定性が高く、かつモノアシルリン脂質体等の不純物の含有量が少ない。本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のモノアシルリン脂質体の含有量は３重量％以下、好ましくは２重量％以下、より好ましくは０．５重量％以下であり、さらに好ましくは実質的に含有されない。このように本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は生体毒性が強いとされているモノアシルリン脂質の含有量が少く、生体に対する安全性の高い高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であるので、界面活性剤、好ましくは生体用の界面活性剤として利用することができる。より具体的には、リポソーム形成剤、生理活性物質の両親媒性化学修飾剤および乳化剤などとして好適に利用することができる。
【００１６】
なお本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質と類似するリン脂質として、ポリオキシアルキレン鎖がジカルボン酸を介さないで直接リン脂質に結合したリン脂質誘導体が知られているが、このリン脂質誘導体はリン酸基周辺の水素結合が弱く界面活性剤として用いる場合に安定性に劣ることがある。界面活性剤、特にリポソーム形成剤として用いる場合、両親媒性のバランスの点から、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が最も利用範囲が広い。
【００１７】
本発明のリポソーム形成剤は前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含むリポソーム形成剤であり、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質だけからなるものであってもよいし、リポソーム膜の形成に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、レシチン、その他のリン脂質、コレステロールなどが挙げられる。
【００１８】
本発明のリポソーム形成剤は、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含んでいるので、リポソーム溶液として保存安定性に優れるとともに、生体毒性が強いモノアシルリン脂質の含有量が少ないので安全であり、このため本発明のリポソーム形成剤を使用することにより安全性の高いドラッグデリバリーシステムとして利用することができるリポソームを得ることができる。
【００１９】
リポソーム溶液として保存安定性に優れる理由としては、次のことが推測される。モノアシルリン脂質はジアシルリン脂質に比べて疎水性が低いので、リポソーム表面から脱離しやすい。このためモノアシルリン脂質の含有量が多いリポソームはモノアシルリン脂質がリポソーム表面から脱離してリポソーム表面の水和層が減少するので、リポソーム粒子の凝集が起こり相分離を起こして不安定となりやすい。これに対して本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はモノアシル体含有量が少ないので、リポソーム表面からのリン脂質の脱離が起こりにくく、このためリポソーム溶液の保存安定性に優れている。
【００２０】
リポソーム溶液として保存安定性に優れる理由としては、次のことが挙げられる。ポリアルキレンオキシド修飾モノアシルリン脂質含有量が高い場合、この化合物は親油性が低いため疎水性が下がり、リポソーム表面から遊離する場合がある。その結果リポソーム表面の水和層が減少し、リポソーム粒子の凝集が起こり相分離を起こし不安定となる。本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、モノアシル体含有量が低くリポソーム溶液とした場合、保存安定性に優れたものができる。
【００２１】
本発明の生理活性物質の化学修飾剤は前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の化学修飾剤であり、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質だけからなるものであってもよいし、生理活性物質の化学修飾に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。
【００２２】
化学修飾する生理活性物質はアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などの官能基を有するものであれば特に限定されず、例えば酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモンが挙げられる。
【００２３】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を生理活性物質の化学修飾剤として使用する場合、式（１）のＹとしてはアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基およびチオール基が好ましい。このような基を有する場合、生理活性物質中に存在する官能基と容易に反応させることができる。例えば、Ｙがカルボキシル基の場合、生理活性物質中のアミノ基とＣＯＮＨ結合を形成させることにより、生理活性物質にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質骨格を導入することができる。このようにして化学修飾された生理活性物質は、リポソーム成分として用いる場合リポソーム表面に存在させることができ、例えば生理活性物質が抗体のタンパク質の場合には標的細胞のリガンドとして用いることができるので、リポソームを標的細胞へ集中して輸送することができる。
【００２４】
本発明の生理活性物質の乳化剤は前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の乳化剤であり、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質だけからなるものであってもよいし、生理活性物質の乳化に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、オキシアルキレン基に由来する親水性と、アシル基に由来する疎水性とを有しているので乳化剤として使用することができ、しかも保存安定性に優れている。さらに、生体細胞構成成分と同等のリン脂質および毒性の低いオキシアルキレン基からなるとともに、生体毒性が強いモノアシルリン脂質の含有量が少ないので安全性が高い。このため、このようなポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む乳化剤を使用することにより、例えば安全性の高い生理活性物質の乳化物を得ることができる。具体的には、酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質またはホルモンなどの生理活性物質の乳化物を得ることができる。
【００２６】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は前記工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）により容易に製造することができる。
工程（Ａ）で使用する前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物および前記式（３）で示されるリン脂質において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4Ｏ、ｎ、Ｘ、pおよびＹは前記式（１）で説明したものと同じである。
【００２７】
工程（Ａ）で使用する前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物は公知の方法により製造することができる。例えば、後述するように、式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物とジカルボン酸無水物とを反応させることにより容易に製造することができる。
【００２８】
前記式（３）で示されるリン脂質は天然リン脂質でも合成リン脂質でもよく、例えば大豆および大豆水添ホスファチジルジエタノールアミン、卵黄および卵黄水添ホスファチジルジエタノールアミン等の天然および合成ホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。前記式（３）で示されるリン脂質としては、ｒが２であるホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００２９】
工程（Ａ）で使用する脱水縮合剤としては、式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物のカルボキシル基と、式（３）のリン脂質の官能基とを脱水縮合させて結合させることができる化合物が制限なく使用できる。このような脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイミド誘導体が挙げられる。脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミドが好ましい。
脱水縮合剤の使用量は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の１．０５〜５倍モル、好ましくは１．５〜２．５倍モルであるのが望ましい。さらに、反応率を上げる場合は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドを反応系中に前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物に対して０．１〜２倍モル加えることが好ましい。
【００３０】
工程（Ａ）の反応に使用する緩衝液はナトリウムまたはカリウムを含む緩衝液であり、例えばナトリウムまたはカリウムをカウンターイオンとする緩衝液である。緩衝液のｐＨは５〜１３、好ましくはｐＨが８〜１１であるのが望ましい。緩衝液の具体的なものとしては、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液およびホウ酸緩衝液などが挙げられる。これらの中ではリン酸緩衝液が好ましい。緩衝液中に含まれるナトリウムおよび／またはカリウムの量は前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の１．５〜１０倍モル、好ましくは２〜５倍モルであるのが望ましい。
【００３１】
工程（Ａ）の反応に使用する有機溶媒は、水酸基等の官能基を有しないものであれば特に制限なく使用することができる。例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼンおよびトルエンなどが挙げられる。これらの中ではクロロホルムおよびトルエンが好ましい。エタノールなどの水酸基を有する有機溶媒は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の末端のカルボキシル基と反応するので好ましくない。ジクロロメタン等でも反応性には問題はないが、低沸点であるため作業上好ましくない。
工程（Ａ）の反応は前記緩衝液と有機溶媒との混合媒体中で行う。緩衝液と有機溶媒との混合割合は有機溶媒１００容量部に対して緩衝液０．１〜５０容量部、好ましくは１〜１０容量部とするのが望ましい。
【００３２】
工程（Ａ）の反応の反応温度は３０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は１時間以上、好ましくは２〜８時間とするのが望ましい。３０℃より低温では反応率が低く、９０℃より高温では反応に用いる前記式（３）で示されるリン脂質のアシル基が加水分解するおそれがあるので好ましくない。
【００３３】
このようにして前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と前記式（３）で示されるリン脂質ジカルボン酸無水物とを反応させることにより、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が得られる。ただし、この段階では前記式（１）のＭが水素原子である水素タイプのリン脂質が含まれている場合が多い。工程（Ａ）終了後は、反応液をそのまま次の工程（Ｂ）に供することができる。
【００３４】
本発明の製造方法は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、上記のように前記脱水縮合剤の存在下に反応させることができるが、別な方法として、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、前記式（３）で示されるリン脂質とを反応させることもできる。上記活性化エステル誘導体は、例えば前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、活性化剤とを前記脱水縮合剤の存在下に反応させることにより得ることができる。
【００３５】
上記活性化剤としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ，Ｎ′−ジコハク酸イミドカーボネート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウム・メチルサルフェート、イソブチルクロロホルメートなどが挙げられる。これらの中ではＮ−ヒドロキシコハク酸イミドが好ましい。
【００３６】
前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と活性化剤との反応は、ジカルボン酸無水物との反応と同様、脱水縮合剤の存在下でカルボン酸と反応しない溶媒、例えばクロロホルム、トルエン等の反応溶媒中で、反応温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜５５℃で活性化剤をポリアルキレンオキシド化合物の溶液に分散撹拌することにより行うことができる。
例えば、活性化剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを使用した場合、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物のカルボキシル基と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドのイミド基が反応し、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物のカルボキシル基側末端にＮ−ヒドロキシコハク酸イミドが結合した活性化エステル誘導体が得られる。
【００３７】
工程（Ａ）において、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の末端がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基、特にアミノ基の場合にはこれらの基を保護して反応に供するのが好ましい。例えば、アミノ基の場合にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基または９−フルオレニルメチルカルボニル基等の保護基を付け、カルボキシル基の場合にはメチル基等によりエステル化して保護し、またチオール基の場合にはＳ−ｔ−ブチルスルフィド基等の保護基を付けて保護するのが好ましい。
【００３８】
工程（Ｂ）では工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９、好ましくはｐＨは６．５〜８に調整する。このとき使用するアルカリとしては、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムなどが挙げられる。アルカリは通常水溶液の状態で使用され、工程（Ａ）の混合媒体に用いた緩衝液の塩水溶液、水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液が挙げられる。ただし、工程（Ａ）の終了後、反応液のｐＨが６．５〜８の場合はｐＨ調整を行わなくてもよい。
【００３９】
工程（Ａ）で得られた反応液をｐＨ調整することにより、水素タイプのものが本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質に変換される。
工程（Ｂ）の終了後は、反応液を貧溶媒または非溶媒に投入して結晶化するなどの公知の方法により、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度かつ高収率で得ることができる。得られたポリアルキレンオキシド修飾リン脂質または工程（Ｂ）の反応液を、下記のような精製工程で精製することにより、さらに高純度の目的物を得ることができる。
【００４０】
工程（Ｃ）では、工程（Ｂ）の反応液を脱水剤を用いて脱水する。脱水は工程（Ｂ）の反応液に脱水剤を添加することにより行うことができる。工程（Ｂ）の反応液は緩衝液と有機溶媒との混合液であるが、脱水することにより水が除去され、有機溶媒の単一な液が得られる。これにより次工程（Ｄ）での溶媒精製において、優れた収率および純度を得ることができる。
【００４１】
工程（Ｃ）で用いる脱水剤は、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質および工程（Ａ）で用いた有機溶媒と反応しない公知の脱水剤が使用できるが、無機ナトリウム塩または無機カリウム塩の無水物が好ましく、特に無水硫酸ナトリウムが好ましい。脱水剤としてナトリウムおよびカリウム以外の無機塩、例えば硫酸マグネシウムなどの２価の金属塩を用いると、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のリン酸基のカウンターイオンが１価の金属塩から２価の塩に置き換わり、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の水への溶解性が低下し、ドラッグデリバリー基材として使用する際問題となるので好ましくない。
【００４２】
工程（Ｄ）を行う前には、濾過などにより工程（Ｂ）の反応液または工程（Ｃ）の反応液から不溶物を除去するのが好ましい。工程（Ｂ）の反応液を濾過する場合は未反応のリン脂質、工程（Ｃ）の反応液を濾過する場合は未反応のリン脂質に加えて脱水に用いた無機脱水剤、さらに工程（Ａ）で用いた緩衝液の塩が不溶となり析出した塩が除去される。濾過に使用するろ材は、被処理液の不溶物を除去することができるものであれば特に制限はなく、通常は保留粒子細孔径が１〜１０μｍで耐溶媒性を有する紙、ガラスなど各種の材質のフィルターを使用することができる。濾過方法には制限なく、例えば減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過などの方法を用いることができる。
【００４３】
工程（Ｄ）では、工程（Ｃ）の反応液またはこれを濾過した濾過液に、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素またはジエチルエーテルなどのエーテルを加え、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶化を行う。
【００４４】
炭素数５〜８の脂肪族炭化水素の添加量は、工程（Ｄ）の被処理液に対して１〜５０倍容量であり、好ましくは２〜５倍容量であるのが望ましい。炭素数５〜８の脂肪族炭化水素の量が、被処理液の容量より少ない場合、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が十分に析出せず溶液中に残存する恐れがある。結晶化を行う際、室温で問題なく行うことができるが、１０℃以下に冷却して行えば濾過速度も早く、良好な収率で結晶が得られる。
【００４５】
工程（Ｄ）の処理により、過剰のジシクロヘシキルカルボジイミドなどの脱水縮合剤を除去できるが、他の精製工程でも除去できるので、さらに精製を行なう場合は蒸留等により有機溶媒を除去して結晶化してもよい。有機溶媒を除去する場合、８０℃以下で減圧下で行うことが望ましい。有機溶媒の留去温度が８０℃を越えると、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のアシル基が加水分解するなど望ましくない副反応が起こる恐れがある。
【００４６】
工程（Ｄ）で得られた結晶を本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、さらに精製に供することもできる。
【００４７】
本発明の方法において、工程（Ｄ）の後に工程（Ｅ）を行うことにより、工程（Ｄ）の前処理で除去できなかった、緩衝液として用いた過剰なナトリウム、カリウム等の式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質に結合していない遊離塩類を吸着除去することができる。工程（Ｅ）は、工程（Ｄ）の後に工程（Ｆ）を行いその後に行ってもよい。
【００４８】
工程（Ｅ）では、工程（Ｄ）で得られた結晶をそのまま用い、加温して液状として処理してもよく、その結晶を酢酸エチル、クロロホルム、トルエン等の水分含有量が低く、かつ式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を溶解する溶媒に溶解し、この溶液に吸着剤を添加して撹拌するなどの方法により行うこともできる。
【００４９】
工程（Ｅ）で用いる吸着剤としては、アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤であり、例えば水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化ケイ素等を含有する吸着剤などが挙げられる。これらの化合物を含有する吸着剤の市販品としては、キョーワード２００、キョーワード３００、キョーワード５００、キョーワード６００、キョーワード７００、キョーワード１０００、キョーワード２０００（協和化学工業（株）製、商標）、トミックス−ＡＤ３００、トミックス−ＡＤ５００、トミックス−ＡＤ７００（冨田製薬（株）製、商標）などが挙げられる。吸着剤は１種単独で使用することもできるし、２種以上を組み合せて使用することもできる。
【００５０】
吸着剤を用いて処理する時の温度は１０〜８５℃、好ましくは４０〜７０℃、時間は１０分〜５時間、好ましくは３０分〜２時間とするのが望ましい。工程（Ｄ）で得られた結晶をそのまま処理してもよいが、上記温度で結晶が溶解しない場合や溶液の粘度が高い場合が多く、トルエンまたはクロロホルムなどの本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を溶解する有機溶媒にて希釈して処理して行う。処理する温度が１０℃未満では本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が析出する場合があり、吸着剤を除去する場合にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質も除去され収率が下がるので好ましくない。また８５℃以上では工程（Ｃ）で完全に除去できず、微量の水分が存在する場合、吸着剤処理中にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の加水分解等が起こる可能性がある。吸着剤の使用量は処理する結晶または溶液１００重量部に対して０．１〜１５重量部、好ましくは０．５〜７．５重量部とするのが望ましい。吸着剤量が上記下限値より少ないと過剰の遊離の塩を充分に除去することができず、上限値より多いと吸着剤の除去が困難であり主成分の収率が下がる。
【００５１】
工程（Ｅ）の終了後は、濾過などの方法により吸着剤を除去し、得られた分離液（以下、工程（Ｅ）の処理液という場合がある）を貧溶媒または非溶媒を用いて再結晶させることができる。これにより得られた結晶を本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、工程（Ｅ）の処理液をさらに精製に供することもできる。
【００５２】
本発明の方法において、工程（Ｆ）では、工程（Ｅ）の処理液に炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の貧溶媒ないし非溶媒を加えることにより結晶化し、得られた結晶にクロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒を加えて溶解し、エーテル、アセトンまたは炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を用いて晶析を行う。
【００５３】
工程（Ｆ）で使用する前記炭素数５〜８の脂肪族炭化水素には特に制限はなく、例えば、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ヘキサン、イソヘキサン、３−メチルペンタン、ネオヘキサン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、３−エチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、３，３−ジメチルペンタン、２，３，３−トリメチルブタン、オクタン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、３−エチルヘキサン、２，２−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン、２，４−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチルヘキサン、３，３−ジメチルヘキサン、３，４−ジメチルヘキサン、２−メチル−３−エチルペンタン、３−メチル−３−エチルペンタン、２，２，３−トリメチルペンタン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，２，３，３−テトラメチルブタンなどを挙げることができる。これらの中でヘキサンおよびヘプタンが好ましい。
【００５４】
工程（Ｆ）を行うにあたり、さらに純度を上げたい場合、アセトン、酢酸エチル、または炭素数１〜３のアルコールから選ばれる溶媒および炭素数５〜８の脂肪族炭化水素からなる溶媒の２種類以上を組み合わせて溶媒として用いて溶解し不溶物を除去した後工程（Ｆ）を行うことにより、純度の優れたポリアルキレンオキサイド修飾リン脂質を得ることができる。この際、アセトン、酢酸エチル、または炭素数１〜３のアルコールから選ばれる溶媒を、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキサイド修飾リン脂質に対して１〜２０倍重量添加し３０〜８５℃で溶解し、不溶物を濾過して除去する。不溶物を除去した後、５０℃以下に冷却した後炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を添加し、３５℃以下に冷却、好ましくは１５℃以下に冷却する。この際８０℃以上で溶解すると、リン脂質のアシル基が分解し、モノアシル体が生じる恐れがある。モノアシルリン脂質は生体に投与する上で問題がある。また、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を添加し冷却する際、４０℃以上では前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が十分に析出せず回収率が低くなる恐れがある。
【００５５】
上記のようにして製造することにより、有毒なモノアシルリン脂質の含有量が少なく、またそれ以外の不純物の含有量も少なく高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を容易に高収率で得ることができる。
【００５６】
なお、工程（Ａ）の出発原料となる前記式（２）で示されポリアルキレンオキシド化合物は、例えば式（４）
ＨＯ−(Ｒ4Ｏ)n−Ｘp−Ｙ …（４）
（式（４）中、Ｒ4Ｏ、ｎ、Ｘ、pおよびＹは前記式（１）と同じである。）
で示されるポリアルキレンオキシド化合物とジカルボン酸無水物とを、塩基性触媒の存在下に反応させることにより製造することができる。
【００５７】
上記ジカルボン酸無水物としては、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、テレフタル酸の無水物などを挙げることができる。これらの中ではコハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびピメリン酸の無水物が好ましく、特にコハク酸またはグルタル酸の無水物が好ましい。ジカルボン酸無水物としては、分子内無水物、分子間無水物のいずれを用いてもよい。
【００５８】
上記塩基性触媒は特に制限なく使用できる。例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジンなどが挙げられ、好ましくは酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムである。トリエチルアミンおよびジメチルアミノピリジンを用いる場合は、工程（Ａ）の前に触媒を除去して用いる必要がある。
反応は通常反応溶媒を用いて行われるが、この場合反応溶媒としては前記式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物およびジカルボン酸無水物と反応する溶媒以外のものが制限なく使用できる。例えばクロロホルム、トルエン、テトラヒドロフランおよびアセトニトリル等が挙げられる。アルコールは前記ジカルボン酸無水物と反応するので好ましくない。
【００５９】
反応は反応温度３０〜１８０℃、好ましくは６０〜１３０℃、より好ましくは８０〜１２０℃、反応時間１〜２０時間、好ましくは３〜１０時間とするのが望ましい。３０℃より低温では反応率が低く、１８０℃より高温では末端活性基が分解するおそれがあるので好ましくない。
カルボン酸無水物の量は、前記式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物が有する水酸基１モルに対して１〜３倍モル、好ましくは１．０２〜１．５倍モルとするのが望ましい。
【００６０】
このようにして前記式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物とジカルボン酸無水物とを反応させることにより、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物が得られる。反応終了後は、反応液にヘキサン等の脂肪族炭化水素などを添加して反応生成物を結晶化させ、この結晶を次の工程（Ａ）に供することができる。
【００６１】
【発明の効果】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は新規かつ有用である。本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は保存安定性が高く、モノアシルリン脂質体等の不純物の含有量が少なく生体に対する安全性の高い高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であるので、リポソーム形成剤、生理活性物質の化学修飾剤および生理活性物質の乳化剤などとして好適に利用することができる。
【００６２】
本発明の製造方法は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、脱水縮合剤の存在下に、ナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液と有機溶媒との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させるか、または前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、ナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液と有機溶媒との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させる工程（Ａ）と、工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９に調整する工程（Ｂ）と、工程（Ｂ）の後に脱水剤を用いて脱水する工程（Ｃ）と、工程（Ｃ）の後に炭素数５〜９の脂肪族炭化水素またはエーテルを用いて精製を行う工程（Ｄ）とを含んでいるので、上記ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を簡単に効率よく、しかも高純度に製造することができる。
【００６３】
【実施例】
実施例１
（１）モノメチルポリオキシエチレン（分子量５０００）サクシンイミジルグルタレートの合成
モノメトキシポリオキシエチレン（平均分子量５０００）５０ｇ（０．０１ｍｏｌ）にリン酸ナトリウムを０．０５ｇ（０．４ｍｍｏｌ）を加えて、１００℃に加温し均一にした後、無水グルタル酸を１．２５ｇ（０．０１１ｍｏｌ）加え、１１０℃で８時間反応を行った。冷却後イソプロピルアルコール２００ｍＬを加えて、モノメチルポリオキシエチレングルタレートの結晶を得た。その結晶にトルエン１５０ｍＬを添加して４０℃で加温溶解した後、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド１．２４ｇ（０．０１１ｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド４．２５ｇ（０．０２１ｍｏｌ）を添加し、４０℃で２時間反応した。反応後濾過し、下記式（５）で示される粗メチルポリオキシエチレンサクシンイミジルグルタレート活性化体４８ｇを得た。
【化５】
（２）モノメチルポリオキシエチレングルタリル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１４．９６ｇ（０．０２ｍｏｌ）にトルエン７５ｍＬを加えて６０℃に加温し、リン脂質トルエン溶液を得た。またリン酸水素ニナトリウム７．２ｇ（０．０５ｍｏｌ）に蒸留水７．５ｍＬと３０％水酸化ナトリウム水溶液０．７５ｍＬとを加えて加温溶解し、リン酸緩衝液を得た。このリン酸緩衝液を前記リン脂質トルエン溶液に添加し、６０℃で撹拌しリン脂質緩衝混合液を得た。このリン脂質緩衝混合液に、前記式（５）の粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルグルタレート活性化体を添加し、６０℃で５時間反応を行った。反応後０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に中和した。その後、硫酸ナトリウム１５０ｇを添加して１時間撹拌し、脱水を行った。
【００６５】
脱水工程後濾過にて不溶物を除去し、ろ液にヘキサンを４００ｍＬ添加し１時間撹拌し、結晶を析出させた。この結晶を濾過にて得た。得られた粗結晶を酢酸エチル１００ｍＬに５０℃で加温溶解し、吸着剤としてキョーワードＫＷ＃７００およびキョーワードＫＷ＃１０００をそれぞれ０．５ｇ加えて３０分間撹拌した。吸引濾過にてキョーワードを除去し、得られたろ液にヘキサン５０ｍＬを添加して結晶析出させた。この結晶を濾過により得た。その結晶にアセトン３００ｍＬを加えて５０℃で加温溶解し、熱時濾過して未反応のリン脂質を不溶物として除去した。その後１５℃以下に冷却し、結晶を析出させた。この結晶を濾過して得た。得られた結晶に酢酸エチル１８０ｍＬを加えて６０℃に加温して溶解し、その後１５℃以下に冷却し、結晶を析出させた。この結晶を濾過して採取した。加温溶解時に不溶物がある場合は、濾過にて除去し次の工程に進んだ。さらに得られた結晶を再度同様に酢酸エチル２００ｍＬに加温溶解し、ヘキサン１００ｍＬを加えて析出した結晶を濾過して最終純度９８％の結晶５０ｇを得た。ポリオキシエチレン活性化体を基準として収率は９０．８％であった。結果を表１にまとめる。
なお参考例として中和後脱水工程を行わず、ヘキサンを添加し結晶化行った場合、純度８７％の結晶５２ｇが得られ、収率は９４．５％であった。
【００６６】
生成物の分析は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５重量比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。
【００６７】
実施例２
モノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量２０００）ジラウロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
モノメトキシポリオキシエチレン（平均分子量２０００）２０ｇ（０．０１ｍｏｌ）にリン酸ナトリウムを０．０５ｇ（０．４ｍｍｏｌ）加えて、１００℃に加温し均一にした後、無水コハク酸を１．１ｇ（０．０１１ｍｏｌ）を加え、１００℃で６時間反応を行い、実施例１の（１）と同様の方法で粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート活性化体を得た。
一方、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン１１．６ｇ（０．０２ｍｏｌ）を用いて、実施例１と同様の条件にてリン脂質緩衝混合液を調製した。
【００６８】
このリン脂質緩衝混合液に、前記粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート活性化体を添加し、６０℃で５時間反応を行った。反応後、実施例１と同様の条件にて精製し最終結晶１８ｇを得た。純度は９８％であった。ポリオキシエチレン活性化体を基準として収率は６９．２％であった。結果を表１にまとめる。
【００６９】
実施例３
モノアミノエチルポリオキシエチレン（分子量３４００）グルタリルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
モノアミノエチルポリオキシエチレン（平均分子量３４００）は、３．４ｇ（０．００１ｍｏｌ）の末端アミノ基をProc. Natl. Acad. Sci. 69, 730(1972)記載の方法に従って、無水物を用いてｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基で保護し、もう片末端を実施例１の（１）の方法に従ってサクシンイミジルグルタレート活性化し、粗ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護アミノエチルポリオキシエチレン（分子量３４００）サクシンイミジルグルタレート活性化体を調製した。
一方、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１．１６ｇ（０．００２ｍｏｌ）を用いて、実施例１と同様の条件にてリン脂質緩衝混合液を調製した。
【００７０】
このリン脂質緩衝混合液に、前記粗ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護アミノエチルポリオキシエチレン（分子量３４００）サクシンイミジルグルタレート活性化体を添加し、４５℃で５時間反応を行った。反応後、キョーワードＫＷ＃７００を０．１ｇおよびキョーワードＫＷ＃１０００を０．０５ｇ加えて３０分間撹拌した。吸引濾過にてキョーワードを除去し、２．５Ｍ塩酸のアセトニトリル溶液を添加し、３０分間室温にて撹拌し保護基を加水分解して外し、水酸化ナトリウム水溶液にて中和した。中和した溶液にキョーワードＫＷ＃７００を０．１ｇおよびキョーワードＫＷ＃１０００を０．０５ｇを加えて３０分間撹拌した後、濾過して不溶物を除去しろ液の溶媒を除去した。アセトンおよび酢酸エチルを用いた晶析については、実施例１と同様の条件にて精製し最終結晶２ｇを得た。純度は９０％であった。モノアミノエチルポリオキシエチレンを基準として収率は５２．０％であった。結果を表１にまとめる。
【００７１】
実施例４
モノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
実施例２と同様の方法でモノメトキシポリオキシエチレン（平均分子量５０００）５０ｇ（０．０１ｍｍｏｌ）をモノメトキシポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート活性化体とし、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１５．０ｇ（０．０２ｍｏｌ）と反応させ、さらに同様に精製しモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを得た。純度９８．５％の最終結晶５３ｇを得、ポリオキシエチレン活性化体を基準として９１．０％の収率となった。結果を表２にまとめる。
【００７２】
実施例５
モノメチルポリオキシエチレングルタリル（分子量５０００）ジドコサノイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジドコサノイルホスファチジルエタノールアミン１４．９６ｇ（０．０２ｍｏｌ）にトルエン７５ｍＬを加えて６０℃に加温しリン脂質トルエン溶液を得た。また炭酸ナトリウム５．３ｇ（０．０５ｍｏｌ）に蒸留水７．５ｍＬと３０％水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍＬとを加えて加温溶解し、炭酸緩衝液を得た。この炭酸緩衝液を前記リン脂質トルエン溶液に添加し６０℃で撹拌しリン脂質緩衝混合液とした。
【００７３】
このリン脂質緩衝混合液に、実施例１で調製した粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルグルタレート活性化体を添加し、６０℃で５時間反応を行った。反応後ｐＨが下がっている場合は、０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７に中和した後、硫酸ナトリウム１５０ｇ添加し１時間撹拌し脱水を行った。その後実施例１と同様の方法にて精製を行い最終純度９５％の結晶４８ｇを得た。ポリオキシエチレン活性化体を基準として８７．２％の収率となった。結果を表２にまとめる。
【００７４】
比較例１
モノメチルポリオキシエチレン（平均分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１４９．６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）にクロロホルム１０ｍＬを加えて撹拌しリン脂質クロロホルム溶液とした。その溶液にモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート３．０６ｇ（０．６ｍｍｏｌ）を添加し、さらにトリエチルアミン０．０１ｇ（０．７ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩反応を行った。反応後窒素ブローにてクロロホルムを除去し、得られた残渣を０．１４５Ｍの塩化ナトリウム水溶液に再溶解し未反応のモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネートを加水分解した。その溶液を、生理食塩水で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ−１．５ｍカラムに展開し生理食塩水で溶出した。排除体積中のポリオキシエチレン修飾ホスファチジルエタノールアミンミセルを含むフラクションを採取し、水に対して５日間透析した後、凍結乾燥にて結晶１９５ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として収率は３５．５％であり、純度は９４％であった。
【００７５】
上記の方法で得られる主成分は、生理食塩水および水中でのｐＨが５〜６であるため、リン酸基の部分が中和されていないＨタイプも含まれる。すべてをナトリウム塩とするため次の中和工程を行った。
得られた結晶１９５ｍｇをメタノール１．９５ｍＬに溶解し、撹拌しながらｐＨが７〜８となるまで０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液約０．１５ｍＬを添加した。その後エバポレーターを用いて濃縮し、ヘキサン５ｍＬを加え濾過して析出した結晶を得た。得られたナトリウム塩タイプの収率は２８％であり、純度は８５％となった。結果を表３にまとめる。
【００７６】
比較例２
モノメチルポリオキシエチレン（平均分子量１９００）サクシニル水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミンの合成
比較例モノメチルポリオキシエチレンサクシネート（平均分子量１９００）１９ｇ（１０ｍｍｏｌ）を四塩化炭素に溶解し、その溶液に無水コハク酸５ｇ（５０ｍｍｏｌ）を添加し７５℃に加温し一晩撹拌した。反応後濾過して余剰の無水コハク酸を除去した。この乾燥試料を容積比９５／５／０．８の塩化エチレン／メタノール／濃アンモニア水混合溶媒に溶解し、同溶液で平衡化したケイ酸カラムに展開した。溶離溶媒のメタノール含有量を上げることにより、溶出してくるサクシニルエチレングリコールフラクションを分取し、溶媒除去して乾燥品を得た。
【００７７】
モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート６３８ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ）をベンゼン１１ｍＬに溶解し、１，１−カルボニルジイミダゾール３１５ｍｇ（２．１６ｍｍｏｌ）を添加し４０℃に加温した。この溶液に水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン５９４．４ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を加え、その後脱溶媒を行い全量３ｍＬまで濃縮し、６５℃で３時間反応を行った。反応後エバポレーターにて脱溶媒し、得られた試料をけい酸クロマトグラフィーで精製し、溶出してくるポリオキシエチレン修飾ホスファチジルエタノールアミン含有フラクションを分取し、溶媒を除去して純度９５％の乾燥品３２４ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として収率は１５％であった。
【００７８】
上記の方法で得られた主成分は水素（Ｈ）タイプであり、ナトリウム塩へ置換を行うために、比較例１と同様の方法にてナトリウム塩とした。得られたナトリウム塩タイプの純度９１％であり、収率は１２％であった。結果を表３にまとめる。
【００７９】
比較例３
比較例２と同様の方法で得られたモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート（平均分子量１９００）６３８ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ）をベンゼン１１ｍＬに溶解し、１，１−カルボニルジイミダゾール３１５ｍｇ（２．１６ｍｍｏｌ）を添加し４０℃に加温した。この溶液に水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン５９４．４ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を加え、その後脱溶媒を行い全量３ｍＬまで濃縮し、６５℃で３時間反応を行った。反応後エバポレーターにて脱溶媒し、クロロホルムと０．２Ｍ塩酸を用いて２相分離を行った。下層を採取し４回水相にて洗浄抽出し、脱溶媒し乾燥品とした。得られた試料を容積比９５／５／０．８の塩化エチレン／メタノール／濃アンモニア水混合溶媒に溶解し、同溶液で平衡化したケイ酸カラムに展開した。溶離溶媒のメタノール含有量を上げることにより、溶出してくるポリオキシエチレン修飾ホスファチジルエタノールアミン含有フラクションを分取し、溶媒を除去して乾燥品８００ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として３７．２％の収率であり、純度は９４％であった。
【００８０】
上記の方法で得られた主成分はアンモニウム塩であり、ナトリウム塩へ置換を行うために、まず陽イオン強酸性樹脂を用いてアンモニウムイオンを除去し、比較例１と同様の方法にてナトリウム塩とした。得られたナトリウム塩タイプの純度は８５％であり、収率は３０％であった。結果を表３にまとめる。
【００８１】
比較例４
モノメチルポリオキシエチレングルタリル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１４９．６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）にクロロホルム１０ｍＬを加えて撹拌しリン脂質クロロホルム溶液とした。その溶液にモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート３．０６ｇ（０．６ｍｍｏｌ）を添加し、さらにトリエチルアミン０．０１ｇ（０．７ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩撹拌し反応を行った。反応後窒素ブローにてクロロホルムを除去し、得られた残渣を水に分散しその溶液を、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｏｒ ＣＥ３０００００ＭＷ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、水に対して５日間透析した。その後凍結乾燥し結晶１９５ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として２５％の収率であり、純度は８５％であった。
【００８２】
上記の方法で得られる主成分は、透析水中でのｐＨが５〜６であるため、リン酸基の部分が中和されていないＨタイプおよびトリエチルアミンタイプも含まれる。トリエチルアミンは毒性が高く、すべてをナトリウム塩とするため比較例３と同様の処理を行いナトリウムタイプとした。得られたナトリウム塩タイプの収率は１８％であり純度は８０％となった。結果を表３にまとめる。
【００８３】
【表１】
表１
【表２】
表２
【表３】
表３
表１〜表３の注
＊１ Ｎａ塩純度：前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の純度、単位ｗｔ％
＊２ リゾ体含有量：モノアシルリン脂質体の含有量、単位ｗｔ％
＊３ フリーＰＥ含有量：未反応のリン脂質の含有量、単位ｗｔ％
＊４ フリーPEG誘導体含有量：単位ｗｔ％
＊５ フリー塩含有量：リン酸塩、その他の塩の含有量、単位ｗｔ％
【００８７】
表１〜表３の結果から、実施例の製造方法は比較例に比べて、高純度のＮａ塩を高収率で製造することができることがわかる。
【００８８】
実施例６
モノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのナトリウムタイプと水素タイプ（Ｈ）の保存安定性の比較
実施例４で得たモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのナトリウムタイプと、対照品となる水素タイプ（Ｈ）とについて、下記の条件にて主成分含有量の経時変化を実施例１のＴＬＣにより測定した。結果を表４に示す。
条件
・保存条件：−３０℃、４℃、２０℃、４０℃
・サンプル形態：粉末（空気存在下、褐色瓶）
【００８９】
【表４】
表４ 純度変化（主成分含有量％）
【００９０】
表４の結果からわかるように、実施例のナトリウムタイプのものは、低温で保存した場合はもちろん、室温より高い温度で長期間保存した場合にも、保存安定性に優れていることがわかる。これに対して、比較例の水素タイプのものは含有量が経時的に大きく減少し、特に保存温度が高い場合に純度が大きく減少することがわかる。４０℃で保存した場合、実施例のナトリウムタイプの保存率は６か月後も９７．１％であるのに対し、比較例の水素タイプの保存率は１週間後で７０．０％であり、保存期間が２５倍以上になっているにもかかわらず、実施例の保存率はなおも高い値を示している。
【００９１】
実施例７
実施例３のモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用して乳液を作製した。すなわち、表５の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、撹拌しながら水相部を同温度で添加した。
【００９２】
【表５】
表５
作製した乳液を４０℃で一か月保存した後、乳化状態を下記の基準により評価した。結果を表７に示す。
３：安定な状態
２：やや不均一な状態
１：クリーミングまたは分離している状態
【００９４】
また、作製した直後の乳液を皮膚に塗布し、官能試験を行った。官能評価は５人の専門パネラーで行った。評価方法は、上腕部を洗浄した後に試料を塗布し、塗布直後および一晩経過後の皮膚刺激についての評価を下記３段階評価でそれぞれ行った。５人の合計点を表７に記す。
３：普通である。全く異常がない。
２：違和感がある。少し痒みを感じる。
１：痒みがある。皮膚に発赤を認める。
【００９５】
実施例８
実施例３のモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用してクリームを作製した。すなわち、表６の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、撹拌しながら水相部を同温度で添加した。
【００９６】
【表６】
表６
作製したクリームについて実施例７と同様の評価を行った。結果を表７に示す。
【００９８】
比較例５および６
比較例２のモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いて実施例７および実施例８と同様の試験を行った。結果を表７に示す。
【００９９】
【表７】
表７
実施例９
リポソーム溶液の安定性評価
ジパルミトイルホスファチジルコリン１．９２ｇ（２．６４ｍｍｏｌ）、コレステロール０．４５ｇ（１．３２ｍｍｏｌ）、実施例４で得たモノメチルポリオキシエチレン（分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン０．８６ｇ（０．１５ｍｍｏｌ）をナス型フラスコに入れ、クロロホルム５０ｍＬを加えて溶解し、ロータリーエバポレーターにて脱溶剤し、フラスコ内壁に脂質の薄膜を形成した。減圧下にて溶剤除去を十分に行い、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水液３０ｍＬを加えて分散し、さらに超音波洗浄器にて５分間処理を行いリポソーム溶液とした。
得られたリポソーム溶液を室温にて１か月間放置した。１か月後のリポソーム溶液の分散状態は、目視では変化が認められず、均一なリポソーム溶液であった。
【０１０１】
比較例７
比較例１で得たモノメチルポリオキシエチレンサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いて、実施例９と同様の評価を行った。その結果、リポソーム溶液は均一ではなく、脂質粒子が沈降していた。
【０１０２】
実施例１０
カルボキシメチルポリオキシエチレン（平均分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いたアスパラギナーゼの修飾
実施例２と同様にして得られたカルボキシメチルポリオキシエチレンサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン５ｇをクロロホルム５０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．１２ｇを添加し、少量のクロロホルムに溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド０．２５ｇを添加して室温にて２時間撹拌した。その後濾過して不溶物を除去した溶液にジエチルエーテルを添加し、析出した結晶を濾過して得た。減圧にて溶剤を除去し、次の工程に用いた。
アスパラギナーゼ０．１ｇをｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水液５０ｍＬに溶解し、上記で得られたサクシンイミジルカルボキシメチルポリオキシエチレンサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを添加し、５℃で４時間撹拌した。この反応液を、ｐＨ７．４、４℃のリン酸緩衝生理食塩水液に対して透析して未反応物を除去し、その後凍結乾燥し、カルボキシメチルポリオキシエチレン（平均分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンがアスパラギナーゼに結合した乾燥品を得た。
Claims (17)
- 下記工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含む方法で製造されたポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であって、モノアシルリン脂質体の含有量が３重量％以下である下記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
（Ａ）：下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、脱水縮合剤の存在下に、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させるか、または
下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させる工程
（Ｂ）：工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９に調整する工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）の後に脱水剤を用いて脱水する工程
（Ｄ）：工程（Ｃ）の後に炭素数５〜９の脂肪族炭化水素またはエーテルを用いて精製を行う工程
- ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が、工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の順で行った後、さらに下記工程（Ｅ）、（Ｆ）の順で行って製造されたものである請求項１記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
（Ｅ）：アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤を用いて精製を行う工程
（Ｆ）：クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒と、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒とを用いて精製を行う工程 - ｐが０、Ｙがメチル基であり、モノアシルリン脂質体の含有量が０．５重量％以下である請求項１または２記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
- 請求項１ないし３のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む界面活性剤。
- 請求項１ないし３のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含むリポソーム形成剤。
- 請求項１ないし３のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の両親媒性化学修飾剤。
- 請求項１ないし３のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の乳化剤。
- 下記工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含む請求項１または３記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法。
（Ａ）：下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、脱水縮合剤の存在下に、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させるか、または
下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させる工程
（Ｂ）：工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９に調整する工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）の後に脱水剤を用いて脱水する工程
（Ｄ）：工程（Ｃ）の後に炭素数５〜９の脂肪族炭化水素またはエーテルを用いて精製を行う工程
- Ｒ1およびＲ2が炭素数１２〜２０のアシル基である請求項８記載の製造方法。
- ｐが０、Ｙがメチル基である請求項８または９記載の製造方法。
- 工程（Ａ）で使用する緩衝液がリン酸緩衝液または炭酸緩衝液、有機溶媒がクロロホルム、トルエンまたは酢酸エチルである請求項８ないし１０のいずれかに記載の製造方法。
- 工程（Ｃ）で使用する脱水剤が無機ナトリウム塩または無機カリウム塩の無水物である請求項８ないし１１のいずれかに記載の製造方法。
- 工程（Ｄ）の後に、下記工程（Ｅ）を行う請求項８ないし１２のいずれかに記載の製造方法。
（Ｅ）：アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤を用いて精製を行う工程 - 工程（Ｄ）または工程（Ｅ）の後に、下記工程（Ｆ）を行う請求項８ないし１３のいずれかに記載の製造方法。
（Ｆ）：クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒と、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒とを用いて精製を行う工程 - 工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の順で行った後、さらに工程（Ｅ）、（Ｆ）の順で行う請求項１４記載の製造方法。
- 工程（Ｆ）を行った後、工程（Ｅ）を行う請求項１４記載の製造方法。
- モノアシルリン脂質体の含有量が２重量％以下である請求項８ないし１６のいずれかに記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000227544A JP4710109B2 (ja) | 2000-07-24 | 2000-07-24 | ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000227544A JP4710109B2 (ja) | 2000-07-24 | 2000-07-24 | ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002037883A JP2002037883A (ja) | 2002-02-06 |
| JP4710109B2 true JP4710109B2 (ja) | 2011-06-29 |
Family
ID=18720972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000227544A Expired - Lifetime JP4710109B2 (ja) | 2000-07-24 | 2000-07-24 | ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4710109B2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1243759C (zh) * | 2001-03-02 | 2006-03-01 | 日本油脂株式会社 | 聚亚烷基氧改性的磷脂及其制备方法 |
| US7198945B2 (en) | 2001-08-09 | 2007-04-03 | Teruyuki Nagamune | Cell having modified cell membrane |
| JP2005170928A (ja) * | 2003-10-21 | 2005-06-30 | Konica Minolta Medical & Graphic Inc | リポソーム含有ｘ線造影剤およびその製造方法 |
| JP2005170923A (ja) * | 2003-10-21 | 2005-06-30 | Konica Minolta Medical & Graphic Inc | リポソーム含有ｘ線造影剤およびその製造方法 |
| JP2005220034A (ja) * | 2004-02-03 | 2005-08-18 | Konica Minolta Medical & Graphic Inc | Ｘ線検査用造影剤の製造方法 |
| JP4654590B2 (ja) * | 2004-03-31 | 2011-03-23 | コニカミノルタエムジー株式会社 | Ｘ線ｃｔ用造影組成物およびその製造方法 |
| WO2006009022A1 (ja) * | 2004-07-21 | 2006-01-26 | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | リポソーム含有ｘ線造影剤およびその製造方法 |
| EP1776948B1 (en) * | 2004-08-11 | 2015-12-09 | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | Method of producing liposome-containing preparation |
| US20090202619A1 (en) * | 2005-02-18 | 2009-08-13 | The University Of Tokushima | Polyoxyalkylene chain-containing lipid derivative and lipid film structure containing such derivative |
| CN114685778B (zh) * | 2020-12-30 | 2023-10-17 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 长循环阳离子脂质体的合成方法 |
| WO2024185762A1 (ja) * | 2023-03-07 | 2024-09-12 | 日油株式会社 | ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000198731A (ja) * | 1998-10-29 | 2000-07-18 | Sankyo Co Ltd | 毒性の低減されたリポソ―ム |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3620059B2 (ja) * | 1994-03-04 | 2005-02-16 | 日本油脂株式会社 | 反応性小胞体、形成剤および機能性物質固定化小胞体 |
| JP3831958B2 (ja) * | 1995-09-20 | 2006-10-11 | 日本油脂株式会社 | リポソーム用混合脂質及びリポソーム分散液 |
-
2000
- 2000-07-24 JP JP2000227544A patent/JP4710109B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000198731A (ja) * | 1998-10-29 | 2000-07-18 | Sankyo Co Ltd | 毒性の低減されたリポソ―ム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002037883A (ja) | 2002-02-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1241172B1 (en) | Polyalkylene oxide-modified phospholipid and production method thereof | |
| JP4710109B2 (ja) | ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、その製造方法および用途 | |
| JPS6320436B2 (ja) | ||
| IL147564A (en) | Neutral lipopolymer and liposomal preparations containing it | |
| JP4480402B2 (ja) | リン脂質誘導体 | |
| JP4540287B2 (ja) | ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法 | |
| JP5093547B2 (ja) | 両イオン性脂質およびその用途 | |
| MX2007007442A (es) | Modificadores de superficie de (polialcoxi)sulfonato. | |
| JP2001515082A (ja) | リン脂質類似化合物 | |
| JPH0418061A (ja) | ペプチド誘導体両親媒性化合物、その中間体、ペプチド誘導体両親媒性化合物を用いたリポソームおよび薄膜 | |
| JP4403303B2 (ja) | リン脂質誘導体及びその製造方法 | |
| JPH07165770A (ja) | リン脂質誘導体 | |
| JP4526479B2 (ja) | リン脂質誘導体 | |
| JP3130135B2 (ja) | リン脂質小胞体用安定化剤 | |
| JP3085485B2 (ja) | オリゴサッカライド誘導体 | |
| JP3220241B2 (ja) | リン脂質小胞体用安定化剤 | |
| JP3590983B2 (ja) | リン脂質誘導体 | |
| JP3529058B2 (ja) | アミノ酸型糖脂質及び小胞体安定化剤 | |
| CN114945668A (zh) | 用于核酸递送的烷基化核苷及其组合物和方法 | |
| CN117919201A (zh) | 一种脂质组合物及其制备方法和应用 | |
| JPH07165771A (ja) | 反応性小胞体および形成剤 | |
| JPH04364121A (ja) | リポソーム製剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070712 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20100730 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100817 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101015 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110222 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110307 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |