JP3620059B2 - Reactive endoplasmic reticulum, forming agent and functional substance-immobilized endoplasmic reticulum - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、反応性小胞体形成剤、これを小胞体形成成分として含む反応性小胞体、この小胞体に機能性物質を固定化した機能性物質固定化小胞体、およびその製造方法に関する。さらに詳しくは医薬の運搬体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒、バイオリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイクロカプセル代替品など、種々の機能性リポソームまたは脂肪乳剤等の小胞体の製造などに用いられる反応性小胞体形成剤、これを小胞体形成成分として含む反応性小胞体、この小胞体に機能性物質を固定化した機能性物質固定化小胞体、およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポソームはリン脂質の二分子膜からなる小胞体であり、多分野での応用が試みられている。特に、医薬運搬体、診断・検出用のセンサーなどへの応用が注目されているが、リポソーム表面上または膜中に機能性物質を固定して各種機能をもたせること、およびリポソームの血中濃度を維持することなどが大きな課題となっている。
【０００３】
従来、リポソーム表面上または膜中への機能性物質の固定化に関しては、プルラン誘導体で被覆したリポソームの表面上の多糖上に置換したアミノエチルカルバミルメチル基にγ−マレイミドブチルオキシサクシニミジルを介して抗体フラグメントを結合させる方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， ８９８， ３２３（１９８７））、あるいはあらかじめリポソーム膜形成成分中に糖脂質を加えておき、リポソーム形成後過よう素酸酸化を行い、生じたアルデヒド基と抗体とを反応させて固定化する方法（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５， １０５０９（１９８０））などがある。
【０００４】
しかし、これらの従来法では、リポソーム調製後にリポソーム膜表面上での多段階の化学反応を行う必要があり、このため目的とする機能性物質の導入量が低く制限され、また反応による副生成物や不純物が混入し、リポソーム膜へのダメージが大きいなどの問題点がある。
【０００５】
一方、リポソームを生体内へ投与したとき、その多くは肝臓、脾臓などの網内系器官で捕捉されるため、十分な効果が得られないことが指摘されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４３， ５３２８（１９８３））。そこで、この網内系器官で捕捉されてしまう問題点や、あるいはリポソーム自身の崩壊性・凝集性など安定性の低さに関する問題点を改善する方法として、リポソームの表面にポリエチレングリコール鎖を導入することが試みられている（例えば、特開平１−２４９７１７号公報、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ， ２６８， ２３５（１９９０））。また、ポリエチレングリコールで修飾されたリポソームは、長期間にわたり血液中濃度を維持できることが明らかになっている（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， １０６６， ２９−３６（１９９１））。
しかし、このような方法により得られるポリエチレングリコール鎖の導入されたリポソームは機能性物質と反応しないので、リポソーム表面上に機能性物質を固定化することはできない。
【０００６】
さらに、特表平４−３４６９１８号公報には、マレイミド基を有するリポソームにまずチオール基を付与したタンパク質（チオール化タンパク質）を反応させ、次いで残存マレイミド基にチオール基を付与したポリアルキレングリコール（チオール化ポリアルキレングリコール）部分を含む化合物を反応させることにより、網内系器官での取込の改善された薬剤含有抗体結合リポソームが得られることが記載されている。
しかし、このリポソームでは、抗体がポリアルキレングリコール層の下部に隠蔽され、標的部位の抗原との反応が妨げられるため、期待される効果が十分には得られないという問題点がある。
【０００７】
また特表平５−５０８３８８号公報には、α−ステアリル−ω−プロピオン酸−ポリオキシエチレンに代表されるようなアニオン基を有するポリエチレングリコール誘導体からなるリポソーム製剤が開示されている。しかし、このポリエチレングリコール誘導体は、疎水部がモノアルキル基であるためリポソーム膜から脱離しやすく、このためこのようなポリエチレングリコール誘導体を膜形成成分として含むリポソームは長期間の安定性に劣るという問題点がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記問題点を解決するため、リポソームその他の小胞体に（ポリ）オキシアルキレン鎖を導入できるとともに、脱離することなく長期にわたり安定して保持され、しかも（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に、簡単にかつ効率よく種々の機能性物質を共有結合によりまたは電気的に固定化することが可能な反応性小胞体形成剤、この形成剤を小胞体形成成分として含む反応性小胞体、この反応性小胞体に機能性物質を固定した機能性物質固定化小胞体、および固定化小胞体の製造方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、次の反応性小胞体形成剤、反応性小胞体、機能性物質固定化小胞体、およびその製造方法である。
（１）下記一般式〔１〕で表わされる反応性ポリアルキレンオキシド誘導体からなることを特徴とする反応性小胞体形成剤。
【化２】
ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
ＸおよびＹは２価の有機残基、
ｐは０または１、
Ｍ１およびＭ２は水素原子またはアルカリ金属原子を表わす。〕
（２）上記（１）記載の反応性小胞体形成剤の一種以上を小胞体形成成分として含むことを特徴とする反応性小胞体。
（３）上記（２）記載の反応性小胞体に機能性物質を固定してなることを特徴とする機能性物質固定化小胞体。
（４）水溶性の脱水縮合剤の存在下に、上記（２）記載の反応性小胞体に機能性物質を反応させることを特徴とする機能性物質固定化小胞体の製造方法。
【００１０】
本発明において、「（ポリ）オキシアルキレン」はｎが１のオキシアルキレンまたはｎが２以上のポリオキシアルキレンを意味する。また「（ポリ）アルキレン」も上記と同様にアルキレンまたはポリアルキレンを意味する。
【００１１】
一般式〔１〕においてＲ１またはＲ２で表わされる脂肪酸のアシル残基は、炭素数３〜３０、好ましくは８〜２０のアシル残基である。このようなアシル残基の具体的なものとしては、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ソロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、２−エチルヘキサン酸等の飽和脂肪酸のアシル残基；オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、２，４−オクタデカジエン酸等の不飽和脂肪酸のアシル残基；イソステアリン酸等の分岐脂肪酸のアシル残基；リシノール酸、１２−ヒドロキシステアリン酸等のアルキル基中に水酸基を有する脂肪酸のアシル残基などがあげられる。
【００１２】
本発明の反応性小胞体形成剤をリポソームまたは脂肪乳剤などの製造に用いる場合は、Ｒ１またはＲ２で表わされる脂肪酸のアシル残基は、安定なリポソームまたは脂肪乳剤が形成できるという理由から、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、２，４−オクタデカジエン酸のアシル残基が好ましく、特にパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸のアシル残基が好ましい。Ｒ１とＲ２とは同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００１３】
一般式〔１〕のＡＯで表わされるオキシアルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒドロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基である。
一般式〔１〕のｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数であり、１〜１０００、好ましくは１０〜５００、さらに好ましくは２０〜３００の正数である。
【００１４】
ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
親水性を付与する場合、ＡＯとしてはエチレンオキシドが単独で付加したものが好ましく、この場合、ｎが１０以上のものが好ましい。また種類の異なるアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオキシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付加しているのが望ましい。（ポリ）オキシアルキレン鎖に親油性を付与する場合はエチレンオキシド以外の付加モル数を多くする。
【００１５】
一般式〔１〕のＭ１およびＭ２は水素原子またはナトリウムもしくはカリウム等のアルカリ金属原子であり、同一でも異なっていてもよい。
一般式〔１〕のＸおよびＹは２価の有機残基を表わす。Ｘの具体的なものとしては、次のような基などがあげられる。式中、ｑは１〜４の整数を表わす。
【化３】
【００１６】
【化４】
一般式〔１〕で表わされる反応性（ポリ）アルキレンオキシド誘導体は、例えば次のような種々の方法により、容易に製造することができる。
１）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にカルボン酸ハライド基を有する（ポリ）アルキレンオキシド誘導体とをトリエチルアミン、ピリジンなどの第３級アミンの存在下で、１：１〜１：１０００モルの仕込み比で反応させ、次に得られた化合物中に残存する活性エステル基を加水分解して得る方法。
２）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にカルボニル−Ｎ−オキシコハク酸イミド基、あるいはカルボニル−１−オキシベンゾトリアゾール基、カルボニル−Ｎ−オキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、カルボニル−Ｎ−オキシフタルイミド、カルボニル−４−オキシフェニルジメチルスルホニウム＝メチルサルフェートなどの活性化エステル基を有する（ポリ）アルキレンオキシド誘導体とを、１：１〜１：１０００モルの仕込み比で反応させ、次に得られた化合物中に残存する活性エステル基を加水分解して得る方法。
３）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にオキシカルボニルイミダゾール基を有する（ポリ）アルキレンオキシド誘導体とを、１：１〜１：１０００モルの仕込み比で反応させ、次に得られた化合物中に残存するオキシカルボニルイミダゾール基を加水分解し、次に得られた化合物にさらに無水コハク酸、またはモノクロロ酢酸などを作用させて得る方法。
４）ホスファチジルコリンと両末端に水酸基を有する（ポリ）アルキレンオキシドとを、１：１〜１：１０００モルの仕込み比で、ホスホリパーゼＤの存在下でエステル交換反応を行い、得られた化合物にさらに無水コハク酸、またはモノクロロ酢酸などを作用させて得る方法。
【００１８】
これらの反応は無溶媒で、または水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液などの水系溶媒中で、またはクロロホルム、塩化メチレン、ベンゼン、ジエチルエーテル、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル等の有機溶媒中で、反応温度−１００〜＋１００℃、好ましくは０〜４０℃、反応時間１０分間〜５００時間、好ましくは３０分間〜１２時間で行うのが望ましい。
反応終了後は、蒸留、再結晶、再沈澱、吸着剤処理、カラム処理、イオン交換、ゲル濾過、限外濾過、透析、薄層クロマトグラフィーなどの方法により単離・精製することができる。
【００１９】
本発明の反応性小胞体形成剤は、疎水性に富む２本の脂肪酸残基と、親水性に富む（ポリ）オキシアルキレン基とを有しているので、優れた界面活性能を有している。このため、本発明の反応性小胞体形成剤は、小胞体形成成分などとして使用することができる。ここで小胞体とは、小胞体形成成分の親水基が界面の水相に向って配向した構造を有する粒子を意味する。具体的なものとしては、二分子膜からなる閉鎖小胞であるリポソーム、植物油およびリン脂質などの混合物が乳化された脂肪乳剤、またはミセルなどがあげられる。
【００２０】
本発明の反応性小胞体形成剤は、末端に官能性としてカルボキシル基を有しているので、アミノ基、水酸基またはチオール基などの官能基、特に第１級アミノ基に対して高い反応性を有している。このため、このような官能基を有する機能性物質と容易に反応し、共有結合が形成される。またカルボキシル基がプラスの電荷を有する機能性物質と容易に電気的に結合する。従って、本発明の反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として用いることにより、小胞体に（ポリ）オキシアルキレン鎖を導入できるとともに、前記官能基を有する機能性物質またはプラスの電荷を有する機能性物質に対する反応性を付与することができ、反応性小胞体を製造することができる。
【００２１】
また本発明の反応性小胞体形成剤はＲ１およびＲ２の２本の脂肪酸アシル残基を有しているため、小胞体中、特にリポソーム膜中から脱離しにくい。このため本発明の反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として含む小胞体、特にリポソームは、１本の脂肪酸残基からなるノニオン系界面活性剤を膜形成成分として含むリポソームに比べて、優れた安定性を有するものとなる。
【００２２】
本発明の反応性小胞体形成剤を用いて小胞体を製造する場合、反応性小胞体形成剤は一種単独で、または二種以上組合せて、あるいは小胞体を形成しうる他の小胞体形成成分、例えば大豆レシチン、卵黄レシチン、その他のリン脂質類、コレステロール、イントラリピッド（大塚製薬（株）、商標）、大豆油、サフラワー油などと混合して使用することができ、反応性リポソームをはじめ反応性脂肪乳剤、反応性ミセルなどの反応性小胞体を形成することができる。この場合、小胞体は公知の方法により製造することができる。
【００２３】
本発明の反応性小胞体形成剤を用いて得られた反応性小胞体は、一般式〔１〕で表わされる化合物中のカルボキシル基が小胞体の表面に存在するので、この基を官能基として利用して、水溶性の脱水縮合剤などを用いることにより種々の機能性物質を共有結合により導入することができる。また種々の機能性物質を電気的に固定化することもできる。これにより機能性物質固定化小胞体が得られる。
【００２４】
次に本発明の反応性小胞体形成剤を用いて製造したそれぞれの反応性小胞体、および機能性物質固定化小胞体について詳しく説明する。
代表的な反応性小胞体である反応性リポソームは、本発明の反応性小胞体形成剤を膜形成成分（小胞体形成成分）として含有するものである。反応性小胞体形成剤の含有量は、反応性小胞体形成剤および他の膜形成成分の合計量に対して０．１〜５０モル％、好ましくは０．５〜３０モル％であるのが望ましい。０．１モル％未満では期待される効果が小さくなるため、一般的には使用されない。また５０モル％を超えるとリポソームの安定性が低下するため一般的には使用されない。全膜形成成分中に占める本発明の反応性小胞体形成剤の割合を多くするほど、固定化する機能性物質の量をより多くすることができる。反応性小胞体形成剤は、一種単独で使用することもできるし、二種以上のものを組合せて使用することもできる。
【００２５】
反応性小胞体形成剤と混合して用いられる他の膜形成成分としては、従来からリポソームの膜形成成分として用いられているものが制限なく使用できる。具体的には、ジホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール等のリン脂質および脂肪酸部に不飽和基を有する重合性リン脂質；スルホキシリボシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ラクトシルジグリセリド等の糖脂質類；コレステロール等の非極性脂質；その他には、非イオン性界面活性剤、ホスファチジルポリエチレングリコール、「Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， １０６６， ２９−３６（１９９１）」に記載されているホスファチジルエタノールアミンとポリエチレングリコールとの反応物、およびこれらの混合物などがあげられる。
【００２６】
反応性リポソームは、反応性小胞体形成剤およびレシチン、コレステロール、リン脂質等の他の膜形成成分を、有機溶媒等の適当な溶媒に溶解し、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆層蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法など、種々の公知の方法によりリポソーム化することにより製造することができる。また、これらの製造法を選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソームなど、種々の大きさや形態を有する反応性リポソームを製造することができる。
【００２７】
このようにして得られた反応性リポソームは、リポソーム膜の内外表面に（ポリ）オキシアルキレンからなるスペーサーを介してカルボキシル基が結合しているので、アミノ基、水酸基、チオール基などの官能基、特に第１級アミノ基を有する機能性物質を効率よくかつ簡単に、リポソームの二分子膜上に（ポリ）オキシアルキレンからなるスペーサーを介して、アミド結合、エステル結合またはチオールエステル結合により化学的に固定化することができ、機能性物質固定化リポソームが得られる。またカルボキシル基に、プラスの電荷を有する機能性物質を電気的に固定化することができ、機能性物質固定化リポソームが得られる。
【００２８】
反応性リポソームに固定化できる機能性物質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合物、電極感応性化合物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医薬などであって、分子中にアミノ基、水酸基またはチオール基を有するもの、またはプラスの電荷を有するものなどがあげられる。これらの中では、アミノ基、特に第１級アミノ基を有する機能性物質が好ましい。
【００２９】
反応性リポソーム上への機能性物質の共有結合による固定化反応は、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド＝メソ−ｐ−トルエンスルホネート、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩など、カルボキシル基と前記官能基とを脱水縮合させることが可能な水溶性の脱水縮合剤の存在下、生理的食塩水、またはｐＨ＝３〜１０、好ましくは４〜８のリン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の種々の緩衝液などの水系溶媒、またはこれらの水系溶媒とメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、ジメチルスルホキシド、ピロリドン等の有機溶媒との混合溶媒中で、反応性リポソームと前記官能基を有する機能性物質とを−１０〜＋１００℃、アミノ基との反応の場合は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは０〜４０℃、水酸基またはチオール基との反応の場合は好ましくは３０〜８０℃で、１０分間〜３００時間、好ましくは３０分間〜２４時間攪拌下に反応させる方法などにより、一段階で容易に行うことができる。これらの条件外では、リポソームの安定性が悪くなるため好ましくない。
このようにして反応させることにより、リポソーム外表面に伸びる（ポリ）オキシアルキレンの先端に機能性物質が共有結合により固定化された機能性物質固定化リポソームが得られる。
【００３０】
リポソーム表面上でのアミノ基を有する機能性物質の固定化反応を模式的に示すと次のようになる。式中、ＡＯ、ｎ、Ｙ、Ｍ２は前記と同じものを示す。
【化５】
機能性物質を電気的に固定化する場合は、種々の緩衝液等の水系溶媒中で、反応性リポソームにプラスの電荷を有する機能性物質を接触させることにより、一段階で容易に行うことができる。
【００３２】
反応性リポソームの内部には、一般のリポソームと同様に種々の物質を公知の方法により封入することが可能である。被封入物質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性化合物、電極感応性化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医薬；ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸等の水溶性高分子類などがあげられる。
固定化反応または封入操作の終了後は、必要によりゲル濾過、限外濾過、透析、遠心分離、静置沈降分離等の方法により精製を行うことができる。
【００３３】
機能性物質固定化リポソームは、（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に機能性物質が固定化されているので、（ポリ）オキシアルキレン鎖に邪魔されることなく機能性物質の作用が十分に発揮される。また、（ポリ）オキシアルキレン鎖が導入されているので、従来からの（ポリ）オキシアルキレン鎖導入の効果、例えば長期間にわたる血液中濃度の維持、非免疫原性、リポソーム内部に封入した物質の漏れ防止などの効果も期待できる。
このため反応性リポソームは、機能性物質を固定化して機能性物質固定化リポソームの形態で、医薬の運搬体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒、バイオリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイクロカプセル代替品など、種々の機能性リポソームとして利用できる。
【００３４】
なお、反応性リポソームを製造する際、他の膜形成成分として重合性リン脂質を配合することにより、重合性の反応性リポソームとすることができる。重合性のリン脂質としては、公知の重合性リン脂質を使用することができるが、例えば１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンの他、野島庄七、砂本順三、井上圭三編集、１９８８年南江堂発行の「リポソーム」ｐ３１３〜３１５に記載のものなどがあげられる。これらの中では、１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンが好ましい。
【００３５】
重合性リポソームは、リポソーム調製後に、光重合開始剤の存在下または非存在下でＵＶ、γ線、電子線などの光照射を行うことにより、あるいはレドックス開始剤系により、あるいはアゾ系開始剤または有機過酸化物などの存在下で加熱を行うことにより、容易に重合を行うことができる。
このようにして得られた重合後のリポソームは、優れた安定性を有しているので、水溶液に分散させたままで、あるいは凍結乾燥等により粉末状に調製し、安定して使用することができる。
【００３６】
他の反応性小胞体としての反応性脂肪乳剤は、本発明の反応性小胞体形成剤と、大豆油、サフラワー油等の植物油と、大豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂質と、必要により添加される他の添加剤、例えばイントラリピッド（大塚製薬（株）製、商標）、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、脂溶性医薬、脂溶性生理活性物質などを含む油脂混合物が乳化されたものである。
油脂混合物中に占める反応性小胞体形成剤の含有量は、０．１〜５０モル％、好ましくは０．５〜３０モル％であるのが望ましい。
【００３７】
反応性脂肪乳剤は、公知の方法により製造することができる。例えば、本発明の反応性小胞体形成剤、植物油、他のリン脂質および必要により配合する添加剤を混合、加熱し、水を加えてホモミキサー等で粗乳化し、次にマントン−ガウリン型の加圧噴射式ホモジナイザー等で均質化する方法などにより製造することができる。
【００３８】
このようにして得られた反応性脂肪乳剤には、反応性リポソームの場合と同様にして、同様の機能性物質を容易に固定化することができ、機能性物質固定化脂肪乳剤が得られる。
このため反応性脂肪乳剤は、機能性物質を固定化して機能性物質固定化脂肪乳剤の形態で、医薬の運般体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒などとして利用できる。
【００３９】
上記以外の反応性小胞体である反応性ミセルは、本発明の反応性小胞体形成剤だけからなるものであっても、レシチン、コレステロール、リン脂質等の他の成分が含有されているものであってもよい。反応性ミセルも反応性脂肪乳剤と同様にして機能性物質を固定化することができ、同様の用途に利用できる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明の反応性小胞体形成剤は、一般式〔１〕で表わされる構造を有しているので、小胞体に（ポリ）オキシアルキレン鎖を導入できるとともに、この（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に、簡単にかつ効率よく種々の機能性物質を共有結合により、または電気的に固定化することができる。この場合、小胞体は長期間の保存安定性に優れている。また本発明の反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として用いることにより、（ポリ）オキシアルキレン鎖導入の効果、例えば長期間にわたる血液中濃度の維持、非免疫原性、小胞体に内包した物質の漏れ防止などの効果も期得できる。
【００４１】
本発明の反応性小胞体は、上記反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として含有しているので、反応性小胞体形成剤が脱離せず、長期間の安定性に優れている。また（ポリ）オキシアルキレン鎖からなるスペーサーを介して、簡単にかつ効率よく種々の機能性物質を共有結合により、または電気的に固定化することができる。
【００４２】
本発明の機能性物質固定化小胞体は、（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に機能性物質が固定化されているので、機能性物質の活性が十分に発揮される。
【００４３】
本発明の機能性物質固定化小胞体の製造方法は、水溶性の脱水縮合剤の存在下に、上記反応性小胞体に機能性物質を反応させるようにしているので、一段階の反応で簡単に、しかも小胞体にダメージを与えることなく機能性物質固定化小胞体を製造することができる。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により、さらに詳細な説明を行うが、本発明はこれらに限定されるものではない。
合成例１
両末端にカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体（Ｍｗ≒３０００）
【化６】
【化７】
実施例１−１
卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）および合成例１で得られた化合物２．４ｍｇ（前記二者に対して１０重量％）をナス型フラスコに入れ、２ｍｌのベンゼンで溶解させた後、凍結乾燥を行った。これに生理的食塩水１ｍｌを加え、バス型超音波照射およびボルテックスミキサーによりリポソーム化し、多重層リポソームを得た。さらにエクスツルーダーにより３．０→１．０→０．２μｍのポリカーボネートメンブランを順次通過させ、大きな一枚膜リポソームを得た。得られた反応性リポソームの粒径をレーザー散乱粒度分布計（ＮＩＣＯＭＰ社製、ＮＩＣＯＭＰ３７０ＨＰＬ、商標）を用いて測定したところ、平均粒径２５４ｎｍ（ＣＶ値１８％）であった。
上記リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を測定したところ、平均粒径２５９ｎｍ、ＣＶ値１９％であり、安定性に優れていた。
【００４６】
実施例１−２
実施例１−１と同様にして、ただし反応性小胞体形成剤として下記の反応性ポリアルキレンオキシド誘導体を他の成分２者に対して５重量％の量で用いて反応性リポソームを得た（平均粒径２７５ｎｍ、ＣＶ値２１％）。
上記リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を測定したところ、平均粒径２７８ｎｍ、ＣＶ値２２％であり、安定性に優れていた。
【化８】
実施例１−３
実施例１−１と同様にして、ただし反応性小胞体形成剤として下記の反応性ポリアルキレンオキシド誘導体を他の成分二者に対して３０重量％の量で用いて反応性リポソームを得た（平均粒径２３８ｎｍ、ＣＶ値２５％）。
上記リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を測定したところ、平均粒径２４０ｎｍ、ＣＶ値２４％であり、安定性に優れていた。
【化９】
実施例１−４
実施例１−１と同様にして、ただし反応性小胞体形成剤として下記の反応性ポリアルキレンオキシド誘導体を他の成分二者に対して１重量％の量で用いて反応性リポソームを得た（平均粒径２４９ｎｍ、ＣＶ値２３％）。
上記リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を測定したところ、平均粒径２５８ｎｍ、ＣＶ値２６％であり、安定性に優れていた。
【化１０】
実施例１−５
実施例１−１と同様にして、ただし反応性小胞体形成剤として下記の反応性ポリアルキレンオキシド誘導体を他の成分二者に対して５重量％の量で用いて反応性リポソームを得た（平均粒径２４６ｎｍ、ＣＶ値２４％）。
上記リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を測定したところ、平均粒径２５１ｎｍ、ＣＶ値２６％であり、安定性に優れていた。
【化１１】
実施例１−６
実施例１−１と同様にして、ただし反応性小胞体形成剤として下記の反応性ポリアルキレンオキシド誘導体を他の成分二者に対して５重量％の量で用いて平均粒径２９４ｎｍ（ＣＶ値２５％）の反応性を有する小さな単層リポソームを得た。
上記リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を測定したところ、平均粒径２９９ｎｍ、ＣＶ値２７％であり、安定性に優れていた。
【化１２】
実施例１−７
実施例１−１と同様にして、ただし卵黄ホスファチジルコリンの代わりに１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＤＰ）を用いて、平均粒径２４９ｎｍ（ＣＶ値２７％）の反応性を有する大きな一枚膜リポソームを得た。このリポソームに０．７５Ｍｒａｄのγ線照射を行ってＤＯＤＰを重合させた。得られた反応性の重合性リポソームは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過後、凍結乾燥して粉末状サンプルとした。このリポソーム粉末は、生理的食塩水で膨潤させ、再生することができた。
【００５２】
実施例２−１
実施例１−１で得られたリポソーム溶液（固形分量０．２５％）の５００μｌに、１ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（ｐＨ５）５００μｌを加え、５℃で３０分間攪拌した。さらに１ｍｇ／ｍｌ濃度の西洋山葵ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌを加え、５℃で２４時間攪拌してＨＲＰをリポソームに固定化した。これをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、含リポソーム分画を分取し、ＨＲＰ固定化リポソームを得た。
このようにして得られたＨＲＰ固定化リポソーム溶液５００μｌに、ＨＲＰの基質である１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）１００μｌを加え、３０℃で１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたところ、褐色の呈色が見られた。
この結果から、実施例１−１の反応性リポソームは、ＨＲＰと攪拌するだけでＨＲＰを固定化できることが確認できた。
【００５３】
実施例２−２ないし２−７
実施例１−２ないし１−７で得られた反応性リポソームを用いて実施例２−１と同様にしてＨＲＰを固定化し、ＨＲＰ固定化リポソームを得た。
それぞれのＨＲＰ固定化リポソームについて実施例２−１と同様にして発色試験を行ったところ、いずれの場合も褐色の呈色が見られ、ＨＲＰの固定化が確認された。
【００５４】
比較例１
卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）のみを用いて、実施例１−１と同様の操作により、固形分量２．５％の多重層リポソームを得た。
このリポソームに実施例２−１と全く同様にしてＨＲＰを作用させ、ゲル濾過により精製した。得られたリポソーム溶液の５００μｌに、１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）１００μｌを加え、３０℃で１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたが、発色は見られなかった。
この結果から、反応性小胞体形成剤を膜形成成分として含まない比較例１のリポソームでは、ＨＲＰを固定化することができなかったことがわかる。
【００５５】
比較例２
卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２μｍｏｌ）、コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）およびα−ステアリル−ω−ヒドロキシ−ポリオキシエチレン（平均付加モル数約１０）２．４ｍｇ（前記二者に対して１０重量％、７μｍｏｌ）をナス型フラスコに入れ、２ｍｌのベンゼンで溶解させた後、凍結乾燥を行った。これに生理的食塩水１ｍｌを加え、バス型超音波照射およびボルテックスミキサーにより、リポソーム化し、多重層リポソームを得た。さらのエクスツルーダーにより３．０→１．０→０．２μｍのポリカーボネートメンブタンを順次通過させ、大きな一枚膜リポソームを得た。
得られたリポソームの平均粒径を測定したところ、平均粒径１９６ｎｍ（ＣＶ値１１％）であった。さらに、５℃で一週間静置後、再び平均粒径を測定したところ２８８ｎｍ（ＣＶ値６５％）と、平均粒径、ＣＶ値ともに大きく変化しており、リポソームが安定に存在していないことが分かった。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a reactive endoplasmic reticulum forming agent, a reactive endoplasmic reticulum containing the same as an endoplasmic reticulum formation component, a functional substance-immobilized endoplasmic reticulum in which a functional substance is immobilized on the endoplasmic reticulum, and a method for producing the same. More specifically, it is used for the production of various functional liposomes or vesicles such as fat emulsions, such as pharmaceutical carriers, test agents, diagnostic agents, sensors, immobilized catalysts, bioreactors, bioelectronic devices, and microcapsule substitutes. The present invention relates to a reactive endoplasmic reticulum forming agent, a reactive endoplasmic reticulum containing this as an endoplasmic reticulum formation component, a functional substance-immobilized endoplasmic reticulum in which a functional substance is immobilized on the endoplasmic reticulum, and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Liposomes are vesicles composed of bilayer membranes of phospholipids, and their application in various fields has been attempted. In particular, its application to pharmaceutical carriers, diagnostic / detection sensors, etc. has attracted attention, but it has various functions by immobilizing a functional substance on the surface or membrane of the liposome, and the blood concentration of the liposome. Maintenance is a major issue.
[0003]
Conventionally, regarding the immobilization of a functional substance on the surface of a liposome or in a membrane, γ-maleimidobutyloxysuccinimidyl was substituted on the aminoethylcarbamylmethyl group substituted on the polysaccharide on the surface of the liposome coated with a pullulan derivative. To bind antibody fragments (Biochem. Biophys. Acta., 898 , 323 (1987)) or a method in which glycolipid is added in advance to a liposome membrane-forming component, periodate oxidation is performed after liposome formation, and the resulting aldehyde group and antibody are reacted to be immobilized (J Biol. Chem., 255 , 10509 (1980)).
[0004]
However, in these conventional methods, it is necessary to perform a multi-step chemical reaction on the surface of the liposome membrane after preparing the liposome, which limits the introduction amount of the target functional substance and reduces the by-products produced by the reaction. There are problems such as contamination of impurities and large damage to the liposome membrane.
[0005]
On the other hand, it has been pointed out that when liposomes are administered into a living body, most of them are trapped by reticuloendothelial organs such as the liver and spleen, so that a sufficient effect cannot be obtained (Cancer Res.,). 43 , 5328 (1983)). Therefore, polyethylene glycol chains are introduced on the surface of liposomes as a method to improve the problems that are trapped in the reticuloendothelial organs or the low stability such as disintegration and aggregation of liposomes. (For example, JP-A-1-249717, FEBS letters, 268 , 235 (1990)). In addition, it has been clarified that liposomes modified with polyethylene glycol can maintain blood concentration over a long period of time (Biochem. Biophys. Acta.,). 1066 , 29-36 (1991)).
However, since the liposome into which the polyethylene glycol chain obtained by such a method is introduced does not react with the functional substance, the functional substance cannot be immobilized on the surface of the liposome.
[0006]
Furthermore, in Japanese Patent Publication No. 4-346918, a liposome having a maleimide group is first reacted with a protein having a thiol group (thiolated protein), and then a polyalkylene glycol having a thiol group added to the remaining maleimide group (thiol). It has been described that drug-containing antibody-bound liposomes with improved uptake in reticuloendothelial organs can be obtained by reacting a compound containing a (modified polyalkylene glycol) moiety.
However, this liposome has a problem that the expected effect cannot be obtained sufficiently because the antibody is concealed in the lower part of the polyalkylene glycol layer and the reaction with the antigen at the target site is prevented.
[0007]
JP-A-5-508388 discloses a liposome preparation comprising a polyethylene glycol derivative having an anion group represented by α-stearyl-ω-propionic acid-polyoxyethylene. However, this polyethylene glycol derivative has a monoalkyl group in the hydrophobic portion, so that it easily detaches from the liposome membrane. Therefore, liposomes containing such a polyethylene glycol derivative as a membrane-forming component are inferior in long-term stability. There is.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
In order to solve the above problems, the object of the present invention is to introduce a (poly) oxyalkylene chain into a liposome or other endoplasmic reticulum, and to stably hold it for a long time without detachment, and (poly) oxyalkylene Reactive endoplasmic reticulum forming agent capable of covalently or electrically immobilizing various functional substances at the chain end easily and efficiently, and a reactive small component containing this forming agent as an endoplasmic reticulum forming component It is intended to provide a vesicle, a functional substance-immobilized vesicle in which a functional substance is immobilized on the reactive vesicle, and a method for producing the immobilized vesicle.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present invention includes the following reactive endoplasmic reticulum forming agent, reactive endoplasmic reticulum, functional substance-immobilized endoplasmic reticulum, and a method for producing the same.
(1) A reactive endoplasmic reticulum forming agent comprising a reactive polyalkylene oxide derivative represented by the following general formula [1].
[Chemical formula 2]
AO is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms,
n is an average addition mole number of the oxyalkylene group and represents a positive number of 1 to 1000. When n is 2 or more, the oxyalkylene groups may be the same or different, and may be added in a random form or in a block form.
X and Y are divalent organic residues,
p is 0 or 1,
M 1 And M 2 Represents a hydrogen atom or an alkali metal atom. ]
(2) A reactive endoplasmic reticulum comprising one or more of the reactive endoplasmic reticulum forming agents described in (1) above as an endoplasmic reticulum formation component.
(3) A functional substance-immobilized vesicle comprising a functional substance immobilized on the reactive vesicle described in (2) above.
(4) A method for producing a functional substance-immobilized vesicle comprising reacting a functional substance with the reactive vesicle described in (2) above in the presence of a water-soluble dehydrating condensing agent.
[0010]
In the present invention, “(poly) oxyalkylene” means oxyalkylene in which n is 1 or polyoxyalkylene in which n is 2 or more. “(Poly) alkylene” means alkylene or polyalkylene as described above.
[0011]
In the general formula [1], R 1 Or R 2 The acyl residue of the fatty acid represented by is an acyl residue having 3 to 30 carbon atoms, preferably 8 to 20 carbon atoms. Specific examples of such acyl residues include propionic acid, butyric acid, caproic acid, caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, undecanoic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, behenic acid. Acyl residues of saturated fatty acids such as acid, lignoceric acid, sorotic acid, montanic acid, melicic acid, 2-ethylhexanoic acid; oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, erucic acid, 2,4-octadecadienoic acid, etc. Examples include acyl residues of unsaturated fatty acids; acyl residues of branched fatty acids such as isostearic acid; acyl residues of fatty acids having a hydroxyl group in an alkyl group such as ricinoleic acid and 12-hydroxystearic acid.
[0012]
When the reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention is used for production of liposomes or fat emulsions, R 1 Or R 2 The acyl residue of the fatty acid represented by is preferably an acyl residue of myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, or 2,4-octadecadienoic acid because a stable liposome or fat emulsion can be formed. Particularly preferred are acyl residues of palmitic acid, stearic acid and oleic acid. R 1 And R 2 May be the same or different.
[0013]
The oxyalkylene group represented by AO in the general formula [1] is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and includes an oxyethylene group, an oxypropylene group, an oxytrimethylene group, an oxy-1-ethylethylene group, an oxy- Examples include 1,2-dimethylethylene group and oxytetramethylene group. These oxyalkylene groups are groups obtained by addition polymerization of alkylene oxides such as ethylene oxide, propylene oxide, oxetane, 1-butene oxide, 2-butene oxide, and tetrahydrofuran.
N in the general formula [1] is an average addition mole number of the oxyalkylene group and is a positive number of 1 to 1000, preferably 10 to 500, more preferably 20 to 300.
[0014]
When n is 2 or more, the types of oxyalkylene groups may be the same or different. In the latter case, it may be added in a random manner or a block shape.
In the case of imparting hydrophilicity, AO is preferably one in which ethylene oxide is added alone, and in this case, n is preferably 10 or more. When different types of alkylene oxide are added, it is desirable that ethylene oxide is added in an amount of 20 mol% or more, preferably 50 mol% or more. When imparting lipophilicity to the (poly) oxyalkylene chain, the number of added moles other than ethylene oxide is increased.
[0015]
M in general formula [1] 1 And M 2 Are hydrogen atoms or alkali metal atoms such as sodium or potassium, which may be the same or different.
X and Y in the general formula [1] represent a divalent organic residue. Specific examples of X include the following groups. In the formula, q represents an integer of 1 to 4.
[Chemical 3]
[0016]
[Formula 4]
The reactive (poly) alkylene oxide derivative represented by the general formula [1] can be easily produced by, for example, the following various methods.
1) Phosphatidylethanolamine and a (poly) alkylene oxide derivative having a carboxylic acid halide group at both ends in the presence of a tertiary amine such as triethylamine or pyridine at a charge ratio of 1: 1 to 1: 1000 mol. A method obtained by reacting and then hydrolyzing the active ester group remaining in the obtained compound.
2) Phosphatidylethanolamine and carbonyl-N-oxysuccinimide group or carbonyl-1-oxybenzotriazole group, carbonyl-N-oxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, carbonyl-N at both ends -Oxyphthalimide, carbonyl-4-oxyphenyldimethylsulfonium = (poly) alkylene oxide derivative having an activated ester group such as methyl sulfate is reacted at a charge ratio of 1: 1 to 1: 1000 mol, and then obtained. A method obtained by hydrolyzing an active ester group remaining in the obtained compound.
3) The phosphatidylethanolamine is reacted with a (poly) alkylene oxide derivative having an oxycarbonylimidazole group at both ends at a charge ratio of 1: 1 to 1: 1000 mol, and then remains in the obtained compound. A method obtained by hydrolyzing an oxycarbonylimidazole group and then further reacting the obtained compound with succinic anhydride, monochloroacetic acid or the like.
4) Transesterification of phosphatidylcholine and (poly) alkylene oxide having hydroxyl groups at both ends in the presence of phospholipase D at a charge ratio of 1: 1 to 1: 1000 mol, and the resulting compound further anhydrous A method obtained by reacting succinic acid or monochloroacetic acid.
[0018]
These reactions are solventless or in an aqueous solvent such as water, physiological saline, phosphate buffer, Tris buffer, carbonate buffer, or chloroform, methylene chloride, benzene, diethyl ether, methanol, ethanol, The reaction is carried out in an organic solvent such as tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, acetonitrile and the like at a reaction temperature of −100 to + 100 ° C., preferably 0 to 40 ° C., a reaction time of 10 minutes to 500 hours, preferably 30 minutes to 12 hours. desirable.
After completion of the reaction, it can be isolated and purified by methods such as distillation, recrystallization, reprecipitation, adsorbent treatment, column treatment, ion exchange, gel filtration, ultrafiltration, dialysis, and thin layer chromatography.
[0019]
Since the reactive endoplasmic reticulum formation agent of the present invention has two fatty acid residues rich in hydrophobicity and a (poly) oxyalkylene group rich in hydrophilicity, it has excellent surface activity. Yes. For this reason, the reactive endoplasmic reticulum formation agent of this invention can be used as an endoplasmic reticulum formation component. Here, the endoplasmic reticulum means a particle having a structure in which the hydrophilic group of the endoplasmic reticulum forming component is oriented toward the aqueous phase at the interface. Specific examples include liposomes, which are closed vesicles composed of bilayer membranes, fat emulsions in which a mixture of vegetable oil and phospholipid is emulsified, or micelles.
[0020]
Since the reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention has a carboxyl group as a functional group at the terminal, it has high reactivity with respect to functional groups such as amino group, hydroxyl group or thiol group, particularly primary amino group. Have. For this reason, it reacts easily with the functional substance having such a functional group, and a covalent bond is formed. In addition, the carboxyl group is easily electrically bonded to a functional substance having a positive charge. Therefore, by using the reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention as an endoplasmic reticulum formation component, a (poly) oxyalkylene chain can be introduced into the endoplasmic reticulum, and a functional substance having the functional group or a function having a positive charge can be introduced. It is possible to impart reactivity to the active substance and to produce a reactive endoplasmic reticulum.
[0021]
The reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention is R 1 And R 2 Thus, it is difficult to detach from the endoplasmic reticulum, particularly from the liposome membrane. For this reason, the endoplasmic reticulum containing the reactive endoplasmic reticulum formation agent of the present invention as an endoplasmic reticulum formation component, particularly a liposome, is superior to a liposome containing a nonionic surfactant composed of a single fatty acid residue as a membrane formation component. Have high stability.
[0022]
When producing the endoplasmic reticulum using the reactive endoplasmic reticulum formation agent of this invention, the reactive endoplasmic reticulum formation agent is single 1 type, 2 or more types combined, or another endoplasmic reticulum formation component which can form an endoplasmic reticulum. For example, it can be used in combination with soybean lecithin, egg yolk lecithin, other phospholipids, cholesterol, intralipid (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., trademark), soybean oil, safflower oil, etc. Reactive vesicles such as reactive fat emulsions and reactive micelles can be formed. In this case, the endoplasmic reticulum can be produced by a known method.
[0023]
In the reactive endoplasmic reticulum obtained using the reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention, since the carboxyl group in the compound represented by the general formula [1] exists on the surface of the endoplasmic reticulum, this group is used as a functional group. By utilizing a water-soluble dehydrating condensing agent, various functional substances can be introduced by covalent bonding. Various functional substances can also be immobilized electrically. Thereby, a functional substance-immobilized endoplasmic reticulum is obtained.
[0024]
Next, each reactive vesicle manufactured using the reactive vesicle-forming agent of the present invention and the functional substance-immobilized vesicle will be described in detail.
The reactive liposome which is a typical reactive endoplasmic reticulum contains the reactive endoplasmic reticulum formation agent of the present invention as a membrane formation ingredient (endoplasmic reticulum formation ingredient). The content of the reactive vesicle-forming agent is 0.1 to 50 mol%, preferably 0.5 to 30 mol%, based on the total amount of the reactive vesicle-forming agent and other film-forming components. desirable. If it is less than 0.1 mol%, the expected effect becomes small, so it is generally not used. On the other hand, if it exceeds 50 mol%, the stability of the liposome is lowered, so that it is generally not used. The larger the proportion of the reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention in the total film-forming component, the more the amount of the functional substance to be immobilized can be increased. A reactive endoplasmic reticulum formation agent can also be used individually by 1 type, and can also be used in combination of 2 or more types.
[0025]
As other film-forming components used by mixing with a reactive endoplasmic reticulum-forming agent, those conventionally used as liposome-forming components can be used without limitation. Specifically, a polymerizable phospholipid having an unsaturated group in a phospholipid and fatty acid part such as diphosphatidylglycerol, cardiolipin, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, soybean lecithin, egg yolk lecithin, phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol; Glycolipids such as xylibosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, lactosyl diglyceride; nonpolar lipids such as cholesterol; other non-ionic surfactants, phosphatidyl polyethylene glycol, “Biochem. Biophys. Acta.,” 1066 29-36 (1991) ", and a reaction product of phosphatidylethanolamine and polyethylene glycol, and a mixture thereof.
[0026]
Reactive liposomes are prepared by dissolving a reactive endoplasmic reticulum-forming agent and other film-forming components such as lecithin, cholesterol and phospholipid in an appropriate solvent such as an organic solvent, and using an extrusion method, a vortex mixer method, an ultrasonic method. By liposome formation by various known methods such as surfactant removal method, reverse layer evaporation method, ethanol injection method, prevesicle method, French press method, W / O / W emulsion method, annealing method, freeze-thaw method, etc. Can be manufactured. Also, by selecting these production methods, reactive liposomes having various sizes and forms such as multilamellar liposomes, small unilamellar liposomes, and large unilamellar liposomes can be produced.
[0027]
Since the reactive liposome thus obtained has a carboxyl group bonded to the inner and outer surfaces of the liposome membrane via a spacer made of (poly) oxyalkylene, a functional group such as an amino group, a hydroxyl group, and a thiol group, In particular, a functional substance having a primary amino group can be chemically and efficiently formed by an amide bond, an ester bond or a thiol ester bond via a spacer made of (poly) oxyalkylene on a bilayer membrane of a liposome. The functional substance-immobilized liposome can be obtained. In addition, a functional substance having a positive charge can be electrically immobilized on the carboxyl group, and a functional substance-immobilized liposome can be obtained.
[0028]
Examples of functional substances that can be immobilized on reactive liposomes include labeling substances such as dyes, dyes, radiolabeled compounds, fluorescent compounds, chemiluminescent compounds, and electrode sensitive compounds; photoresponsive compounds, pH responsive compounds, and thermal responses. External stimuli-responsive compounds such as sexual compounds; physiologically active substances such as enzymes, antibodies, other proteins, sugars, lipids, glycoproteins, glycolipids, hormones; pharmaceuticals, etc., with amino groups, hydroxyl groups or thiols in the molecule Examples thereof include those having a group or those having a positive charge. In these, the functional substance which has an amino group, especially a primary amino group is preferable.
[0029]
Immobilization reaction of the functional substance on the reactive liposome by covalent bond was carried out using N-cyclohexyl-N ′-(2-morpholinoethyl) carbodiimide = meso-p-toluenesulfonate, 1-ethyl-3- (3-dimethyl). In the presence of a water-soluble dehydration condensing agent capable of dehydrating condensation of the carboxyl group and the functional group, such as aminopropyl) carbodiimide hydrochloride, physiological saline, or pH = 3 to 10, preferably 4 to 8 Aqueous buffers such as various buffer solutions such as phosphate buffer, carbonate buffer, Tris buffer, and acetate buffer, or these aqueous solvents and methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, In mixed solvents with organic solvents such as dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, pyrrolidone In the case of a reaction between a reactive liposome and a functional substance having the functional group at −10 to + 100 ° C. and an amino group, preferably 0 to 60 ° C., more preferably 0 to 40 ° C., a hydroxyl group or a thiol group In the case of reaction, it can be easily carried out in one step, preferably by a method of reacting at 30 to 80 ° C. with stirring for 10 minutes to 300 hours, preferably 30 minutes to 24 hours. Outside these conditions, the stability of the liposomes is deteriorated, which is not preferable.
By reacting in this manner, a functional substance-immobilized liposome in which a functional substance is immobilized by covalent bonding at the tip of (poly) oxyalkylene extending to the outer surface of the liposome is obtained.
[0030]
The immobilization reaction of the functional substance having an amino group on the liposome surface is schematically shown as follows. Where AO, n, Y, M 2 Indicates the same as above.
[Chemical formula 5]
When electrically immobilizing a functional substance, it can be easily performed in one step by bringing a functional substance having a positive charge into contact with the reactive liposome in an aqueous solvent such as various buffer solutions. it can.
[0032]
In the interior of the reactive liposome, various substances can be encapsulated by a known method in the same manner as general liposomes. Examples of encapsulated substances include labeling substances such as pigments, dyes, radiation label compounds, fluorescent compounds, and chemiluminescent compounds; external stimulus responses such as photoresponsive compounds, pH responsive compounds, thermoresponsive compounds, and electrode sensitive compounds. Compounds; enzymes, antibodies, other proteins, physiologically active substances such as sugars, lipids, glycoproteins, glycolipids, hormones; pharmaceuticals; water-soluble polymers such as polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, hyaluronic acid, etc. can give.
After completion of the immobilization reaction or the enclosing operation, purification can be performed by a method such as gel filtration, ultrafiltration, dialysis, centrifugation, or stationary sedimentation, if necessary.
[0033]
The functional substance-immobilized liposome has a functional substance immobilized at the tip of the (poly) oxyalkylene chain, so that the function of the functional substance is fully exerted without being interrupted by the (poly) oxyalkylene chain. The In addition, since a (poly) oxyalkylene chain has been introduced, the effects of conventional (poly) oxyalkylene chain introduction, for example, maintenance of blood concentration over a long period of time, non-immunogenicity, substance enclosed in the liposome It can also be expected to prevent leakage.
For this reason, reactive liposomes are in the form of functional substance-immobilized liposomes by immobilizing functional substances, such as pharmaceutical carriers, test agents, diagnostic agents, sensors, immobilized catalysts, bioreactors, bioelectronic devices, and microcapsules. It can be used as various functional liposomes such as substitutes.
[0034]
In addition, when manufacturing a reactive liposome, it can be set as a polymeric reactive liposome by mix | blending polymeric phospholipid as another film formation component. As the polymerizable phospholipid, a known polymerizable phospholipid can be used. For example, in addition to 1,2-di (2,4-octadecadienoyl) -3-phosphatidylcholine, Shochi Nojima, sand Examples include those described in Junzo Honmoto, Shinzo Inoue, and “Liposome” p313-315 published in 1988 by Nanedo. Among these, 1,2-di (2,4-octadecadienoyl) -3-phosphatidylcholine is preferable.
[0035]
Polymerizable liposomes are prepared by irradiating UV, γ-rays, electron beams or the like in the presence or absence of a photopolymerization initiator after preparation of the liposome, by a redox initiator system, or by an azo initiator or Polymerization can be easily carried out by heating in the presence of an organic peroxide or the like.
The thus obtained post-polymerization liposomes have excellent stability, and thus can be used stably while being dispersed in an aqueous solution or prepared in a powder form by lyophilization or the like. .
[0036]
Reactive fat emulsion as other reactive endoplasmic reticulum is added to the reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention, vegetable oil such as soybean oil and safflower oil, and phospholipid such as soybean lecithin and egg yolk lecithin, if necessary. Other oil additives such as Intralipid (trade name, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), emulsification aids, stabilizers, tonicity agents, fat-soluble drugs, fat-soluble bioactive substances, and the like are emulsified It has been done.
The content of the reactive vesicle-forming agent in the oil / fat mixture is 0.1 to 50 mol%, preferably 0.5 to 30 mol%.
[0037]
The reactive fat emulsion can be produced by a known method. For example, the reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention, vegetable oil, other phospholipids and additives to be blended as necessary are mixed and heated, water is added and coarsely emulsified with a homomixer or the like, and then the Manton-Gaurin type It can be manufactured by a homogenizing method using a pressure injection type homogenizer or the like.
[0038]
In the reactive fat emulsion thus obtained, the same functional substance can be easily immobilized in the same manner as in the case of the reactive liposome, and a functional substance-immobilized fat emulsion can be obtained.
Therefore, the reactive fat emulsion can be used as a pharmaceutical carrier, a test agent, a diagnostic agent, a sensor, an immobilized catalyst, etc. in the form of a functional substance-immobilized fat emulsion by immobilizing a functional substance.
[0039]
Reactive micelles that are reactive endoplasmic reticulums other than those described above are composed of only the reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention, and contain other components such as lecithin, cholesterol, and phospholipid. There may be. Reactive micelles can immobilize functional substances in the same manner as reactive fat emulsions and can be used for similar purposes.
[0040]
【The invention's effect】
Since the reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention has a structure represented by the general formula [1], a (poly) oxyalkylene chain can be introduced into the endoplasmic reticulum, and the tip of the (poly) oxyalkylene chain. In addition, various functional substances can be easily and efficiently immobilized by covalent bonding or electrically. In this case, the endoplasmic reticulum has excellent long-term storage stability. In addition, by using the reactive endoplasmic reticulum forming agent of the present invention as an endoplasmic reticulum formation component, the effect of (poly) oxyalkylene chain introduction, for example, maintaining blood concentration over a long period of time, non-immunogenic, encapsulated in the endoplasmic reticulum Effects such as prevention of substance leakage can also be expected.
[0041]
Since the reactive endoplasmic reticulum of the present invention contains the above-mentioned reactive endoplasmic reticulum formation agent as an endoplasmic reticulum formation component, the reactive endoplasmic reticulum formation agent does not detach and is excellent in long-term stability. In addition, various functional substances can be easily and efficiently immobilized through a covalent bond or electrically via a spacer composed of a (poly) oxyalkylene chain.
[0042]
In the functional substance-immobilized vesicle of the present invention, the functional substance is sufficiently exhibited at the tip of the (poly) oxyalkylene chain, and thus the activity of the functional substance is sufficiently exhibited.
[0043]
In the method for producing a functional substance-immobilized vesicle according to the present invention, the functional substance is reacted with the reactive vesicle in the presence of a water-soluble dehydrating condensing agent. In addition, a functional substance-immobilized vesicle can be produced without damaging the vesicle.
[0044]
【Example】
Hereinafter, although an Example demonstrates still in detail, this invention is not limited to these.
Synthesis example 1
Polyethylene glycol derivative having carboxyl groups at both ends (Mw≈3000)
[Chemical 6]
[Chemical 7]
Example 1-1
Egg yolk phosphatidylcholine 20 mg (26 μmol), cholesterol 3.9 mg (10 μmol) and 2.4 mg of the compound obtained in Synthesis Example 1 (10 wt% with respect to the above two) were placed in an eggplant type flask and dissolved in 2 ml of benzene. After that, freeze-drying was performed. To this was added 1 ml of physiological saline, and the mixture was made into liposomes by bath-type ultrasonic irradiation and a vortex mixer to obtain multilamellar liposomes. Furthermore, a polycarbonate membrane of 3.0 → 1.0 → 0.2 μm was sequentially passed through an extruder to obtain large unilamellar liposomes. When the particle size of the obtained reactive liposome was measured using a laser scattering particle size distribution meter (manufactured by NICOMP, NICOMP370HPL, trademark), the average particle size was 254 nm (CV value 18%).
When the average particle size was measured after the liposomes were allowed to stand at 5 ° C. for 1 month, the average particle size was 259 nm, the CV value was 19%, and the stability was excellent.
[0046]
Example 1-2
Reactive liposomes were obtained in the same manner as in Example 1-1 except that the following reactive polyalkylene oxide derivatives were used as reactive vesicle forming agents in an amount of 5% by weight based on the other two components ( (Average particle size 275 nm, CV value 21%).
When the average particle size was measured after the liposomes were allowed to stand at 5 ° C. for 1 month, the average particle size was 278 nm, the CV value was 22%, and the stability was excellent.
[Chemical 8]
Example 1-3
Reactive liposomes were obtained in the same manner as in Example 1-1 except that the following reactive polyalkylene oxide derivatives were used as reactive vesicle forming agents in an amount of 30% by weight based on the other two components ( (Average particle size 238 nm, CV value 25%).
When the average particle size was measured after the liposomes were allowed to stand at 5 ° C. for 1 month, the average particle size was 240 nm, and the CV value was 24%, which was excellent in stability.
[Chemical 9]
Example 1-4
Reactive liposomes were obtained in the same manner as in Example 1-1 except that the following reactive polyalkylene oxide derivatives were used as reactive vesicle forming agents in an amount of 1% by weight based on the other two components ( (Average particle size 249 nm, CV value 23%).
When the average particle size was measured after the liposomes were allowed to stand at 5 ° C. for 1 month, the average particle size was 258 nm, the CV value was 26%, and the stability was excellent.
[Chemical Formula 10]
Example 1-5
Reactive liposomes were obtained in the same manner as in Example 1-1 except that the following reactive polyalkylene oxide derivative was used as a reactive vesicle-forming agent in an amount of 5% by weight based on the other two components ( (Average particle size 246 nm, CV value 24%).
When the average particle size was measured after the liposomes were allowed to stand at 5 ° C. for 1 month, the average particle size was 251 nm, the CV value was 26%, and the stability was excellent.
Embedded image
Example 1-6
In the same manner as in Example 1-1 except that the following reactive polyalkylene oxide derivative was used as a reactive endoplasmic reticulum forming agent in an amount of 5% by weight based on the other two components, and the average particle size was 294 nm (CV value Small unilamellar liposomes having a reactivity of 25%) were obtained.
When the average particle size was measured after the liposomes were allowed to stand at 5 ° C. for 1 month, the average particle size was 299 nm, the CV value was 27%, and the stability was excellent.
Embedded image
Example 1-7
In the same manner as in Example 1-1 except that 1,2-di (2,4-octadecadienoyl) -3-phosphatidylcholine (DODP) was used instead of egg yolk phosphatidylcholine and the average particle size was 249 nm (CV value 27 %) Having high reactivity. This liposome was irradiated with 0.75 Mrad of γ rays to polymerize DODP. The obtained reactive polymerizable liposome was subjected to gel filtration using Sephadex G-50 and then freeze-dried to obtain a powder sample. The liposome powder could be regenerated by swelling with physiological saline.
[0052]
Example 2-1
To 500 μl of the liposome solution (solid content 0.25%) obtained in Example 1-1, 500 μl of 1 mg / ml 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride aqueous solution (pH 5) was added. Stir at 5 ° C. for 30 minutes. Further, 100 μl of 1 mg / ml western yam peroxidase (hereinafter abbreviated as HRP) /0.1 M phosphate buffer (pH 7.5) was added and stirred at 5 ° C. for 24 hours to immobilize HRP on the liposomes. This was subjected to gel filtration using Sephadex G-50, and the liposome-containing fraction was fractionated to obtain HRP-immobilized liposomes.
To 500 μl of the HRP-immobilized liposome solution thus obtained, 100 μl of a 1,2-phenylenediamine solution (10 mmol / l) as a substrate for HRP is added, incubated at 30 ° C. for 10 minutes, and further 10 μl of 0.1N sulfuric acid. As a result, brown coloration was observed.
From this result, it was confirmed that the reactive liposome of Example 1-1 can immobilize HRP only by stirring with HRP.
[0053]
Examples 2-2 to 2-7
Using the reactive liposomes obtained in Examples 1-2 to 1-7, HRP was immobilized in the same manner as in Example 2-1, to obtain HRP-immobilized liposomes.
When each HRP-immobilized liposome was subjected to a color development test in the same manner as in Example 2-1, a brown coloration was observed in each case, confirming the fixation of HRP.
[0054]
Comparative Example 1
Multilayer liposomes having a solid content of 2.5% were obtained in the same manner as in Example 1-1 using only egg yolk phosphatidylcholine 20 mg (26 μmol) and cholesterol 3.9 mg (10 μmol).
HRP was allowed to act on the liposome in the same manner as in Example 2-1, and purified by gel filtration. To 500 μl of the obtained liposome solution, 100 μl of 1,2-phenylenediamine solution (10 mmol / l) was added, incubated at 30 ° C. for 10 minutes, and further 10 μl of 0.1N sulfuric acid was added, but no color development was observed. .
From this result, it can be seen that HRP could not be immobilized in the liposome of Comparative Example 1 that did not contain a reactive endoplasmic reticulum forming agent as a membrane-forming component.
[0055]
Comparative Example 2
Egg yolk phosphatidylcholine 20 mg (2 μmol), cholesterol 3.9 mg (10 μmol) and α-stearyl-ω-hydroxy-polyoxyethylene (average added mole number about 10) 2.4 mg (10% by weight relative to the two, 7 μmol) Was placed in an eggplant-shaped flask and dissolved in 2 ml of benzene, and then lyophilized. To this was added 1 ml of physiological saline, and the mixture was made into liposomes by bath-type ultrasonic irradiation and a vortex mixer to obtain multilamellar liposomes. Further, 3.0 to 1.0 to 0.2 μm of polycarbonate membrane was sequentially passed through an extruder to obtain large unilamellar liposomes.
When the average particle diameter of the obtained liposome was measured, it was 196 nm (CV value 11%). Furthermore, after standing at 5 ° C. for one week, the average particle size was measured again, and both the average particle size and CV value were greatly changed to 288 nm (CV value 65%), and liposomes were not present stably. I understood.
Claims (4)
ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
ＸおよびＹは２価の有機残基、
ｐは０または１、
Ｍ１およびＭ２は水素原子またはアルカリ金属原子を表わす。〕A reactive endoplasmic reticulum forming agent comprising a reactive polyalkylene oxide derivative represented by the following general formula [1].
AO is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms,
n is an average addition mole number of the oxyalkylene group and represents a positive number of 1 to 1000. When n is 2 or more, the oxyalkylene groups may be the same or different, and may be added in a random form or in a block form.
X and Y are divalent organic residues,
p is 0 or 1,
M 1 and M 2 represent a hydrogen atom or an alkali metal atom. ]
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