JP3529058B2 - アミノ酸型糖脂質及び小胞体安定化剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、低コストで大量に合成
できる構造の明確なアミノ酸型糖脂質に関するものであ
り、当該糖脂質をリン脂質小胞体の二分子膜中に導入す
ることによって小胞体の分散状態を安定化させることが
できる。従って、本発明は医薬、食品、化粧品、界面活
性剤の各分野において広く利用できる。

【０００２】周知の通り、糖脂質の利用分野は、その両
親媒性や糖鎖構造に由来する諸機能を生かして、医薬、
化粧品、バイオテクノロジー、機能性食品、環境保全な
ど広範囲にわたっている。例えば、界面活性を利用して
クリームなどのエマルション形成に用いられている。ま
た、化合物の分離精製に用いるＨＰＬＣの充填剤に糖脂
質糖鎖自体が有する分子認識能を利用する試みも行われ
ている。

【０００３】さらに糖脂質を、リン脂質を主成分とした
二分子膜小胞体( リポソーム) の二分子膜に導入する用
途開発が行われており、特に小胞体はその内水相に種々
の水溶性の機能物質を内包させたり、膜中に脂溶性機能
物質を包埋させることができ、しかも、生体適合性が高
く毒性が低いため、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤ
Ｓ）や保湿性を生かした化粧品、徐放剤などへの応用が
試みられているが、この小胞体の表面を糖鎖にて修飾す
ることにより、血中滞留時間制御、放出制御、ターゲッ
ティングや各種生理活性などの機能性付与が期待でき
る。

【０００４】本発明者らは小胞体の応用において問題と
なる凝集・融合などの不安定性を解決するための一手段
として、合成糖脂質を二分子膜の一成分として導入し、
小胞体表面を糖修飾することが有効であることを明らか
にしている（特開平１−２９４７０１号公報、特開平５
−２９４９８３号公報、および特開平５−３１７６７７
号公報）。

【０００５】

【従来の技術】リン脂質小胞体が外部刺激によって凝集
・融合したり、内包物を漏出する現象や静脈内投与した
場合に細網内皮系（ＲＥＳ）に捕捉されて速やかに血流
中から排除される現象を回避するために、リン脂質小胞
体表面を改質する技術が数多く提案されている。

【０００６】例えば、負に帯電したリン脂質小胞体にカ
ルシウムイオンを添加すると直ちに凝集するが、天然の
オリゴ糖脂質であるトリヘキソシルセラミドを膜成分と
して導入することによって、糖鎖の立体障害により凝集
が抑制されることが報告されている(D.Hoekstra & N.Du
zgunes, Biochemistry 25, 1321 (1986)) 。また、ガン
グリオシド（ＧＭ１）を小胞体に導入することによって
細網内皮系への捕捉が抑制されて血中滞留時間が延長さ
れることが報告されている(T.M.Allen et al,FEBS Let
t., 223, 42 (1987) )。また、疎水部のセラミド部位に
存在するアミド基や水酸基はリン脂質膜の親疎水界面付
近に存在し、膜中の隣接する脂質と水素結合することに
よって高い親和性を示して安定に導入されることが知ら
れている。また、オリゴ糖鎖は小胞体表面から２５Å伸
び、１０Åの位置に負電荷が存在しているが、このと
き、オリゴ糖鎖の立体障害によって負電荷が遮蔽されて
いることが重要であるとされている（岩森、細胞工学
5, 566 (1986)））。しかし、これらの糖脂質は、生体
からの抽出物であるために量産が困難という問題があ
る。

【０００７】天然の糖脂質の機能が明らかにされるにつ
れ、天然糖脂質の合成法の開発が行われるようになった
( 木曽、長谷川，油化学 40, 28 (1991)) 。しかし、糖
鎖に保護基の導入、脱保護など煩雑な反応工程が必要で
あることや疎水性基であるセラミドの合成も困難である
ことから、やはり糖脂質の量産には不向きであるという
問題がある。なお、ＳＰセラミドと称するセラミドと類
似構造の疎水性基が開発され、化粧品分野で使用されて
いる例もあるが、糖鎖は結合していない。

【０００８】また、ホスファチジルエタノールアミンに
還元性末端基を有する生体由来のオリゴ糖鎖を添加して
シッフ塩基を形成させてNaBH₄ などで還元してオリゴ糖
脂質を合成する方法が生化学の分野で広く用いられてい
るが、ホスファチジルエタノールアミンが高価であるた
め量産に適さないという問題がある(M.S.Stoll, T. Miz
oguchi, et al., Biochem. J., 256, 661 (1988)) 。

【０００９】また、シュガーエステルは合成法が確立さ
れている上に安全性も十分に確認されているため広く食
品の添加剤として利用されているが、反応部位が特定さ
れておらず、種々の異性体が存在して構造が不明瞭であ
ると共に、リン脂質小胞体の二分子膜中に一成分として
導入しても安定化効果は得られていない。

【００１０】小胞体の凝集・融合の抑制は、オリゴ糖鎖
の立体障害によるものであり、細胞表面に存在する構造
の複雑なオリゴ糖鎖に限らず、澱粉を解重合して得られ
るグルカンのような単純な構造のオリゴ糖鎖でも、小胞
体表面に固定されると小胞体の凝集抑制能を示す(S. Ta
keoka, et al., J.Colloid & Interface Sci., 152,351
(1992)) 。オリゴ糖鎖に脂肪酸をエステル結合させて
得られるオリゴ糖脂質は、合成が簡便である( 特開平１
−２９４７０１号公報) ものの、構造が不明瞭で種々の
異性体を生じるためその分離が困難であること、また異
性体によって小胞体凝集に対する効果が異なることなど
が問題とされている。

【００１１】グルカン骨格の糖鎖の水酸基をアセチル基
で保護してトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホ
ン酸で末端アノマー位のみを活性化させ、これにジアル
キルグリセロールなどの水酸基を有する疎水性基をエー
テル結合させ、最終的にアセチル基を脱保護して糖脂質
を得る方法が知られている(T.Ogawa, et al., Carbohyd
rate Res.,93, C6 (1981))。この方法では、糖鎖と疎水
性基がグリセロールを介して結合した構造明確な糖脂質
を得ることができる。同様の方法で、本発明者らは、マ
ルトペンタオースからオリゴ糖脂質(1,2-di-O-octadecy
l-3-O-α( β)-maltopentaosyl-rac-glycerol)を合成
し、これを小胞体に導入すると高い導入率と優れた凝集
抑制能を示すことを確認している(S. Takeoka, et al.,
Chem. Lett., 1977 (1992))が、反応率が低く、保護基
の導入や反応雰囲気の厳密な制御、ＨＰＬＣによる精製
を必要とし、大量合成にはさらなる改良を要する( 特開
平５−２９４９８３号公報) 。

【００１２】オリゴ糖鎖末端アノマー位を臭素酸酸化し
てカルボン酸とし、ラクトン化を経て疎水性基を結合さ
せる方法により構造明確なオリゴ糖脂質が合成できる。
Denkinger らは、マルトースからマルトヘキサオースま
での一連のオリゴ糖をラクトン化したあと、種々の長鎖
アルキルアミンをアミド結合させた糖脂質を合成し、界
面活性剤としての物理化学的特性を調べている(Colloid
& Polymer Sci., 268, 513 (1990)) 。本発明者らもマ
ルトペンタオースラクトンにヘキサデシルアミンを反応
させて得られるヘキサデシルマルトペンタオンアミド
（ＨＤＭＰＡ）をはじめとする一連のアミド結合型オリ
ゴ糖脂質、および、ラクトンを開裂した四級アンモニウ
ム塩とハロゲン化アルキルとの反応で得られるエステル
結合型のオリゴ糖脂質が、小胞体の凝集抑制能、凍結融
解や凍結乾燥に対する安定化効果を有することを報告し
た(H. Sakai, et al., Chem. Lett., 1891 (1993) 、特
開平５−３１７６７７号、および特願平５−２０６９７
０号公報) 。しかし、オリゴ糖鎖に一本のアルキル鎖が
導入された構造は、親水性が高いため未反応の糖との分
離が困難になる場合がある。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】前記の通り、構造が明
確な糖脂質の合成法が幾つか確立されてはいるが、より
精製工程が簡便で生産性が高く、また二本の疎水性基が
導入された構造により、従来の一本のアルキル鎖が結合
したオリゴ糖脂質よりも疎水性が高く、二分子膜内に安
定に導入できる構造のオリゴ糖脂質が望まれている。隣
接脂質分子との親和性が高く、小胞体安定化効果に優れ
るオリゴ糖脂質が量産可能となれば、医薬品業界や化粧
品業界への影響は大きく、様々な実用への道が期待でき
る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、糖単位数２〜
５０である糖末端のアルドースのアノマー位にアミノ酸
のアミノ基が結合していると共に、二本の疎水性基がア
ミノ酸のアミノ基あるいはカルボン酸基に導入されてい
る構造のアミノ酸型糖脂質及び該アミノ酸型糖脂質から
なるリン脂質小胞体安定化剤である。

【００１５】本発明に係るアミノ酸型糖脂質は、反応部
位が限定されるため保護基を導入せずとも単一体のみの
生成であるので高収率で得られることから、低コストで
大量合成でき、また、アルキル鎖が二本鎖であるため疎
水性が高いので、リン脂質小胞体の二分子膜中に安定に
導入できる。

【００１６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
係るアミノ酸型糖脂質の原料となる糖は、糖鎖末端にア
ルドースをもつ糖単位数２〜５０の整数で示される糖で
ある。好ましくは糖鎖末端にアルドースをもつ糖単位数
５〜２０の整数で示されるオリゴ糖がよい。糖鎖は、グ
ルカン、フルクタン、キシラン、ガラクタン、マンナ
ン、キチン、キトサン系列の糖のほか、結合様式が異な
った糖でもよい。アルドースとアミノ酸との結合様式と
しては、アミド結合による導入やシッフ塩基による結合
を−ＣＨ₂ −ＮＨ−に還元する結合などがある。

【００１７】糖とアミノ酸をアミド結合させる場合に
は、糖鎖末端のアルドースを臭素酸酸化、ヨウ素酸酸
化、電解酸化、などによってカルボン酸塩とした後、イ
オン交換樹脂や透析によって脱塩してプロトン化し、溶
媒を減圧留去、加熱乾燥を経て、分子内エステルを形成
させてラクトン型とする。この糖鎖のラクトン部位にア
ミノ酸のアミノ基を反応させてアミド結合を得る。

【００１８】ここでいうアミノ酸は、カルボン酸基およ
びアミノ基を合わせて３つ以上あることが要求される。
うち１つのアミノ基は糖鎖末端のアルドースと結合し、
他のアミノ基またはカルボン酸基は疎水性基と結合す
る。アミノ酸はα、β、γ、δ型、またこれらのペプチ
ド、ポリペプチドなどどれも可能であるが、好ましくは
α- アミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、
リジンおよびアルギニンなどが経済的に用いられる。

【００１９】アミノ酸のカルボン酸基にエステル結合に
よって疎水性基を導入する反応剤としては、炭素数１２
−２２個の第一および第二ハロゲン化アルキルがあり、
直鎖第一ハロゲン化アルキルとしてはラウリルクロライ
ド、セチルブロマイド、ステアリルブロマイド、ベヘニ
ルヨーダイドなどがあり、直鎖第一不飽和ハロゲン化ア
ルキルとしてはオレイルブロマイド、リノレニルヨーダ
イドなどがある。また、分岐第一飽和ハロゲン化アルキ
ル、あるいは第二不飽和ハロゲン化アルキルなども用い
られる。また、前記直鎖状の反応剤のほかにステロール
があり、ハロゲン化コレステリルなどが用いられる。ア
ミノ酸のカルボン酸の対カチオンをテトラアルキルアン
モニウムイオンとし、上記ハロゲン化物を反応させる
と、疎水性基がアミノ酸部位に導入される。

【００２０】また、アミノ酸のカルボン酸基にエステル
結合により疎水性基を導入する別の方法として、水酸基
を有する疎水性物質をアミノ酸と混合し脱水反応により
エステル結合させる方法があるが、このときの水酸基を
有する疎水性物質としては、炭素数１２−２２個の第一
および第二長鎖アルコールがあり、直鎖第一アルコール
としては、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ス
テアリルアルコール、ベヘニルアルコールなどがあり、
直鎖第一不飽和アルコールとしてはオレイルアルコー
ル、リノレニルアルコールなどがある。また、分岐第一
飽和アルコールあるいは第二不飽和アルコールなどがあ
り、ステロールとしてはコレステロールがある。

【００２１】また、脱水反応によりアミノ酸のカルボン
酸基にアミド結合により疎水性基を導入する反応剤とし
ては、炭素数１２−２２個の第一および第二アルキルア
ミンが用いられ、直鎖第一アルキルアミンとしては、ラ
ウリルアミン、セチルアミン、ステアリルアミン、ベヘ
ニルアミンなどがあり、直鎖第一不飽和アルキルアミン
としてはオレイルアミン、リノレニルアミンなどがあ
る。また、分岐第一飽和アルキルアミンあるいは第二不
飽和アルキルアミンなどが用いられる。また、反応剤と
してコレステリルアミンなどのステロールも用いること
ができる。

【００２２】また、アミノ酸のアミノ基でアミド結合さ
せることにより疎水性基を導入する場合の反応剤として
は、炭素数１２−２２個の脂肪酸のハロゲン化物があ
り、ラウリン酸クロライド、ミリスチン酸クロライド、
ペンタデカン酸ブロマイド、パルミチン酸クロライド、
アラキン酸クロライド、マーガリン酸クロライド、ステ
アリン酸クロライド、ノナデカン酸クロライド、ベヘン
酸クロライド等が挙げられ、その他オレイン酸ブロマイ
ド、リノール酸クロライド、リノレン酸ブロマイド等で
知られる直鎖不飽和脂肪酸ハロゲン化物やあるいはミコ
ール酸ブロマイドなどの分岐脂肪酸、分岐不飽和脂肪酸
ハロゲン化物などがある。これら脂肪酸ハロゲン化物を
アミノ酸のアミノ基と反応させることにより疎水性基を
導入する。残りのアミノ基をラクトン化糖と反応させて
アミド結合させる。

【００２３】また、糖がアミノ酸と−ＣＨ₂ −ＮＨ−で
結合した糖脂質の場合には、上記方法によりアミノ基が
一つ残るようにアミノ酸に疎水性基を二本結合させ、得
られた脂質をクロロホルム／メタノール／水の混合溶媒
に分散させる。これに末端アルドースの糖を添加してア
ミノ酸アミノ基と糖鎖末端アルドースをシッフ塩基で結
合させる。更に水素化ホウ素ナトリウムやシアノ水素化
ホウ素ナトリウムなどの還元剤で還元させ、結合を（糖
−ＣＨ₂ −ＮＨ−アミノ酸) とする。また、小胞体の表
面に糖鎖を結合させる方法もある。アミノ酸の一つのア
ミノ基を残し、他の残基に疎水性基を二本結合して得ら
れる両親媒性分子を小胞体膜の一成分としておき、これ
に末端アルドースの糖を添加して小胞体表面に存在する
アミノ基にシッフ塩基で結合させる。更に同様の還元剤
を用いて還元させて、結合を（糖−ＣＨ₂ −ＮＨ−アミ
ノ酸) とする。

【００２４】

【作用】本発明に係るアミノ酸型糖脂質は、構造の明確
な糖脂質であり、合成に当たっては結合部位と結合様式
が自ずと限定されるために保護基を必要としない。ま
た、比較的安価な原料を用いて合成でき、反応率が高
く、原料や副生物との溶解性が大きく異なるため精製が
容易である。二本の疎水性基が結合していることでリン
脂質小胞体の二分子膜にこれまで以上に安定に導入する
ことができる。

【００２５】また、本発明に係るアミノ酸型糖脂質は、
リン脂質小胞体凝集防止、膜融合防止、特定抗体による
認識用ラベル化、生体内での貪食抑制などに応じての使
い分けが可能である。しかもいずれも少量の添加で十分
に有効であり、リン脂質小胞体の基本的な物性は変化さ
せない。

【００２６】リン脂質小胞体は、その構成分子のゲル−
液晶相転移温度以下での静置や、カルシウムイオンや、
デキストラン、ポリエチレングリコールなどの水溶性高
分子の添加、アルコールなどの有機溶媒の添加で凝集・
融合し、内包物の漏出を認める。同様の現象は血漿蛋白
質との相互作用でも誘起される。しかし、本発明に係る
アミノ酸型糖脂質で小胞体表面を修飾することにより、
このような不安定化を抑制することができる。

【００２７】リン脂質小胞体の内水相に機能性分子を包
含してこれを運搬体として生体投与した場合、血中滞留
時間が長いほど有効性が高くなるが、リン脂質小胞体は
血漿中に存在する蛋白質やカルシウムイオンなどとの相
互作用により凝集し、細網内皮系や貪食細胞へのとりこ
みにより短時間で血中より除外される。本発明に係るア
ミノ酸型糖脂質による表面修飾により、血中滞留時間を
制御することができる。また、リン脂質小胞体は疎水性
相互作用により脂質分子が集合して形成した比較的不安
定な構造であるために、そのままでは長期保存すること
ができない。しかし、本発明に係るアミノ酸型糖脂質の
導入により、凍結融解や凍結乾燥が可能となり、またそ
の性能は従来の糖脂質との比較でも優れた効果が得られ
る。

【００２８】

【実施例】以下、本発明を実施例並びに比較例を挙げて
より詳しく説明する。 実施例１ （アミノ酸型糖脂質の合成）マルトペンタオース（２
３．０ｇ）と炭酸カルシウム（６．６７ｇ）を純水１２
０ｍｌに分散させ、２５℃で撹拌しながら臭素水溶液
（８．８ｇ／３４０ｍｌ水）を徐々に添加した。６時間
後、薄層クロマトグラフィー( シリカゲル６０：商品
名、Ｍｅｒｃｋ社、展開溶媒 クロロホルム／メタノー
ル／水／酢酸＝３／４／２／１）ではマルトペンタオー
スのスポット（Ｒｆ＝０．４）が消失し、末端カルボン
酸塩のスポット（Ｒｆ＝０．２４）のみになり、末端ア
ルドースの酸化反応が完了した。濾過により炭酸カルシ
ウムを除去後、炭酸銀（１８．０ｇ）を添加し、遮光下
２時間撹拌して、溶存する臭素イオンを臭化銀として不
溶化して除去した。更にＨ＋型陽イオン交換樹脂(Amber
lite IR-120B) により末端をカルボン酸型とした。得ら
れた水溶液を凍結乾燥、更に８０℃にて真空乾燥を８時
間した。ＴＬＣではＲｆ値０．２４が乾燥とともに減少
し、Ｒｆ値０．４１のラクトン型のスポットのみになっ
た。ＩＲスペクトルでは、１７４０ｃｍ^-1にエステル結
合由来のＣ＝Ｏ逆対称伸縮のピークの出現と、¹³Ｃ−Ｎ
ＭＲ（溶媒: 重ＤＭＳＯ）では、カルボン酸由来のピー
ク（１７４．５ｐｐｍ）の消失とラクトンの炭素由来の
ピーク（１７１．５ｐｐｍ）の出現から、カルボン酸が
ラクトン化したことを確認した。マルトペンタオースラ
クトンは１８ｇ得られた（収率：７８％）。

【００２９】グルタミン酸( 関東化学５．７ｇ，３８．
８ｍｍｏｌ）を７９２ｍｌのテトラブチルアンモニウム
ハイドロオキサイドのベンゼン／メタノール溶液（０．
１Ｎ，関東化学）にて中和してグルタミン酸テトラブチ
ルアンモニウム塩（以下Ｇｌｕ−（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）₂ 塩と
略す）２２．６ｇを得た（収率９２％）。このＧｌｕ−
（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）₂ 塩２２．６ｇ（３６ｍｍｏｌ）および
マルトペンタオースラクトン（１８ｇ，２２ｍｍｏｌ）
をＤＭＦ（１５０ｍｌ）に溶解させ、７０℃にて１６時
間撹拌した。反応の進行は、ＴＬＣ（展開溶媒：クロロ
ホルム／メタノール／水＝３／４／１）にてマルトペン
タオースラクトンのスポット（Ｒｆ＝０．４１）の消失
と、アミド結合して得られたマルトペンタオース−グル
タミン酸塩のスポット（Ｒｆ＝０．２０）の生成から確
認した。７０℃にて減圧留去して濃縮後、アセトンへの
再沈精製を二度繰り返し、真空乾燥してマルトペンタオ
ース−Ｇｌｕ−（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）₂ 塩（２８ｇ，収率８８
％）を得た。ＩＲスペクトルでは、１６３７ｃｍ^-1のア
ミド結合由来のＣ＝Ｏ逆対称伸縮が確認された。

【００３０】マルトペンタオース−Ｇｌｕ−（Ｂｕ₄ Ｎ
⁺ ）₂ 塩（２８ｇ，１９ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌのＤＭ
Ｆに溶解させ、これに１−ブロモテトラデカン（４２ｍ
ｌ，８０ｍｍｏｌ）を加え、６５℃にて８時間撹拌し
た。反応の進行は、ＴＬＣ（展開溶媒：クロロホルム／
メタノール／水／酢酸＝３／４／２／１）にて、原料の
スポット（Ｒｆ＝０．１）、一本のアルキル鎖が導入さ
れた型のスポット（Ｒｆ＝０．４５）の消失と、O1,O5-
ditetradecyl-N-maltopentaonoyl-L-glutamateのスポッ
ト（Ｒｆ＝０．７）の出現から確認した。減圧留去によ
り濃縮後、アセトン再沈し、Ｒｆ＝０．９に出現する未
反応の１−ブロモテトラデカンをアセトン層に抽出除去
した後、真空乾燥して目的とするアミノ酸型糖脂質であ
るO1,O5-ditetradecyl-N-maltopentaonoyl-L-glutamate
（以下「ＤＴＭＰＧｌｕ」と略す）２２ｇを得た（収率
９０％）。

【００３１】（リン脂質小胞体の調製）1,2-Dipalmitoy
l-sn-glycero-3-phosphorylcholine（以下、「ＤＰＰ
Ｃ」と略す），コレステロール、パルミチン酸、および
前記ＤＴＭＰＧｌｕを、モル比で７／７／２／１．５の
割合で５ｇ秤量し、メタノール／クロロホルム（１／１
ｖｏｌ比）の混合溶媒約５０ｍｌに溶解させた。この溶
液を１リットル容量のナス型フラスコに溶解させ、ロー
タリーエバポレータを用いて内壁に薄膜を形成せしめ
た。これを更に真空乾燥して溶媒を完全に除去後、４０
ｍｇ／ｄｌ濃度の中性インスリン水溶液（１０ｍＭ−リ
ン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を添加し、４℃にて１２時間
撹拌、水和させた。得られたインスリン内包小胞体分散
液を、エクストルージョン法により最終的に孔径０．２
μm のポリカーボネート製メンブランフィルター(Milli
pore製) に透過させることにより、平均粒径２０５±４
０ｎｍに制御した。超遠心分離（ Beckman L8-80M,２０
万ｇ、３０分）操作を２回行って、外水相の未内包のイ
ンスリンを除去し、総脂質濃度を５ｇ／ｄｌとした。遠
心分離して得られる上澄の糖成分をフェノール硫酸法で
定量したところ、糖は殆ど検出されず、ＤＴＭＰＧｌｕ
は９９％二分子膜中に導入されたことが確認された。ま
た、対照試料として、ＤＴＭＰＧｌｕを二分子膜に含ま
ないインスリン内包小胞体を調製した。

【００３２】このインスリン内包ＤＴＭＰＧｌｕ修飾小
胞体分散液０．５ｍｌを、ヒト血漿３ｍｌと混合して３
７℃にて静置した。ＤＴＭＰＧｌｕ修飾系では、１時間
経過後も溶液の状態には変化は認められず凝集体形成も
確認されなかった。一方、ＤＴＭＰＧｌｕ修飾していな
い系では、１５分後には目で確認できる凝集体が出現
し、１時間後には凝集体の殆どが沈澱した。従って、Ｄ
ＴＭＰＧｌｕには血漿中での小胞体凝集抑制効果がある
ことが確認された。次に、血中動態を調べることを目的
とし小胞体をラベルするため、膜成分として1,2-di[1-1
4C]palmitoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine を５％
含む小胞体を同様の方法により調製した。これをマウス
( 雄) に、脂質量で４００μｇ／匹の小胞体分散液を尾
静脈投与した（ｎ＝１０）。経時的に血中放射能濃度を
測定し、半減期を得た。ＤＴＭＰＧｌｕ修飾していない
系では半減期は約２時間であったが、ＤＴＭＰＧｌｕ修
飾系では、約８時間にまで延長された。

【００３３】比較例１ 対照試料として、アルキル鎖が一本結合したオリゴ糖脂
質、N-hexadecylmaltopentaonamide（以下、ＨＤＭＰＡ
と略す) を二分子膜に導入したインスリン内包小胞体を
調製し、実施例１記載の方法で血漿中での分散安定度試
験を行った。ＨＤＭＰＡ修飾系は３７℃で静置を開始し
て２０分後に凝集体が確認されはじめ、１時間後には一
部沈澱している小胞体が確認された。１時間経過後、糖
修飾した小胞体を遠心分離して回収して再分散させ、リ
ン脂質濃度と糖定量から小胞体から抜け出たＨＤＭＰＡ
の量を測定したところ、血漿と混合する前と比較して、
約１８％が小胞体から消失していた。一方、実施例１で
調製したＤＴＭＰＧｌｕ修飾系についても同様にして小
胞体から抜け出たＤＴＭＰＧｌｕの量を測定したところ
消失量は約３％であった。従って血漿中での分散安定度
は、アルキル二本鎖型のＤＴＭＰＧｌｕの方が一本鎖型
のＨＤＭＰＡよりも小胞体安定化効果が高いことが判
る。また、同様の方法により血中での半減期を観察した
ところ、アルキル一本鎖型のＨＤＭＰＡ系は約４時間で
あるのに対し、アルキル二本鎖型のＤＴＭＰＧｌｕ系は
約８時間であるので、血中でも一本鎖型よりも二本鎖型
が小胞体安定化効果に優れていることが確認できた。

【００３４】実施例２ （アミノ酸型糖脂質の合成）マルトオリゴ糖（サンオリ
ゴ５，６：商品名、参松工業（株）、マルトペンタオー
スとマルトヘキサオースを７０％以上含む）２．０ｇを
実施例１と同様の臭素を使用する方法により酸化した。
ＴＬＣ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水／酢
酸＝３／４／２／１）では、サンオリゴ５，６のスポッ
ト（Ｒｆ＝０．４１）が消失し、カルボン酸塩型のスポ
ット（Ｒｆ＝０．２６）のみが認められ、反応の終了を
確認した。炭酸銀、陽イオン交換樹脂を用いて脱塩した
あと、凍結乾燥、加熱乾燥（８０℃、５時間）を経て、
マルトオリゴ糖ラクトンを得た（１．８ｇ、収率９０
％）。

【００３５】Ｎ−ドデカノイル−Ｌ−リジン（AMIHOPE
LL：商品名、味の素）１０ｇにテトラブチルアンモニウ
ムハイドロオキサイドのベンゼン／メタノール溶液
（０．１Ｎ、関東化学）を２６ｍｌ加え、２５℃にて1
時間撹拌した。減圧乾固してＮ−ドデカノイル−Ｌ−リ
ジンのテトラブチルアンモニウム塩を得た。これを１０
０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、マルトオリゴ糖ラクトンを
２１ｇ添加して７０℃にて５時間撹拌した。反応の進行
は、ＴＬＣ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水
＝３／４／１）にて、Ｎ−ドデカノイル−Ｌ−リジンが
マルトオリゴ糖に結合した型のスポット（Ｒｆ＝０．５
０）の出現から確認した。反応終了後、更に１−ブロモ
ヘキサデカンを４．３ｇ添加し、リジンのカルボン酸基
にヘキサデシル基を結合させた。反応の進行は、ＴＬＣ
にてＲｆ＝０．７５のスポットから確認した。減圧留去
により濃縮後、アセトンに滴下して再沈し、未反応の長
鎖アルキル基と、副生するテトラブチルアンモニウムブ
ロマイド塩を除去した後、真空乾燥して、目的とするア
ミノ酸型糖脂質である O-hexadecyl-N1-maltooligonoyl
-N5-dodecanoyl-L-lysine （以下ＨＭＤＬと略す）を収
率９０％で得た。ＩＲスペクトルでは、１６３６ｃｍ^-1
のアミド結合由来のＣ＝Ｏ逆対称伸縮と、１７３９ｃｍ
^-1にエステル結合由来のＣ＝Ｏ逆対称伸縮のピークが確
認された。

【００３６】（リン脂質小胞体の調製）ＨＭＤＬの３ｍ
ｇとＤＰＰＣ１００ｍｇを、メタノールに溶解し混合し
た後、ロータリーエバポレーターにて２００ｍｌ容量の
ナス型フラスコの内壁に薄膜を形成させた。５ｍｌの純
水とガラスビーズと共に添加して、ボルテックスにて５
０℃で撹拌して白濁液を得た。この白濁液をエクストル
ーダーにて処理し最終的に孔径０．０５μｍのポリカー
ボネート製フィルター(Nuclepore社) を５回通過させる
ことにより白色透明なＤＰＰＣ小胞体分散液を得た。粒
径分布測定装置(Coultrer, NS 4D) で測定したこの小胞
体の平均粒径は各々５７±１２ｎｍであった。

【００３７】前記小胞体分散液を０．５ｗｔ％に希釈し
た後、ゲル濾過( ファルマシア社製、セファロース CL-
4B, 20mm d × 300mm h) し、小胞体に導入されなかっ
たＨＭＤＬを系外に除去した後、各フラクションの糖を
フェノール−硫酸法によって定量することにより、ＨＭ
ＤＬの小胞体への導入率を測定した。ＨＭＤＬは添加量
の９９．５％が小胞体に取り込まれていた。

【００３８】この小胞体の分散安定性は、４℃静置で８
００ｎｍの吸光度（濁度）の変化を紫外可視分光光度計
（島津社製、MP-2,000）で測定して評価した。ＨＭＤＬ
を導入していないＤＰＰＣ小胞体分散液は直ちに濁度が
上昇しはじめ、吸光度は０．２まで上昇し、小胞体の凝
集が生起していることを示した。一方、ＨＭＤＬを導入
した系では、静置直後０．０３程上昇が認められるがそ
れ以降は殆ど上昇せず、凝集が抑制されていた。従来の
マルトペンタオースにパルミチン酸が一本エステル結合
した糖脂質では、吸光度が０．０６にまで上昇したので
これよりもＨＭＤＬは優れている。また、グリセロール
型の二本鎖のオリゴ糖脂質(1,2-di-O-octadecyl-3-O-α
( β)-maltopentaosyl-rac-glycerol)は吸光度は約０．
０３でＨＭＤＬと同程度であった。

【００３９】実施例３ （アミノ酸型糖脂質の合成）デキストリン( マルトオリ
ゴ糖、平均重合度２０) の末端アノマー炭素を実施例１
と同様にして酸化し、脱塩、脱水を経てデキストリンラ
クトンを得た。Ｌ−アスパラギン酸( 関東化学) にテト
ラエチルアンモニウムハイドロオキサイド２５％水溶液
（関東化学）を二つのカルボン酸に対して等モル添加し
て中和したあと、ロータリーエバポレータにて減圧留
去、加熱乾燥した。実施例１記載の方法と同様に、デキ
ストリンラクトンとＬ−アスパラギン酸テトラエチルア
ンモニウム塩をＤＭＦ中に加熱溶解後、７０℃にて２０
時間撹拌した。減圧留去にて濃縮後、アセトンへの再沈
精製を三度繰り返した後、真空乾燥して、デキストリン
−アスパラギン酸テトラエチルアンモニウム塩を９０％
の収率で得た。ＩＲスペクトルでは、１６３７ｃｍ^-1の
アミド結合由来のＣ＝Ｏ逆対称伸縮の出現が確認され
た。

【００４０】デキストリン−アスパラギン酸テトラエチ
ルアンモニウム塩をＤＭＦに溶解させた。これに１−ブ
ロモオクタデカンを加え、７０℃にて５時間撹拌した。
反応の進行は、ＴＬＣにて、原料のスポット（Ｒｆ＝
０．０５）、一本のアルキル鎖が導入された型のスポッ
ト（Ｒｆ＝０．３０）の消失と、O1,O2-dioctadecyl-N-
maltooligonoyl-L-aspartateのスポット（Ｒｆ＝０．４
５）の出現から確認した。減圧留去により濃縮後、アセ
トンに滴下して再沈精製した後、真空乾燥して目的とす
るアミノ酸型糖脂質であるO1,O2-dioctadecyl-N-maltoo
ligonoyl-L-aspartate（以下「ＤＯＭＯＡｓｐ」と略
す）（糖鎖平均重合度２０）を収率９１％で得た。

【００４１】（リン脂質小胞体の調製）混合脂質（ＤＰ
ＰＣ／コレステロール／ステアリン酸＝７／７／２（モ
ル比）の薄膜に、アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩
を２ｗｔ％含むエタノール／水（４／９６ vol）混合溶
液を添加して水和させ、実施例１記載のエクストルージ
ョン法にて造粒し、平均粒径２０９±３０ｎｍの小胞体
を調製した。０．３Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨ
値を約７．４に調整したあと、遠心濃縮（２０万ｇ，３
０分）により脂質濃度を１ｗｔ％に調節した。この小胞
体分散液２ｍｌにＤＯＭＯＡｓｐの０．１ｗｔ％水溶液
を２ｍｌ添加して３７℃にて１時間撹拌することによ
り、ＤＯＭＯＡｓｐを小胞体二分子膜に導入した。遠心
分離（２０万ｇ，３０分）して上澄を回収し、フェノー
ル硫酸法にて糖の定量を行い、ＤＯＭＯＡｓｐの導入率
を算出したところ、９７％であった。また、紫外可視吸
収スペクトル(Shimadzu MPS-2000) にて上澄のアスコ
ルビン酸リン酸マグネシウム塩を定量したところ、ＤＯ
ＭＯＡｓｐの導入操作で漏出した割合は約１％であっ
た。

【００４２】遠心分離した小胞体を再度４％エタノール
水に分散させて、４０℃にて静置した。ＤＯＭＯＡｓｐ
を導入していない系では、1 日後に粒径が３７２±２３
０ｎｍに増大し、漏出率も４０％と高いが、ＤＯＭＯＡ
ｓｐを導入した系では、３０日後も粒径は２１０±４０
ｎｍで殆ど変化せず、漏出率も５％に抑制された。従っ
て、ＤＯＭＯＡｓｐは小胞体をエタノールに対して安定
化させる効果を有する事が判る。

【００４３】比較例２ 実施例３記載のＤＯＭＯＡｓｐ合成において、１−ブロ
モオクタデカンの添加量を半減させて、一本のアルキル
鎖が導入された型（Ｒｆ＝０．３０）の糖脂質O-octade
cyl-N-maltooligonoyl-L-aspartate（以下ＯＭＯＡｓｐ
と略す）を得た。これを純水に溶解させて０．１ｗｔ％
の水溶液とし、同様の方法によりリン脂質小胞体分散液
に加えて二分子膜中に導入する操作を行った。遠心分離
後の上清中の糖定量から、導入率は４０％であり、ＤＯ
ＭＯＡｓｐに比較してＯＭＯＡｓｐは親水性が高いため
に、安定に導入されない。５％エタノール中４０℃で静
置したところ、２０日後の粒径は３０５±１００ｎｍで
あり、漏出率は１０％であった。アルコールに対する安
定化効果は認められるが、二本鎖型のＤＯＭＯＡｓｐよ
りは低いものであった。

【００４４】実施例４ （アミノ酸型糖脂質の合成）ヘキサデシルアルコールを
ベンゼンに溶解させ、これにグルタミン酸を分散させ
た。パラトルエンスルホン酸を触媒として加え沸点還流
を行い、共沸する水を除去し、脱水反応によってヘキサ
デシルアルコールをグルタミン酸のカルボン酸にエステ
ル結合させ、O1,O5-dihexadecyl-L-glutamate とした。
反応終了後、水洗により未反応のグルタミン酸を除去
し、またヘキサン洗浄により未反応のヘキサデシルアル
コールを除去した。O1,O5-dihexadecyl-L-glutamate と
実施例１記載の方法と同様にして得られたデキストリン
ラクトン（平均糖重合度４０）をＤＭＦ中に加熱溶解
後、７０℃、９時間反応させた。反応の追跡は、ＴＬＣ
（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水＝３／４／
１）にて、O1,O5-dihexadecyl-N-maltooligonoyl-L-glu
tamateのスポット（Ｒｆ＝０．３５）の出現から確認し
た。減圧留去により濃縮後アセトンに滴下して再沈し
た。真空乾燥して目的とするアミノ酸型糖脂質であるO
1,O5-dihexadecyl-N-maltooligonoyl-L-glutamate（以
下ＤＨＭＯＧｌｕと略す）を収率９０％で得た。

【００４５】混合脂質粉末( 水添大豆レシチン／コレス
テロール／ミリスチン酸＝７／７／２モル比）１０．０
ｇに１０ｍＭのカルボキシフルオレセイン( 以下、ＣＦ
と略す）を溶解させた生理食塩水１００ｍｌを添加し
（脂質濃度１０ｗｔ％）、２４時間４℃で撹拌した。こ
れをマイクロフルイダイザー(M-110T マイクロフルイデ
ィクス コーポレーション) で処理し（４５００ｐｓ
ｉ、２０分、４℃）、平均粒径３００±１３０ｎｍの小
胞体分散液を得た。これにＤＨＭＯＧｌｕの０．１ｗｔ
％水溶液を添加して２５℃にて２時間撹拌し、二分子膜
への導入を実施した。実施例３と同様の方法で遠心分離
により未内包ＣＦを除去した。また、ＤＨＭＯＧｌｕの
導入率は９５％であった。再分散により脂質濃度を５ｗ
ｔ％に調節したあと、分散液５ｍｌを液体窒素中に滴下
して粒状に凍結させた。これを１００ｍｌのナス型フラ
スコに入れて、−２０℃にて１Ｔｏｒｒ以下の減圧に保
ち、凍結乾燥させた。最後に温度を４０℃まで上昇させ
て乾燥を完全にし、小胞体粉末を得た。この粉末に純水
５ｍｌを添加して２０分間撹拌して分散させた後、セル
ロースアセテート製フィルター（孔径０．４５μｍ、東
洋濾紙）を透過させた。小胞体の平均粒径は３１０±１
１０ｎｍであり、凍結乾燥前と比較して殆ど変化は認め
られなかった。また、超遠心分離して得られた上澄中の
ＣＦの定量から漏出率を算出したところ、約２％であっ
た。対照試験としてＤＨＭＯＧｌｕを添加せずに同様の
凍結乾燥を行い分散させたところ、粒径、粒径分布共に
大きくなり、２〜５μｍの融合体が光学顕微鏡視野にお
いても多数認められた。更にＣＦの漏出率は８０％であ
った。

【００４６】実施例５ （アミノ酸型糖脂質の合成とリン脂質小胞体の調製）実
施例４記載のＤＨＭＯＧｌｕ合成法と同様の方法によ
り、オクタデシルアルコールをグルタミン酸に結合させ
て、目的とするアミノ酸型脂質である01,05-dioctadecy
l-L-glutamate（以下ＤＯＧｌｕと略す）を得た。実施
例１記載の方法と同様の方法により、ＤＰＰＣ／コレス
テロール／ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
／ＤＯＧｌｕ（７／７／２／１ ｂｙ ｍｏｌ）の混合
脂質薄膜にｐＨ７．０、１０ｍＭ−リン酸緩衝液を添加
し、エクストルージョン法により脂質濃度１ｗｔ％の小
胞体を調製した。この小胞体の平均粒径は２１１±３０
ｎｍであった。これにマルトペンタオースを１ｗｔ％に
なるように分散させて、６０℃にて２時間反応させるこ
とによりマルトペンタオースの末端をＤＯＧｌｕのアミ
ノ基にシッフ塩基の形成により結合させた。これにシア
ノ水素化ホウ素ナトリウム０．２ｇを添加し、６０℃に
て１６時間撹拌することにより還元し、結合を安定化さ
せ、小胞体外面をＤＯＧｌｕにて修飾した。

【００４７】得られた分散液を超遠心分離で洗浄し、再
度分散させた総脂質濃度１ｗｔ％の試料０．５ｍｌを硝
子容器に入れてドライアイス／メタノール寒剤にて凍結
させた後、３７℃の水槽に入れて融解させた。粒径分布
は２０５±４０ｎｍであり、小胞体の形態変化は認めら
れなかった。ＤＯＧｌｕ修飾せずに凍結融解を行った場
合、粒径分布は幅広になり、目視できる凝集体が多数観
測された。従って、マルトペンタオースを小胞体を形成
させてから結合させる方法によって、凍結融解に対する
安定化効果を付与できることが判る。

【００４８】実施例６ （アミノ酸型糖脂質の合成とリン脂質小胞体の調製）実
施例１記載のＤＴＭＰＧｌｕ合成と同様の方法により、
１−ブロモ−２，４−オクタデカジエンをグルタミン酸
に結合させて、目的とする重合性のジエン基を有するア
ミノ酸型糖脂質であるO1,O5-di(2,4-octadecadienyl)-N
-maltopentaonoyl-L-glutamate（以下ＯＭＧｌｕと略
す）を合成した。このＯＭＧｌｕを重合性のリン脂質1,
2-di(2,4-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphoryl
choline と重量比で１／９の割合でベンゼンに混合し、
凍結乾燥をして混合脂質粉末を得た。これに純水を添加
してエクストルージョン法により粒径１０３±１０ｎｍ
の小胞体（１ｗｔ％）を調製した。分散液１０ｍｌを石
英管に入れて充分窒素置換した後、４℃にて低圧水銀ラ
ンプ(Riko 社製 30W) から紫外光照射し、小胞体二分子
膜中のジエン基を重合させた。重合率は、ジエン基由来
の２５０ｎｍ付近の極大吸収の減少から追跡し、１時間
で重合率は９５％に達した。

【００４９】得られたＯＭＧｌｕで修飾した高分子リン
脂質小胞体の分散液を凍結乾燥した粉末状態で保存後、
純水を滴下してゆっくりと撹拌を行ったところ、粉末は
速やかに分散して均一系となった。粒径を測定したとこ
ろ１０５±１２ｎｍであり、形態の変化は無い。また、
血漿との混合では３７℃にて２時間静置しても、溶液の
状態に変化は認められず、粒径は１０２±１５ｎｍで維
持されていた。

【００５０】

【発明の効果】本発明に係るアミノ酸型糖脂質は、構造
の明確なオリゴ糖脂質であり、天然の糖脂質に近く、し
かも合成に当たっては結合部位と結合様式が自ずと限定
されるため保護基を必要とせず、精製工程ではＨＰＬＣ
を用いず、比較的安価な原料を用いて収率高く得ること
ができる。また、合成方法が簡単であるため、誘導体の
合成も幅広く行うことができる。さらに、アルキル鎖が
二本あるために脂質二分子膜中に安定に導入されるの
で、多くの用途が期待されているリン脂質小胞体の安定
化剤として性能的にも経済的にも優れている。従って本
発明は、当業界に貢献するところ甚だ大きいものといえ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｃ 229/26 Ｃ０７Ｈ 15/04 Ｅ Ｃ０７Ｈ 15/04 Ｂ０１Ｊ 13/02 Ｚ (72)発明者 土田 英俊 東京都練馬区関町南２丁目10番10号 (56)参考文献 特開 平６−31153（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−317677（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−294983（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−144140（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−197431（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−49311（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−292301（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−263788（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−255369（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−188274（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−201814（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 9/127 A61K 47/36 B01F 17/56 B01J 13/02 C07C 229/24 C07C 229/26 C07H 15/04

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】糖単位数２〜５０である糖の末端アルドー
   スのアノマー位に、アミノ基及びカルボン酸基を合わせ
   て３つ以上あるアミノ酸のアミノ基が結合されていると
   共に、該アミノ酸の残りのアミノ基、カルボン酸基に炭
   素数１２〜２２のアルキル基、アルケニル基又はステリ
   ル基から選ばれる１種又は２種の二本の疎水性基が導入
   されているアミノ酸型糖脂質からなるリン脂質小胞体安
   定化剤。
2. 【請求項２】糖単位数が５〜２０である請求項１記載の
   リン脂質小胞体安定化剤。
3. 【請求項３】アミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸
   もしくはリジンである請求項１又は２記載のリン脂質小
   胞体安定化剤。