JP3831958B2

JP3831958B2 - Lipid mixed lipid and liposome dispersion

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Publication number: JP3831958B2
Application number: JP24148895A
Authority: JP
Inventors: 嘉宏矢野; 善郎中野; 真人森
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1995-09-20
Filing date: 1995-09-20
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2015-09-20
Also published as: JPH0987168A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリポソーム製造用中間原料であるリポソーム用混合脂質の製造方法、この方法により得られたリポソーム用混合脂質及びこれを用いたリポソーム分散液に関する。リポソームは化粧品成分や薬物を体内に送り込むキャリアーとして利用され、ＤＤＳ（薬物送達システム）や人工血液、ワクチン等に利用される他、分散液としてバイオ素子や人工細胞、マイクロセルリアクターとして利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
天然リン脂質などにより構成された二分子膜小胞体であるリポソームは、化粧品や医薬品などのファインケミカルの分野において広く用いられ、特に医薬用ＤＤＳの用途に好適な素材として注目されている。しかし、一度に大量のリポソームを作るのは容易ではなく、通常、リポソーム膜構成物質となる各成分を別々に水に投入するだけではリポソームは形成できない。この為、リポソームを工業規模で調製するには、リポソームの中間原料となるリポソーム用混合脂質を、工業生産に利用しやすい様に均一化し、水に分散しやすい形態に、何らかの方法によって加工する事が重要となる。
【０００３】
一般に、この様な用途に用いられるリポソーム用混合脂質の製造方法について幾つかの手段が知られている。また、適切なリポソーム用混合脂質がない為に、脂質原料成分を水中に均一分散させる工夫をしたリポソームの製造方法などについても、様々な方法が提案されている。これらのリポソーム用混合脂質の製造方法及びリポソームの製造方法として例えば下記のごとき方法が知られている。
【０００４】
▲１▼特開昭６０−１２１２７の方法。リポソーム膜構成物質を少量の有機溶媒に膨潤せしめた後、撹拌、練合しながら有機溶媒を除去し均一なリポソーム用混合脂質を得る。これを水に撹拌することによりリポソームが得られる。
【０００５】
▲２▼特開平２−１６７２１８の方法。リン脂質原料を有機溶媒に均一溶解させ、その後、瞬間真空乾燥によって有機溶媒を揮散させることによってリポソーム用混合脂質を得る。これを水に撹拌することによりリポソームが得られる。
【０００６】
▲３▼特開平４−２９９２５の方法。リポソーム形成脂質を水に投入し、これを高圧蒸気にさらした後、薬剤溶液と混ぜ撹拌することでリポソームを得る。
【０００７】
▲４▼特開平１−１１７８２４の方法。リポソーム膜構成物質を揮発性有機溶媒に溶解し、得られた溶液に水和物の形成に必要な量の水を加え、撹拌しながら有機溶媒を除去して膜構成物質水和物を作り、これに生理活性物質を含有する水溶液を加えて分散させることによりリポソームを得る。
【０００８】
▲５▼逆相蒸発法（リポソーム、南江堂、１９８８年発行、ｐ３４）。リポソーム膜構成物質を揮発性有機溶媒に溶解させ少量の水溶液を加えてＷ／Ｏエマルジョンを形成させた後、エバポレーターにて有機溶媒を留去することによりゼリー状にゲル化したリポソーム用混合脂質が得られる。これをボルテックスミキサーにて撹拌するか、もしくは多量の水中に分散させることによりリポソームが得られる。
【０００９】
▲６▼薄膜法（リポソーム、南江堂、１９８８年発行、ｐ２６）。リポソーム膜構成物質を揮発性有機溶媒に溶解させた後、エバポレーターにて有機溶媒を留去することにより茄子型フラスコの壁面に脂質薄膜を形成させ、これに水溶液を加えてボルテックスミキサーで撹拌することによりリポソームが得られる。
【００１０】
▲７▼特開昭６０−５８９１５の方法。有機溶媒に溶解していない親油性界面活性剤を含有するリン脂質と水溶液を混合撹拌しリポソームを形成する。また、このものを凍結乾燥、または噴霧乾燥することによりリポソーム製剤が得られ、これを水に再分散させてリポソームを形成させることもできる。
【００１１】
▲８▼特開昭５７−８２３１０の方法。リン脂質を水性媒体中に分散させた後、この分散液に薬剤を溶解させ、このものを凍結乾燥することによりリポソーム製剤が得られ、これを水に再分散させてリポソームを形成できる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
上記、従来のリポソーム用混合脂質及びリポソーム製造方法のうち、▲１▼、▲２▼及び▲６▼は、リポソーム膜構成物質を有機溶媒に溶解させることにより均一化させ、その後、有機溶媒を除き、リポソーム用混合脂質を得る方法である。この方法では、見かけ上均一な脂質混合物が得られるが、有機溶媒中では脂質分子がランダムな配向をとっており、親水基の向きがバラバラで、そのままの状態で凍結乾燥しても得られる乾燥物は水になじみ難いという欠点を持っている。例えば、このリポソーム用混合脂質を水に分散させ、押出し法によってリポソームを作製する場合、分散性の悪い部分の影響により、フィルターの目詰まりが頻繁に生じる。
【００１３】
それに対し、▲７▼及び▲８▼は一度水に分散させてから、凍結乾燥させているので、脂質が親水基を配向しており、▲１▼、▲２▼や▲６▼の製法で作るより水になじみ易い混合物が製造できる。しかし、もともと水に均一分散させにくい脂質を水に分散しやすくするための工夫が必要であり、均一分散させる媒体として最初から水を用いても、その目的を達するのは困難であり、見かけ上均一な粉末が得られても、微小な未分散の原料が混入する。特に、脂質成分に混合添加されるステロールや脂肪酸など、水難溶性の物質を成分として多量に混ぜた場合、この方法でリポソーム用混合脂質を作るのは困難である。この方法で得られたリポソーム用混合脂質を水に分散させ、押出し法によってリポソームを作製する場合も、未分散原料の影響により、フィルターの目詰まりが頻繁に生じる。
【００１４】
▲３▼の方法も、均一分散させる媒体として水を用いているので、基本的には▲７▼▲８▼と同様の欠点を持っている。但し、▲３▼の方法では、未分散原料が均一化しない欠点を緩和する為に、高圧蒸気滅菌をかけ、高圧と高熱により脂質類を水中で強制的に融和させている。しかし、この方法では、高熱による脂質類の変成が避けられない。特に一部のリン脂質は加水分解して、リゾ体を生じる。リゾ体は体内に投与された場合、溶血などの原因となり毒性がある事から、医薬品として使用する場合には問題となる。また不飽和成分を含む場合、加熱による過酸化の問題もある。また、この方法では、粉末化していないのでリポソーム形成前の脂質混合物の状態で保存すると、相分離などを生じ保存安定性も良くない。
【００１５】
これらに対し、▲４▼及び▲５▼では、最初に有機溶媒中に脂質成分を溶解させることにより、まず脂質を均一化させ、ここにごく少量の水を加えることによりエマルジョン、もしくは均一な外観を呈する糊状物を形成させる。ここから有機溶媒を除くことで、親水基を配向させた水に分散しやすいリポソーム用混合脂質を得ている。しかし、これらの方法では、有機溶媒と水との混合物から、水を除去せず有機溶媒のみを除去しているので、得られたものは少量の水を含有しており、▲３▼と同様に保存安定性が良くない。また▲４▼の方法では、リポソームに内包させたい薬液と混合する前に、すでにリポソーム用混合脂質に水を含有しているので、混合する薬液を希釈してしまう。その為、高濃度に薬剤を内包させたいと考える場合には不利になる。また水を除去せず有機溶媒のみを除去しているため、エバポレーターやバブリング操作などの方法で水中に分散溶解している有機溶媒を完全に留去するのは困難であり、微量の有機溶媒が水を含んだ脂質混合物中に残留する事は避けられない。このようなものを化粧品や医薬品の中間原料として用いるには品質が不適切であった。
【００１６】
以上のようにこれまでに知られている▲１▼〜▲８▼の製造方法には、いずれも欠点があり、これらの方法により得られたリポソーム用混合脂質及びリポソームは水分散性、均一性、保存安定性、少量の有機溶媒の残留による安全性、品質などそれぞれに問題を抱えている。従来、これらの問題すべてを一度に解決した高品質のリポソーム用混合脂質は製造が困難であった。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、前記従来の方法の問題点を解決した理想的なリポソーム用混合脂質、並びにこれを用いたリポソームの製造方法の提供を目的として、水分散性、均一性、品質等に優れるリポソーム用混合脂質及びこれからリポソームを製造する方法について検討を重ねた結果、リポソーム膜構成物質を、水不溶性の揮発性有機溶媒を含む溶媒中に溶解せしめ、この有機溶媒溶液に対して、水もしくは水溶液を加えた後、撹拌しながら有機溶媒を留去し、脂質分散水相を形成後、これを凍結乾燥させることにより、医薬用素材としても利用できる均一で分散性の良い理想的なリポソーム用混合脂質が得られることを見出した。また、この脂質混合物を水に分散させ、押出し法によってリポソームの製造を行うと、従来、押出し法の欠点であったフィルターの目詰まりを著しく軽減できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち本発明は、リポソーム膜構成物質を、水不溶性揮発性有機溶媒を含む均一溶媒中に溶解する工程 (A) 、これに水または水溶液を加える工程 (B) 、混合液を撹拌しながら有機溶媒を留去する工程 (C) 、及び残留するリポソーム膜構成物質混合分散水相を凍結乾燥する工程 (D) からなるリポソーム用混合脂質の製造方法、かくして得られたリポソーム用混合脂質および、これを水性溶液に分散させてなるリポソーム分散液である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されるリポソーム膜構成物質には、膜構成物質として一般に使用されるものであれば特に限定されないが、リポソーム形成能を有する脂質成分を必須成分とし、膜安定化剤としてのステロール類、荷電物質としての脂肪酸または脂肪酸塩、酸化防止剤等を任意成分とするものである。リポソーム形成能を有する脂質としては特にリン脂質が好ましい。
【００２０】
リン脂質はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどに代表される物質で、卵黄、大豆、その他天然原料に由来するものあるいは合成によって得られるものでも良く、これらの混合物もしくは単体いずれでもかまわない。これらに修飾を施したリン脂質誘導体も使用してよい。また１，２−ジ（オクタデカ−２，４−ジエノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどに代表される各種の重合性リン脂質もこれらのリン脂質に含まれる。これらのリン脂質の中では特にホスファチジルコリンを用いるのが好ましい。
【００２１】
ステロールはコレステロールを始めとして、コレステロールアセテート、ジヒドロコレステロールフィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロールなどを代表とする多くのステロール類が膜安定化剤として使用できるが、特にコレステロールが好ましい。
【００２２】
荷電物質として、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、エレオステアリン酸、２，４−オクタデカジエン酸などを代表とする脂肪酸やこれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩など各種の脂肪酸塩が好適に用いられる。またホスファチジン酸やジセチルホスフェートなども荷電物質として好適であり、更にリン脂質成分としてホスファチジルグリセロールをまたはその塩を用いた場合、それ自身が荷電物質としても作用する。
【００２３】
また酸化防止剤としてトコフェロール等を本発明の効果を損なわない範囲で加えて良い。さらに、特種な安定化効果、生理活性などを付与する目的で、糖脂質やカルジオリピンなど特異な構造の脂質を含有させることも可能である。この他、生理活性を持つ物質を少量混合しておくことも行って良い。
【００２４】
リポソーム膜構成物質として、上記の成分を任意に混合して用いることができるが、特に下記の成分の組み合わせを用い、本発明によりリポソーム用混合脂質とする場合に優れた均一性や水分散性を示す。
Ａ：リン脂質とステロール。
上記Ａの配合のうち、特に好ましくは下記の成分の組み合わせである。
Ｂ：ホスファチジルグリセロールを必須成分とするリン脂質成分とステロール。
Ｃ：リン脂質成分とステロール及び脂肪酸塩。
【００２５】
リポソーム膜構成物質としてリン脂質とステロールとを含んでいると、得られるリポソーム用混合脂質を水に分散させる際、混合脂質の分散性が向上する。
またホスファチジルグリセロールまたは脂肪酸塩を含んでいると、水への分散性はさらに向上する。
【００２６】
Ｂの処方における組成は、ホスファチジルグリセロールを含むリン脂質全体の量を１とした場合、ステロールはモル比で０．０５〜２の割合で含有するのが好ましい。リン脂質中のホスファチジルグリセロールと他のリン脂質の比はモル比で０．００５：１〜１：０、更に好ましくは０．０５：１〜１：０の範囲で選択される。Ｃの場合、リン脂質１に対してステロールはモル比で０．０５〜２、脂肪酸塩は０．００１〜２、更に好ましくは０．０１〜１．５の範囲で選択されるのが好ましい。
【００２７】
本発明においては、まず上記リポソーム膜構成物質を、水不溶性揮発性有機溶媒を含む均一溶媒中に溶解させる。水不溶性揮発性有機溶媒としてはクロロホルム、ベンゼン、ジクロロメタン、ヘキサン等が挙げられる。またこれらの有機溶媒は混合して用いてもよく、その溶解性を上げる目的で、エタノールやメタノールなど水溶性の有機溶媒や、これと合わせて可溶化させた少量の水などを混合して、水不溶性の揮発性有機溶を含む均一溶媒を調製して使用してもよい。そのような目的に好適な混合溶媒組成の例としてはクロロホルム，メタノール，水の６５：２５：４の組成や、あるいは８０：１８：２の組成などが適当であるが、均一な外観であれば必ずしもこの組成や比率に限定する必要はない。
【００２８】
膜構成物質を溶解した水不溶性の揮発性有機溶媒を含む均一溶媒に加える水または水溶液としては、蒸留水、イオン交換水、局方注射用水などが好ましく使用され、糖などを含有した水溶液や緩衝液等を加えても良い。あるいは生理活性物質を含ませておいても良い。
【００２９】
本発明のリポソーム用混合脂質の製造方法は次に示す手順で実施される。まず、水不溶性の揮発性有機溶を含む均一溶媒にリポソーム膜構成物質を溶解させる。これらの溶媒の使用量は、膜構成物質を完全に溶解する量ならば特に制限はないが、操作性などの条件からリポソーム膜構成物質１ｇあたり０．０５〜２０ｍｌ程度が適当である。
【００３０】
次に、かくして得られたリポソーム膜構成物質の溶液に対し、水もしくは水溶液を加える。加える水または水溶液の使用量は、膜構成物質１ｇあたり４〜１００ｍｌ程度が適当である。この時、水不溶性の揮発性有機溶媒を含む均一溶媒に対する水もしくは水溶液の量は、体積比で少なくとも０．５倍程度あるのが良い。より好ましくは１．５倍〜５０倍の範囲で選択するのが適当である。これらの水を、水不溶性の揮発性有機溶を含む均一溶媒に添加したときに均一相を形成せず、相分離を生じていると好ましい。
【００３１】
次に揮発性有機溶媒の除去を行うが、有機溶媒の除去はエバポレーターを用いて、揮発性有機溶媒を留去しながら水相中にリポソーム膜構成物質を分散する方法が好適であるが、他にも不活性ガス（窒素、アルゴン等）の吹き付けや、バブリング、トラップを付けた減圧装置等、既知の方法が利用できる。いずれの場合も撹拌しながら有機溶媒を除去することが必要である。この工程で十分に有機溶媒を除く必要があるが、微量の残留ならばリポソーム膜構成物質が均一に水相中に分散したことが確認できれば許容できる。
【００３２】
次に有機溶媒の除去により生成した混合脂質分散水相を液体窒素もしくはドライアイス- メタノール等を用いて凍結後、凍結乾燥機に取り付け凍結乾燥する。本発明においてはリポソーム膜構成物質を有機溶媒で溶解させた後、これに水性溶液を相当量加えているので凍結乾燥することが重要であり、これによって水及び残留する微量の有機溶媒を除去することができる。このようにしてリポソーム膜構成物質から、リポソーム製造に適する均一なリポソーム用混合脂質を得ることができる。
【００３３】
リポソーム用混合脂質からリポソームの製造は、次のようにして行われる。まずリポソーム膜構成物質１ｇに対して、１〜１０００ｍｌの水性溶媒を準備する。水性溶媒としては単なる水を用いても良いし、少量のメタノールなどを含む水性混合溶媒であってもよいが、好ましくは局方注射用水や蒸留水などが用いられる。この時、また水性溶媒に生理活性物質や、蛋白質、緩衝物質や各種の塩、血漿などを溶解させ、溶液状としたのものであってもよい。リポソーム形成溶脂質混合物をこれらの水性溶媒に懸濁させる。これを、マントンガウリンやマイクロフルイダイザーなどの乳化機やワーリングブレンダーなどの高速撹拌機などを用いて物理的な力を加え、分散液とすることによりリポソームが形成される。
【００３４】
また本発明によるリポソーム用混合脂質を用い、簡単な分散処理をした分散液を各種の静圧式押出し装置、例えば”ＥＸＴＲＵＤＥＲ”（商品名、日油リポソーム製）や”リポナイザー”（商品名、野村マイクロサイエンス製）等によって市販のフィルターを強制的に通過させることにより、フィルターの目詰まりを生じることなく、粒径の揃ったリポソームを簡単に製造することができる。
【００３５】
このようにして得られたリポソームは、限外濾過、遠心分離、ゲル濾過等の方法によって未保持の薬物を除いても良いし、濃縮や希釈等の操作を自由に行って良い。
【００３６】
次に実施例を示して、本発明を更に詳しく説明する。
【実施例】
［実施例１］（ホスファチジルコリン／コレステロール／脂肪酸Ｎａ）
リポソーム膜構成物質として、ジミリストイルホスファチジルコリン２．８９ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン３．１３ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）、コレステロール３．３０ｇ（８．５３ｍｍｏｌ）、パルミチン酸ナトリウム０．６８ｇ（２．４４ｍｍｏｌ）を秤量し、２リットルのナス型フラスコに加えた。ここにクロロホルム、メタノール、水からなる均一系混合溶媒（混合比率（容量比）８０：１８：２）の１００ｍｌを加え加温しながら完全溶解させた。これに注射用水２００ｍｌを添加して、エバポレーターに取り付け、回転させつつ突沸に注意しながら有機溶媒を取り除いた。途中、透明な糊状の相を経て、膜構成物質は均一に水相に分散し、最終的には粘性のある白色の液体を形成した。このものを液体窒素で凍結後、凍結乾燥器に装着し、３０時間凍結乾燥して白色粉末状のリポソーム用混合脂質を得た。
【００３７】
得られたリポソーム用混合脂質について、他の実施例、比較例とともに、クロロホルム臭官能試験、リポソーム形成試験、押出し法によるリポソーム形成試験及び内包物取り込み度評価を行った。評価方法は下記▲１▼〜▲４▼のとおりである。評価結果を表１に示す。
【００３８】
▲１▼クロロホルム臭官能試験
実施例、比較例で得られたリポソーム用混合脂質５ｇ（液体の場合は計算上５ｇを含む体積を計量して５ｇをとる）をビーカーに秤量し、成人男子３名、成人女子２名の被験者を対象として、リポソーム用混合脂質のクロロホルム臭の有無を判断させ、下記２段階により判定した。
×：被験者のうち２名以上がクロロホルム臭を感じたもの。
○：クロロホルム臭を感じた被験者が１名以下の場合。
【００３９】
▲２▼リポソーム用混合脂質のリポソーム分散液の作製（リポソーム形成試験）
実施例、比較例で得られたリポソーム用混合脂質１ｇ（液体の場合は計算上１ｇを含む体積を計量して１ｇをとる）をビーカーに秤量し、生理食塩水１０ｍｌを加えたのち、ホモミキサーで激しく撹拌した。これを口径２５φのＥＸＴＲＵＤＥＲに加え、約３ｋｇ／ｃｍ² の圧力を加えながら２０℃で孔径３．０μｍの混合セルロースフィルター（日本ミリポア製）を通過させた。リポソーム形成能の評価は、１０ｍｌが通過し終わる時間を測定し、下記の３段階で評価した。
○：１８０秒以内に通過するもの
小粒径のリポソームが良好に形成されていると考えられる。
△：通過時間が１８０秒以上、３００秒未満のもの。
軽度な不良と考えられる。
×：通過時間が３００秒以上かかるもの
これはフィルターにおいて目詰まりが生じているためであり、孔径３．０μｍ以上の粗大なリポソームもしくは凝集物が生じており、リポソーム形成能不良のものである。
【００４０】
▲３▼押出し法によるＨｂ内包リポソーム分散液の作製（押出し法によるリポソーム形成試験）
リポソーム用混合脂質１ｇ（液体の場合は計算上１ｇを含む体積を計量して１ｇをとる）をビーカーに秤量し、濃度３０ｇ／ｄｌのヘモグロビン溶液１０ｍｌを加えたのち、マグネットスターラーを用いて１２時間緩やかに撹拌した。これを口径２５φのＥＸＴＲＵＤＥＲに加え、加圧（１〜３０ｋｇ／ｃｍ² ）しながら１０℃で孔径３．０μｍ、１．２μｍ、０．８μｍ、０．６μｍ、０．４５μｍ、０．３μｍ、０．２２μｍの混合セルロースフィルター（日本ミリポア製）まで順に通過させた。フィルターでの目詰まりの状況を観察し、下記２段階により、押出し法によるリポソーム形成能を判定した。
○：フィルター通過の際、途中で目詰まりする事なく０．２２μｍまで１０ｍｌ
全量通過したもので、押出し法によりリポソーム形成容易と考えられる。
×：途中で目詰まりしたもので、押出し法では小粒径リポソームは形成困難と考
えられる。
【００４１】
▲４▼内包物質取り込み度測定
また、この試験で０．２２μｍを全量通過させたサンプルについてのみ、内包物質取り込み度測定を行った。作製したサンプルを生理食塩水で置換したセファロース４Ｂ（ファルマシア製）カラムにチャージして、内包されなかったヘモグロビンを除去した。こうして得たヘモグロビン内包リポソームについて市販のリン定量キットおよびヘモグロビン定量キットを用いて、リン定量、ヘモグロビン定量を行った。リン定量から総脂質重量を求め、ヘモグロビン重量を総脂重質量で除してヘモグロビン／総脂質比を算出した。この時のヘモグロビン／総脂質比をリポソーム内包物質取り込み度とした。
【００４２】
［実施例２］（ホスファチジルコリン／コレステロール／脂肪酸Ｎａ）
実施例１においてクロロホルム、メタノール、水からなる均一系混合溶媒（混合比率８０：１８：２）の量を２０ｍｌに、注射用水添加量を１５ｍｌにした以外は実施例１と同様にして操作をし、白色粉末状のリポソーム用混合脂質を得た。得られたリポソーム用混合脂質について、実施例１と同様に▲１▼〜▲４▼の項目について評価を行った。結果を表１に合わせて示す。
【００４３】
［実施例３］（ホスファチジルコリン／コレステロール／脂肪酸Ｎａ）
実施例１においてクロロホルム、メタノール、水からなる均一系混合溶媒（混合比率８０：１８：２）の量を２０ｍｌに、注射用水添加量を２００ｍｌにした以外は実施例１と同様にして操作をし、白色粉末状のリポソーム用混合脂質を得た。得られたリポソーム用混合脂質について、実施例１と同様に▲１▼〜▲４▼の項目について評価を行った。結果を表１に合わせて示す。
【００４４】
［実施例４］（ホスファチジルコリン／コレステロール／ホスファチジルグリセロール塩）
リポソーム膜構成物質をジミリストイルホスファチジルコリン２．６３ｇ（３．８７ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン２．８５ｇ（３．８８ｍｍｏｌ）、コレステロール３．００ｇ（７．７６ｍｍｏｌ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロールアンモニウム塩１．５２ｇ（２．２２ｍｍｏｌ）とした以外は実施例１と同様にして白色粉末状のリポソーム用混合脂質を得た。得られたリポソーム用混合脂質について、実施例１と同様に▲１▼〜▲４▼の項目について評価を行った。結果を表１に合わせて示す。
【００４５】
［実施例５］（ホスファチジルコリン／コレステロール／脂肪酸）
リポソーム膜構成物質として、ジミリストイルホスファチジルコリン２．９１ｇ（４．２９ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン３．１５ｇ（４．２９ｍｍｏｌ）、コレステロール３．３１ｇ（８．５６ｍｍｏｌ）、パルミチン酸０．６３ｇ（２．４６ｍｍｏｌ）とした以外は実施例１と同様にして白色粉末状のリポソーム用混合脂質を得た。得られたリポソーム用混合脂質について、実施例１と同様に▲１▼〜▲４▼の項目について評価を行った。結果を表１に合わせて示す。
【００４６】
上記実施例で得られたリポソーム用混合脂質はいずれもクロロホルム臭がなく、水に分散させることにより小粒径の良好なリポソームが形成され、ヘモグロビンと混合して押出し法によるリポソーム形成においても目詰まりを生ずることなく高い取り込み度でヘモグロビンを内包することができた。
【００４７】
［比較例１］（凍結乾燥なし）
リポソーム膜構成物質として、実施例１と同様の処方で、ジミリストイルホスファチジルコリン２．８９ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン３．１３ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）、コレステロール３．３０ｇ（８．５３ｍｍｏｌ）、パルミチン酸ナトリウム０．６８ｇ（２．４４ｍｍｏｌ）を秤量し、２リットルのナス型フラスコに加えた。ここにクロロホルム１００ｍｌを加え加温しながら完全溶解させた。ここに注射用水３０ｍｌを添加して、エバポレーターに取り付け、回転させつつ突沸に注意しながら有機溶媒を取り除いた。膜構成物質は水相に分散し、凍結乾燥を行わずに最終的に粘性のある全量４０ｍｌの白色のクリームを形成した。
【００４８】
この生成物について、実施例１と同様に、▲１▼〜▲４▼の項目について評価を行った。評価結果を表２に示した。凍結乾燥していないので、クロロホルム臭が残っていた。また３０ｇ／ｄｌのヘモグロビンと混合して押出し法によってリポソームを形成した結果、内包物質取り込み率が０．６と低かった。
【００４９】
［比較例２］（有機溶媒溶液に水添加せず溶媒除去、荷電物質：脂肪酸）
リポソーム膜構成物質として、ジミリストイルホスファチジルコリン２．９１ｇ（４．２９ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン３．１５ｇ（４．２９ｍｍｏｌ）、コレステロール３．３１ｇ（８．５６ｍｍｏｌ）、パルミチン酸０．６３ｇ（２．４６ｍｍｏｌ）を秤量し、２リットルのナス型フラスコに加えた。ここにクロロホルム１００ｍｌを加え加温しながら完全溶解させた。これをそのままエバポレーターに取り付け、回転させつつ有機溶媒を取り除き固形物を形成させた。ここに水２００ｍｌを添加し撹拌によって分散させ、さらさらした微粒子を含む白色の液体を形成した。これを液体窒素により凍結させ、凍結乾燥器に装着し、３０時間凍結乾燥して白色粉末を得た。
【００５０】
生成物について▲１▼〜▲３▼の項目について評価を行い、結果を表２に示した。有機溶媒に溶解させたのち水添加をしなかったため、リポソーム分散性は悪く、また３０ｇ／ｄｌのヘモグロビンと混合して押出し法によるリポソーム形成試験を試みたが目詰まりを生じ、内包物質取り込み度の測定はできなかったた。
【００５１】
［比較例３］（有機溶媒溶液に水添加せず溶媒除去、荷電物質：脂肪酸Ｎａ）
リポソーム膜構成物質として、ジミリストイルホスファチジルコリン２．８９ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン３．１３ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）、コレステロール３．３０ｇ（８．５３ｍｍｏｌ）、パルミチン酸ナトリウム０．６８ｇ（２．４４ｍｍｏｌ）を秤量し、２リットルのナス型フラスコに加えた。ここにクロロホルム、メタノールからなる比率が１：２の均一系混合溶媒１００ｍｌを加え加温しながら完全溶解させた。エバポレーターに取り付け、回転させつつ有機溶媒を取り除き固形物を形成した。ここに水２００ｍｌを添加し撹拌によって分散後、このものを液体窒素で凍結した。凍結乾燥器に装着し、３０時間凍結乾燥して白色粉末を得た。
【００５２】
生成物について実施例１と同様の評価をし結果を表２に示した。有機溶媒に溶解させた後、水添加をしなかったので、混合脂質成分に脂肪酸ナトリウムを含んでいても、リポソーム分散性は悪く、３０ｇ／ｄｌのヘモグロビンと混合して押出し法によるリポソーム形成試験で目詰まりを生じた。
【００５３】
［比較例４］（有機溶媒溶液に水添加せず溶媒除去、凍結乾燥なし）
リポソーム膜構成物質として、ジミリストイルホスファチジルコリン２．８９ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン３．１３ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）、コレステロール３．３０ｇ（８．５３ｍｍｏｌ）、パルミチン酸ナトリウム０．６８ｇ（２．４４ｍｍｏｌ）を秤量し、２リットルのナス型フラスコに加えた。ここにクロロホルム、メタノールからなる比率が１：２の均一系混合溶媒１００ｍｌを加え加温しながら完全溶解させた。エバポレーターに取り付け、回転させつつ有機溶媒を取り除き固形物を形成した。
【００５４】
生成物について▲１▼〜▲３▼の項目について評価を行い、結果を表２に示した。リポソーム分散性は悪く、３０ｇ／ｄｌのヘモグロビンと混合して押出し法によるリポソーム形成試験で目詰まりを生じた。
【００５５】
【表１】

【００５６】
【表２】

【００５７】
【発明の効果】
本発明により得られるリポソーム用混合脂質は水分散性、均一性、品質等に優れ、この混合脂質を水に分散させることによって品質の良いリポソームが得られ、押出し法によってもフィルターの目詰まりを起こすことなく高い取り込み率でヘモグロビン等の内包物質を取り込むことができるので、ＤＤＳや人工血液等に広く応用することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a mixed lipid for liposomes which is an intermediate raw material for liposome production, A mixed lipid for liposomes obtained by this methodAnd a liposome dispersion using the same. Liposomes are used as carriers for delivering cosmetic ingredients and drugs into the body, and can be used as DDS (drug delivery system), artificial blood, vaccines, and the like, and can also be used as bioelements, artificial cells, and microcell reactors as dispersions.
[0002]
[Prior art]
Liposomes, which are bilayer vesicles composed of natural phospholipids and the like, are widely used in the field of fine chemicals such as cosmetics and pharmaceuticals, and are particularly attracting attention as materials suitable for use in pharmaceutical DDS. However, it is not easy to produce a large amount of liposomes at a time, and it is not usually possible to form liposomes by simply putting each component constituting the liposome membrane constituent material into water separately. For this reason, in order to prepare liposomes on an industrial scale, the mixed lipid for liposomes, which is an intermediate raw material for liposomes, should be homogenized so that it can be easily used for industrial production and processed into a form that is easily dispersed in water by some method. Is important.
[0003]
In general, several means are known for producing a mixed lipid for liposomes used for such applications. In addition, since there is no appropriate mixed lipid for liposomes, various methods have been proposed for producing liposomes that are devised to uniformly disperse lipid raw material components in water. For example, the following methods are known as a method for producing these mixed lipids for liposomes and a method for producing liposomes.
[0004]
(1) The method described in JP-A-60-12127. After the liposome membrane constituent material is swollen in a small amount of an organic solvent, the organic solvent is removed while stirring and kneading to obtain a uniform mixed lipid for liposome. A liposome is obtained by stirring this in water.
[0005]
(2) The method described in JP-A-2-167218. The phospholipid raw material is uniformly dissolved in an organic solvent, and then the organic solvent is volatilized by instantaneous vacuum drying to obtain a mixed lipid for liposome. A liposome is obtained by stirring this in water.
[0006]
(3) The method described in JP-A-4-29925. Liposome-forming lipid is put into water, exposed to high pressure steam, mixed with a drug solution and stirred to obtain liposomes.
[0007]
(4) The method described in JP-A-1-117824. Dissolve the liposomal membrane constituent material in a volatile organic solvent, add the amount of water necessary for hydrate formation to the resulting solution, remove the organic solvent with stirring to make the membrane constituent hydrate, Liposomes are obtained by adding and dispersing an aqueous solution containing a physiologically active substance.
[0008]
(5) Reversed-phase evaporation method (liposome, Nanedo, 1988, p34). The liposome membrane constituent substance is dissolved in a volatile organic solvent, a small amount of aqueous solution is added to form a W / O emulsion, and then the organic lipid is distilled off by an evaporator to form a jelly-like mixed lipid for liposomes. can get. This is stirred with a vortex mixer or dispersed in a large amount of water to obtain liposomes.
[0009]
(6) Thin film method (Liposome, Nankodo, 1988, p. 26). Dissolve the liposome membrane constituent material in a volatile organic solvent, and then evaporate the organic solvent with an evaporator to form a lipid thin film on the wall of the insulator flask, add an aqueous solution to this, and stir with a vortex mixer To obtain liposomes.
[0010]
(7) The method described in JP-A-60-58915. A phospholipid containing a lipophilic surfactant not dissolved in an organic solvent and an aqueous solution are mixed and stirred to form liposomes. Moreover, a liposomal preparation can be obtained by freeze-drying or spray-drying this, and it can be re-dispersed in water to form liposomes.
[0011]
(8) The method described in JP-A-57-82310. After the phospholipid is dispersed in an aqueous medium, the drug is dissolved in this dispersion, and this is freeze-dried to obtain a liposome preparation, which can be redispersed in water to form liposomes.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
Of the above-mentioned conventional mixed lipids for liposomes and liposome production methods, (1), (2) and (6) are homogenized by dissolving liposome membrane constituents in an organic solvent, and then the organic solvent is removed. This is a method for obtaining a mixed lipid for liposomes. In this method, an apparently uniform lipid mixture can be obtained, but the lipid molecules are randomly oriented in the organic solvent, the orientation of the hydrophilic group is disjoint, and the drying can be obtained by lyophilization as it is. Things have the disadvantage of being unfamiliar with water. For example, when this liposome mixed lipid is dispersed in water and a liposome is produced by an extrusion method, clogging of the filter frequently occurs due to the influence of a portion having poor dispersibility.
[0013]
On the other hand, since (7) and (8) are once dispersed in water and then freeze-dried, the lipids are oriented with hydrophilic groups, and the production methods (1), (2) and (6) are used. Mixtures that are more compatible with water than can be made. However, it is necessary to devise measures to make it easy to disperse lipids that are difficult to uniformly disperse in water, and even if water is used from the beginning as a medium to uniformly disperse, it is difficult to achieve its purpose. Even if a uniform powder is obtained, minute undispersed raw materials are mixed. In particular, when a large amount of a poorly water-soluble substance such as sterol or fatty acid mixed and added to a lipid component is mixed as a component, it is difficult to make a mixed lipid for liposomes by this method. Even when the mixed lipids for liposomes obtained by this method are dispersed in water and liposomes are produced by an extrusion method, clogging of the filter frequently occurs due to the influence of undispersed raw materials.
[0014]
The method (3) also has the same drawbacks as (7) and (8) since water is used as the medium for uniform dispersion. However, in the method (3), in order to alleviate the disadvantage that the undispersed raw material is not homogenized, high-pressure steam sterilization is applied, and lipids are forcibly mixed in water by high pressure and high heat. However, in this method, the transformation of lipids due to high heat is inevitable. In particular, some phospholipids are hydrolyzed to give lyso forms. When the lyso form is administered into the body, it causes hemolysis and is toxic, which causes a problem when used as a medicine. Moreover, when an unsaturated component is included, there also exists a problem of peroxidation by heating. Moreover, in this method, since it is not powdered, storage in the state of a lipid mixture before liposome formation causes phase separation and the like, and storage stability is not good.
[0015]
On the other hand, in (4) and (5), the lipid component is first dissolved in an organic solvent to homogenize the lipid first, and then a very small amount of water is added to the emulsion or uniform appearance. To form a paste-like material. By removing the organic solvent from here, a mixed lipid for liposomes that is easily dispersed in water with oriented hydrophilic groups is obtained. However, in these methods, since only the organic solvent is removed from the mixture of the organic solvent and water without removing water, the obtained product contains a small amount of water, and is the same as (3). Storage stability is not good. In the method (4), before mixing with the drug solution to be encapsulated in the liposome, the mixed lipid for liposome already contains water, so the drug solution to be mixed is diluted. Therefore, it is disadvantageous when it is desired to encapsulate the drug at a high concentration. Moreover, since only the organic solvent is removed without removing water, it is difficult to completely distill off the organic solvent that is dispersed and dissolved in water by a method such as an evaporator or bubbling operation. It is inevitable to remain in the lipid mixture containing water. The quality was unsuitable for using such a product as an intermediate material for cosmetics and pharmaceuticals.
[0016]
As described above, the production methods (1) to (8) known so far have drawbacks, and the mixed lipids and liposomes obtained by these methods are water-dispersible and uniform. , Storage stability, safety due to residual small amount of organic solvent, quality, etc. Conventionally, it has been difficult to produce high-quality mixed lipids for liposomes that solve all of these problems at once.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
For the purpose of providing an ideal mixed lipid for liposomes that has solved the problems of the conventional methods as well as a method for producing liposomes using the same, the inventors of the present invention have water dispersibility, uniformity, quality, etc. As a result of repeated studies on the mixed lipid for liposomes and the method for producing liposomes therefrom, the liposome membrane constituent material was dissolved in a solvent containing a water-insoluble volatile organic solvent. Alternatively, after adding an aqueous solution, the organic solvent is distilled off while stirring to form a lipid-dispersed aqueous phase, which is then lyophilized to provide an ideal liposome with uniform and good dispersibility that can be used as a pharmaceutical material. It was found that mixed lipids can be obtained. Moreover, when this lipid mixture was dispersed in water and liposomes were produced by an extrusion method, it was found that filter clogging, which was a drawback of the extrusion method, can be remarkably reduced, and the present invention has been completed.
[0018]
That is, the present invention provides a liposome membrane constituent material in a homogeneous solvent containing a water-insoluble volatile organic solvent.Melting process (A) ,Add water or aqueous solutionAdding process (B) The mixed liquidDistill off organic solvent while stirringProcess (C) ,as well asFreeze-drying the remaining dispersed aqueous phase of liposome membrane constituentsProcess (D) A method for producing a mixed lipid for liposomes, thus comprisingObtained mixed lipid for liposomeAnd a liposome dispersion obtained by dispersing this in an aqueous solutionIt is.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The liposome membrane constituent material used in the present invention is not particularly limited as long as it is generally used as a membrane constituent material, but a lipid component having liposome-forming ability is an essential component, and sterols as membrane stabilizers Further, a fatty acid or fatty acid salt as a charged substance, an antioxidant or the like is an optional component. As the lipid having liposome-forming ability, phospholipid is particularly preferable.
[0020]
Phospholipids are typified by phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, etc., and may be derived from egg yolk, soybeans, other natural raw materials, or obtained by synthesis, or a mixture or a single substance thereof. Absent. Phospholipid derivatives modified to these may also be used. Various polymerizable phospholipids represented by 1,2-di (octadeca-2,4-dienoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine and the like are also included in these phospholipids. Among these phospholipids, phosphatidylcholine is particularly preferably used.
[0021]
As the sterol, many sterols represented by cholesterol, cholesterol acetate, dihydrocholesterol phytosterol, sitosterol, stigmasterol, campesterol and the like can be used as a film stabilizer, and cholesterol is particularly preferable.
[0022]
As charged substances, fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, elaidic acid, eleostearic acid, 2,4-octadecadienoic acid and the like, sodium salts, potassium salts thereof, Various fatty acid salts such as calcium salts and ammonium salts are preferably used. Further, phosphatidic acid, dicetyl phosphate, and the like are also suitable as charged substances, and when phosphatidylglycerol or a salt thereof is used as a phospholipid component, it itself acts as a charged substance.
[0023]
Moreover, you may add tocopherol etc. as an antioxidant in the range which does not impair the effect of this invention. Furthermore, for the purpose of imparting a special stabilizing effect, physiological activity, etc., it is possible to contain a lipid having a specific structure such as a glycolipid or cardiolipin. In addition, a small amount of a physiologically active substance may be mixed.
[0024]
As the liposome membrane-constituting substance, the above-mentioned components can be arbitrarily mixed and used. Particularly, the following combination of the components is used, and excellent homogeneity and water dispersibility when used as a mixed lipid for liposomes according to the present invention. Show.
A: Phospholipid and sterol.
Among the combinations of the above A, the combination of the following components is particularly preferable.
B: Phospholipid component and sterol containing phosphatidylglycerol as essential components.
C: Phospholipid component, sterol and fatty acid salt.
[0025]
When phospholipid and sterol are contained as the liposome membrane constituent material, the dispersibility of the mixed lipid is improved when the obtained mixed lipid for liposome is dispersed in water.
Further, when phosphatidylglycerol or a fatty acid salt is contained, the dispersibility in water is further improved.
[0026]
The composition in the formulation of B is preferably such that sterol is contained in a molar ratio of 0.05 to 2, assuming that the total amount of phospholipids including phosphatidylglycerol is 1. The ratio of phosphatidylglycerol to other phospholipids in the phospholipid is selected in a molar ratio of 0.005: 1 to 1: 0, more preferably 0.05: 1 to 1: 0. In the case of C, the sterol is preferably selected in a molar ratio of 0.05 to 2 and the fatty acid salt is selected in the range of 0.001 to 2, more preferably 0.01 to 1.5 with respect to phospholipid 1.
[0027]
In the present invention, the liposome membrane constituent material is first dissolved in a homogeneous solvent containing a water-insoluble volatile organic solvent. Examples of the water-insoluble volatile organic solvent include chloroform, benzene, dichloromethane, hexane and the like. These organic solvents may be used as a mixture. For the purpose of increasing the solubility, a water-soluble organic solvent such as ethanol or methanol, or a small amount of water solubilized in combination with this, A homogeneous solvent containing a water-insoluble volatile organic solvent may be prepared and used. As an example of a mixed solvent composition suitable for such purpose, a composition of 65: 25: 4 of chloroform, methanol, and water, or a composition of 80: 18: 2 is suitable. It is not necessarily limited to this composition and ratio.
[0028]
Distilled water, ion-exchanged water, pharmacopoeia water, etc. are preferably used as water or an aqueous solution to be added to a homogeneous solvent containing a water-insoluble volatile organic solvent in which membrane constituents are dissolved. An aqueous solution or buffer containing sugar or the like is preferably used. A liquid or the like may be added. Alternatively, a physiologically active substance may be included.
[0029]
The method for producing a mixed lipid for liposomes of the present invention is carried out by the following procedure. First, the liposome membrane constituent material is dissolved in a homogeneous solvent containing a water-insoluble volatile organic solvent. The amount of these solvents to be used is not particularly limited as long as it completely dissolves the membrane constituent material. However, about 0.05 to 20 ml per 1 g of the liposome membrane constituent material is appropriate from the viewpoint of operability and the like.
[0030]
Next, water or an aqueous solution is added to the solution of the liposome membrane constituent material thus obtained. The amount of water or aqueous solution to be added is suitably about 4 to 100 ml per gram of membrane constituent material. At this time, the amount of water or aqueous solution with respect to the homogeneous solvent including the water-insoluble volatile organic solvent is preferably at least about 0.5 times by volume. More preferably, the selection is in the range of 1.5 times to 50 times. When these waters are added to a homogeneous solvent containing a water-insoluble volatile organic solvent, it is preferable that a homogeneous phase is not formed and phase separation occurs.
[0031]
Next, removal of the volatile organic solvent is performed. For the removal of the organic solvent, a method of dispersing the liposome membrane constituent material in the aqueous phase while distilling off the volatile organic solvent is suitable. In addition, known methods such as spraying an inert gas (nitrogen, argon, etc.), bubbling, and a pressure reducing device with a trap can be used. In either case, it is necessary to remove the organic solvent with stirring. In this step, it is necessary to sufficiently remove the organic solvent. However, if the residual amount is small, it is acceptable if it can be confirmed that the liposome membrane constituent material is uniformly dispersed in the aqueous phase.
[0032]
Next, the mixed lipid-dispersed aqueous phase formed by removing the organic solvent is frozen using liquid nitrogen or dry ice-methanol, and then attached to a freeze dryer and freeze-dried. In the present invention, after a liposome membrane constituent material is dissolved in an organic solvent, a considerable amount of an aqueous solution is added thereto, so that it is important to freeze-dry, thereby removing water and a small amount of remaining organic solvent. be able to. In this way, a uniform mixed lipid for liposomes suitable for liposome production can be obtained from the liposome membrane constituent material.
[0033]
Production of liposomes from the mixed lipid for liposomes is performed as follows. First, 1-1000 ml of aqueous solvent is prepared for 1 g of liposome membrane constituent material. As the aqueous solvent, mere water may be used, or an aqueous mixed solvent containing a small amount of methanol or the like may be used, but pharmacopoeia water for injection or distilled water is preferably used. At this time, a physiologically active substance, protein, buffer substance, various salts, plasma, and the like may be dissolved in an aqueous solvent to form a solution. The liposome-forming dissolved lipid mixture is suspended in these aqueous solvents. Liposomes are formed by applying a physical force to this using a high-speed stirrer such as an emulsifier such as Manton Gaurin or a microfluidizer or a Waring blender to form a dispersion.
[0034]
In addition, the dispersion obtained by using the mixed lipid for liposomes according to the present invention and subjected to a simple dispersion treatment is subjected to various hydrostatic extrusion apparatuses such as “EXTRUDER” (trade name, manufactured by NOF Liposome) and “Liponizer” (trade name, Nomura Micro). By forcibly passing a commercially available filter such as by Science), liposomes having a uniform particle size can be easily produced without clogging the filter.
[0035]
The liposomes thus obtained may be freed of unretained drugs by methods such as ultrafiltration, centrifugation, and gel filtration, and may be freely subjected to operations such as concentration and dilution.
[0036]
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
【Example】
[Example 1] (phosphatidylcholine / cholesterol / fatty acid Na)
As liposome membrane constituents, dimyristoyl phosphatidylcholine 2.89 g (4.26 mmol), dipalmitoyl phosphatidylcholine 3.13 g (4.26 mmol), cholesterol 3.30 g (8.53 mmol), sodium palmitate 0.68 g (2.44 mmol) ) And weighed into a 2 liter eggplant flask. 100 ml of a homogeneous mixed solvent (mixing ratio (volume ratio) 80: 18: 2) composed of chloroform, methanol and water was added thereto and completely dissolved while heating. To this, 200 ml of water for injection was added, attached to an evaporator, and the organic solvent was removed while rotating while paying attention to bumping. On the way, through a transparent paste-like phase, the film constituent material was uniformly dispersed in the aqueous phase, and finally a viscous white liquid was formed. This was frozen in liquid nitrogen, mounted on a freeze dryer, and freeze-dried for 30 hours to obtain a white powdered mixed lipid for liposomes.
[0037]
About the obtained mixed lipid for liposomes, together with other examples and comparative examples, a chloroform odor sensory test, a liposome formation test, a liposome formation test by an extrusion method, and an inclusion inclusion evaluation were performed. The evaluation methods are as follows (1) to (4). The evaluation results are shown in Table 1.
[0038]
(1) Chloroform odor sensory test
5 g of the mixed lipids for liposomes obtained in Examples and Comparative Examples (in the case of liquid, the volume including 5 g in calculation is measured to take 5 g) is weighed in a beaker, and 3 adult males and 2 adult females are subjects. The presence or absence of the chloroform odor of the mixed lipid for liposomes was determined, and the determination was made according to the following two steps.
X: Two or more of the subjects felt a chloroform odor.
○: When the number of subjects who felt chloroform odor was 1 or less.
[0039]
(2) Preparation of liposome dispersion of liposome mixed lipid (Liposome formation test)
1 g of the mixed lipid for liposomes obtained in Examples and Comparative Examples (in the case of liquid, 1 g is measured by measuring the volume containing 1 g in calculation) is weighed in a beaker, 10 ml of physiological saline is added, and then a homomixer Stir vigorously. Add this to EXTRUDER with a caliber of 25φ and add about 3kg / cm² While being applied, the mixture was passed through a mixed cellulose filter (manufactured by Nihon Millipore) having a pore size of 3.0 μm at 20 ° C. The liposome forming ability was evaluated by measuring the time required for 10 ml to pass through and evaluating the following three levels.
○: Passed within 180 seconds
It is considered that small-sized liposomes are well formed.
Δ: Passing time of 180 seconds or more and less than 300 seconds.
It is considered to be mildly defective.
X: Passing time more than 300 seconds
This is because clogging occurs in the filter. Coarse liposomes or aggregates having a pore size of 3.0 μm or more are formed, and liposome formation ability is poor.
[0040]
(3) Preparation of Hb-encapsulated liposome dispersion by extrusion method (Liposome formation test by extrusion method)
Weigh 1 g of lipid mixture for liposome (in the case of liquid, measure 1 g of the volume containing 1 g in calculation) into a beaker, add 10 ml of hemoglobin solution with a concentration of 30 g / dl, and then use a magnetic stirrer for 12 hours. Gently stirred. Add this to EXTRUDER with a diameter of 25φ and pressurize (1-30 kg / cm² ) At 10 ° C. in order to a mixed cellulose filter (manufactured by Nihon Millipore) having pore sizes of 3.0 μm, 1.2 μm, 0.8 μm, 0.6 μm, 0.45 μm, 0.3 μm, and 0.22 μm. The state of clogging in the filter was observed, and the liposome forming ability by the extrusion method was determined by the following two steps.
○: 10 ml up to 0.22 μm without clogging during filter passage
The whole amount has passed, and it is considered that liposome formation is easy by the extrusion method.
×: Clogged in the middle, and it is considered difficult to form small-sized liposomes by the extrusion method.
available.
[0041]
(4) Inclusion substance uptake measurement
In addition, the inclusion substance uptake degree measurement was performed only for the sample through which 0.22 μm was completely passed in this test. The prepared sample was charged into a Sepharose 4B (Pharmacia) column substituted with physiological saline to remove hemoglobin that was not encapsulated. The hemoglobin-encapsulated liposome thus obtained was subjected to phosphorus quantification and hemoglobin quantification using a commercially available phosphorus quantification kit and hemoglobin quantification kit. The total lipid weight was determined from the phosphorus quantification, and the hemoglobin / total lipid ratio was calculated by dividing the hemoglobin weight by the total fat mass. The hemoglobin / total lipid ratio at this time was defined as the liposome inclusion substance uptake degree.
[0042]
[Example 2] (phosphatidylcholine / cholesterol / fatty acid Na)
The same operation as in Example 1 was carried out except that the amount of the homogeneous mixed solvent (mixing ratio 80: 18: 2) consisting of chloroform, methanol and water in Example 1 was 20 ml, and the amount of water added for injection was 15 ml. A white powdery mixed lipid for liposomes was obtained. About the obtained mixed lipid for liposomes, the items (1) to (4) were evaluated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 1.
[0043]
[Example 3] (phosphatidylcholine / cholesterol / fatty acid Na)
The same operation as in Example 1 was carried out except that the amount of the homogeneous mixed solvent (mixing ratio 80: 18: 2) consisting of chloroform, methanol and water in Example 1 was 20 ml, and the amount of water added for injection was 200 ml. A white powdery mixed lipid for liposomes was obtained. About the obtained mixed lipid for liposomes, the items (1) to (4) were evaluated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 1.
[0044]
[Example 4] (phosphatidylcholine / cholesterol / phosphatidylglycerol salt)
Liposome membrane constituents were dimyristoylphosphatidylcholine 2.63 g (3.87 mmol), dipalmitoylphosphatidylcholine 2.85 g (3.88 mmol), cholesterol 3.00 g (7.76 mmol), dimyristoylphosphatidylglycerol ammonium salt 1.52 g (2 .22 mmol), a white powdery mixed lipid for liposomes was obtained in the same manner as in Example 1. About the obtained mixed lipid for liposomes, the items (1) to (4) were evaluated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 1.
[0045]
[Example 5] (phosphatidylcholine / cholesterol / fatty acid)
As liposome membrane constituents, dimyristoyl phosphatidylcholine 2.91 g (4.29 mmol), dipalmitoyl phosphatidylcholine 3.15 g (4.29 mmol), cholesterol 3.31 g (8.56 mmol), palmitic acid 0.63 g (2.46 mmol) Except for the above, a white powdery mixed lipid for liposomes was obtained in the same manner as in Example 1. About the obtained mixed lipid for liposomes, the items (1) to (4) were evaluated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 1.
[0046]
None of the mixed lipids for liposomes obtained in the above examples has a chloroform odor, and when dispersed in water, good liposomes having a small particle size are formed. When mixed with hemoglobin, the liposomes are clogged even when they are formed by extrusion. It was possible to encapsulate hemoglobin at a high uptake without causing
[0047]
[Comparative Example 1] (no lyophilization)
As liposomal membrane constituents, dimyristoylphosphatidylcholine 2.89 g (4.26 mmol), dipalmitoylphosphatidylcholine 3.13 g (4.26 mmol), cholesterol 3.30 g (8.53 mmol), palmiticin in the same formulation as in Example 1. 0.68 g (2.44 mmol) of sodium acid was weighed and added to a 2 liter eggplant type flask. 100 ml of chloroform was added thereto and completely dissolved while heating. 30 ml of water for injection was added here, it attached to the evaporator, the organic solvent was removed paying attention to bumping while rotating. The membrane constituents were dispersed in the aqueous phase and finally formed a viscous total 40 ml white cream without lyophilization.
[0048]
For this product, as in Example 1, the items (1) to (4) were evaluated. The evaluation results are shown in Table 2. Since it was not lyophilized, a chloroform odor remained. In addition, as a result of mixing with 30 g / dl hemoglobin and forming liposomes by an extrusion method, the entrapment substance uptake rate was as low as 0.6.
[0049]
[Comparative Example 2] (Solvent removal without adding water to organic solvent solution, charged substance: fatty acid)
As liposome membrane constituents, dimyristoyl phosphatidylcholine 2.91 g (4.29 mmol), dipalmitoyl phosphatidylcholine 3.15 g (4.29 mmol), cholesterol 3.31 g (8.56 mmol), palmitic acid 0.63 g (2.46 mmol) Was weighed and added to a 2 liter eggplant flask. 100 ml of chloroform was added thereto and completely dissolved while heating. This was directly attached to the evaporator and the organic solvent was removed while rotating to form a solid. 200 ml of water was added and dispersed by stirring to form a white liquid containing free-flowing fine particles. This was frozen with liquid nitrogen, mounted in a lyophilizer, and lyophilized for 30 hours to obtain a white powder.
[0050]
The products (1) to (3) were evaluated, and the results are shown in Table 2. Since it was dissolved in an organic solvent and water was not added, the liposome dispersibility was poor, and when it was mixed with 30 g / dl hemoglobin, a liposome formation test was attempted by the extrusion method. Measurement was not possible.
[0051]
[Comparative Example 3] (Solvent removal without adding water to organic solvent solution, charged substance: fatty acid Na)
As liposome membrane constituents, dimyristoyl phosphatidylcholine 2.89 g (4.26 mmol), dipalmitoyl phosphatidylcholine 3.13 g (4.26 mmol), cholesterol 3.30 g (8.53 mmol), sodium palmitate 0.68 g (2.44 mmol) ) And weighed into a 2 liter eggplant flask. To this, 100 ml of a homogeneous mixed solvent of chloroform and methanol with a ratio of 1: 2 was added and completely dissolved while heating. It was attached to an evaporator and the organic solvent was removed while rotating to form a solid. 200 ml of water was added thereto and dispersed by stirring, and then this was frozen with liquid nitrogen. It was mounted on a freeze dryer and freeze dried for 30 hours to obtain a white powder.
[0052]
The product was evaluated in the same manner as in Example 1, and the results are shown in Table 2. Since water was not added after dissolving in an organic solvent, liposome dispersibility was poor even when fatty acid sodium was included in the mixed lipid component, and it was mixed with 30 g / dl hemoglobin in a liposome formation test by extrusion method. Clogging occurred.
[0053]
[Comparative Example 4] (Solvent removal without adding water to organic solvent solution, no lyophilization)
As liposome membrane constituents, dimyristoyl phosphatidylcholine 2.89 g (4.26 mmol), dipalmitoyl phosphatidylcholine 3.13 g (4.26 mmol), cholesterol 3.30 g (8.53 mmol), sodium palmitate 0.68 g (2.44 mmol) ) And weighed into a 2 liter eggplant flask. To this, 100 ml of a homogeneous mixed solvent of chloroform and methanol with a ratio of 1: 2 was added and completely dissolved while heating. It was attached to an evaporator and the organic solvent was removed while rotating to form a solid.
[0054]
The products (1) to (3) were evaluated, and the results are shown in Table 2. Liposome dispersibility was poor and clogging occurred in a liposome formation test by an extrusion method after mixing with 30 g / dl of hemoglobin.
[0055]
[Table 1]

[0056]
[Table 2]

[0057]
【The invention's effect】
The mixed lipid for liposomes obtained by the present invention is excellent in water dispersibility, uniformity, quality, etc., and by dispersing this mixed lipid in water, a high quality liposome can be obtained, and the clogging of the filter is caused even by the extrusion method. Since encapsulated substances such as hemoglobin can be taken in at a high uptake rate without any problem, it can be widely applied to DDS, artificial blood and the like.

Claims

The step of dissolving the liposome membrane constituent in a homogeneous solvent containing a water-insoluble volatile organic solvent (A) , the step of adding water or an aqueous solution thereto (B) , the step of distilling off the organic solvent while stirring the mixture (C) and a method for producing a mixed lipid for liposome, comprising the step (D) of freeze-drying the remaining aqueous dispersion of liposome membrane constituents .

The method for producing a mixed lipid for liposome according to claim 1, wherein the liposome membrane-constituting substance contains a phospholipid component and a sterol.

The method for producing a mixed lipid for liposome according to claim 2, wherein the phospholipid component contains phosphatidylglycerol.

The method for producing a mixed lipid for liposome according to claim 2, wherein the liposome membrane-constituting substance contains a fatty acid salt.

A mixed lipid for liposomes obtained by the method according to claim 1.

A liposome dispersion obtained by dispersing the mixed lipid for liposomes according to claim 5 in an aqueous solution.