JP4710109B2 - Polyalkylene oxide-modified phospholipid, production method and use thereof - Google Patents

Description

（式（１）中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、Ｒ³は炭素数１〜８の２価の炭化水素基、ｍは０または１、Ｒ⁴Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。Ｍはナトリウムイオンまたはカリウムイオン、ｒは２〜４、Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ₂)ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。）
【化５】

（式（２）および（３）中、Ｒ ¹ およびＲ ² はそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、Ｒ ³ は炭素数１〜８の２価の炭化水素基、ｍは０または１、Ｒ ⁴ Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。ｒは２〜４、Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ ₂ )ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。）
（２） ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が、工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の順で行った後、さらに下記工程（Ｅ）、（Ｆ）の順で行って製造されたものである上記（１）記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
（Ｅ）：アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤を用いて精製を行う工程
（Ｆ）：クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒と、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒とを用いて精製を行う工程
（３） ｐが０、Ｙがメチル基であり、モノアシルリン脂質体の含有量が０．５重量％以下である上記（１）または（２）記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質。
（４） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む界面活性剤。
（５） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含むリポソーム形成剤。
（６） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の両親媒性化学修飾剤。
（７） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の乳化剤。
（８） 下記工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含む上記（１）または（３）記載のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法。
（Ａ）：下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、脱水縮合剤の存在下に、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させるか、または
下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、有機溶媒とナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させる工程
（Ｂ）：工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９に調整する工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）の後に脱水剤を用いて脱水する工程
（Ｄ）：工程（Ｃ）の後に炭素数５〜９の脂肪族炭化水素またはエーテルを用いて精製を行う工程
【化６】

（式（２）および（３）中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、Ｒ³は炭素数１〜８の２価の炭化水素基、ｍは０または１、Ｒ⁴Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。ｒは２〜４、Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ₂)ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。）
（９） Ｒ¹およびＲ²が炭素数１２〜２０のアシル基である上記（８）記載の製造方法。
（１０） ｐが０、Ｙがメチル基である上記（８）または（９）記載の製造方法。
（１１） 工程（Ａ）で使用する緩衝液がリン酸緩衝液または炭酸緩衝液、有機溶媒がクロロホルム、トルエンまたは酢酸エチルである上記（８）ないし（１０）のいずれかに記載の製造方法。
（１２） 工程（Ｃ）で使用する脱水剤が無機ナトリウム塩または無機カリウム塩の無水物である上記（８）ないし（１１）のいずれかに記載の製造方法。
（１３） 工程（Ｄ）の後に、下記工程（Ｅ）を行う上記（８）ないし（１２）のいずれかに記載の製造方法。
（Ｅ）：アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤を用いて精製を行う工程
（１４） 工程（Ｄ）または工程（Ｅ）の後に、下記工程（Ｆ）を行う上記（８）ないし（１３）のいずれかに記載の製造方法。
（Ｆ）：クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒と、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒とを用いて精製を行う工程
（１５） 工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の順で行った後、さらに工程（Ｅ）、（Ｆ）の順で行う上記（１４）記載の製造方法。
（１６） 工程（Ｆ）を行った後、工程（Ｅ）を行う上記（１４）記載の製造方法。
（１７） モノアシルリン脂質体の含有量が２重量％以下である上記（８）ないし（１６）のいずれかに記載の製造方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質において、Ｒ¹およびＲ²は炭素数４〜２４、好ましくは１２〜２０のアシル基である。このアシル基は通常脂肪酸に由来する。Ｒ¹およびＲ²の具体的なものとしては、例えば酪酸、イソ酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、リグノセリン酸などの飽和および不飽和の直鎖または分岐の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。Ｒ¹およびＲ²は同じであっても異なっていてもよい。炭素数が２４を越える場合、水相への分散が悪く反応性が下がる。また炭素数が４より少ない場合、精製工程での結晶性が悪く最終純度が低くなるおそれがある。
【０００８】
前記式（１）においてＲ³は炭素数１〜８、好ましくは２〜５、さらに好ましくは２または３の２価の炭化水素基であり、直鎖状、分枝状または環状のいずれでもよい。また飽和でも不飽和でもよい。具体的なものとしては−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂ＣＨ₂−、−(ＣＨ₂)₃−、−(ＣＨ₂)₄−、−(ＣＨ₂)₅−、−(ＣＨ₂)₆−、−ＣＨ＝ＣＨ−、フェニレン基などが挙げられる。ｍは０または１であり、好ましくは１である。
【０００９】
前記式（１）においてＲ⁴Ｏで表されるオキシアルキレン基は炭素数２〜４、好ましくは２または３のオキシアルキレン基であり、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基などが挙げられる。これらの中ではオキシエチレン基、オキシプロピレン基が好ましく、特にオキシエチレン基が好ましい。分子内にはｎの数だけオキシアルキレン基が存在するが、このオキシアルキレン基は１種単独であってもよいし、２種以上が組み合わされていてもよく、その組み合わせ方に制限はない。またブロック状であってもランダム状であってもよい。ただし、全オキシアルキレン基に対するオキシエチレン基の比率が低い場合は水溶性が低下する可能性があるので、全オキシアルキレン基に対するオキシエチレン基の比率は５０〜１００モル％であるのが好ましい。
【００１０】
前記式（１）においてｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数を表し、１０〜８００、好ましくは２０〜５００の数である。ｎが１０より小さいと、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をドラッグデリバリーシステムに使用した場合の効果が小さい。また８００より大きいと、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を製造する際、前記式（２）のポリアルキレンオキシド化合物と式（３）のリン脂質との反応性が低下するほか、前記式（２）のポリアルキレンオキシド化合物の粘度が上昇して作業性が低下するため好ましくない。
【００１１】
前記式（１）においてＭはナトリウムイオンまたはカリウムイオンの一価の金属陽イオンである。前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、リン酸基部分がナトリウムイオンまたはカリウムイオンと塩を形成しているので、−２０℃の冷凍保存時はもちろん、室温で保存しても、さらには輸送の際などに４０℃前後の状態に置かれても加水分解を起こしにくく保存安定性に優れている。なお、Ｍが水素イオンである場合は加水分解を起こし易く保存安定性が悪い。
【００１２】
リン酸基部分と塩を形成するナトリウムイオンまたはカリウムイオンは、通常薬剤等の調製に用いる生理食塩緩衝液中に含まれ、さらに生体内にも存在するため、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をドラッグデリバリーシステムに使用しても体内での毒性等の問題も少ない。Ｍがナトリウムイオンまたはカリウムイオン以外の金属イオン、例えばカルシウムまたはマグネシウム等の二価金属イオンの場合は、リン脂質２分子が会合した構造等をとるため、緩衝液等への溶解性がかなり低くなることから好ましくない。
【００１３】
前記式（１）においてｒは２〜４の整数であり、好ましくは２である。
前記式（１）においてＸは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ₂)ｑ−（ここでｑは１〜４）である。炭化水素基の具体的なものとしては−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂ＣＨ₂−、−(ＣＨ₂)₃−などが挙げられる。ｐは０または１である。
【００１４】
前記式（１）においてｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であり、好ましくはアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等が挙げられる。これの中ではメチル基が好ましい。
またｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基であり、好ましくはアミノ基である。
Ｘp−Ｙとしてはメチル基、エチル基、プロピル基およびアミノメチル基が好ましく、特にメチル基が好ましい。
【００１５】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は保存安定性が高く、かつモノアシルリン脂質体等の不純物の含有量が少ない。本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のモノアシルリン脂質体の含有量は３重量％以下、好ましくは２重量％以下、より好ましくは０．５重量％以下であり、さらに好ましくは実質的に含有されない。このように本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は生体毒性が強いとされているモノアシルリン脂質の含有量が少く、生体に対する安全性の高い高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であるので、界面活性剤、好ましくは生体用の界面活性剤として利用することができる。より具体的には、リポソーム形成剤、生理活性物質の両親媒性化学修飾剤および乳化剤などとして好適に利用することができる。
【００１６】
なお本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質と類似するリン脂質として、ポリオキシアルキレン鎖がジカルボン酸を介さないで直接リン脂質に結合したリン脂質誘導体が知られているが、このリン脂質誘導体はリン酸基周辺の水素結合が弱く界面活性剤として用いる場合に安定性に劣ることがある。界面活性剤、特にリポソーム形成剤として用いる場合、両親媒性のバランスの点から、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が最も利用範囲が広い。
【００１７】
本発明のリポソーム形成剤は前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含むリポソーム形成剤であり、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質だけからなるものであってもよいし、リポソーム膜の形成に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、レシチン、その他のリン脂質、コレステロールなどが挙げられる。
【００１８】
本発明のリポソーム形成剤は、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含んでいるので、リポソーム溶液として保存安定性に優れるとともに、生体毒性が強いモノアシルリン脂質の含有量が少ないので安全であり、このため本発明のリポソーム形成剤を使用することにより安全性の高いドラッグデリバリーシステムとして利用することができるリポソームを得ることができる。
【００１９】
リポソーム溶液として保存安定性に優れる理由としては、次のことが推測される。モノアシルリン脂質はジアシルリン脂質に比べて疎水性が低いので、リポソーム表面から脱離しやすい。このためモノアシルリン脂質の含有量が多いリポソームはモノアシルリン脂質がリポソーム表面から脱離してリポソーム表面の水和層が減少するので、リポソーム粒子の凝集が起こり相分離を起こして不安定となりやすい。これに対して本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はモノアシル体含有量が少ないので、リポソーム表面からのリン脂質の脱離が起こりにくく、このためリポソーム溶液の保存安定性に優れている。
【００２０】
リポソーム溶液として保存安定性に優れる理由としては、次のことが挙げられる。ポリアルキレンオキシド修飾モノアシルリン脂質含有量が高い場合、この化合物は親油性が低いため疎水性が下がり、リポソーム表面から遊離する場合がある。その結果リポソーム表面の水和層が減少し、リポソーム粒子の凝集が起こり相分離を起こし不安定となる。本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、モノアシル体含有量が低くリポソーム溶液とした場合、保存安定性に優れたものができる。
【００２１】
本発明の生理活性物質の化学修飾剤は前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の化学修飾剤であり、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質だけからなるものであってもよいし、生理活性物質の化学修飾に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。
【００２２】
化学修飾する生理活性物質はアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などの官能基を有するものであれば特に限定されず、例えば酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモンが挙げられる。
【００２３】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を生理活性物質の化学修飾剤として使用する場合、式（１）のＹとしてはアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基およびチオール基が好ましい。このような基を有する場合、生理活性物質中に存在する官能基と容易に反応させることができる。例えば、Ｙがカルボキシル基の場合、生理活性物質中のアミノ基とＣＯＮＨ結合を形成させることにより、生理活性物質にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質骨格を導入することができる。このようにして化学修飾された生理活性物質は、リポソーム成分として用いる場合リポソーム表面に存在させることができ、例えば生理活性物質が抗体のタンパク質の場合には標的細胞のリガンドとして用いることができるので、リポソームを標的細胞へ集中して輸送することができる。
【００２４】
本発明の生理活性物質の乳化剤は前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む生理活性物質の乳化剤であり、前記本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質だけからなるものであってもよいし、生理活性物質の乳化に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、オキシアルキレン基に由来する親水性と、アシル基に由来する疎水性とを有しているので乳化剤として使用することができ、しかも保存安定性に優れている。さらに、生体細胞構成成分と同等のリン脂質および毒性の低いオキシアルキレン基からなるとともに、生体毒性が強いモノアシルリン脂質の含有量が少ないので安全性が高い。このため、このようなポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む乳化剤を使用することにより、例えば安全性の高い生理活性物質の乳化物を得ることができる。具体的には、酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質またはホルモンなどの生理活性物質の乳化物を得ることができる。
【００２６】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は前記工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）により容易に製造することができる。
工程（Ａ）で使用する前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物および前記式（３）で示されるリン脂質において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴Ｏ、ｎ、Ｘ、pおよびＹは前記式（１）で説明したものと同じである。
【００２７】
工程（Ａ）で使用する前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物は公知の方法により製造することができる。例えば、後述するように、式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物とジカルボン酸無水物とを反応させることにより容易に製造することができる。
【００２８】
前記式（３）で示されるリン脂質は天然リン脂質でも合成リン脂質でもよく、例えば大豆および大豆水添ホスファチジルジエタノールアミン、卵黄および卵黄水添ホスファチジルジエタノールアミン等の天然および合成ホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。前記式（３）で示されるリン脂質としては、ｒが２であるホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００２９】
工程（Ａ）で使用する脱水縮合剤としては、式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物のカルボキシル基と、式（３）のリン脂質の官能基とを脱水縮合させて結合させることができる化合物が制限なく使用できる。このような脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイミド誘導体が挙げられる。脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミドが好ましい。
脱水縮合剤の使用量は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の１．０５〜５倍モル、好ましくは１．５〜２．５倍モルであるのが望ましい。さらに、反応率を上げる場合は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドを反応系中に前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物に対して０．１〜２倍モル加えることが好ましい。
【００３０】
工程（Ａ）の反応に使用する緩衝液はナトリウムまたはカリウムを含む緩衝液であり、例えばナトリウムまたはカリウムをカウンターイオンとする緩衝液である。緩衝液のｐＨは５〜１３、好ましくはｐＨが８〜１１であるのが望ましい。緩衝液の具体的なものとしては、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液およびホウ酸緩衝液などが挙げられる。これらの中ではリン酸緩衝液が好ましい。緩衝液中に含まれるナトリウムおよび／またはカリウムの量は前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の１．５〜１０倍モル、好ましくは２〜５倍モルであるのが望ましい。
【００３１】
工程（Ａ）の反応に使用する有機溶媒は、水酸基等の官能基を有しないものであれば特に制限なく使用することができる。例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼンおよびトルエンなどが挙げられる。これらの中ではクロロホルムおよびトルエンが好ましい。エタノールなどの水酸基を有する有機溶媒は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の末端のカルボキシル基と反応するので好ましくない。ジクロロメタン等でも反応性には問題はないが、低沸点であるため作業上好ましくない。
工程（Ａ）の反応は前記緩衝液と有機溶媒との混合媒体中で行う。緩衝液と有機溶媒との混合割合は有機溶媒１００容量部に対して緩衝液０．１〜５０容量部、好ましくは１〜１０容量部とするのが望ましい。
【００３２】
工程（Ａ）の反応の反応温度は３０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は１時間以上、好ましくは２〜８時間とするのが望ましい。３０℃より低温では反応率が低く、９０℃より高温では反応に用いる前記式（３）で示されるリン脂質のアシル基が加水分解するおそれがあるので好ましくない。
【００３３】
このようにして前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と前記式（３）で示されるリン脂質ジカルボン酸無水物とを反応させることにより、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が得られる。ただし、この段階では前記式（１）のＭが水素原子である水素タイプのリン脂質が含まれている場合が多い。工程（Ａ）終了後は、反応液をそのまま次の工程（Ｂ）に供することができる。
【００３４】
本発明の製造方法は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、上記のように前記脱水縮合剤の存在下に反応させることができるが、別な方法として、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、前記式（３）で示されるリン脂質とを反応させることもできる。上記活性化エステル誘導体は、例えば前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、活性化剤とを前記脱水縮合剤の存在下に反応させることにより得ることができる。
【００３５】
上記活性化剤としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ，Ｎ′−ジコハク酸イミドカーボネート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウム・メチルサルフェート、イソブチルクロロホルメートなどが挙げられる。これらの中ではＮ−ヒドロキシコハク酸イミドが好ましい。
【００３６】
前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と活性化剤との反応は、ジカルボン酸無水物との反応と同様、脱水縮合剤の存在下でカルボン酸と反応しない溶媒、例えばクロロホルム、トルエン等の反応溶媒中で、反応温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜５５℃で活性化剤をポリアルキレンオキシド化合物の溶液に分散撹拌することにより行うことができる。
例えば、活性化剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを使用した場合、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物のカルボキシル基と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドのイミド基が反応し、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物のカルボキシル基側末端にＮ−ヒドロキシコハク酸イミドが結合した活性化エステル誘導体が得られる。
【００３７】
工程（Ａ）において、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の末端がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基、特にアミノ基の場合にはこれらの基を保護して反応に供するのが好ましい。例えば、アミノ基の場合にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基または９−フルオレニルメチルカルボニル基等の保護基を付け、カルボキシル基の場合にはメチル基等によりエステル化して保護し、またチオール基の場合にはＳ−ｔ−ブチルスルフィド基等の保護基を付けて保護するのが好ましい。
【００３８】
工程（Ｂ）では工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９、好ましくはｐＨは６．５〜８に調整する。このとき使用するアルカリとしては、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムなどが挙げられる。アルカリは通常水溶液の状態で使用され、工程（Ａ）の混合媒体に用いた緩衝液の塩水溶液、水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液が挙げられる。ただし、工程（Ａ）の終了後、反応液のｐＨが６．５〜８の場合はｐＨ調整を行わなくてもよい。
【００３９】
工程（Ａ）で得られた反応液をｐＨ調整することにより、水素タイプのものが本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質に変換される。
工程（Ｂ）の終了後は、反応液を貧溶媒または非溶媒に投入して結晶化するなどの公知の方法により、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度かつ高収率で得ることができる。得られたポリアルキレンオキシド修飾リン脂質または工程（Ｂ）の反応液を、下記のような精製工程で精製することにより、さらに高純度の目的物を得ることができる。
【００４０】
工程（Ｃ）では、工程（Ｂ）の反応液を脱水剤を用いて脱水する。脱水は工程（Ｂ）の反応液に脱水剤を添加することにより行うことができる。工程（Ｂ）の反応液は緩衝液と有機溶媒との混合液であるが、脱水することにより水が除去され、有機溶媒の単一な液が得られる。これにより次工程（Ｄ）での溶媒精製において、優れた収率および純度を得ることができる。
【００４１】
工程（Ｃ）で用いる脱水剤は、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質および工程（Ａ）で用いた有機溶媒と反応しない公知の脱水剤が使用できるが、無機ナトリウム塩または無機カリウム塩の無水物が好ましく、特に無水硫酸ナトリウムが好ましい。脱水剤としてナトリウムおよびカリウム以外の無機塩、例えば硫酸マグネシウムなどの２価の金属塩を用いると、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のリン酸基のカウンターイオンが１価の金属塩から２価の塩に置き換わり、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の水への溶解性が低下し、ドラッグデリバリー基材として使用する際問題となるので好ましくない。
【００４２】
工程（Ｄ）を行う前には、濾過などにより工程（Ｂ）の反応液または工程（Ｃ）の反応液から不溶物を除去するのが好ましい。工程（Ｂ）の反応液を濾過する場合は未反応のリン脂質、工程（Ｃ）の反応液を濾過する場合は未反応のリン脂質に加えて脱水に用いた無機脱水剤、さらに工程（Ａ）で用いた緩衝液の塩が不溶となり析出した塩が除去される。濾過に使用するろ材は、被処理液の不溶物を除去することができるものであれば特に制限はなく、通常は保留粒子細孔径が１〜１０μｍで耐溶媒性を有する紙、ガラスなど各種の材質のフィルターを使用することができる。濾過方法には制限なく、例えば減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過などの方法を用いることができる。
【００４３】
工程（Ｄ）では、工程（Ｃ）の反応液またはこれを濾過した濾過液に、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素またはジエチルエーテルなどのエーテルを加え、前記式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶化を行う。
【００４４】
炭素数５〜８の脂肪族炭化水素の添加量は、工程（Ｄ）の被処理液に対して１〜５０倍容量であり、好ましくは２〜５倍容量であるのが望ましい。炭素数５〜８の脂肪族炭化水素の量が、被処理液の容量より少ない場合、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が十分に析出せず溶液中に残存する恐れがある。結晶化を行う際、室温で問題なく行うことができるが、１０℃以下に冷却して行えば濾過速度も早く、良好な収率で結晶が得られる。
【００４５】
工程（Ｄ）の処理により、過剰のジシクロヘシキルカルボジイミドなどの脱水縮合剤を除去できるが、他の精製工程でも除去できるので、さらに精製を行なう場合は蒸留等により有機溶媒を除去して結晶化してもよい。有機溶媒を除去する場合、８０℃以下で減圧下で行うことが望ましい。有機溶媒の留去温度が８０℃を越えると、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のアシル基が加水分解するなど望ましくない副反応が起こる恐れがある。
【００４６】
工程（Ｄ）で得られた結晶を本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、さらに精製に供することもできる。
【００４７】
本発明の方法において、工程（Ｄ）の後に工程（Ｅ）を行うことにより、工程（Ｄ）の前処理で除去できなかった、緩衝液として用いた過剰なナトリウム、カリウム等の式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質に結合していない遊離塩類を吸着除去することができる。工程（Ｅ）は、工程（Ｄ）の後に工程（Ｆ）を行いその後に行ってもよい。
【００４８】
工程（Ｅ）では、工程（Ｄ）で得られた結晶をそのまま用い、加温して液状として処理してもよく、その結晶を酢酸エチル、クロロホルム、トルエン等の水分含有量が低く、かつ式（１）のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を溶解する溶媒に溶解し、この溶液に吸着剤を添加して撹拌するなどの方法により行うこともできる。
【００４９】
工程（Ｅ）で用いる吸着剤としては、アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウムまたはケイ素を含有する吸着剤であり、例えば水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化ケイ素等を含有する吸着剤などが挙げられる。これらの化合物を含有する吸着剤の市販品としては、キョーワード２００、キョーワード３００、キョーワード５００、キョーワード６００、キョーワード７００、キョーワード１０００、キョーワード２０００（協和化学工業（株）製、商標）、トミックス−ＡＤ３００、トミックス−ＡＤ５００、トミックス−ＡＤ７００（冨田製薬（株）製、商標）などが挙げられる。吸着剤は１種単独で使用することもできるし、２種以上を組み合せて使用することもできる。
【００５０】
吸着剤を用いて処理する時の温度は１０〜８５℃、好ましくは４０〜７０℃、時間は１０分〜５時間、好ましくは３０分〜２時間とするのが望ましい。工程（Ｄ）で得られた結晶をそのまま処理してもよいが、上記温度で結晶が溶解しない場合や溶液の粘度が高い場合が多く、トルエンまたはクロロホルムなどの本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を溶解する有機溶媒にて希釈して処理して行う。処理する温度が１０℃未満では本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が析出する場合があり、吸着剤を除去する場合にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質も除去され収率が下がるので好ましくない。また８５℃以上では工程（Ｃ）で完全に除去できず、微量の水分が存在する場合、吸着剤処理中にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の加水分解等が起こる可能性がある。吸着剤の使用量は処理する結晶または溶液１００重量部に対して０．１〜１５重量部、好ましくは０．５〜７．５重量部とするのが望ましい。吸着剤量が上記下限値より少ないと過剰の遊離の塩を充分に除去することができず、上限値より多いと吸着剤の除去が困難であり主成分の収率が下がる。
【００５１】
工程（Ｅ）の終了後は、濾過などの方法により吸着剤を除去し、得られた分離液（以下、工程（Ｅ）の処理液という場合がある）を貧溶媒または非溶媒を用いて再結晶させることができる。これにより得られた結晶を本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、工程（Ｅ）の処理液をさらに精製に供することもできる。
【００５２】
本発明の方法において、工程（Ｆ）では、工程（Ｅ）の処理液に炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種の貧溶媒ないし非溶媒を加えることにより結晶化し、得られた結晶にクロロホルム、トルエン、酢酸エチル、アセトンおよび炭素数１〜３のアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒を加えて溶解し、エーテル、アセトンまたは炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を用いて晶析を行う。
【００５３】
工程（Ｆ）で使用する前記炭素数５〜８の脂肪族炭化水素には特に制限はなく、例えば、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ヘキサン、イソヘキサン、３−メチルペンタン、ネオヘキサン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、３−エチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、３，３−ジメチルペンタン、２，３，３−トリメチルブタン、オクタン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、３−エチルヘキサン、２，２−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン、２，４−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチルヘキサン、３，３−ジメチルヘキサン、３，４−ジメチルヘキサン、２−メチル−３−エチルペンタン、３−メチル−３−エチルペンタン、２，２，３−トリメチルペンタン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，２，３，３−テトラメチルブタンなどを挙げることができる。これらの中でヘキサンおよびヘプタンが好ましい。
【００５４】
工程（Ｆ）を行うにあたり、さらに純度を上げたい場合、アセトン、酢酸エチル、または炭素数１〜３のアルコールから選ばれる溶媒および炭素数５〜８の脂肪族炭化水素からなる溶媒の２種類以上を組み合わせて溶媒として用いて溶解し不溶物を除去した後工程（Ｆ）を行うことにより、純度の優れたポリアルキレンオキサイド修飾リン脂質を得ることができる。この際、アセトン、酢酸エチル、または炭素数１〜３のアルコールから選ばれる溶媒を、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキサイド修飾リン脂質に対して１〜２０倍重量添加し３０〜８５℃で溶解し、不溶物を濾過して除去する。不溶物を除去した後、５０℃以下に冷却した後炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を添加し、３５℃以下に冷却、好ましくは１５℃以下に冷却する。この際８０℃以上で溶解すると、リン脂質のアシル基が分解し、モノアシル体が生じる恐れがある。モノアシルリン脂質は生体に投与する上で問題がある。また、炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を添加し冷却する際、４０℃以上では前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が十分に析出せず回収率が低くなる恐れがある。
【００５５】
上記のようにして製造することにより、有毒なモノアシルリン脂質の含有量が少なく、またそれ以外の不純物の含有量も少なく高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を容易に高収率で得ることができる。
【００５６】
なお、工程（Ａ）の出発原料となる前記式（２）で示されポリアルキレンオキシド化合物は、例えば式（４）
ＨＯ−(Ｒ⁴Ｏ)n−Ｘp−Ｙ …（４）
（式（４）中、Ｒ⁴Ｏ、ｎ、Ｘ、pおよびＹは前記式（１）と同じである。）
で示されるポリアルキレンオキシド化合物とジカルボン酸無水物とを、塩基性触媒の存在下に反応させることにより製造することができる。
【００５７】
上記ジカルボン酸無水物としては、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、テレフタル酸の無水物などを挙げることができる。これらの中ではコハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびピメリン酸の無水物が好ましく、特にコハク酸またはグルタル酸の無水物が好ましい。ジカルボン酸無水物としては、分子内無水物、分子間無水物のいずれを用いてもよい。
【００５８】
上記塩基性触媒は特に制限なく使用できる。例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジンなどが挙げられ、好ましくは酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムである。トリエチルアミンおよびジメチルアミノピリジンを用いる場合は、工程（Ａ）の前に触媒を除去して用いる必要がある。
反応は通常反応溶媒を用いて行われるが、この場合反応溶媒としては前記式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物およびジカルボン酸無水物と反応する溶媒以外のものが制限なく使用できる。例えばクロロホルム、トルエン、テトラヒドロフランおよびアセトニトリル等が挙げられる。アルコールは前記ジカルボン酸無水物と反応するので好ましくない。
【００５９】
反応は反応温度３０〜１８０℃、好ましくは６０〜１３０℃、より好ましくは８０〜１２０℃、反応時間１〜２０時間、好ましくは３〜１０時間とするのが望ましい。３０℃より低温では反応率が低く、１８０℃より高温では末端活性基が分解するおそれがあるので好ましくない。
カルボン酸無水物の量は、前記式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物が有する水酸基１モルに対して１〜３倍モル、好ましくは１．０２〜１．５倍モルとするのが望ましい。
【００６０】
このようにして前記式（４）で示されるポリアルキレンオキシド化合物とジカルボン酸無水物とを反応させることにより、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物が得られる。反応終了後は、反応液にヘキサン等の脂肪族炭化水素などを添加して反応生成物を結晶化させ、この結晶を次の工程（Ａ）に供することができる。
【００６１】
【発明の効果】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は新規かつ有用である。本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は保存安定性が高く、モノアシルリン脂質体等の不純物の含有量が少なく生体に対する安全性の高い高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であるので、リポソーム形成剤、生理活性物質の化学修飾剤および生理活性物質の乳化剤などとして好適に利用することができる。
【００６２】
本発明の製造方法は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、脱水縮合剤の存在下に、ナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液と有機溶媒との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させるか、または前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化エステル誘導体と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、ナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含む緩衝液と有機溶媒との混合媒体中で３０〜９０℃で反応させる工程（Ａ）と、工程（Ａ）で得られた反応液をナトリウムイオンおよび／またはカリウムイオンを含むアルカリでｐＨ６〜９に調整する工程（Ｂ）と、工程（Ｂ）の後に脱水剤を用いて脱水する工程（Ｃ）と、工程（Ｃ）の後に炭素数５〜９の脂肪族炭化水素またはエーテルを用いて精製を行う工程（Ｄ）とを含んでいるので、上記ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を簡単に効率よく、しかも高純度に製造することができる。
【００６３】
【実施例】
実施例１
（１）モノメチルポリオキシエチレン（分子量５０００）サクシンイミジルグルタレートの合成
モノメトキシポリオキシエチレン（平均分子量５０００）５０ｇ（０．０１ｍｏｌ）にリン酸ナトリウムを０．０５ｇ（０．４ｍｍｏｌ）を加えて、１００℃に加温し均一にした後、無水グルタル酸を１．２５ｇ（０．０１１ｍｏｌ）加え、１１０℃で８時間反応を行った。冷却後イソプロピルアルコール２００ｍＬを加えて、モノメチルポリオキシエチレングルタレートの結晶を得た。その結晶にトルエン１５０ｍＬを添加して４０℃で加温溶解した後、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド１．２４ｇ（０．０１１ｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド４．２５ｇ（０．０２１ｍｏｌ）を添加し、４０℃で２時間反応した。反応後濾過し、下記式（５）で示される粗メチルポリオキシエチレンサクシンイミジルグルタレート活性化体４８ｇを得た。
【化５】

【００６４】
（２）モノメチルポリオキシエチレングルタリル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１４．９６ｇ（０．０２ｍｏｌ）にトルエン７５ｍＬを加えて６０℃に加温し、リン脂質トルエン溶液を得た。またリン酸水素ニナトリウム７．２ｇ（０．０５ｍｏｌ）に蒸留水７．５ｍＬと３０％水酸化ナトリウム水溶液０．７５ｍＬとを加えて加温溶解し、リン酸緩衝液を得た。このリン酸緩衝液を前記リン脂質トルエン溶液に添加し、６０℃で撹拌しリン脂質緩衝混合液を得た。このリン脂質緩衝混合液に、前記式（５）の粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルグルタレート活性化体を添加し、６０℃で５時間反応を行った。反応後０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に中和した。その後、硫酸ナトリウム１５０ｇを添加して１時間撹拌し、脱水を行った。
【００６５】
脱水工程後濾過にて不溶物を除去し、ろ液にヘキサンを４００ｍＬ添加し１時間撹拌し、結晶を析出させた。この結晶を濾過にて得た。得られた粗結晶を酢酸エチル１００ｍＬに５０℃で加温溶解し、吸着剤としてキョーワードＫＷ＃７００およびキョーワードＫＷ＃１０００をそれぞれ０．５ｇ加えて３０分間撹拌した。吸引濾過にてキョーワードを除去し、得られたろ液にヘキサン５０ｍＬを添加して結晶析出させた。この結晶を濾過により得た。その結晶にアセトン３００ｍＬを加えて５０℃で加温溶解し、熱時濾過して未反応のリン脂質を不溶物として除去した。その後１５℃以下に冷却し、結晶を析出させた。この結晶を濾過して得た。得られた結晶に酢酸エチル１８０ｍＬを加えて６０℃に加温して溶解し、その後１５℃以下に冷却し、結晶を析出させた。この結晶を濾過して採取した。加温溶解時に不溶物がある場合は、濾過にて除去し次の工程に進んだ。さらに得られた結晶を再度同様に酢酸エチル２００ｍＬに加温溶解し、ヘキサン１００ｍＬを加えて析出した結晶を濾過して最終純度９８％の結晶５０ｇを得た。ポリオキシエチレン活性化体を基準として収率は９０．８％であった。結果を表１にまとめる。
なお参考例として中和後脱水工程を行わず、ヘキサンを添加し結晶化行った場合、純度８７％の結晶５２ｇが得られ、収率は９４．５％であった。
【００６６】
生成物の分析は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５重量比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。
【００６７】
実施例２
モノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量２０００）ジラウロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
モノメトキシポリオキシエチレン（平均分子量２０００）２０ｇ（０．０１ｍｏｌ）にリン酸ナトリウムを０．０５ｇ（０．４ｍｍｏｌ）加えて、１００℃に加温し均一にした後、無水コハク酸を１．１ｇ（０．０１１ｍｏｌ）を加え、１００℃で６時間反応を行い、実施例１の（１）と同様の方法で粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート活性化体を得た。
一方、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン１１．６ｇ（０．０２ｍｏｌ）を用いて、実施例１と同様の条件にてリン脂質緩衝混合液を調製した。
【００６８】
このリン脂質緩衝混合液に、前記粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート活性化体を添加し、６０℃で５時間反応を行った。反応後、実施例１と同様の条件にて精製し最終結晶１８ｇを得た。純度は９８％であった。ポリオキシエチレン活性化体を基準として収率は６９．２％であった。結果を表１にまとめる。
【００６９】
実施例３
モノアミノエチルポリオキシエチレン（分子量３４００）グルタリルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
モノアミノエチルポリオキシエチレン（平均分子量３４００）は、３．４ｇ（０．００１ｍｏｌ）の末端アミノ基をProc. Natl. Acad. Sci. 69, 730(1972)記載の方法に従って、無水物を用いてｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基で保護し、もう片末端を実施例１の（１）の方法に従ってサクシンイミジルグルタレート活性化し、粗ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護アミノエチルポリオキシエチレン（分子量３４００）サクシンイミジルグルタレート活性化体を調製した。
一方、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１．１６ｇ（０．００２ｍｏｌ）を用いて、実施例１と同様の条件にてリン脂質緩衝混合液を調製した。
【００７０】
このリン脂質緩衝混合液に、前記粗ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護アミノエチルポリオキシエチレン（分子量３４００）サクシンイミジルグルタレート活性化体を添加し、４５℃で５時間反応を行った。反応後、キョーワードＫＷ＃７００を０．１ｇおよびキョーワードＫＷ＃１０００を０．０５ｇ加えて３０分間撹拌した。吸引濾過にてキョーワードを除去し、２．５Ｍ塩酸のアセトニトリル溶液を添加し、３０分間室温にて撹拌し保護基を加水分解して外し、水酸化ナトリウム水溶液にて中和した。中和した溶液にキョーワードＫＷ＃７００を０．１ｇおよびキョーワードＫＷ＃１０００を０．０５ｇを加えて３０分間撹拌した後、濾過して不溶物を除去しろ液の溶媒を除去した。アセトンおよび酢酸エチルを用いた晶析については、実施例１と同様の条件にて精製し最終結晶２ｇを得た。純度は９０％であった。モノアミノエチルポリオキシエチレンを基準として収率は５２．０％であった。結果を表１にまとめる。
【００７１】
実施例４
モノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
実施例２と同様の方法でモノメトキシポリオキシエチレン（平均分子量５０００）５０ｇ（０．０１ｍｍｏｌ）をモノメトキシポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート活性化体とし、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１５．０ｇ（０．０２ｍｏｌ）と反応させ、さらに同様に精製しモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを得た。純度９８．５％の最終結晶５３ｇを得、ポリオキシエチレン活性化体を基準として９１．０％の収率となった。結果を表２にまとめる。
【００７２】
実施例５
モノメチルポリオキシエチレングルタリル（分子量５０００）ジドコサノイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジドコサノイルホスファチジルエタノールアミン１４．９６ｇ（０．０２ｍｏｌ）にトルエン７５ｍＬを加えて６０℃に加温しリン脂質トルエン溶液を得た。また炭酸ナトリウム５．３ｇ（０．０５ｍｏｌ）に蒸留水７．５ｍＬと３０％水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍＬとを加えて加温溶解し、炭酸緩衝液を得た。この炭酸緩衝液を前記リン脂質トルエン溶液に添加し６０℃で撹拌しリン脂質緩衝混合液とした。
【００７３】
このリン脂質緩衝混合液に、実施例１で調製した粗モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルグルタレート活性化体を添加し、６０℃で５時間反応を行った。反応後ｐＨが下がっている場合は、０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７に中和した後、硫酸ナトリウム１５０ｇ添加し１時間撹拌し脱水を行った。その後実施例１と同様の方法にて精製を行い最終純度９５％の結晶４８ｇを得た。ポリオキシエチレン活性化体を基準として８７．２％の収率となった。結果を表２にまとめる。
【００７４】
比較例１
モノメチルポリオキシエチレン（平均分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１４９．６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）にクロロホルム１０ｍＬを加えて撹拌しリン脂質クロロホルム溶液とした。その溶液にモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート３．０６ｇ（０．６ｍｍｏｌ）を添加し、さらにトリエチルアミン０．０１ｇ（０．７ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩反応を行った。反応後窒素ブローにてクロロホルムを除去し、得られた残渣を０．１４５Ｍの塩化ナトリウム水溶液に再溶解し未反応のモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネートを加水分解した。その溶液を、生理食塩水で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ−１．５ｍカラムに展開し生理食塩水で溶出した。排除体積中のポリオキシエチレン修飾ホスファチジルエタノールアミンミセルを含むフラクションを採取し、水に対して５日間透析した後、凍結乾燥にて結晶１９５ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として収率は３５．５％であり、純度は９４％であった。
【００７５】
上記の方法で得られる主成分は、生理食塩水および水中でのｐＨが５〜６であるため、リン酸基の部分が中和されていないＨタイプも含まれる。すべてをナトリウム塩とするため次の中和工程を行った。
得られた結晶１９５ｍｇをメタノール１．９５ｍＬに溶解し、撹拌しながらｐＨが７〜８となるまで０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液約０．１５ｍＬを添加した。その後エバポレーターを用いて濃縮し、ヘキサン５ｍＬを加え濾過して析出した結晶を得た。得られたナトリウム塩タイプの収率は２８％であり、純度は８５％となった。結果を表３にまとめる。
【００７６】
比較例２
モノメチルポリオキシエチレン（平均分子量１９００）サクシニル水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミンの合成
比較例モノメチルポリオキシエチレンサクシネート（平均分子量１９００）１９ｇ（１０ｍｍｏｌ）を四塩化炭素に溶解し、その溶液に無水コハク酸５ｇ（５０ｍｍｏｌ）を添加し７５℃に加温し一晩撹拌した。反応後濾過して余剰の無水コハク酸を除去した。この乾燥試料を容積比９５／５／０．８の塩化エチレン／メタノール／濃アンモニア水混合溶媒に溶解し、同溶液で平衡化したケイ酸カラムに展開した。溶離溶媒のメタノール含有量を上げることにより、溶出してくるサクシニルエチレングリコールフラクションを分取し、溶媒除去して乾燥品を得た。
【００７７】
モノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート６３８ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ）をベンゼン１１ｍＬに溶解し、１，１−カルボニルジイミダゾール３１５ｍｇ（２．１６ｍｍｏｌ）を添加し４０℃に加温した。この溶液に水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン５９４．４ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を加え、その後脱溶媒を行い全量３ｍＬまで濃縮し、６５℃で３時間反応を行った。反応後エバポレーターにて脱溶媒し、得られた試料をけい酸クロマトグラフィーで精製し、溶出してくるポリオキシエチレン修飾ホスファチジルエタノールアミン含有フラクションを分取し、溶媒を除去して純度９５％の乾燥品３２４ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として収率は１５％であった。
【００７８】
上記の方法で得られた主成分は水素（Ｈ）タイプであり、ナトリウム塩へ置換を行うために、比較例１と同様の方法にてナトリウム塩とした。得られたナトリウム塩タイプの純度９１％であり、収率は１２％であった。結果を表３にまとめる。
【００７９】
比較例３
比較例２と同様の方法で得られたモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート（平均分子量１９００）６３８ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ）をベンゼン１１ｍＬに溶解し、１，１−カルボニルジイミダゾール３１５ｍｇ（２．１６ｍｍｏｌ）を添加し４０℃に加温した。この溶液に水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン５９４．４ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を加え、その後脱溶媒を行い全量３ｍＬまで濃縮し、６５℃で３時間反応を行った。反応後エバポレーターにて脱溶媒し、クロロホルムと０．２Ｍ塩酸を用いて２相分離を行った。下層を採取し４回水相にて洗浄抽出し、脱溶媒し乾燥品とした。得られた試料を容積比９５／５／０．８の塩化エチレン／メタノール／濃アンモニア水混合溶媒に溶解し、同溶液で平衡化したケイ酸カラムに展開した。溶離溶媒のメタノール含有量を上げることにより、溶出してくるポリオキシエチレン修飾ホスファチジルエタノールアミン含有フラクションを分取し、溶媒を除去して乾燥品８００ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として３７．２％の収率であり、純度は９４％であった。
【００８０】
上記の方法で得られた主成分はアンモニウム塩であり、ナトリウム塩へ置換を行うために、まず陽イオン強酸性樹脂を用いてアンモニウムイオンを除去し、比較例１と同様の方法にてナトリウム塩とした。得られたナトリウム塩タイプの純度は８５％であり、収率は３０％であった。結果を表３にまとめる。
【００８１】
比較例４
モノメチルポリオキシエチレングルタリル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１４９．６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）にクロロホルム１０ｍＬを加えて撹拌しリン脂質クロロホルム溶液とした。その溶液にモノメチルポリオキシエチレンサクシンイミジルサクシネート３．０６ｇ（０．６ｍｍｏｌ）を添加し、さらにトリエチルアミン０．０１ｇ（０．７ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩撹拌し反応を行った。反応後窒素ブローにてクロロホルムを除去し、得られた残渣を水に分散しその溶液を、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｏｒ ＣＥ３０００００ＭＷ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、水に対して５日間透析した。その後凍結乾燥し結晶１９５ｍｇを得た。反応に用いたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを基準として２５％の収率であり、純度は８５％であった。
【００８２】
上記の方法で得られる主成分は、透析水中でのｐＨが５〜６であるため、リン酸基の部分が中和されていないＨタイプおよびトリエチルアミンタイプも含まれる。トリエチルアミンは毒性が高く、すべてをナトリウム塩とするため比較例３と同様の処理を行いナトリウムタイプとした。得られたナトリウム塩タイプの収率は１８％であり純度は８０％となった。結果を表３にまとめる。
【００８３】
【表１】
表１

【００８４】
【表２】
表２

【００８５】
【表３】
表３

【００８６】
表１〜表３の注
＊１ Ｎａ塩純度：前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の純度、単位ｗｔ％
＊２ リゾ体含有量：モノアシルリン脂質体の含有量、単位ｗｔ％
＊３ フリーＰＥ含有量：未反応のリン脂質の含有量、単位ｗｔ％
＊４ フリーPEG誘導体含有量：単位ｗｔ％
＊５ フリー塩含有量：リン酸塩、その他の塩の含有量、単位ｗｔ％
【００８７】
表１〜表３の結果から、実施例の製造方法は比較例に比べて、高純度のＮａ塩を高収率で製造することができることがわかる。
【００８８】
実施例６
モノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのナトリウムタイプと水素タイプ（Ｈ）の保存安定性の比較
実施例４で得たモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのナトリウムタイプと、対照品となる水素タイプ（Ｈ）とについて、下記の条件にて主成分含有量の経時変化を実施例１のＴＬＣにより測定した。結果を表４に示す。
条件
・保存条件：−３０℃、４℃、２０℃、４０℃
・サンプル形態：粉末（空気存在下、褐色瓶）
【００８９】
【表４】
表４ 純度変化（主成分含有量％）

注） 保存率は保存開始時の含有量に対する保存期間経過後の含有量の割合である。
【００９０】
表４の結果からわかるように、実施例のナトリウムタイプのものは、低温で保存した場合はもちろん、室温より高い温度で長期間保存した場合にも、保存安定性に優れていることがわかる。これに対して、比較例の水素タイプのものは含有量が経時的に大きく減少し、特に保存温度が高い場合に純度が大きく減少することがわかる。４０℃で保存した場合、実施例のナトリウムタイプの保存率は６か月後も９７．１％であるのに対し、比較例の水素タイプの保存率は１週間後で７０．０％であり、保存期間が２５倍以上になっているにもかかわらず、実施例の保存率はなおも高い値を示している。
【００９１】
実施例７
実施例３のモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用して乳液を作製した。すなわち、表５の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、撹拌しながら水相部を同温度で添加した。
【００９２】
【表５】
表５

【００９３】
作製した乳液を４０℃で一か月保存した後、乳化状態を下記の基準により評価した。結果を表７に示す。
３：安定な状態
２：やや不均一な状態
１：クリーミングまたは分離している状態
【００９４】
また、作製した直後の乳液を皮膚に塗布し、官能試験を行った。官能評価は５人の専門パネラーで行った。評価方法は、上腕部を洗浄した後に試料を塗布し、塗布直後および一晩経過後の皮膚刺激についての評価を下記３段階評価でそれぞれ行った。５人の合計点を表７に記す。
３：普通である。全く異常がない。
２：違和感がある。少し痒みを感じる。
１：痒みがある。皮膚に発赤を認める。
【００９５】
実施例８
実施例３のモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用してクリームを作製した。すなわち、表６の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、撹拌しながら水相部を同温度で添加した。
【００９６】
【表６】
表６

【００９７】
作製したクリームについて実施例７と同様の評価を行った。結果を表７に示す。
【００９８】
比較例５および６
比較例２のモノメチルポリオキシエチレンサクシニル（分子量５０００）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いて実施例７および実施例８と同様の試験を行った。結果を表７に示す。
【００９９】
【表７】
表７

【０１００】
実施例９
リポソーム溶液の安定性評価
ジパルミトイルホスファチジルコリン１．９２ｇ（２．６４ｍｍｏｌ）、コレステロール０．４５ｇ（１．３２ｍｍｏｌ）、実施例４で得たモノメチルポリオキシエチレン（分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン０．８６ｇ（０．１５ｍｍｏｌ）をナス型フラスコに入れ、クロロホルム５０ｍＬを加えて溶解し、ロータリーエバポレーターにて脱溶剤し、フラスコ内壁に脂質の薄膜を形成した。減圧下にて溶剤除去を十分に行い、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水液３０ｍＬを加えて分散し、さらに超音波洗浄器にて５分間処理を行いリポソーム溶液とした。
得られたリポソーム溶液を室温にて１か月間放置した。１か月後のリポソーム溶液の分散状態は、目視では変化が認められず、均一なリポソーム溶液であった。
【０１０１】
比較例７
比較例１で得たモノメチルポリオキシエチレンサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いて、実施例９と同様の評価を行った。その結果、リポソーム溶液は均一ではなく、脂質粒子が沈降していた。
【０１０２】
実施例１０
カルボキシメチルポリオキシエチレン（平均分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いたアスパラギナーゼの修飾
実施例２と同様にして得られたカルボキシメチルポリオキシエチレンサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン５ｇをクロロホルム５０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．１２ｇを添加し、少量のクロロホルムに溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド０．２５ｇを添加して室温にて２時間撹拌した。その後濾過して不溶物を除去した溶液にジエチルエーテルを添加し、析出した結晶を濾過して得た。減圧にて溶剤を除去し、次の工程に用いた。
アスパラギナーゼ０．１ｇをｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水液５０ｍＬに溶解し、上記で得られたサクシンイミジルカルボキシメチルポリオキシエチレンサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを添加し、５℃で４時間撹拌した。この反応液を、ｐＨ７．４、４℃のリン酸緩衝生理食塩水液に対して透析して未反応物を除去し、その後凍結乾燥し、カルボキシメチルポリオキシエチレン（平均分子量５０００）サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンがアスパラギナーゼに結合した乾燥品を得た。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel and useful polyalkylene oxide-modified phospholipid, a method for producing the same, and uses thereof, and in particular, polyalkylene oxide-modified phospholipid that can be used in drug delivery systems such as chemical modification and emulsification of liposomes or liposomes, The present invention relates to a manufacturing method and an application.
[0002]
[Prior art]
In recent years, research on liposome preparations such as anticancer agents has been widely conducted, and water-soluble polymer modification of liposomes has been actively performed for the purpose of improving the retention in blood. As one of them, polyethylene oxide modified phospholipid for liposome modification is used.
These are acidic phospholipids. However, considering the storage stability until the acid phospholipid is usually administered into the body, that is, until dissolved in a buffer solution, the acidic group is not neutralized with a salt. The pH is lowered and hydrolysis and the like are likely to occur, resulting in decomposition products. The storage stability is higher when neutralized with sodium or the like than the acidic type. However, when the acidic type is neutralized to the sodium salt type, it may be deteriorated in the process and it is difficult to obtain a high purity product. For this reason, the thing of a sodium salt and the high purity were desired.
[0003]
As production methods of polyethylene oxide-modified phospholipids, TM Allen (Biochimica et Biophysica Acta, 1066, 29-36 (1991) et al., VP Torchilin et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1195, 11-20 (1994)) As reported, in the presence of a basic catalyst such as triethylamine in an organic solvent such as chloroform, the product is reacted with a polyethylene oxide compound or a purified column product thereof and a phospholipid such as phosphatidylethanolamine. There is a method of obtaining a polyethylene oxide-modified phospholipid by elution fractionation in a mixed solvent system, and polyethylene oxide using 1,1-carbonyldiimidazole as described in JP-B-4-7353. There is a method of reacting an acid compound with phospholipid, which is a long process because column purification and the like are performed twice. In the method, high-purity products can be obtained, but the yield and other efficiency are poor and the amount of solvent used is large, making it difficult to develop industrial production. Although it is possible to obtain an acidic type high-purity product, it is difficult to obtain a high-purity product neutralized with sodium or the like.
[0004]
There is a report that a sodium salt type polyethylene oxide-modified phospholipid is obtained by synthesizing by the same method and dialysis or ultrafiltration in a buffer solution. In this method, it is difficult to obtain a high purity product by causing hydrolysis during dialysis to produce a monoacylphospholipid body.
Monoacyl phospholipids are generally referred to as lysophospholipids, and lyso forms of phospholipids are reported to be highly biotoxic and physiologically active. When used as a drug delivery system, this problem is emphasized and is a problem for pharmaceutical use.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the conventional problems, and is a novel and useful polyalkylene oxide-modified phospholipid which is excellent in storage stability and has a small amount of impurities such as a monoacyl phospholipid body and high purity, and its It is to provide a manufacturing method and use.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
  The present invention provides the following polyalkylene oxide-modified phospholipids, production methods and uses thereof.
  (1)A polyalkylene oxide-modified phospholipid produced by a method comprising the following steps (A), (B), (C) and (D):A polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the following formula (1) having a monoacylphospholipid content of 3% by weight or less.
  (A): A polyalkylene oxide compound represented by the following formula (2) and a phospholipid represented by the following formula (3) are mixed with an organic solvent and sodium ions and / or potassium ions in the presence of a dehydrating condensing agent. React at 30-90 ° C. in a mixed medium with the containing buffer, or
  A mixed medium of an activated ester derivative of a polyalkylene oxide compound represented by the following formula (2) and a phospholipid represented by the following formula (3) in an organic solvent and a buffer containing sodium ions and / or potassium ions Reacting at 30-90 ° C.
  (B): A step of adjusting the reaction solution obtained in step (A) to pH 6 to 9 with an alkali containing sodium ions and / or potassium ions.
  (C): Step of dehydration using a dehydrating agent after step (B)
  (D): The process of refine | purifying using a C5-C9 aliphatic hydrocarbon or ether after a process (C).
[Formula 4]

(In formula (1), R¹And R²Are each independently an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, R^ThreeIs a divalent hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms, m is 0 or 1, R^FourO is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and n is an average added mole number of an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, which is a number of 10 to 800. M is a sodium ion or potassium ion, r is 2 to 4, X is a divalent hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms, or -C (= O) (CH₂) q- (where q is 1 to 4), p is 0 or 1. When p is 0, Y is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. When p is 1, Y is a hydrogen atom, amino group, carboxyl group, aldehyde group, glycidyl group or thiol group. )
[Chemical formula 5]

(In the formulas (2) and (3), R ¹ And R ² Are each independently an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, R ^Three Is a divalent hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms, m is 0 or 1, R ^Four O is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and n is an average added mole number of an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, which is a number of 10 to 800. r is 2 to 4, X is a divalent hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms, or -C (= O) (CH ₂ ) q- (where q is 1 to 4), p is 0 or 1. When p is 0, Y is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. When p is 1, Y is a hydrogen atom, amino group, carboxyl group, aldehyde group, glycidyl group or thiol group. )
  (2)A polyalkylene oxide-modified phospholipid produced by performing steps (A), (B), (C) and (D) in this order, and further performing steps (E) and (F) below. The polyalkylene oxide-modified phospholipid according to (1) above.
  (E): A step of performing purification using an adsorbent containing alkaline earth metal oxide, alkaline earth metal hydroxide, aluminum or silicon.
  (F): selected from the group consisting of at least one solvent selected from the group consisting of chloroform, toluene, ethyl acetate, acetone and an alcohol having 1 to 3 carbon atoms, and an aliphatic hydrocarbon and ether having 5 to 8 carbon atoms. And performing the purification using at least one solvent
  (3)  The above (1), wherein p is 0, Y is a methyl group, and the content of the monoacylphospholipid body is 0.5% by weight or less.Or (2)The polyalkylene oxide-modified phospholipid as described.
  (4)  Above (1)Or (3)Surfactants comprising the described polyalkylene oxide modified phospholipids.
  (5)  Above (1)Or (3)A liposome-forming agent comprising the described polyalkylene oxide-modified phospholipid.
  (6)  Above (1)Or (3)An amphiphilic chemical modifier for a physiologically active substance comprising the polyalkylene oxide-modified phospholipid as described.
  (7)  Above (1)Or (3)An emulsifier for a physiologically active substance comprising the polyalkylene oxide-modified phospholipid as described.
  (8)  The following process (A), (B), (C)and(D)(1) or including(3)A process for producing the described polyalkylene oxide-modified phospholipid.
  (A): A polyalkylene oxide compound represented by the following formula (2) and a phospholipid represented by the following formula (3) are mixed with an organic solvent and sodium ions and / or potassium ions in the presence of a dehydrating condensing agent. React at 30-90 ° C. in a mixed medium with the containing buffer, or
  A mixed medium of an activated ester derivative of a polyalkylene oxide compound represented by the following formula (2) and a phospholipid represented by the following formula (3) in an organic solvent and a buffer containing sodium ions and / or potassium ions Reacting at 30-90 ° C.
  (B): A step of adjusting the reaction solution obtained in step (A) to pH 6 to 9 with an alkali containing sodium ions and / or potassium ions.
  (C): Step of dehydration using a dehydrating agent after step (B)
  (D): The process of refine | purifying using a C5-C9 aliphatic hydrocarbon or ether after a process (C).
[Chemical 6]

(In the formulas (2) and (3), R¹And R²Are each independently an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, R^ThreeIs a divalent hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms, m is 0 or 1, R^FourO is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and n is an average added mole number of an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, which is a number of 10 to 800. r is 2 to 4, X is a divalent hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms, or -C (= O) (CH₂) q- (where q is 1 to 4), p is 0 or 1. When p is 0, Y is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. When p is 1, Y is a hydrogen atom, amino group, carboxyl group, aldehyde group, glycidyl group or thiol group. )
  (9)  R¹And R²Is an acyl group having 12 to 20 carbon atoms(8)The manufacturing method as described.
  (10)  p is 0 and Y is a methyl group(8)Or(9)The manufacturing method as described.
  (11)  The above wherein the buffer used in step (A) is a phosphate buffer or carbonate buffer, and the organic solvent is chloroform, toluene or ethyl acetate(8)Or(10)The manufacturing method in any one of.
  (12) The above dehydrating agent used in step (C) is an inorganic sodium salt or inorganic potassium salt anhydride(8) to any of (11)The manufacturing method as described.
  (13)   After the step (D), the following step (E) is performed(8) to any of (12)The manufacturing method as described.
  (E): A step of performing purification using an adsorbent containing alkaline earth metal oxide, alkaline earth metal hydroxide, aluminum or silicon.
  (14)  CraftThe above step (F) is performed after step (D) or step (E).(8)Or(13)The manufacturing method in any one of.
  (F): selected from the group consisting of at least one solvent selected from the group consisting of chloroform, toluene, ethyl acetate, acetone and an alcohol having 1 to 3 carbon atoms, and an aliphatic hydrocarbon and ether having 5 to 8 carbon atoms. And performing the purification using at least one solvent
  (15)The production method according to (14), wherein the step (A), (B), (C), and (D) are performed in this order, and the step (E) and (F) are further performed in this order.
  (16)  After performing step (F), the above step (E) is performed(14)The manufacturing method as described.
  (17) The content of the monoacylphospholipid body is 2% by weight or less(8)Or(16)The manufacturing method in any one of.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention represented by the formula (1), R¹And R²Is an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, preferably 12 to 20 carbon atoms. This acyl group is usually derived from fatty acids. R¹And R²Specific examples of such as butyric acid, isobutyric acid, caproic acid, caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, isostearic acid, oleic acid, linoleic acid, arachic acid, Mention may be made of acyl groups derived from saturated and unsaturated linear or branched fatty acids such as behenic acid, erucic acid and lignoceric acid. R¹And R²May be the same or different. When the number of carbon atoms exceeds 24, dispersion in the aqueous phase is poor and reactivity is lowered. On the other hand, when the number of carbon atoms is less than 4, the crystallinity in the purification process is poor and the final purity may be lowered.
[0008]
In the formula (1), R^ThreeIs a divalent hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 or 3, and may be linear, branched or cyclic. It may be saturated or unsaturated. Specifically, -CH₂-, -CH₂CH₂-,-(CH₂)_Three-,-(CH₂)_Four-,-(CH₂)_Five-,-(CH₂)₆-, -CH = CH-, a phenylene group, and the like. m is 0 or 1, preferably 1.
[0009]
In the formula (1), R^FourThe oxyalkylene group represented by O is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, preferably 2 or 3, and examples thereof include an oxyethylene group, an oxypropylene group, an oxytrimethylene group, and an oxybutylene group. Among these, an oxyethylene group and an oxypropylene group are preferable, and an oxyethylene group is particularly preferable. There are as many oxyalkylene groups in the molecule as there are n, but these oxyalkylene groups may be used singly or in combination of two or more, and there is no limitation on the combination. Further, it may be a block shape or a random shape. However, when the ratio of oxyethylene groups to all oxyalkylene groups is low, the water solubility may decrease, so the ratio of oxyethylene groups to all oxyalkylene groups is preferably 50 to 100 mol%.
[0010]
In said Formula (1), n represents the average addition mole number of an oxyalkylene group, and is the number of 10-800, Preferably it is 20-500. When n is smaller than 10, the effect when the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention is used in a drug delivery system is small. On the other hand, when the polyalkylene oxide-modified phospholipid is larger than 800, the reactivity between the polyalkylene oxide compound of the formula (2) and the phospholipid of the formula (3) decreases, and the formula (2) Since the viscosity of a polyalkylene oxide compound rises and workability | operativity falls, it is unpreferable.
[0011]
In the formula (1), M is a monovalent metal cation of sodium ion or potassium ion. In the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention represented by the formula (1), the phosphate group part forms a salt with sodium ion or potassium ion. Even when stored, even when placed at a temperature of around 40 ° C. during transportation, hydrolysis is unlikely to occur and the storage stability is excellent. When M is a hydrogen ion, hydrolysis tends to occur and storage stability is poor.
[0012]
Since the sodium ion or potassium ion that forms a salt with the phosphate group moiety is usually contained in a physiological saline buffer used for the preparation of drugs and the like, and is also present in vivo, the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention Even when used in drug delivery systems, there are few problems such as toxicity in the body. When M is a metal ion other than sodium ion or potassium ion, for example, a divalent metal ion such as calcium or magnesium, since it has a structure in which two phospholipid molecules are associated, solubility in a buffer solution or the like is considerably low. That is not preferable.
[0013]
In the formula (1), r is an integer of 2 to 4, preferably 2.
In the formula (1), X is a divalent hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms or —C (═O) (CH₂) q- (where q is 1 to 4). Specific examples of the hydrocarbon group include —CH₂-, -CH₂CH₂-,-(CH₂)_Three-Etc. are mentioned. p is 0 or 1;
[0014]
In the above formula (1), when p is 0, Y is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, preferably an alkyl group. Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and a butyl group. Of these, a methyl group is preferred.
When p is 1, Y is a hydrogen atom, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a glycidyl group or a thiol group, preferably an amino group.
Xp-Y is preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group or an aminomethyl group, particularly preferably a methyl group.
[0015]
The polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention has high storage stability and a low content of impurities such as a monoacyl phospholipid body. The content of the monoacylphospholipid body of the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention is 3% by weight or less, preferably 2% by weight or less, more preferably 0.5% by weight or less, and still more preferably not substantially contained. As described above, the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention is a high-purity polyalkylene oxide-modified phospholipid having a low content of monoacyl phospholipid, which is considered to be highly biotoxic, and highly safe for living organisms. It can be used as an agent, preferably a biological surfactant. More specifically, it can be suitably used as a liposome-forming agent, an amphiphilic chemical modifier for bioactive substances, an emulsifier, and the like.
[0016]
As a phospholipid similar to the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, a phospholipid derivative in which a polyoxyalkylene chain is directly bonded to a phospholipid without using a dicarboxylic acid is known. When used as a surfactant, the hydrogen bond around the acid group is weak and the stability may be poor. When used as a surfactant, particularly as a liposome-forming agent, the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention has the widest use range from the viewpoint of the amphiphilic balance.
[0017]
The liposome-forming agent of the present invention is a liposome-forming agent containing the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, and may consist only of the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, or form a liposome membrane. It may contain other known components used in the above. Examples of other components include lecithin, other phospholipids, and cholesterol.
[0018]
Since the liposome-forming agent of the present invention contains the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, it has excellent storage stability as a liposome solution and is safe because it contains a small amount of monoacylphospholipid having strong biotoxicity, For this reason, the liposome which can be utilized as a highly safe drug delivery system can be obtained by using the liposome forming agent of the present invention.
[0019]
The reason for the excellent storage stability as a liposome solution is presumed as follows. Monoacyl phospholipids are less hydrophobic than diacyl phospholipids and are therefore easily detached from the liposome surface. For this reason, liposomes with a high monoacylphospholipid content tend to be unstable due to aggregation of liposome particles and phase separation, because monoacylphospholipids are detached from the liposome surface and the hydration layer on the liposome surface decreases. On the other hand, since the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention has a low monoacyl content, detachment of the phospholipid from the liposome surface hardly occurs, and thus the storage stability of the liposome solution is excellent.
[0020]
The reason why the liposome solution is excellent in storage stability is as follows. When the polyalkylene oxide-modified monoacyl phospholipid content is high, this compound has low lipophilicity and thus becomes less hydrophobic and may be released from the liposome surface. As a result, the hydration layer on the surface of the liposome is reduced, and the liposome particles are aggregated to cause phase separation and become unstable. The polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention has a low monoacyl content and is excellent in storage stability when formed into a liposome solution.
[0021]
The chemical modifier for a physiologically active substance of the present invention is a chemical modifier for a physiologically active substance containing the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, and comprises only the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention. It may also contain other known components used for chemical modification of physiologically active substances.
[0022]
The physiologically active substance to be chemically modified is not particularly limited as long as it has a functional group such as amino group, carboxyl group, hydroxyl group, and thiol group. For example, enzymes, antibodies, other proteins, sugars, lipids, glycoproteins, glycolipids , Hormones.
[0023]
When the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention is used as a chemical modifier for a physiologically active substance, Y in formula (1) is preferably an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group or a thiol group. When having such a group, it can be easily reacted with a functional group present in the physiologically active substance. For example, when Y is a carboxyl group, a polyalkylene oxide-modified phospholipid skeleton can be introduced into the physiologically active substance by forming a CONH bond with an amino group in the physiologically active substance. The physiologically active substance thus chemically modified can be present on the liposome surface when used as a liposome component. For example, when the physiologically active substance is an antibody protein, it can be used as a ligand for a target cell. Liposomes can be concentrated and transported to target cells.
[0024]
The emulsifier of the physiologically active substance of the present invention is an emulsifier of the physiologically active substance containing the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, and may comprise only the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, It may contain other known components used for emulsification of physiologically active substances.
[0025]
Since the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention has hydrophilicity derived from an oxyalkylene group and hydrophobicity derived from an acyl group, it can be used as an emulsifier and has excellent storage stability. Yes. Furthermore, it is composed of a phospholipid equivalent to a biological cell component and a toxic oxyalkylene group having low toxicity, and the content of monoacylphospholipid having strong biological toxicity is small, so that safety is high. For this reason, by using an emulsifier containing such a polyalkylene oxide-modified phospholipid, for example, a highly safe emulsion of a physiologically active substance can be obtained. Specifically, emulsions of physiologically active substances such as enzymes, antibodies, other proteins, sugars, lipids, glycoproteins, glycolipids or hormones can be obtained.
[0026]
  The polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention is the step (A)., (B), (C)and(D)Made easier byBuildCan.
    In the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) and the phospholipid represented by the formula (3) used in the step (A), R¹, R², R^Three, R^FourO, n, X, p and Y are the same as those described in the formula (1).
[0027]
The polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) used in the step (A) can be produced by a known method. For example, as described later, it can be easily produced by reacting a polyalkylene oxide compound represented by the formula (4) with a dicarboxylic acid anhydride.
[0028]
  The phospholipid represented by the formula (3) may be a natural phospholipid or a synthetic phospholipid, and examples thereof include natural and synthetic phosphatidylethanolamines such as soybean and soybean hydrogenated phosphatidyldiethanolamine, egg yolk and egg yolk hydrogenated phosphatidyldiethanolamine, and the like. As the phospholipid represented by the formula (3),rIs preferably phosphatidylethanolamine.
[0029]
As the dehydrating condensing agent used in the step (A), the carboxyl group of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) and the functional group of the phospholipid of the formula (3) can be dehydrated and combined. Compounds can be used without limitation. Examples of such a dehydration condensing agent include carbodiimide derivatives such as dicyclohexylcarbodiimide. As the dehydrating condensation agent, dicyclohexylcarbodiimide is preferable.
The amount of the dehydrating condensing agent used is 1.05 to 5 times mol, preferably 1.5 to 2.5 times mol of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2). Furthermore, when raising a reaction rate, it is preferable to add 0.1-2 times mole of N-hydroxysuccinimide with respect to the polyalkylene oxide compound shown by said Formula (2) in a reaction system.
[0030]
The buffer used for the reaction in the step (A) is a buffer containing sodium or potassium, for example, a buffer containing sodium or potassium as a counter ion. The pH of the buffer solution is 5 to 13, preferably 8 to 11. Specific examples of the buffer include phosphate buffer, acetate buffer, carbonate buffer, and borate buffer. Among these, a phosphate buffer is preferable. The amount of sodium and / or potassium contained in the buffer solution is 1.5 to 10 times mol, preferably 2 to 5 times mol of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2).
[0031]
The organic solvent used for the reaction in the step (A) can be used without particular limitation as long as it does not have a functional group such as a hydroxyl group. Examples thereof include ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, benzene and toluene. Of these, chloroform and toluene are preferred. An organic solvent having a hydroxyl group such as ethanol is not preferable because it reacts with the carboxyl group at the terminal of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2). Dichloromethane or the like has no problem in reactivity, but is low in work because of its low boiling point.
The reaction in the step (A) is performed in a mixed medium of the buffer solution and the organic solvent. The mixing ratio of the buffer solution and the organic solvent is 0.1 to 50 parts by volume, preferably 1 to 10 parts by volume with respect to 100 parts by volume of the organic solvent.
[0032]
The reaction temperature of the reaction in step (A) is 30 to 90 ° C, preferably 40 to 80 ° C. The reaction time is 1 hour or longer, preferably 2 to 8 hours. When the temperature is lower than 30 ° C., the reaction rate is low, and when the temperature is higher than 90 ° C., the acyl group of the phospholipid represented by the formula (3) used for the reaction may be hydrolyzed, which is not preferable.
[0033]
Thus, by reacting the polyalkylene oxide compound represented by the above formula (2) with the phospholipid dicarboxylic acid anhydride represented by the above formula (3), the polyalkylene oxide represented by the above formula (1) is reacted. An alkylene oxide modified phospholipid is obtained. However, at this stage, hydrogen-type phospholipids in which M in the formula (1) is a hydrogen atom are often included. After completion of the step (A), the reaction solution can be directly used for the next step (B).
[0034]
In the production method of the present invention, the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) and the phospholipid represented by the formula (3) are reacted in the presence of the dehydrating condensing agent as described above. However, as another method, an activated ester derivative of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) can be reacted with the phospholipid represented by the formula (3). The activated ester derivative can be obtained, for example, by reacting a polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) with an activating agent in the presence of the dehydrating condensing agent.
[0035]
Examples of the activator include N-hydroxysuccinimide, N, N'-disuccinimide carbonate, 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, N-hydroxyphthalimide 4-hydroxyphenyldimethylsulfonium methylsulfate, isobutyl chloroformate and the like. Among these, N-hydroxysuccinimide is preferable.
[0036]
The reaction between the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) and the activating agent is the same as the reaction with the dicarboxylic acid anhydride, such as a solvent that does not react with the carboxylic acid in the presence of the dehydrating condensing agent, such as chloroform and toluene. In the reaction solvent at a reaction temperature of 15 to 80 ° C., preferably 25 to 55 ° C., by dispersing and stirring the activator in the polyalkylene oxide compound solution.
For example, when N-hydroxysuccinimide is used as the activator, the carboxyl group of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) reacts with the imide group of N-hydroxysuccinimide, and the formula An activated ester derivative in which N-hydroxysuccinimide is bonded to the carboxyl group side terminal of the polyalkylene oxide compound represented by (2) is obtained.
[0037]
In the step (A), when the terminal of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) is an amino group, a carboxyl group or a thiol group, particularly an amino group, it is preferable to protect these groups for use in the reaction. . For example, in the case of an amino group, a protective group such as tert-butoxycarbonyl group or 9-fluorenylmethylcarbonyl group is attached, and in the case of a carboxyl group, it is protected by esterification with a methyl group or the like. Is preferably protected by attaching a protecting group such as an St-butyl sulfide group.
[0038]
In step (B), the reaction solution obtained in step (A) is adjusted to pH 6 to 9, preferably pH 6.5 to 8, with an alkali containing sodium ions and / or potassium ions. Examples of the alkali used at this time include sodium hydroxide and potassium hydroxide. The alkali is usually used in the form of an aqueous solution, and examples thereof include a salt aqueous solution, a sodium hydroxide aqueous solution, or a potassium hydroxide aqueous solution of the buffer solution used in the mixed medium in step (A). However, when the pH of the reaction liquid is 6.5 to 8 after the completion of the step (A), pH adjustment may not be performed.
[0039]
By adjusting the pH of the reaction solution obtained in the step (A), the hydrogen type is converted to the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention.
After completion of the step (B), the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention represented by the above formula (1) is increased by a known method such as crystallization by introducing the reaction solution into a poor solvent or a non-solvent. Purity and high yield can be obtained. By purifying the obtained polyalkylene oxide-modified phospholipid or the reaction solution of step (B) in the following purification step, a further highly pure target product can be obtained.
[0040]
In step (C), the reaction solution in step (B) is dehydrated using a dehydrating agent. Dehydration can be performed by adding a dehydrating agent to the reaction solution in step (B). The reaction solution in step (B) is a mixed solution of a buffer solution and an organic solvent, but water is removed by dehydration, and a single solution of the organic solvent is obtained. Thereby, in the solvent purification in the next step (D), an excellent yield and purity can be obtained.
[0041]
As the dehydrating agent used in the step (C), a known dehydrating agent that does not react with the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the formula (1) and the organic solvent used in the step (A) can be used. Anhydrous salts are preferred, especially anhydrous sodium sulfate. When an inorganic salt other than sodium and potassium, for example, a divalent metal salt such as magnesium sulfate is used as the dehydrating agent, the counter ion of the phosphate group of the polyalkylene oxide-modified phospholipid of formula (1) is a monovalent metal salt The divalent salt is replaced with a divalent salt, so that the solubility of the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the formula (1) in water is lowered, which causes a problem when used as a drug delivery substrate.
[0042]
Before performing the step (D), it is preferable to remove insoluble matters from the reaction solution of the step (B) or the reaction solution of the step (C) by filtration or the like. In the case of filtering the reaction solution in step (B), an unreacted phospholipid, in the case of filtering the reaction solution in step (C), an inorganic dehydrating agent used for dehydration in addition to the unreacted phospholipid, The salt of the buffer solution used in) becomes insoluble and the deposited salt is removed. The filter medium used for filtration is not particularly limited as long as it can remove the insoluble matter in the liquid to be treated. Usually, various kinds of media such as paper and glass having a reserved particle pore diameter of 1 to 10 μm and solvent resistance. Material filters can be used. There is no restriction | limiting in the filtration method, For example, methods, such as reduced pressure filtration, pressure filtration, and centrifugal filtration, can be used.
[0043]
  In step (D)Is a craft(C) reaction solution orThisAn ether such as an aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms or diethyl ether is added to the filtered filtrate to crystallize the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the above formula (1).
[0044]
The addition amount of the aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms is 1 to 50 times the volume, preferably 2 to 5 times the volume of the liquid to be treated in the step (D). When the amount of the aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms is less than the capacity of the liquid to be treated, the polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the formula (1) may not sufficiently precipitate and remain in the solution. is there. Crystallization can be carried out at room temperature without problems, but if cooled to 10 ° C. or lower, the filtration rate is fast and crystals can be obtained in good yield.
[0045]
Excess dehydration condensing agent such as dicyclohexyl carbodiimide can be removed by the treatment in step (D), but it can also be removed by other purification steps. Therefore, when further purification is performed, the organic solvent is removed by distillation or the like to obtain crystals. May be used. When removing the organic solvent, it is desirable to carry out under reduced pressure at 80 degrees C or less. When the distillation temperature of the organic solvent exceeds 80 ° C., undesirable side reactions such as hydrolysis of the acyl group of the polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the formula (1) may occur.
[0046]
The crystals obtained in the step (D) can be used as the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, and further can be subjected to purification.
[0047]
In the method of the present invention, by performing the step (E) after the step (D), the excess of sodium, potassium, etc. used as a buffer that could not be removed by the pretreatment in the step (D) (1) It is possible to adsorb and remove free salts that are not bound to the polyalkylene oxide-modified phospholipid. The step (E) may be performed after the step (F) after the step (F).
[0048]
In the step (E), the crystal obtained in the step (D) may be used as it is and heated to be treated as a liquid. The crystal has a low water content such as ethyl acetate, chloroform, toluene, etc. The polyalkylene oxide-modified phospholipid (1) can be dissolved in a solvent that dissolves, and an adsorbent is added to the solution and stirred.
[0049]
The adsorbent used in the step (E) is an adsorbent containing alkaline earth metal oxide, alkaline earth metal hydroxide, aluminum or silicon. For example, aluminum hydroxide, aluminum oxide, magnesium oxide, hydroxide Examples include adsorbents containing magnesium, silicon oxide and the like. Commercially available adsorbents containing these compounds include Kyoward 200, Kyoward 300, Kyoward 500, Kyoward 600, Kyoward 700, Kyoward 1000, Kyoward 2000 (manufactured by Kyowa Chemical Industry Co., Ltd., Trademark), Tomix-AD300, Tomix-AD500, Tomix-AD700 (trade name, manufactured by Iwata Pharmaceutical Co., Ltd.), and the like. Adsorbents can be used alone or in combination of two or more.
[0050]
The treatment temperature using the adsorbent is 10 to 85 ° C, preferably 40 to 70 ° C, and the time is 10 minutes to 5 hours, preferably 30 minutes to 2 hours. The crystal obtained in the step (D) may be treated as it is, but the crystal does not dissolve at the above temperature or the viscosity of the solution is often high, and the polyalkylene oxide modified phospholipid of the present invention such as toluene or chloroform This is performed by diluting with an organic solvent that dissolves. When the treatment temperature is less than 10 ° C., the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention may be precipitated, and when the adsorbent is removed, the polyalkylene oxide-modified phospholipid is also removed and the yield is lowered. Moreover, when it is 85 degreeC or more and it cannot remove completely by process (C) and a trace amount of water | moisture content exists, a hydrolysis etc. of polyalkylene oxide modification phospholipid may occur during adsorption agent processing. The adsorbent is used in an amount of 0.1 to 15 parts by weight, preferably 0.5 to 7.5 parts by weight, based on 100 parts by weight of the crystal or solution to be treated. If the amount of adsorbent is less than the above lower limit, excess free salt cannot be sufficiently removed, and if it exceeds the upper limit, removal of the adsorbent is difficult and the yield of the main component is reduced.
[0051]
After completion of the step (E), the adsorbent is removed by a method such as filtration, and the obtained separation liquid (hereinafter sometimes referred to as the treatment liquid in the step (E)) is re-used using a poor solvent or a non-solvent. It can be crystallized. The crystal thus obtained can be used as the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, and the treatment liquid in the step (E) can be further subjected to purification.
[0052]
In the method of the present invention, in step (F), at least one poor solvent or non-solvent selected from the group consisting of aliphatic hydrocarbons having 5 to 8 carbon atoms and ether is added to the treatment liquid in step (E). The obtained crystals are dissolved by adding at least one solvent selected from the group consisting of chloroform, toluene, ethyl acetate, acetone and alcohols having 1 to 3 carbon atoms, ether, acetone or carbon atoms having 5 to 5 carbon atoms. Crystallization is performed using 8 aliphatic hydrocarbons.
[0053]
There is no restriction | limiting in particular in the said C5-C8 aliphatic hydrocarbon used at a process (F), For example, a pentane, isopentane, neopentane, hexane, isohexane, 3-methylpentane, neohexane, 2,3-dimethyl Butane, heptane, 2-methylhexane, 3-methylhexane, 3-ethylpentane, 2,2-dimethylpentane, 2,3-dimethylpentane, 2,2-dimethylpentane, 3,3-dimethylpentane, 2,3 , 3-trimethylbutane, octane, 2-methylheptane, 3-methylheptane, 4-methylheptane, 3-ethylhexane, 2,2-dimethylhexane, 2,3-dimethylhexane, 2,4-dimethylhexane, 2 , 5-dimethylhexane, 3,3-dimethylhexane, 3,4-dimethylhexane, 2-methyl-3- Chirupentan, 3-methyl-3-ethyl pentane, 2,2,3-trimethylpentane, 2,2,4-trimethylpentane, and the like 2,2,3,3-tetramethyl-butane. Of these, hexane and heptane are preferred.
[0054]
In carrying out the step (F), when it is desired to further increase the purity, two or more kinds of solvents selected from acetone, ethyl acetate, or a C1-C3 alcohol and a C5-C8 aliphatic hydrocarbon are used. A polyalkylene oxide-modified phospholipid having an excellent purity can be obtained by performing the step (F) after dissolving and removing insolubles by using a combination of these as a solvent. At this time, a solvent selected from acetone, ethyl acetate, or an alcohol having 1 to 3 carbon atoms is added in an amount of 1 to 20 times by weight with respect to the polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the formula (1), and 30 to 85 ° C. Insoluble matter is removed by filtration. After removing the insoluble matter, the mixture is cooled to 50 ° C. or lower, and then an aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms is added and cooled to 35 ° C. or lower, preferably 15 ° C. or lower. At this time, if dissolved at 80 ° C. or higher, the acyl group of the phospholipid may be decomposed to produce a monoacyl body. Monoacylphospholipids have problems when administered to living bodies. In addition, when an aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms is added and cooled, the polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the formula (1) is not sufficiently precipitated at 40 ° C. or higher, and the recovery rate may be lowered. is there.
[0055]
By producing as described above, a high-purity polyalkylene oxide-modified phospholipid can be easily obtained in a high yield with a low content of toxic monoacyl phospholipid and a low content of other impurities. .
[0056]
In addition, the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) used as the starting material of the step (A) is, for example, the formula (4).
HO- (R^FourO) n-Xp-Y (4)
(In formula (4), R^FourO, n, X, p and Y are the same as those in the formula (1). )
It can manufacture by making the polyalkylene oxide compound shown by and dicarboxylic anhydride react in presence of a basic catalyst.
[0057]
Examples of the dicarboxylic acid anhydride include oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, maleic acid, fumaric acid, phthalic acid, and terephthalic acid anhydride. And so on. Among these, succinic acid, glutaric acid, adipic acid and pimelic acid anhydride are preferable, and succinic acid or glutaric acid anhydride is particularly preferable. As the dicarboxylic acid anhydride, either an intramolecular anhydride or an intermolecular anhydride may be used.
[0058]
The basic catalyst can be used without particular limitation. Examples thereof include sodium acetate, sodium phosphate, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium borate, triethylamine, dimethylaminopyridine and the like, preferably sodium acetate and sodium phosphate. When using triethylamine and dimethylaminopyridine, it is necessary to remove the catalyst before the step (A).
The reaction is usually carried out using a reaction solvent. In this case, a reaction solvent other than the solvent that reacts with the polyalkylene oxide compound represented by the formula (4) and the dicarboxylic acid anhydride can be used without limitation. For example, chloroform, toluene, tetrahydrofuran, acetonitrile and the like can be mentioned. Alcohol is not preferable because it reacts with the dicarboxylic anhydride.
[0059]
The reaction is desirably performed at a reaction temperature of 30 to 180 ° C, preferably 60 to 130 ° C, more preferably 80 to 120 ° C, and a reaction time of 1 to 20 hours, preferably 3 to 10 hours. If the temperature is lower than 30 ° C, the reaction rate is low, and if it is higher than 180 ° C, the terminal active group may be decomposed, which is not preferable.
The amount of the carboxylic acid anhydride is 1 to 3 times mol, preferably 1.02 to 1.5 times mol, based on 1 mol of the hydroxyl group of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (4). .
[0060]
In this way, the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) is obtained by reacting the polyalkylene oxide compound represented by the formula (4) with the dicarboxylic acid anhydride. After completion of the reaction, an aliphatic hydrocarbon such as hexane is added to the reaction solution to crystallize the reaction product, and this crystal can be subjected to the next step (A).
[0061]
【The invention's effect】
The polyalkylene oxide modified phospholipids of the present invention are new and useful. Since the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention is a high-purity polyalkylene oxide-modified phospholipid having high storage stability and a low content of impurities such as a monoacyl phospholipid body and high safety to living bodies, a liposome-forming agent, It can be suitably used as a chemical modifier for physiologically active substances and an emulsifier for physiologically active substances.
[0062]
  In the production method of the present invention, the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) and the phospholipid represented by the formula (3) are mixed with sodium ions and / or potassium ions in the presence of a dehydrating condensing agent. Reacting at 30 to 90 ° C. in a mixed medium of a buffer solution and an organic solvent, or an activated ester derivative of a polyalkylene oxide compound represented by the formula (2),in frontA step (A) in which a phospholipid represented by the formula (3) is reacted at 30 to 90 ° C. in a mixed medium of a buffer solution containing sodium ions and / or potassium ions and an organic solvent; and step (A) Step (B) of adjusting the reaction solution obtained in step 1 to pH 6-9 with an alkali containing sodium ions and / or potassium ionsAnd step (C) of dehydrating using a dehydrating agent after step (B), and step (D) of performing purification using aliphatic hydrocarbon or ether having 5 to 9 carbon atoms after step (C).Therefore, the polyalkylene oxide-modified phospholipid can be easily and efficiently produced with high purity.
[0063]
【Example】
Example 1
(1) Synthesis of monomethyl polyoxyethylene (molecular weight 5000) succinimidyl glutarate
After adding 0.05 g (0.4 mmol) of sodium phosphate to 50 g (0.01 mol) of monomethoxypolyoxyethylene (average molecular weight 5000) and heating to 100 ° C. to make uniform, glutaric anhydride 1. 25 g (0.011 mol) was added, and the reaction was performed at 110 ° C. for 8 hours. After cooling, 200 mL of isopropyl alcohol was added to obtain monomethyl polyoxyethylene glutarate crystals. After 150 mL of toluene was added to the crystals and dissolved by heating at 40 ° C., 1.24 g (0.011 mol) of N-hydroxysuccinimide and 4.25 g (0.021 mol) of dicyclohexylcarbodiimide were added, and at 40 ° C. Reacted for 2 hours. After the reaction, filtration was performed to obtain 48 g of a crude methylpolyoxyethylene succinimidyl glutarate activated product represented by the following formula (5).
[Chemical formula 5]

[0064]
(2) Synthesis of monomethyl polyoxyethylene glutaryl (molecular weight 5000) distearoylphosphatidylethanolamine
75 mL of toluene was added to 14.96 g (0.02 mol) of distearoylphosphatidylethanolamine and heated to 60 ° C. to obtain a phospholipid toluene solution. Moreover, 7.5 mL of distilled water and 0.75 mL of 30% sodium hydroxide aqueous solution were added to 7.2 g (0.05 mol) of disodium hydrogen phosphate and dissolved by heating to obtain a phosphate buffer. This phosphate buffer was added to the phospholipid toluene solution and stirred at 60 ° C. to obtain a phospholipid buffer mixture. To this phospholipid buffer mixed solution, the crude monomethyl polyoxyethylene succinimidyl glutarate activator of the above formula (5) was added and reacted at 60 ° C. for 5 hours. After the reaction, the solution was neutralized to pH 7 with 0.5N aqueous sodium hydroxide solution. Thereafter, 150 g of sodium sulfate was added and stirred for 1 hour to perform dehydration.
[0065]
  Insoluble matter was removed by filtration after the dehydration step, 400 mL of hexane was added to the filtrate, and the mixture was stirred for 1 hour to precipitate crystals. The crystals were obtained by filtration. The obtained crude crystals were dissolved by heating in 100 mL of ethyl acetate at 50 ° C., 0.5 g of Kyoward KW # 700 and Kyoword KW # 1000 were added as adsorbents, and the mixture was stirred for 30 minutes. The keyword was removed by suction filtration, and 50 mL of hexane was added to the obtained filtrate to cause crystal precipitation. The crystals were obtained by filtration. Acetone (300 mL) was added to the crystals, dissolved by heating at 50 ° C., and filtered while hot to remove unreacted phospholipids as insoluble matters. Thereafter, the mixture was cooled to 15 ° C. or lower to precipitate crystals. The crystals were obtained by filtration. 180 mL of ethyl acetate was added to the obtained crystals and dissolved by heating to 60 ° C., and then cooled to 15 ° C. or lower to precipitate crystals. The crystals were collected by filtration. When there was an insoluble matter at the time of warming dissolution, it was removed by filtration and proceeded to the next step. Further, the obtained crystals were again dissolved in 200 mL of ethyl acetate in the same manner, 100 mL of hexane was added, and the precipitated crystals were filtered to obtain 50 g of crystals having a final purity of 98%. The yield was 90.8% based on the activated polyoxyethylene. The results are summarized in Table 1.
  In additionAs a reference exampleWhen neutralization was carried out without adding a dehydration step after neutralization, 52 g of crystals having a purity of 87% was obtained, and the yield was 94.5%.
[0066]
The product was analyzed by thin layer chromatography (TLC) using silica gel plates. As a developing solvent, a mixed solvent having a mixing ratio of chloroform and methanol of 85:15 by weight was used, and the substance contained was quantified by coloring with iodine vapor and comparing with a known amount of standard substance.
[0067]
Example 2
Synthesis of monomethyl polyoxyethylene succinyl (molecular weight 2000) dilauroylphosphatidylethanolamine
After adding 0.05 g (0.4 mmol) of sodium phosphate to 20 g (0.01 mol) of monomethoxypolyoxyethylene (average molecular weight 2000) and heating to 100 ° C. to make uniform, 1.1 g of succinic anhydride was added. (0.011 mol) was added, the reaction was performed at 100 ° C. for 6 hours, and a crude monomethyl polyoxyethylene succinimidyl succinate activated product was obtained in the same manner as in (1) of Example 1.
On the other hand, using 11.6 g (0.02 mol) of dilauroylphosphatidylethanolamine, a phospholipid buffer mixed solution was prepared under the same conditions as in Example 1.
[0068]
The crude monomethyl polyoxyethylene succinimidyl succinate activated product was added to this phospholipid buffer mixed solution, and reacted at 60 ° C. for 5 hours. After the reaction, purification was performed under the same conditions as in Example 1 to obtain 18 g of final crystals. The purity was 98%. The yield was 69.2% based on the activated polyoxyethylene. The results are summarized in Table 1.
[0069]
Example 3
Monoaminoethyl polyoxyethylene (molecular weight 3400) glutaryl distearoyl phosphatidylethanolamine
Monoaminoethyl polyoxyethylene (average molecular weight 3400) is obtained by using 3.4 g (0.001 mol) of terminal amino group in accordance with the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. 69, 730 (1972) with an anhydride. Protected with a tert-butoxycarbonyl group, the other end was activated with succinimidyl glutarate according to the method of Example 1 (1), and crude tert-butoxycarbonyl protected aminoethyl polyoxyethylene (molecular weight 3400) succinimidyl glutarate A rate activated form was prepared.
On the other hand, a phospholipid buffer mixed solution was prepared under the same conditions as in Example 1 using 1.16 g (0.002 mol) of distearoylphosphatidylethanolamine.
[0070]
The crude tert-butoxycarbonyl-protected aminoethyl polyoxyethylene (molecular weight 3400) succinimidyl glutarate activator was added to this phospholipid buffer mixed solution and reacted at 45 ° C. for 5 hours. After the reaction, 0.1 g of Kyoword KW # 700 and 0.05 g of Kyoword KW # 1000 were added and stirred for 30 minutes. The keyword was removed by suction filtration, 2.5 M hydrochloric acid in acetonitrile was added, and the mixture was stirred for 30 minutes at room temperature to hydrolyze the protecting groups and neutralized with an aqueous sodium hydroxide solution. To the neutralized solution, 0.1 g of Kyoward KW # 700 and 0.05 g of Kyoword KW # 1000 were added and stirred for 30 minutes, followed by filtration to remove insoluble matters and the solvent of the filtrate. Crystallization using acetone and ethyl acetate was purified under the same conditions as in Example 1 to obtain 2 g of final crystals. The purity was 90%. The yield based on monoaminoethyl polyoxyethylene was 52.0%. The results are summarized in Table 1.
[0071]
Example 4
Synthesis of monomethyl polyoxyethylene succinyl (molecular weight 5000) distearoylphosphatidylethanolamine
In the same manner as in Example 2, 50 g (0.01 mmol) of monomethoxypolyoxyethylene (average molecular weight 5000) was converted to an activated form of monomethoxypolyoxyethylene succinimidyl succinate, and 15.0 g of distearoylphosphatidylethanolamine (0 0.02 mol) and further purified in the same manner to obtain monomethylpolyoxyethylenesuccinyl (molecular weight 5000) distearoylphosphatidylethanolamine. A final crystal (53 g) having a purity of 98.5% was obtained, and the yield was 91.0% based on the activated polyoxyethylene. The results are summarized in Table 2.
[0072]
Example 5
Synthesis of monomethyl polyoxyethylene glutaryl (molecular weight 5000) didocosanoyl phosphatidylethanolamine
75 mL of toluene was added to 14.96 g (0.02 mol) of didocosanoylphosphatidylethanolamine and heated to 60 ° C. to obtain a phospholipid toluene solution. Moreover, 7.5 mL of distilled water and 0.1 mL of 30% sodium hydroxide aqueous solution were added to 5.3 g (0.05 mol) of sodium carbonate and dissolved by heating to obtain a carbonate buffer. This carbonate buffer was added to the phospholipid toluene solution and stirred at 60 ° C. to obtain a phospholipid buffer mixture.
[0073]
The crude monomethyl polyoxyethylene succinimidyl glutarate activator prepared in Example 1 was added to this phospholipid buffer mixed solution, and the reaction was performed at 60 ° C. for 5 hours. When the pH was lowered after the reaction, the solution was neutralized to pH 7 with 0.5N sodium hydroxide solution, 150 g of sodium sulfate was added, and the mixture was stirred for 1 hour for dehydration. Thereafter, purification was performed in the same manner as in Example 1 to obtain 48 g of crystals having a final purity of 95%. The yield was 87.2% based on the activated polyoxyethylene. The results are summarized in Table 2.
[0074]
Comparative Example 1
Synthesis of monomethylpolyoxyethylene (average molecular weight 5000) succinyl distearoyl phosphatidylethanolamine
Chloroform 10 mL was added to distearoylphosphatidylethanolamine 149.6 mg (0.2 mmol) and stirred to obtain a phospholipid chloroform solution. To the solution, 3.06 g (0.6 mmol) of monomethyl polyoxyethylene succinimidyl succinate was added, 0.01 g (0.7 mmol) of triethylamine was further added, and the reaction was performed at room temperature overnight. After the reaction, chloroform was removed by nitrogen blowing, and the resulting residue was redissolved in a 0.145 M aqueous sodium chloride solution to hydrolyze unreacted monomethyl polyoxyethylene succinimidyl succinate. The solution was developed on a Bio-Gel A-1.5m column equilibrated with physiological saline and eluted with physiological saline. Fractions containing polyoxyethylene-modified phosphatidylethanolamine micelles in the excluded volume were collected, dialyzed against water for 5 days, and then lyophilized to obtain 195 mg of crystals. The yield was 35.5% based on distearoylphosphatidylethanolamine used in the reaction, and the purity was 94%.
[0075]
Since the main component obtained by the above method has a pH of 5 to 6 in physiological saline and water, the H type in which the phosphate group portion is not neutralized is also included. The following neutralization step was performed to make all sodium salts.
195 mg of the obtained crystals were dissolved in 1.95 mL of methanol, and about 0.15 mL of 0.1N sodium hydroxide aqueous solution was added with stirring until the pH reached 7-8. Thereafter, the mixture was concentrated using an evaporator, and 5 mL of hexane was added and filtered to obtain precipitated crystals. The yield of the obtained sodium salt type was 28%, and the purity was 85%. The results are summarized in Table 3.
[0076]
Comparative Example 2
Synthesis of monomethyl polyoxyethylene (average molecular weight 1900) succinyl hydrogenated soybean phosphatidylethanolamine
Comparative Example 19 g (10 mmol) of monomethyl polyoxyethylene succinate (average molecular weight 1900) was dissolved in carbon tetrachloride, 5 g (50 mmol) of succinic anhydride was added to the solution, heated to 75 ° C. and stirred overnight. After the reaction, it was filtered to remove excess succinic anhydride. This dried sample was dissolved in a mixed solvent of ethylene chloride / methanol / concentrated aqueous ammonia having a volume ratio of 95/5 / 0.8 and developed on a silicic acid column equilibrated with the same solution. By elevating the methanol content of the eluting solvent, the eluted succinylethylene glycol fraction was collected and the solvent was removed to obtain a dried product.
[0077]
Monomethyl polyoxyethylene succinimidyl succinate (638 mg, 2.4 mmol) was dissolved in benzene (11 mL), 1,1-carbonyldiimidazole (315 mg, 2.16 mmol) was added, and the mixture was heated to 40 ° C. To this solution, 594.4 mg (0.8 mmol) of hydrogenated soybean phosphatidylethanolamine was added, and then the solvent was removed, the solution was concentrated to 3 mL, and reacted at 65 ° C. for 3 hours. After the reaction, the solvent is removed by an evaporator, and the obtained sample is purified by silicic acid chromatography. The eluted polyoxyethylene-modified phosphatidylethanolamine-containing fraction is separated, the solvent is removed, and the purity is 95%. 324 mg of product was obtained. The yield was 15% based on the distearoylphosphatidylethanolamine used for the reaction.
[0078]
The main component obtained by the above method is of the hydrogen (H) type, and a sodium salt was prepared in the same manner as in Comparative Example 1 in order to substitute the sodium salt. The purity of the obtained sodium salt type was 91%, and the yield was 12%. The results are summarized in Table 3.
[0079]
Comparative Example 3
638 mg (2.4 mmol) of monomethyl polyoxyethylene succinimidyl succinate (average molecular weight 1900) obtained in the same manner as in Comparative Example 2 was dissolved in 11 mL of benzene, and 315 mg (2.16 mmol) of 1,1-carbonyldiimidazole was dissolved. ) Was added and warmed to 40 ° C. To this solution, 594.4 mg (0.8 mmol) of hydrogenated soybean phosphatidylethanolamine was added, and then the solvent was removed, the solution was concentrated to 3 mL, and reacted at 65 ° C. for 3 hours. After the reaction, the solvent was removed by an evaporator, and two-phase separation was performed using chloroform and 0.2 M hydrochloric acid. The lower layer was collected, washed and extracted four times in the aqueous phase, desolvated, and dried. The obtained sample was dissolved in a mixed solvent of ethylene chloride / methanol / concentrated aqueous ammonia having a volume ratio of 95/5 / 0.8 and developed on a silicic acid column equilibrated with the same solution. By elevating the methanol content of the elution solvent, the eluted polyoxyethylene-modified phosphatidylethanolamine-containing fraction was collected, and the solvent was removed to obtain 800 mg of a dried product. The yield was 37.2% based on the distearoylphosphatidylethanolamine used in the reaction, and the purity was 94%.
[0080]
The main component obtained by the above method is an ammonium salt. In order to substitute the sodium salt, first, ammonium ions are removed using a cationic strong acidic resin, and the sodium salt is prepared in the same manner as in Comparative Example 1. It was. The purity of the obtained sodium salt type was 85%, and the yield was 30%. The results are summarized in Table 3.
[0081]
Comparative Example 4
Synthesis of monomethyl polyoxyethylene glutaryl (molecular weight 5000) distearoylphosphatidylethanolamine
Chloroform 10 mL was added to distearoylphosphatidylethanolamine 149.6 mg (0.2 mmol) and stirred to obtain a phospholipid chloroform solution. To the solution, 3.06 g (0.6 mmol) of monomethyl polyoxyethylene succinimidyl succinate was added, 0.01 g (0.7 mmol) of triethylamine was further added, and the mixture was stirred overnight at room temperature for reaction. After the reaction, chloroform was removed by nitrogen blowing, the obtained residue was dispersed in water, and the solution was dialyzed against water for 5 days using Spectra-Por CE300000MW (Spectrum Medical). Thereafter, the crystals were lyophilized to obtain 195 mg of crystals. The yield was 25% based on distearoylphosphatidylethanolamine used in the reaction, and the purity was 85%.
[0082]
Since the main component obtained by the above method has a pH of 5 to 6 in dialysis water, the H type and triethylamine type in which the phosphate group portion is not neutralized are also included. Triethylamine is highly toxic and is treated with sodium salt in the same manner as in Comparative Example 3 in order to make all sodium salt. The yield of the obtained sodium salt type was 18% and the purity was 80%. The results are summarized in Table 3.
[0083]
[Table 1]
Table 1

[0084]
[Table 2]
Table 2

[0085]
[Table 3]
Table 3

[0086]
Notes to Tables 1 to 3
  * 1 Na salt purity: purity and unit of polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the formula (1)wt%
  * 2 Lyso body content: Monoacyl phospholipid body content, unitwt%
  * 3 Free PE content: Unreacted phospholipid content, unitwt%
  * 4 Free PEG derivative content: Unit wt%
  * 5 Free salt content: Content and units of phosphate and other saltswt%
[0087]
From the results of Tables 1 to 3, it can be seen that the production method of the example can produce a high-purity Na salt in a high yield as compared with the comparative example.
[0088]
Example 6
Comparison of storage stability of sodium type and hydrogen type (H) of monomethyl polyoxyethylene succinyl (molecular weight 5000) distearoylphosphatidylethanolamine
With respect to the sodium type of monomethylpolyoxyethylenesuccinyl (molecular weight 5000) distearoylphosphatidylethanolamine obtained in Example 4 and the hydrogen type (H) as a control product, the main component content was changed over time under the following conditions. Measured by TLC in Example 1. The results are shown in Table 4.
conditions
Storage conditions: -30 ° C, 4 ° C, 20 ° C, 40 ° C
・ Sample form: powder (in the presence of air, brown bottle)
[0089]
[Table 4]
Table 4 Purity change (main component content%)

Note) The storage ratio is the ratio of the content after the storage period to the content at the start of storage.
[0090]
As can be seen from the results in Table 4, it can be seen that the sodium type of the example is excellent in storage stability not only when stored at a low temperature but also when stored for a long time at a temperature higher than room temperature. On the other hand, it can be seen that the content of the hydrogen type of the comparative example greatly decreases with time, and the purity decreases greatly particularly when the storage temperature is high. When stored at 40 ° C., the storage rate of the sodium type of the example is 97.1% after 6 months, whereas the storage rate of the hydrogen type of the comparative example is 70.0% after 1 week. Even though the storage period is 25 times or more, the storage rate of the example still shows a high value.
[0091]
Example 7
An emulsion was prepared using the monomethyl polyoxyethylene succinyl (molecular weight 5000) distearoylphosphatidylethanolamine of Example 3. That is, after heating the oil phase part containing an emulsifier among the base materials which consist of a composition of Table 5 to 60 degreeC, and melt | dissolving uniformly, the water phase part was added at the same temperature, stirring.
[0092]
[Table 5]
Table 5

[0093]
After the produced emulsion was stored at 40 ° C. for one month, the emulsified state was evaluated according to the following criteria. The results are shown in Table 7.
3: Stable state
2: Slightly non-uniform state
1: Creaming or separated
[0094]
Moreover, the emulsion immediately after preparation was apply | coated to skin and the sensory test was done. The sensory evaluation was conducted by five expert panelists. In the evaluation method, the upper arm was washed and then the sample was applied, and the skin irritation immediately after application and overnight was evaluated in the following three-stage evaluation. The total score of the five people is shown in Table 7.
3: Normal. There is no abnormality at all.
2: There is a sense of incongruity. I feel a little grudge.
1: There is itch. Redness is observed on the skin.
[0095]
Example 8
A cream was made using the monomethyl polyoxyethylene succinyl (molecular weight 5000) distearoylphosphatidylethanolamine of Example 3. That is, after heating the oil phase part containing an emulsifier among the base materials which consist of a composition of Table 6 to 60 degreeC and melt | dissolving uniformly, the water phase part was added at the same temperature, stirring.
[0096]
[Table 6]
Table 6

[0097]
Evaluation similar to Example 7 was performed about the produced cream. The results are shown in Table 7.
[0098]
Comparative Examples 5 and 6
The same test as in Example 7 and Example 8 was performed using the monomethyl polyoxyethylene succinyl (molecular weight 5000) distearoylphosphatidylethanolamine of Comparative Example 2. The results are shown in Table 7.
[0099]
[Table 7]
Table 7

[0100]
Example 9
Liposome solution stability evaluation
Dipalmitoylphosphatidylcholine 1.92 g (2.64 mmol), cholesterol 0.45 g (1.32 mmol), monomethylpolyoxyethylene (molecular weight 5000) succinyl distearoylphosphatidylethanolamine 0.86 g (0.15 mmol) obtained in Example 4 Was added to an eggplant-shaped flask and dissolved by adding 50 mL of chloroform, and the solvent was removed by a rotary evaporator to form a lipid thin film on the inner wall of the flask. The solvent was sufficiently removed under reduced pressure, 30 mL of a phosphate buffered saline solution having a pH of 7 was added and dispersed, and further treated with an ultrasonic cleaner for 5 minutes to obtain a liposome solution.
The resulting liposome solution was left at room temperature for 1 month. The dispersion state of the liposome solution after one month was not visually changed, and was a uniform liposome solution.
[0101]
Comparative Example 7
The same evaluation as in Example 9 was performed using the monomethyl polyoxyethylene succinyl distearoyl phosphatidylethanolamine obtained in Comparative Example 1. As a result, the liposome solution was not uniform, and lipid particles were precipitated.
[0102]
Example 10
Modification of asparaginase with carboxymethylpolyoxyethylene (average molecular weight 5000) succinyl distearoyl phosphatidylethanolamine
Dicyclohexylcarbodiimide obtained by dissolving 5 g of carboxymethylpolyoxyethylenesuccinyl distearoylphosphatidylethanolamine obtained in the same manner as in Example 2 in 50 mL of chloroform, adding 0.12 g of N-hydroxysuccinimide, and dissolving in a small amount of chloroform. 0.25 g was added and stirred at room temperature for 2 hours. Thereafter, diethyl ether was added to the solution from which insolubles were removed by filtration, and the precipitated crystals were obtained by filtration. The solvent was removed under reduced pressure and used in the next step.
Dissolve 0.1 g of asparaginase in 50 mL of phosphate buffered saline at pH 7.4, add the succinimidyl carboxymethyl polyoxyethylene succinyl distearoyl phosphatidylethanolamine obtained above, and stir at 5 ° C. for 4 hours. did. This reaction solution was dialyzed against phosphate buffered saline solution at pH 7.4, 4 ° C. to remove unreacted substances, and then lyophilized to obtain carboxymethylpolyoxyethylene (average molecular weight 5000) succinyl distearoyl. A dried product in which phosphatidylethanolamine was bound to asparaginase was obtained.

Claims (17)

A polyalkylene oxide-modified phospholipid produced by a method comprising the following steps (A), (B), (C) and (D), wherein the content of the monoacylphospholipid body is 3% by weight or less: A polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by 1).
(A): A polyalkylene oxide compound represented by the following formula (2) and a phospholipid represented by the following formula (3) are mixed with an organic solvent and sodium ions and / or potassium ions in the presence of a dehydrating condensing agent. React at 30-90 ° C. in a mixed medium with the containing buffer, or
A mixed medium of an activated ester derivative of a polyalkylene oxide compound represented by the following formula (2) and a phospholipid represented by the following formula (3) in an organic solvent and a buffer containing sodium ions and / or potassium ions Reacting at 30-90 ° C.
(B): A step of adjusting the reaction solution obtained in step (A) to pH 6 to 9 with an alkali containing sodium ions and / or potassium ions.
(C): Step of dehydration using a dehydrating agent after step (B)
(D): The process of refine | purifying using a C5-C9 aliphatic hydrocarbon or ether after a process (C).

(In the formula (1), R ¹ and R ² are each independently an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, R ³ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms, m is 0 or 1, R ⁴ O Is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, n is an average added mole number of the oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, M is a sodium ion or potassium ion, r is 2 to 4, X is a divalent hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms or —C (═O) (CH ₂ ) q— (where q is 1 to 4), and p is 0 or 1. When p is 0 Y is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. When p is 1, Y is a hydrogen atom, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a glycidyl group, or a thiol group.)

(In formulas (2) and (3), R ¹ and R ² are each independently an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, R ³ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms, and m is 0 or 1 , R ⁴ O is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, n is an average added mole number of an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and r is 2 to 4 and X is a carbon number. 1 to 3 divalent hydrocarbon groups or —C (═O) (CH ₂ ) q— (where q is 1 to 4), p is 0 or 1. When p is 0, Y is hydrogen An atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and when p is 1, Y is a hydrogen atom, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a glycidyl group or a thiol group.) A polyalkylene oxide-modified phospholipid produced by performing steps (A), (B), (C) and (D) in this order, and further performing steps (E) and (F) below. The polyalkylene oxide-modified phospholipid according to claim 1.
(E): A step of performing purification using an adsorbent containing alkaline earth metal oxide, alkaline earth metal hydroxide, aluminum or silicon.
(F): selected from the group consisting of at least one solvent selected from the group consisting of chloroform, toluene, ethyl acetate, acetone and an alcohol having 1 to 3 carbon atoms, and an aliphatic hydrocarbon and ether having 5 to 8 carbon atoms. And performing the purification using at least one solvent The polyalkylene oxide-modified phospholipid according to claim 1 or 2 , wherein p is 0, Y is a methyl group, and the content of the monoacylphospholipid body is 0.5 wt% or less. A surfactant comprising the polyalkylene oxide-modified phospholipid according to any one of claims 1 to 3 . A liposome-forming agent comprising the polyalkylene oxide-modified phospholipid according to any one of claims 1 to 3 . An amphiphilic chemical modifier for a physiologically active substance comprising the polyalkylene oxide-modified phospholipid according to any one of claims 1 to 3 . The emulsifier of the bioactive substance containing the polyalkylene oxide modified phospholipid in any one of Claim 1 thru | or 3 . The method for producing a polyalkylene oxide-modified phospholipid according to claim 1 or 3 , comprising the following steps (A) , (B), (C) and (D) .
(A): A polyalkylene oxide compound represented by the following formula (2) and a phospholipid represented by the following formula (3) are mixed with an organic solvent and sodium ions and / or potassium ions in the presence of a dehydrating condensing agent. Or reacting at 30 to 90 ° C. in a mixed medium containing a buffer solution, or an activated ester derivative of a polyalkylene oxide compound represented by the following formula (2) and a phospholipid represented by the following formula (3): The step of reacting at 30 to 90 ° C. in a mixed medium of an organic solvent and a buffer containing sodium ions and / or potassium ions (B): The reaction solution obtained in step (A) is sodium ions and / or potassium Adjusting to pH 6-9 with alkali containing ions
(C): Step of dehydration using a dehydrating agent after step (B)
(D): The process of refine | purifying using a C5-C9 aliphatic hydrocarbon or ether after a process (C).

(In formulas (2) and (3), R ¹ and R ² are each independently an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, R ³ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms, and m is 0 or 1 , R ⁴ O is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, n is an average added mole number of an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and r is 2 to 4 and X is a carbon number. 1 to 3 divalent hydrocarbon groups or —C (═O) (CH ₂ ) q— (where q is 1 to 4), p is 0 or 1. When p is 0, Y is hydrogen An atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and when p is 1, Y is a hydrogen atom, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a glycidyl group or a thiol group.) The production method according to claim 8 , wherein R ¹ and R ² are acyl groups having 12 to 20 carbon atoms. The production method according to claim 8 or 9 , wherein p is 0 and Y is a methyl group. The production method according to any one of claims 8 to 10 , wherein the buffer used in the step (A) is a phosphate buffer or a carbonate buffer, and the organic solvent is chloroform, toluene or ethyl acetate. The method according to any one of claims 8 to 11, wherein the dehydrating agent used in the step (C) is an inorganic sodium salt or an anhydrous inorganic potassium salt. After step (D), a manufacturing method of placing serial to any one of claims 8 performs the following steps (E) 12.
(E): A step of performing purification using an adsorbent containing alkaline earth metal oxide, alkaline earth metal hydroxide, aluminum or silicon. After Engineering as the (D) or step (E), method according to any one of claims 8 to 13 carried out the following steps (F).
(F): selected from the group consisting of at least one solvent selected from the group consisting of chloroform, toluene, ethyl acetate, acetone and an alcohol having 1 to 3 carbon atoms, and an aliphatic hydrocarbon and ether having 5 to 8 carbon atoms. And performing the purification using at least one solvent The manufacturing method according to claim 14, wherein the steps (A), (B), (C), and (D) are performed in this order, and the steps (E) and (F) are further performed in this order. After the step (F), The process according to claim 1 4, wherein the performing step (E). The process according to any one of the content of Monoashirurin lipid body claims 8 or less 2 wt% 1 6.