JP3575037B2 - Reactive endoplasmic reticulum and forming agent - Google Patents

Description

〔式中、Ｒ^１Ｃ（＝０）およびＲ^２Ｃ（＝０）は炭素数３〜３０の脂肪酸のアシル残基を表わし、同一でも異なっていてもよい。
Ｒ^３は水素原子またはメチル基、
ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
Ｍは水素原子またはアルカリ金属原子を表わす。〕
（２）上記（１）記載の反応性小胞体形成剤の一種以上を小胞体形成成分として含むことを特徴とする反応性小胞体。
【０００９】
一般式〔１〕においてＲ^１Ｃ（＝０）、Ｒ^２Ｃ（＝０）で表わされる脂肪酸のアシル残基は、炭素数（カルボニル基の炭素も含む）３〜３０、好ましくは８〜２０のアシル残基である。このようなアシル残基の具体的なものとしては、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ソロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、２−エチルヘキサン酸等の飽和脂肪酸のアシル残基；オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、２，４−オクタデカジエン酸等の不飽和脂肪酸のアシル残基；イソステアリン酸等の分岐脂肪酸のアシル残基；リシノール酸、１２−ヒドロキシステアリン酸等のアルキル基中に水酸基を有する脂肪酸のアシル残基などがあげられる。
【００１０】
これらの中では、安定なリポソームまたは脂肪乳剤が形成できるという理由から、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、２，４−オクタデカジエン酸のアシル残基が好ましく、特にパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸のアシル残基が好ましい。Ｒ^１Ｃ（＝０）とＲ^２Ｃ（＝０）とは同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００１１】
一般式〔１〕のＡＯで表わされるオキシアルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒドロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基である。
一般式〔１〕のｎは１〜１０００、好ましくは１０〜３００、さらに好ましくは２０〜１２０の正数である。
【００１２】
ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
親水性を付与する場合、ＡＯとしてはエチレンオキシドが単独で付加したものが好ましく、この場合、ｎが１０以上のものが好ましい。また種類の異なるアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオキシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付加しているのが望ましい。ポリアルキレンオキシド鎖に親油性を付与する場合はエチレンオキシド以外の付加モル数を多くする。
【００１３】
一般式〔１〕のＲ^３は水素原子またはメチル基である。
一般式〔１〕のＭは水素原子またはナトリウムもしくはカリウム等のアルカリ金属原子である。
【００１４】
一般式〔１〕で表わされる反応性リン脂質誘導体は、例えば次のような２段階の反応により、容易に製造することができる。
第１段階目の反応では、ホスホリパーゼＤ酵素（ＰＬａｓｅ−Ｄ）の存在下に、リン脂質とポリアルキレングリコールとを反応させ、ホスファチジル＝ポリアルキレングリコールを合成する。このとき使用するホスホリパーゼＤとしては、市販品または「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２，４７７−４８４（１９６７）」に記載されている方法などにより抽出・精製したものであってもよい。またリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸などが使用できる。ホスホリパーゼＤの使用量は、特に限定されないが、リン脂質１ｇに対して１００〜５００単位とするのが好ましい。また、リン脂質とポリアルキレングリコールとの仕込モル比は、リン脂質１モルに対してポリアルキレングリコール５〜１００モルとするのが好ましい。
【００１５】
反応は酢酸緩衝液、炭酸緩衝液等の水系溶媒、またはこれらの水系溶媒とクロロホルム、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等の有機溶媒との混合溶媒中で行うのが好ましい。反応温度は０〜８０℃、好ましくは３０〜４０℃、反応時間は１０分間〜１７０時間、好ましくは３０分間〜２４時間とするのが望ましい。
このようにして得られたホスファチジル＝ポリアルキレングリコールは、そのまま、または再沈殿、カラム処理、吸着剤処理、イオン交換、ゲル濾過、限外濾過、透析などの方法により単離・精製して、次の第２段階目の反応に供する。
【００１６】
第２段階目の反応では、第１段階目の反応で得られたホスファチジル＝ポリアルキレングリコールにＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはその誘導体を反応させ、目的とするリン脂質誘導体を合成する。両者の仕込モル比は特に限定されないが、ホスファチジル＝ポリアルキレングリコール１モルに対してＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾールまたはその誘導体０．１〜１００モル、好ましくは１〜１０モルとするのが望ましい。
【００１７】
反応はクロロホルム、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等の有機溶媒中で行うのが好ましい。反応温度は−１００〜１００℃、好ましくは０〜４０℃、反応時間は１分間〜４８時間、好ましくは１０分間〜６時間とするのが望ましい。
反応終了後は、得られた反応混合物はそのまま、あるいは蒸留、再結晶、再沈澱、吸着剤処理、カラム処理、イオン交換、ゲル濾過、限外濾過、透析などの方法により単離・精製した後、反応性小胞体形成剤として使用することができる。
【００１８】
ポリアルキレングリコールとしてポリエチレングリコールを用いた場合の反応式を次に示す。なお、式中Ｒ^１（Ｃ＝Ｏ）、Ｒ^２（Ｃ＝Ｏ）、Ｍおよびｎは前記と同じもの、ＰＬ−ＰＥＧはホスファチジル＝ポリエチレングリコールを示す。
【化３】

【００１９】
本発明の反応性小胞体形成剤は、アミノ基、水酸基またはチオール基などの官能基、特に第１級アミノ基に対して高い反応性のあるオキシカルボニルイミダゾール基を有しているので、このような官能基を有する機能性物質と容易に反応し、共有結合が形成される。このため、本発明の反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として用いることにより、小胞体にポリアルキレンオキシド鎖を導入できるとともに、前記官能基を有する機能性物質に対する反応性を付与することができる。
【００２０】
本発明の反応性小胞体は、上記反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として含有し、前記官能基を有する機能性物質に対する反応性を有するものである。反応性小胞体形成剤は一種単独で含有されていても、二種以上が組合されて含有されていてもよい。また小胞体形成成分としては本発明の反応性小胞体形成剤の他に小胞体を形成し得る他の小胞体形成成分が含まれていてもよい。
【００２１】
本発明において小胞体とは、反応性小胞体形成剤または反応性小胞体形成剤と他の小胞体形成成分の親水基が界面の水相に向って配向した構造を有する粒子を意味する。具体的なものとしては、二分子膜からなる閉鎖小胞であるリポソーム、植物油およびリン脂質などの混合物が乳化された脂肪乳剤、またはミセルなどがあげられる。
【００２２】
本発明の反応性小胞体形成剤は、一般式〔１〕で表わされる反応性リン脂質誘導体を一種単独で、または二種以上組合せて、あるいは小胞体を形成しうる他の小胞体形成成分、例えば大豆レシチン、卵黄レシチン、その他のリン脂質類、コレステロールやイントラリピッド（大塚製薬（株）、商標）、大豆油、サフラワー油などと混合して使用することにより、反応性リポソームをはじめ反応性脂肪乳剤、反応性ミセルなどの反応性小胞体を形成することができる。この場合、小胞体は公知の方法により製造することができる。
本発明の反応性小胞体形成剤を用いて得られた反応性小胞体は、一般式〔１〕で表わされる化合物中のオキシカルボニルイミダゾール基を官能基として利用して、種々の機能性物質を共有結合により導入することができる。
【００２３】
次にそれぞれの反応性小胞体について詳しく説明する。
代表的な反応性小胞体である反応性リポソームは、反応性小胞体形成剤を膜形成成分（小胞体形成成分）として含有するものである。反応性小胞体形成剤の含有量は、反応性小胞体形成剤および他の膜形成成分の合計量に対して０．００１〜１００モル％、好ましくは０．５〜３０モル％であるのが望ましい。０．００１モル％未満では期待される効果が小さくなるため、一般的には使用されない。反応性小胞体形成剤は、一種単独で使用することもできるし、二種以上のものを組合せて使用することもできる。
【００２４】
反応性小胞体形成剤と混合して用いられる他の膜形成成分としては、従来からリポソームの膜形成成分として用いられているものが制限なく使用できる。具体的には、ジホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール等のリン脂質および脂肪酸部に不飽和基を有する重合性リン脂質；スルホキシリボシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ラクトシルジグリセリド等の糖脂質類；コレステロール等の非極性脂質；その他には、非イオン性界面活性剤、ホスファチジルポリエチレングリコール、「Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， １０６６， ２９−３６（１９９１）」に記載されているホスファチジルエタノールアミンとポリエチレングリコールとの反応物、およびこれらの混合物などがあげられる。
【００２５】
反応性リポソームは、反応性小胞体形成剤およびレシチン、その他のリン脂質、コレステロール等の他の膜形成成分を、有機溶媒等の適当な溶媒に溶解し、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆層蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法など、種々の公知の方法によりリポソーム化することにより製造することができる。また、これらの製造法を選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソームなど、種々の大きさや形態を有する反応性リポソームを製造することができる。
【００２６】
このようにして得られた反応性リポソームは、リポソーム膜の内外表面にポリアルキレンオキシドからなるスペーサーを介してオキシカルボニルイミダゾール基が結合しているので、アミノ基、水酸基、チオール基などの官能基、特に第１級アミノ基を有する機能性物質を効率よくかつ簡単にリポソームの二分子膜上にポリアルキレンオキシドからなるスペーサーを介して、ウレタン結合、カーボネート結合またはチオカーボネート結合により化学的に固定化することができる。
【００２７】
反応性リポソームに固定化できる機能性物質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合物、電極感応性化合物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医薬などがあげられる。
【００２８】
反応性リポソーム上への機能性物質の固定化反応は、種々の緩衝液等の水系溶媒、またはこれらの水系溶媒とアセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、ジメチルスルホキシド、ピロリドン等の有機溶媒との混合溶媒中で、反応性リポソームと機能性物質とを−１０〜１２０℃、アミノ基との反応の場合は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは０〜４０℃、水酸基またはチオール基との反応の場合は好ましくは４０〜１２０℃で、５分間〜１０００時間、好ましくは３０分間〜７２時間攪拌下に反応させる方法などにより、一段階で容易に行うことができる。これらの条件外では、リポソームの安定性が悪くなるため好ましくない。
【００２９】
リポソーム表面上でのアミノ基を有する機能性物質の固定化反応を模式的に示すと次のようになる。式中、Ｒ^３、ＡＯ、ｎは前記と同じものを示す。
【化４】

【００３０】
また、反応性リポソームの内部には、一般のリポソームと同様に種々の物質を公知の方法により封入することが可能である。被封入物質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性化合物、電極感応性化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医薬；ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸等の水溶性高分子類などがあげられる。
固定化反応または封入操作の終了後は、必要によりゲル濾過、限外濾過、透析、遠心分離、静置沈降分離等の方法により精製を行うことができる。
【００３１】
機能性物質を固定化したリポソームは、ポリアルキレンオキシド鎖の先端に機能性物質が固定化されているので、ポリアルキレンオキシド鎖に邪魔されることなく機能性物質の作用が十分に発揮される。また、ポリアルキレンオキシド鎖が導入されているので、従来からのポリアルキレンオキシド鎖導入の効果、例えば長期間にわたる血液中濃度の維持、非免疫原性、リポソーム内部に封入した物質の漏れ防止などの効果も期待できる。
このため反応性リポソームは、医薬の運搬体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒、バイオリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイクロカプセル代替品など、種々の機能性リポソームとして利用できる。
【００３２】
なお、反応性リポソームを製造する際、他の膜形成成分として重合性リン脂質を配合することにより、重合性の反応性リポソームとすることができる。重合性のリン脂質としては、公知の重合性リン脂質を使用することができるが、例えば１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンの他、野島庄七、砂本順三、井上圭三編集、１９８８年南江堂発行の「リポソーム」ｐ３１３〜３１５に記載のものなどがあげられる。これらの中では、１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンが好ましい。
【００３３】
重合性リポソームは、リポソーム調製後に、光重合開始剤の存在下または非存在下でＵＶ、γ線、電子線などの光照射を行うことにより、あるいはレドックス開始剤系により、あるいはアゾ系開始剤または有機過酸化物などの存在下で加熱を行うことにより、容易に重合を行うことができる。
このようにして得られた重合後のリポソームは、優れた安定性を有しているので、水溶液に分散させたままで、あるいは凍結乾燥等により粉末状に調製し、安定して使用することができる。
【００３４】
他の反応性小胞体としての反応性脂肪乳剤は、本発明の反応性小胞体形成剤と、大豆油、サフラワー油等の植物油と、大豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂質と、必要により添加される他の添加剤、例えばイントラリピッド（大塚製薬（株）製、商標）、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、脂溶性医薬、脂溶性生理活性物質などを含む油脂混合物が乳化されたものである。
油脂混合物中に占める反応性小胞体形成剤の含有量は、０．００１〜５０モル％、好ましくは０．５〜３０モル％であるのが望ましい。
【００３５】
反応性脂肪乳剤は、公知の方法により製造することができる。例えば、本発明の反応性小胞体形成剤、植物油、他のリン脂質および必要により配合する添加剤を混合、加熱し、水を加えてホモミキサー等で粗乳化し、次にマントン−ガウリン型の加圧噴射式ホモジナイザー等で均質化する方法などにより製造することができる。
【００３６】
このようにして得られた反応性脂肪乳剤には、反応性リポソームの場合と同様にして、同様の機能性物質を容易に固定化することができる。
このため反応性脂肪乳剤は、医薬の運般体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒などとして利用できる。
【００３７】
上記以外の反応性小胞体である反応性ミセルは、本発明の反応性小胞体形成剤だけからなるものであっても、レシチン、その他のリン脂質類、コレステロール等の他の成分が含有されているものであってもよい。反応性ミセルも反応性脂肪乳剤と同様にして機能性物質を固定化することができ、同様の用途に利用できる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の反応性小胞体形成剤は、一般式〔１〕で表わされる構造を有しているので、小胞体にポリアルキレンオキシド鎖を導入できるとともに、このポリアルキレンオキシド鎖の先端に、簡単にかつ効率よく種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、しかも機能性物質の導入量を多くすることができる。
【００３９】
本発明の反応性小胞体は、上記反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として含有しているので、ポリアルキレンオキシド鎖が導入されるとともに、小胞体にポリアルキレンオキシドからなるスペーサーを介して、簡単にかつ効率よく種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、しかも機能性物質の導入量を多くすることができる。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により、さらに詳細な説明を行うが、本発明はこれらに限定されるものではない。
合成例１
ジパルミトイルホスファチジルコリン０．５ｇ（０．６５ｍｍｏｌ）およびポリエチレングリコール（Ｍｗ≒２０００、ｎ≒４５）５ｇ（１．７ｍｍｏｌ）を溶解させたクロロホルム溶液４０ｍｌに、ホスホリパーゼＤ（東洋醸造（株）製）４０単位を溶解させた１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）２０ｍｌを加え、４０℃で１２時間攪拌して反応させた。次に、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、有機層を減圧下で濃縮した。得られた反応混合物をシリカゲルカラム（２０％メタノール／クロロホルム）を用いて分画し、濃縮した後、少量のクロロホルムに溶解させ、これをジエチルエーテルに再沈殿することにより、ジパルミトイルホスファチジル＝ポリエチレングリコールを得た（収率３０％）。
【００４１】
次に、乾燥させたクロロホルム１０ｍｌ中に、上記ジパルミトイルホスファチジル＝ポリエチレングリコール１００ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ′−ジカルボニルイミダゾール８７ｍｇ（０．５４ｍｍｏｌ）を加え、室温で６時間攪拌した。得られた反応混合物をジエチルエール中で再沈殿させ、目的の反応性リン脂質誘導体（一般式〔１〕において、Ｒ^１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ^２（Ｃ＝Ｏ）がパルミトイル基、Ｒ^３の水素原子、Ｍが水素原子、ＡＯがオキシエチレン基、ｎが約４５の反応性リン脂質誘導体）を得た（収率９２％）。
反応の進行は、１Ｒスペクトル（ＫＢｒ法）において、ポリエチレングリコール末端の水酸基（ＯＨ伸縮、３４２８ｃｍ^−１）の消失およびオキシカルボニルイミダゾール基（カルボニル結合）の生成（Ｃ＝Ｏ伸縮、１７６０ｃｍ^−１）により確認した。
【００４２】
実施例１−１
卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、およびコレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）に、合成例１で得られた反応性リン脂質誘導体を前記二者に対して１０ｗｔ％（２．４ｍｇ、０．８μｍｏｌ）ナス型フラスコに入れ、２ｍｌのベンゼンで溶解させた後、凍結乾燥を行った。これに生理的食塩水１ｍｌを加え、バス型超音波照射およびボルテックスミキサーにより多重層リポソームを得た。また、さらにエクスツルーダーにより３．０→１．０→０．２μｍのポリカーボネート製メンブランを順次通過させ、大きな単層の反応性リポソームを得た。得られた反応性リポソームの粒径をレーザー散乱粒度分布計（ＮＩＣＯＭＰ社製、ＮＩＣＯＭＰ３７０ＨＰＬ、商標）を用いて測定したところ、平均粒径は２２１ｎｍ（ＣＶ値１９％）であった。
【００４３】
実施例１−２
実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕においてＲ^１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ^２（Ｃ＝Ｏ）がミリストイル基、Ｒ^３が水素原子、Ｍが水素原子、ＡＯがオキシエチレン基、ｎが約１０である反応性リン脂質誘導体５ｗｔ％（１μｍｏｌ）と、ジミリストイルホスファチジル＝ポリエチレングリコール（Ｍｗ≒２０００）５ｗｔ％（０．４μｍｏｌ）とを用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２６８ｎｍ、ＣＶ値２２％）。
【００４４】
実施例１−３
実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕においてＲ^１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ^２（Ｃ＝Ｏ）がミリストイル基、Ｒ^３が水素原子、Ｍが水素原子、ＡＯがオキシエチレン基、ｎが約３０である反応性リン脂質誘導体３０ｗｔ％（３．５μｍｏｌ）を用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２３８ｎｍ、ＣＶ値２２％）。
【００４５】
実施例１−４
実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕においてＲ^１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ^２（Ｃ＝Ｏ）がステアロイル基、Ｒ^３が水素原子、Ｍが水素原子、オキシアルキレン鎖がオキシプロピレン基（平均付加モル数約１０）とオキシエチレン基（平均付加モル数約２５）とがランダムに付加したものである反応性リン脂質誘導体１ｗｔ％（０．１μｍｏｌ）と、ジミリストイルホスファチジル＝ポリエチレングリコール（Ｍｗ≒２０００）５ｗｔ％（０．４μｍｏｌ）とを用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２３９ｎｍ、ＣＶ値２５％）。
【００４６】
実施例１−５
実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕においてＲ^１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ^２（Ｃ＝Ｏ）がステアロイル基、Ｒ^３が水素原子、Ｍが水素原子、オキシアルキレン鎖がオキシプロピレン基（平均付加モル数約１０）とオキシエチレン基（平均付加モル数約１５）とがブロック状に付加したものである反応性リン脂質誘導体５ｗｔ％（０．６μｍｏｌ）を用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２４７ｎｍ、ＣＶ値１９％）。
【００４７】
実施例１−６
実施例１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕においてＲ^１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ^２（Ｃ＝Ｏ）がステアロイル基、Ｒ^３が水素原子、Ｍが水素原子、オキシアルキレン鎖がオキシテトラメチレン基（平均付加モル数５）とオキシエチレン基（平均付加モル数約２７８）とがブロック状に付加したものである反応性リン脂質誘導体５ｗｔ％（０．１μｍｏｌ）を用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２９０ｎｍ、ＣＶ値２３％）。
【００４８】
実施例１−７
実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕におけるてＲ^１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ^２（Ｃ＝Ｏ）がミリストイル基、Ｒ^３がメチル基、Ｍが水素原子、ＡＯがオキシエチレン基、ｎが約１０である反応性リン脂質誘導体２０ｗｔ％（４．２μｍｏｌ）を用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２１１ｎｍ、ＣＶ値１９％）。
【００４９】
実施例２
実施例１−１と同様にして、ただし卵黄ホスファチジルコリンの代わりに１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＤＰ）を用いて、平均粒径２５４ｎｍ（ＣＶ値２３％）の重合性を有する大きな単層の反応性リポソームを得た。このリポソームに０．７５Ｍｒａｄのγ線照射を行い、ＤＯＤＰを重合させた。得られた重合リポソームは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過後、凍結乾燥により粉末状サンプルとした。このリポソーム粉末は、生理的食塩水で膨潤させることにより再生することができた。
【００５０】
実施例３
実施例１−１で得られた反応性リポソーム溶液（固形分量２．５ｗｔ％）０．５ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌの西洋山葵ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を、４℃で２４時間攪拌してＨＲＰを反応性リポソームに固定化した。これをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、含リポソーム分画を分取した。これにＨＲＰの基質である１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃で１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたところ、褐色の呈色が見られた。
この結果から、実施例１−１の反応性リポソームは、ＨＲＰと攪拌するだけでＨＲＰを固定化できることが確認できた。
【００５１】
比較例１
卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、およびコレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）のみにより、実施例１−１と同様の操作により、固形分量２．５ｗｔ％の大きな単層のリポソームを得た。このリポソーム溶液に実施例３と同様にしてＨＲＰを作用させ、ゲル濾過により精製後、１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃で１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたが、発色は見られなかった。
この結果から、反応性リン脂質誘導体を膜形成成分として含まない比較例１のリポソームでは、ＨＲＰを固定化することができなかったことがわかる。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a reactive endoplasmic reticulum-forming agent and a reactive endoplasmic reticulum containing the same as an endoplasmic reticulum-forming component. More specifically, it is used for the production of vesicles such as various functional liposomes or fat emulsions, such as pharmaceutical carriers, test agents, diagnostic agents, sensors, immobilized catalysts, bioreactors, bioelectronic devices, and microcapsule substitutes. The present invention relates to a reactive endoplasmic reticulum-forming agent and a reactive endoplasmic reticulum containing the same as an endoplasmic reticulum-forming component.
[0002]
[Prior art]
Liposomes are vesicles composed of a phospholipid bilayer membrane, and their application in various fields has been attempted. In particular, application to pharmaceutical carriers, sensors for diagnosis and detection, etc., has attracted attention.However, immobilizing a functional substance on the liposome surface or in a membrane to provide various functions, and reducing the blood concentration of liposome Maintaining is a major issue.
[0003]
Conventionally, regarding immobilization of a functional substance on the surface of a liposome or in a membrane, γ-maleimidobutyloxysuccinimidyl is added to an aminoethylcarbamylmethyl group substituted on a polysaccharide on the surface of a liposome coated with a pullulan derivative. (Biochem. Biophys. Acta., 898 , 323 (1987)) or a glycolipid is previously added to a liposome membrane-forming component, and liposome formation is followed by periodate oxidation. There is a method of reacting the resulting aldehyde group with the antibody and immobilizing the antibody (J. Biol. Chem., 255 , 10509 (1980)).
[0004]
However, in these conventional methods, it is necessary to carry out a multi-step chemical reaction on the liposome membrane surface after the preparation of the liposome. And impurities are mixed, and the liposome membrane is seriously damaged.
[0005]
On the other hand, it has been pointed out that when liposomes are administered into a living body, most of them are trapped in reticulo-organs such as liver and spleen, and thus cannot provide a sufficient effect (Cancer Res., 43 , 5328). (1983)). Therefore, as a method of improving the problem of being trapped by the reticulo-organs or the problem of low stability such as disintegration and aggregation of the liposome itself, a polyethylene glycol chain is introduced into the surface of the liposome. (For example, JP-A-1-249717, FEBS letters, 268 , 235 (1990)). In addition, it has been shown that liposomes modified with polyethylene glycol can maintain blood concentrations for a long period of time (Biochem. Biophys. Acta., 1066 , 29-36 (1991)).
However, since the liposome into which the polyethylene glycol chain obtained by such a method has been introduced does not react with the functional substance, the functional substance cannot be immobilized on the liposome surface.
[0006]
Further, JP-A-4-346918 discloses that a liposome having a maleimide group is first reacted with a protein having a thiol group (thiolated protein), and then a polyalkylene glycol having a thiol group added to a remaining maleimide group (thiolated liposome). It is described that by reacting a compound containing a (polyalkylene glycol) moiety, drug-containing antibody-bound liposomes with improved uptake in reticulo-organs can be obtained.
However, this liposome has a problem that the expected effect cannot be sufficiently obtained because the antibody is hidden under the polyalkylene glycol layer and the reaction with the antigen at the target site is hindered.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above problems by introducing a polyalkylene oxide chain into a liposome or other endoplasmic reticulum, and easily and efficiently sharing various functional substances at the tip of the polyalkylene oxide chain. A reactive endoplasmic reticulum-forming agent that can be immobilized by bonding and can increase the amount of the introduced functional substance, and a reactive endoplasmic reticulum containing the reactive endoplasmic reticulum-forming agent as an endoplasmic reticulum-forming component. To provide.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides the following reactive vesicle-forming agent and reactive vesicle.
(1) A reactive vesicle-forming agent comprising a reactive phospholipid derivative represented by the following general formula [1].
Embedded image

[Wherein, R ¹ C (= 0) and R ² C (= 0) represent an acyl residue of a fatty acid having 3 to 30 carbon atoms, which may be the same or different.
R ³ is a hydrogen atom or a methyl group,
AO is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms,
n is an average number of added moles of the oxyalkylene group, and represents a positive number of 1 to 1000. When n is 2 or more, the oxyalkylene groups may be the same or different, and may be added randomly or in blocks.
M represents a hydrogen atom or an alkali metal atom. ]
(2) A reactive endoplasmic reticulum comprising one or more of the reactive endoplasmic reticulum-forming agents according to (1) above as an endoplasmic reticulum-forming component.
[0009]
The acyl residue of the fatty acid represented by R ¹ C (= 0) and R ² C (= 0) in the general formula [1] has 3 to 30 carbon atoms (including carbon of a carbonyl group), preferably 8 to 20 carbon atoms. Is an acyl residue. Specific examples of such acyl residues include propionic acid, butyric acid, caproic acid, caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, undecanoic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, and behenic acid. Acyl residues of saturated fatty acids such as acid, lignoceric acid, sorotic acid, montanic acid, melicic acid, 2-ethylhexanoic acid; oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, erucic acid, 2,4-octadecadienoic acid, etc. Acyl residues of unsaturated fatty acids; acyl residues of branched fatty acids such as isostearic acid; acyl residues of fatty acids having a hydroxyl group in an alkyl group such as ricinoleic acid and 12-hydroxystearic acid.
[0010]
Of these, acyl residues of myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, and 2,4-octadecadienoic acid are preferable because stable liposomes or fat emulsions can be formed, and particularly, palmitic acid, stearic acid, and the like. Acid and oleic acid acyl residues are preferred. R ¹ C (= 0) and R ² C (= 0) may be the same or different.
[0011]
The oxyalkylene group represented by AO in the general formula [1] is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and is an oxyethylene group, an oxypropylene group, an oxytrimethylene group, an oxy-1-ethylethylene group, an oxy- Examples thereof include a 1,2-dimethylethylene group and an oxytetramethylene group. These oxyalkylene groups are groups obtained by addition polymerization of alkylene oxides such as ethylene oxide, propylene oxide, oxetane, 1-butene oxide, 2-butene oxide, and tetrahydrofuran.
N in the general formula [1] is a positive number of 1 to 1000, preferably 10 to 300, and more preferably 20 to 120.
[0012]
When n is 2 or more, the types of the oxyalkylene groups may be the same or different. In the latter case, they may be added randomly or in blocks.
When imparting hydrophilicity, AO is preferably one to which ethylene oxide is independently added, and in this case, n is preferably 10 or more. When different types of alkylene oxides are added, it is desirable that ethylene oxide is added in an amount of 20 mol% or more, preferably 50 mol% or more. When imparting lipophilicity to the polyalkylene oxide chain, the number of moles other than ethylene oxide is increased.
[0013]
R ^{3 in the} general formula [1] is a hydrogen atom or a methyl group.
M in the general formula [1] is a hydrogen atom or an alkali metal atom such as sodium or potassium.
[0014]
The reactive phospholipid derivative represented by the general formula [1] can be easily produced, for example, by the following two-step reaction.
In the first-stage reaction, a phospholipid is reacted with a polyalkylene glycol in the presence of a phospholipase D enzyme (PLase-D) to synthesize phosphatidyl polyalkylene glycol. The phospholipase D used at this time may be a commercially available product or a product extracted and purified by the method described in “J. Biol. Chem., 242 , 477-484 (1967)”. As the phospholipid, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid and the like can be used. The amount of phospholipase D used is not particularly limited, but is preferably 100 to 500 units per 1 g of phospholipid. Further, the charged molar ratio of the phospholipid to the polyalkylene glycol is preferably 5 to 100 mol of the polyalkylene glycol per 1 mol of the phospholipid.
[0015]
The reaction is preferably performed in an aqueous solvent such as an acetate buffer or a carbonate buffer, or a mixed solvent of these aqueous solvents and an organic solvent such as chloroform, benzene, toluene, tetrahydrofuran, or acetonitrile. The reaction temperature is preferably 0 to 80 ° C, preferably 30 to 40 ° C, and the reaction time is preferably 10 minutes to 170 hours, preferably 30 minutes to 24 hours.
The phosphatidyl polyalkylene glycol thus obtained is isolated or purified as it is or by reprecipitation, column treatment, adsorbent treatment, ion exchange, gel filtration, ultrafiltration, dialysis, etc. For the second-stage reaction.
[0016]
In the second-stage reaction, N, N'-carbonyldiimidazole (CDI) or a derivative thereof is reacted with the phosphatidyl polyalkylene glycol obtained in the first-stage reaction to synthesize a target phospholipid derivative. I do. The molar ratio of the two is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 100 mol, more preferably 1 to 10 mol, of N, N'-carbonyldiimidazole or a derivative thereof per mol of phosphatidyl = polyalkylene glycol. .
[0017]
The reaction is preferably performed in an organic solvent such as chloroform, benzene, toluene, tetrahydrofuran, and acetonitrile. The reaction temperature is -100 to 100C, preferably 0 to 40C, and the reaction time is 1 minute to 48 hours, preferably 10 minutes to 6 hours.
After completion of the reaction, the obtained reaction mixture is isolated or purified as it is or by methods such as distillation, recrystallization, reprecipitation, adsorbent treatment, column treatment, ion exchange, gel filtration, ultrafiltration, and dialysis. And can be used as a reactive vesicle forming agent.
[0018]
The reaction formula when polyethylene glycol is used as the polyalkylene glycol is shown below. In the formula, R ¹ (C ＝ O), R ² (C ＝ O), M and n are the same as described above, and PL-PEG represents phosphatidyl = polyethylene glycol.
Embedded image

[0019]
The reactive endoplasmic reticulum-forming agent of the present invention has a functional group such as an amino group, a hydroxyl group or a thiol group, particularly an oxycarbonylimidazole group highly reactive with a primary amino group. Easily reacts with a functional substance having an appropriate functional group to form a covalent bond. Therefore, by using the reactive endoplasmic reticulum-forming agent of the present invention as an endoplasmic reticulum-forming component, it is possible to introduce a polyalkylene oxide chain into the endoplasmic reticulum and to impart reactivity to the functional substance having the functional group. it can.
[0020]
The reactive endoplasmic reticulum of the present invention contains the above-mentioned reactive endoplasmic reticulum-forming agent as an endoplasmic reticulum-forming component and has reactivity with the functional substance having the functional group. The reactive vesicle forming agent may be contained alone or in combination of two or more. The vesicle-forming component may contain other vesicle-forming components capable of forming vesicles in addition to the reactive vesicle-forming agent of the present invention.
[0021]
In the present invention, the endoplasmic reticulum means particles having a structure in which a reactive endoplasmic reticulum forming agent or a hydrophilic group of the reactive endoplasmic reticulum forming agent and another endoplasmic reticulum forming component is oriented toward an aqueous phase at an interface. Specific examples include liposomes, which are closed vesicles composed of a bilayer membrane, fat emulsions in which a mixture of vegetable oil, phospholipid, and the like are emulsified, micelles, and the like.
[0022]
The reactive endoplasmic reticulum-forming agent of the present invention comprises a reactive phospholipid derivative represented by the general formula [1] alone or in combination of two or more, or other endoplasmic reticulum-forming components capable of forming an endoplasmic reticulum, For example, by mixing with soybean lecithin, egg yolk lecithin, other phospholipids, cholesterol and intralipid (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., trademark), soybean oil, safflower oil, etc. Reactive vesicles such as fat emulsions and reactive micelles can be formed. In this case, the endoplasmic reticulum can be produced by a known method.
The reactive endoplasmic reticulum obtained using the reactive endoplasmic reticulum-forming agent of the present invention utilizes various functional substances by utilizing the oxycarbonylimidazole group in the compound represented by the general formula [1] as a functional group. It can be introduced by a covalent bond.
[0023]
Next, each reactive vesicle will be described in detail.
Reactive liposomes, which are typical reactive vesicles, contain a reactive vesicle-forming agent as a membrane-forming component (vesicle-forming component). The content of the reactive vesicle-forming agent is 0.001 to 100 mol%, preferably 0.5 to 30 mol%, based on the total amount of the reactive vesicle-forming agent and other film-forming components. desirable. If the amount is less than 0.001 mol%, the expected effect is reduced, so that it is not generally used. The reactive endoplasmic reticulum-forming agent can be used alone or in combination of two or more.
[0024]
As other membrane-forming components to be used by mixing with the reactive vesicle-forming agent, those conventionally used as liposome membrane-forming components can be used without limitation. Specifically, phospholipids such as diphosphatidylglycerol, cardiolipin, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, soybean lecithin, egg yolk lecithin, phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and the like, and polymerizable phospholipids having an unsaturated group in the fatty acid portion; Glycolipids such as xyribosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, and lactosyl diglyceride; nonpolar lipids such as cholesterol; and other nonionic surfactants, phosphatidyl polyethylene glycol, "Biochem. Biophys. Acta., 1066 , 29. -36 (1991) ", a reaction product of phosphatidylethanolamine and polyethylene glycol, and a mixture thereof. It is below.
[0025]
Reactive liposomes are prepared by dissolving a reactive vesicle-forming agent and other membrane-forming components such as lecithin, other phospholipids, and cholesterol in a suitable solvent such as an organic solvent, and then subjecting the solution to extrusion, vortex mixer, or ultrafiltration. Liposomes are formed by various known methods such as a sonication method, a surfactant removal method, a reverse layer evaporation method, an ethanol injection method, a prevesicle method, a French press method, a W / O / W emulsion method, an annealing method, and a freeze-thaw method. It can be manufactured by the following. In addition, by selecting these production methods, reactive liposomes having various sizes and forms such as multilamellar liposomes, small unilamellar liposomes, and large unilamellar liposomes can be produced.
[0026]
The reactive liposome thus obtained has an oxycarbonylimidazole group bonded to the inner and outer surfaces of the liposome membrane via a spacer made of polyalkylene oxide, and thus has a functional group such as an amino group, a hydroxyl group, or a thiol group, In particular, a functional substance having a primary amino group is efficiently and easily chemically immobilized on a bilayer membrane of a liposome by a urethane bond, a carbonate bond or a thiocarbonate bond via a spacer made of a polyalkylene oxide. be able to.
[0027]
Examples of the functional substance that can be immobilized on the reactive liposome include a labeling substance such as a dye, a dye, a radiation label compound, a fluorescent compound, a chemiluminescent compound, and an electrode sensitive compound; a photoresponsive compound, a pH responsive compound, and a thermoresponsive compound. External stimuli-responsive compounds such as sex compounds; enzymes, antibodies, and other physiologically active substances such as proteins, sugars, lipids, glycoproteins, glycolipids, and hormones; and pharmaceuticals.
[0028]
The immobilization reaction of the functional substance on the reactive liposome is performed using an aqueous solvent such as various buffers, or these aqueous solvents and acetone, acetonitrile, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, In a mixed solvent with an organic solvent such as dimethyl sulfoxide and pyrrolidone, the reactive liposome and the functional substance are subjected to -10 to 120 ° C, preferably 0 to 60 ° C, more preferably 0 to 60 ° C in the case of a reaction with an amino group. In the case of a reaction with a hydroxyl group or a thiol group at 40 ° C., the reaction can be easily performed in a single step, for example, by reacting at 40 to 120 ° C. with stirring for 5 minutes to 1000 hours, preferably 30 minutes to 72 hours. Can be. Outside these conditions, the stability of the liposome deteriorates, which is not preferable.
[0029]
The immobilization reaction of a functional substance having an amino group on the liposome surface is schematically shown as follows. In the formula, R ³ , AO, and n represent the same as described above.
Embedded image

[0030]
In addition, various substances can be encapsulated in the reactive liposome by a known method as in general liposomes. Examples of the substance to be encapsulated include labeling substances such as dyes, dyes, radiation labeling compounds, fluorescent compounds, and chemiluminescent compounds; and external stimulus responses such as photoresponsive compounds, pH-responsive compounds, thermoresponsive compounds, and electrode-sensitive compounds. Active compounds: enzymes, antibodies, other physiologically active substances such as proteins, sugars, lipids, glycoproteins, glycolipids, hormones, etc .; medicines; water-soluble polymers such as polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, hyaluronic acid, etc. can give.
After completion of the immobilization reaction or the encapsulation operation, if necessary, purification can be performed by a method such as gel filtration, ultrafiltration, dialysis, centrifugation, and sedimentation by standing.
[0031]
Since the functional substance is immobilized on the tip of the polyalkylene oxide chain in the liposome having the functional substance immobilized thereon, the function of the functional substance is sufficiently exerted without being disturbed by the polyalkylene oxide chain. In addition, since a polyalkylene oxide chain has been introduced, the effects of conventional polyalkylene oxide chain introduction, such as maintenance of blood concentration over a long period of time, non-immunogenicity, prevention of leakage of substances encapsulated inside liposomes, etc. The effect can be expected.
For this reason, the reactive liposome can be used as various functional liposomes such as a drug carrier, a test agent, a diagnostic agent, a sensor, an immobilized catalyst, a bioreactor, a bioelectronic element, and a microcapsule substitute.
[0032]
When producing a reactive liposome, a polymerizable reactive liposome can be obtained by blending a polymerizable phospholipid as another membrane-forming component. As the polymerizable phospholipid, known polymerizable phospholipids can be used. For example, in addition to 1,2-di (2,4-octadecadienoyl) -3-phosphatidylcholine, Shochichi Nojima, Sand Junzo Hon and Keizo Inoue, liposomes published by Nankodo in 1988, pp. 313-315, and the like. Among them, 1,2-di (2,4-octadecadienoyl) -3-phosphatidylcholine is preferable.
[0033]
Polymerizable liposomes, after liposome preparation, by performing light irradiation such as UV, γ-ray, electron beam in the presence or absence of a photopolymerization initiator, or by a redox initiator system, or by an azo initiator or Polymerization can be easily performed by heating in the presence of an organic peroxide or the like.
Since the liposome after polymerization obtained in this manner has excellent stability, it can be stably used while being dispersed in an aqueous solution or prepared in a powder form by freeze-drying or the like. .
[0034]
The reactive fat emulsion as other reactive vesicles, the reactive vesicle-forming agent of the present invention, soybean oil, vegetable oils such as safflower oil, and soybean lecithin, phospholipids such as egg yolk lecithin and, if necessary, added The oil / fat mixture containing other additives, for example, Intralipid (trade name, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), an emulsifier, a stabilizer, a tonicity agent, a fat-soluble drug, a fat-soluble bioactive substance, etc. is emulsified. It was done.
The content of the reactive vesicle-forming agent in the oil and fat mixture is desirably 0.001 to 50 mol%, preferably 0.5 to 30 mol%.
[0035]
The reactive fat emulsion can be produced by a known method. For example, the reactive endoplasmic reticulum-forming agent of the present invention, vegetable oil, other phospholipids and additives to be blended if necessary are mixed and heated, water is added thereto, and the mixture is coarsely emulsified by a homomixer or the like, and then a manton-gaurin type It can be manufactured by a method of homogenizing with a pressure injection type homogenizer or the like.
[0036]
The same functional substance can be easily immobilized on the reactive fat emulsion thus obtained in the same manner as in the case of the reactive liposome.
Therefore, the reactive fat emulsion can be used as a pharmaceutical carrier, a test agent, a diagnostic agent, a sensor, an immobilized catalyst, and the like.
[0037]
Reactive micelles that are reactive vesicles other than those described above, even if they consist only of the reactive vesicle-forming agent of the present invention, contain lecithin, other phospholipids, and other components such as cholesterol. May be available. The reactive micelle can immobilize the functional substance in the same manner as the reactive fat emulsion, and can be used for the same purpose.
[0038]
【The invention's effect】
Since the reactive endoplasmic reticulum-forming agent of the present invention has a structure represented by the general formula [1], a polyalkylene oxide chain can be introduced into the endoplasmic reticulum, and the end of the polyalkylene oxide chain can be easily added to the end. In addition, various functional substances can be efficiently immobilized by covalent bonds, and the amount of functional substances introduced can be increased.
[0039]
Since the reactive endoplasmic reticulum of the present invention contains the above-mentioned reactive endoplasmic reticulum-forming agent as an endoplasmic reticulum-forming component, a polyalkylene oxide chain is introduced and the endoplasmic reticulum is connected to the endoplasmic reticulum via a spacer made of polyalkylene oxide. In addition, various functional substances can be easily and efficiently immobilized by covalent bonds, and the amount of introduced functional substances can be increased.
[0040]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
Synthesis Example 1
40 units of phospholipase D (manufactured by Toyo Brewery Co., Ltd.) was added to 40 ml of a chloroform solution in which 0.5 g (0.65 mmol) of dipalmitoylphosphatidylcholine and 5 g (1.7 mmol) of polyethylene glycol (Mw 2000, n 45) were dissolved. Was dissolved in 20 mL of a 1 M acetate buffer (pH 5.6), and the mixture was stirred and reacted at 40 ° C. for 12 hours. Next, after neutralizing with a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution, the organic layer was concentrated under reduced pressure. The obtained reaction mixture was fractionated using a silica gel column (20% methanol / chloroform), concentrated, dissolved in a small amount of chloroform, and re-precipitated in diethyl ether to obtain dipalmitoyl phosphatidyl = polyethylene glycol. Was obtained (yield 30%).
[0041]
Next, 100 mg (0.27 mmol) of the above-mentioned dipalmitoyl phosphatidyl = polyethylene glycol and 87 mg (0.54 mmol) of N, N'-dicarbonylimidazole were added to 10 ml of dried chloroform, followed by stirring at room temperature for 6 hours. The obtained reaction mixture is reprecipitated in diethyl ale, and the target reactive phospholipid derivative (in the general formula [1], R ¹ (C ＝ O) and R ² (C ＝ O) is a palmitoyl group, R ³ Hydrogen atom, M is a hydrogen atom, AO is an oxyethylene group, and n is about 45, a reactive phospholipid derivative) (yield 92%).
The progress of the reaction, the 1R spectrum (KBr method), polyethylene glycol terminal hydroxyl group (OH stretching, 3428Cm ^-1) generation of loss and oxycarbonylimidazole group (carbonyl bond) (C = O stretching, 1760 cm ^-1) by confirmed.
[0042]
Example 1-1
Egg yolk phosphatidylcholine 20 mg (26 μmol) and cholesterol 3.9 mg (10 μmol) were added with the reactive phospholipid derivative obtained in Synthesis Example 1 at 10 wt% (2.4 mg, 0.8 μmol) eggplant type flask. And dissolved in 2 ml of benzene, followed by freeze-drying. To this, 1 ml of physiological saline was added, and multilamellar liposomes were obtained by bath-type ultrasonic irradiation and vortex mixer. Further, the mixture was sequentially passed through a polycarbonate membrane of 3.0 → 1.0 → 0.2 μm by an extruder to obtain a large unilamellar reactive liposome. When the particle size of the obtained reactive liposome was measured using a laser scattering particle size distribution analyzer (manufactured by NICOMP, NICOMP370HPL, trademark), the average particle size was 221 nm (CV value: 19%).
[0043]
Example 1-2
In the same manner as in Example 1-1, but instead of the reactive phospholipid derivative of Synthesis Example 1, R ¹ (C ＝ O) and R ² (C ＝ O) in the general formula [1] are a myristoyl group, R ³ is a hydrogen atom, M is a hydrogen atom, AO is an oxyethylene group, n is about 10 and 5 wt% (1 μmol) of a reactive phospholipid derivative, and dimyristoyl phosphatidyl = polyethylene glycol (Mw ≒ 2000) 5 wt% (0. 4 μmol) to obtain a reactive liposome (average particle size: 268 nm, CV value: 22%).
[0044]
Example 1-3
In the same manner as in Example 1-1, but instead of the reactive phospholipid derivative of Synthesis Example 1, R ¹ (C ＝ O) and R ² (C ＝ O) in the general formula [1] are a myristoyl group, R ³ was a hydrogen atom, M was a hydrogen atom, AO was an oxyethylene group, and n was about 30. Using a reactive phospholipid derivative 30 wt% (3.5 μmol), a reactive liposome was obtained (average particle size: 238 nm, CV value 22%).
[0045]
Example 1-4
In the same manner as in Example 1-1, but instead of the reactive phospholipid derivative of Synthesis Example 1, R ¹ (CＲO) and R ² (C ＝ O) in the general formula [1] represent a stearoyl group, R ³ is a hydrogen atom, M is a hydrogen atom, and the oxyalkylene chain is a reactive phospholipid in which an oxypropylene group (average addition mole number: about 10) and an oxyethylene group (average addition mole number: about 25) are randomly added. Reactive liposomes were obtained using 1 wt% (0.1 μmol) of the derivative and 5 wt% (0.4 μmol) of dimyristoyl phosphatidyl = polyethylene glycol (Mw ≒ 2000) (average particle size: 239 nm, CV value: 25%). .
[0046]
Example 1-5
In the same manner as in Example 1-1, but instead of the reactive phospholipid derivative of Synthesis Example 1, R ¹ (CＲO) and R ² (C ＝ O) in the general formula [1] represent a stearoyl group, R ³ is a hydrogen atom, M is a hydrogen atom, and the oxyalkylene chain is a reactive phosphorus compound in which an oxypropylene group (average number of moles added: about 10) and an oxyethylene group (average number of moles added: about 15) are added in block form Reactive liposomes were obtained using 5 wt% (0.6 μmol) of the lipid derivative (average particle size: 247 nm, CV value: 19%).
[0047]
Example 1-6
As in Example 1, but instead of the reactive phospholipid derivative of Synthesis Example 1, R ¹ (C ＝ O) and R ² (C ＝ O) in the general formula [1] are a stearoyl group, and R ³ is A reactive phospholipid derivative in which a hydrogen atom, M is a hydrogen atom, and an oxyalkylene chain is a block-like addition of an oxytetramethylene group (average number of moles added: 5) and an oxyethylene group (average number of moles added: about 278) Reactive liposomes were obtained using 5 wt% (0.1 μmol) (average particle size 290 nm, CV value 23%).
[0048]
Example 1-7
As in Example 1-1, but instead of the reactive phospholipid derivative of Synthesis Example 1, R ¹ (CＣO) and R ² (C ＝ O) in the general formula [1] are a myristoyl group, A reactive liposome was obtained using a reactive phospholipid derivative 20 wt% (4.2 μmol) in which R ³ was a methyl group, M was a hydrogen atom, AO was an oxyethylene group, and n was about 10 (average particle diameter: 211 nm). , CV value 19%).
[0049]
Example 2
In the same manner as in Example 1-1, except that 1,2-di (2,4-octadecadienoyl) -3-phosphatidylcholine (DODP) was used instead of egg yolk phosphatidylcholine, and the average particle size was 254 nm (CV value: 23). %) Of a polymerizable large monolayer of reactive liposome. The liposome was irradiated with 0.75 Mrad of γ-ray to polymerize DODP. The obtained polymerized liposome was subjected to gel filtration using Sephadex G-50, and then freeze-dried to obtain a powdery sample. This liposome powder could be regenerated by swelling with physiological saline.
[0050]
Example 3
0.5 ml of the reactive liposome solution (solid content 2.5 wt%) obtained in Example 1-1 and 1 mg / ml of horseradish peroxidase (hereinafter abbreviated as HRP) /0.1 M phosphate buffer (pH 7) .5) was stirred at 4 ° C. for 24 hours to immobilize HRP on the reactive liposome. This was subjected to gel filtration using Sephadex G-50, and a liposome-containing fraction was collected. To this, 0.1 ml of a 1,2-phenylenediamine solution (10 mmol / l) as a substrate of HRP was added, incubated at 30 ° C. for 10 minutes, and further, 10 μl of 0.1N sulfuric acid was added. Was done.
From this result, it was confirmed that the reactive liposome of Example 1-1 can immobilize HRP only by stirring with HRP.
[0051]
Comparative Example 1
Large unilamellar liposomes having a solid content of 2.5 wt% were obtained in the same manner as in Example 1-1, using only 20 mg (26 μmol) of egg yolk phosphatidylcholine and 3.9 mg (10 μmol) of cholesterol. The liposome solution was reacted with HRP in the same manner as in Example 3 and purified by gel filtration. Then, 0.1 ml of a 1,2-phenylenediamine solution (10 mmol / l) was added, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 10 minutes. 10 μl of 1N sulfuric acid was added, but no color development was observed.
From this result, it is understood that HRP could not be immobilized in the liposome of Comparative Example 1 containing no reactive phospholipid derivative as a film-forming component.

Claims (2)

A reactive vesicle-forming agent comprising a reactive phospholipid derivative represented by the following general formula [1]:

[Wherein, R ¹ C (= 0) and R ² C (= 0) represent an acyl residue of a fatty acid having 3 to 30 carbon atoms, which may be the same or different.
R ³ is a hydrogen atom or a methyl group,
AO is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms,
n is an average number of added moles of the oxyalkylene group, and represents a positive number of 1 to 1000. When n is 2 or more, the oxyalkylene groups may be the same or different, and may be added randomly or in blocks.
M represents a hydrogen atom or an alkali metal atom. ] A reactive vesicle comprising at least one reactive vesicle-forming agent according to claim 1 as a vesicle-forming component.