JP4540287B2 - Process for producing polyalkylene oxide-modified phospholipids - Google Patents

Description

（式（２）中、Ｒ³Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ₂)ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。Ｚは活性付与基である。）
【化５】

（式（３）中、Ｒ¹ＣＯおよびＲ²ＣＯはそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、ｋは１〜６である。）
（２） Ｒ¹ＣＯおよびＲ²ＣＯが炭素数１２〜２０のアシル基である上記（１）記載の製造方法。
（３） ｐが０、Ｙがメチル基である上記（１）または（２）記載の製造方法。
（４） 工程（Ａ）で使用する固体塩が炭酸ナトリウムであり、有機溶媒がトルエンまたはクロロホルムである上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５） 工程（Ａ）の後に、下記工程（Ｂ）を有する（１）ないし（４）のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｂ）：酢酸エチルまたはアセトンを用いて式（３）で示される未反応のリン脂質を除去する工程。
（６） 工程（Ａ）の後に、下記工程（Ｃ）を有する上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｃ）：溶媒として酢酸エチルおよび／またはアセトンを用いて再結晶を行う工程。
（７） 工程（Ｃ）において、さらに炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を溶媒として使用する上記（６）記載の製造方法。
（８） 工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）の後に行われる上記（６）または（７）記載の製造方法。
（９） 工程（Ａ）の後に、下記工程（Ｄ）を有する上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｄ）：吸着剤を用いて精製を行う工程。
（１０） 工程（Ｄ）で使用する吸着剤が、アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウム若しくはケイ素を含有する吸着剤、または活性炭である上記（９）記載の製造方法。
（１１） 工程（Ｄ）は、工程（Ｂ）の後に行われる上記（９）または（１０）記載の製造方法。
（１２） ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が、モノアシルリン脂質体の含有量が３重量％以下であり、かつ窒素原子を有する塩基の含有量が０．０２重量％以下である下記式（１）で示される化合物である上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の製造方法。
【化６】

（式（１）中、Ｒ¹ＣＯおよびＲ²ＣＯはそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、ｋは１〜６、Ｒ³Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。Ｍは水素原子、ナトリウムまたはカリウム、Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ₂)ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。）
（１３） モノアシルリン脂質体の含有量が２重量％以下である上記（１２）記載の製造方法。
（１４） ｐが０、Ｙがメチル基であり、モノアシルリン脂質体の含有量が０．５重量％以下である上記（１２）記載の製造方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質において、Ｒ¹ＣＯおよびＲ²ＣＯは炭素数４〜２４、好ましくは１２〜２０のアシル基である。このアシル基は通常脂肪酸に由来する。Ｒ¹ＣＯおよびＲ²ＣＯの具体的なものとしては、例えば酪酸、イソ酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、リグノセリン酸などの飽和および不飽和の直鎖または分岐の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。Ｒ¹ＣＯおよびＲ²ＣＯは互いに同じであっても異なっていてもよい。
【００１０】
前記式（１）においてＲ³Ｏで表されるオキシアルキレン基は炭素数２〜４、好ましくは２または３のオキシアルキレン基である。Ｒ³Ｏとしては、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基などが挙げられる。これらの中ではオキシエチレン基、オキシプロピレン基が好ましく、特にオキシエチレン基が好ましい。分子内にはｎの数だけオキシアルキレン基が存在するが、このオキシアルキレン基は１種単独であってもよいし、２種以上が組み合わされていてもよく、その組み合わせ方に制限はない。またブロック状であってもランダム状であってもよい。
【００１１】
前記式（１）においてｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数を表し、１０〜８００、好ましくは２０〜５００の数である。ｎが１０以上であると、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をドラッグデリバリーシステムに使用した場合にデリバリー効果が高くなる。またｎが８００以下であると、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を製造する際、原料である前記式（２）のポリアルキレンオキシド化合物の粘度がさほど上昇しないので作業性がよいものとなる。
【００１２】
前記式（１）においてＭは水素原子、ナトリウムまたはカリウムである。前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、これらの混合物であってもよい。
リン酸基部分と塩を形成するナトリウムまたはカリウムは、通常薬剤等の調製に用いる生理食塩緩衝液中に含まれるものであり、さらに生体内にも存在するものである。したがって、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をドラッグデリバリーシステムに使用しても体内での毒性等の問題も少ない。Ｍがナトリウムまたはカリウム以外の金属イオン、例えばカルシウムまたはマグネシウム等の二価金属イオンの場合は、リン脂質２分子が会合した構造等をとるため、好ましくない。
【００１３】
前記式（１）においてｋは１〜６の整数であり、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４、さらに好ましくは２である。
前記式（１）においてＸは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ₂)ｑ−（ここでｑは１〜４）である。炭化水素基の具体的なものとしては−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂ＣＨ₂−、−(ＣＨ₂)₃−、−ＣＨ(ＣＨ₃)ＣＨ₂−などが挙げられる。ｐは０または１である。
【００１４】
前記式（１）においてｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であり、好ましくはアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等が挙げられる。これの中ではメチル基が好ましい。
またｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基であり、好ましくはアミノ基である。
Ｘｐ−Ｙとしてはメチル基、エチル基、プロピル基およびアミノメチル基が好ましく、特にメチル基が好ましい。
【００１５】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はモノアシルリン脂質体や触媒に由来する残留物である窒素原子を有する塩基などの不純物の含有量が少ない。
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質中に存在するモノアシルリン脂質体の含有量は３重量％以下、好ましくは２重量％以下、より好ましくは０．５重量％以下である。
【００１６】
また、窒素原子を有する塩基の含有量については０．０２重量％以下であり、より好ましくは０．０１重量％以下であり、さらに好ましくは実質的に含有されない。
窒素原子を有する塩基は、触媒に由来する残留物であり、例えばトリエチルアミンなどの塩基に由来するものであり、窒素原子を少なくとも１個有している。窒素原子を有する塩基として例えば、ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジメチルアミノピリジン、イミダゾール、ジエチルアミン、ジイソブチルアミン、トリ−ｎ−オクチルアミン、ジ−２−エチルヘキシルアミンなどが挙げられる。これらの中でも、特にトリエチルアミンが毒性の面で少ないことが望まれている。なお前記式（３）で示されるリン脂質は窒素原子を有しているが、分子内で中和されているため、窒素原子を有する塩基には該当しない。
【００１７】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は生体毒性が強いとされているモノアシルリン脂質の含有量が少なく、トリエチルアミンなどの窒素原子を有する不純物の含有量が少ないので、生体に対する安全性が高い。
また、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は生体内にも存在するナトリウムイオンまたはカリウムイオンの一価の金属陽イオンを含有しているので、生体に対する安全性が高い。
このように生体に対する安全性が高いため、界面活性剤、特に生体用の界面活性剤として利用することができる。その中でも、生理活性物質用の界面活性剤として好適に使用することができる。
【００１８】
本発明の界面活性剤は本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む界面活性剤である。通常、界面活性剤を含む組成物等の全組成に対して、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を０．０１〜３０重量％配合して使用することがが望ましく、好ましくは０．１〜５重量％配合して使用することが望ましい。なお、界面活性剤の使用量は、界面活性剤の使用目的や組成の違い等により適宜選択される。
【００１９】
本発明の界面活性剤は、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を１種または２種以上併用してもよく、または他の界面活性剤と併用してもよい。
本発明の界面活性剤は、１）水に不溶または難溶の対象物質を水、緩衝液などの分散媒に乳化させる乳化剤、２）水に不溶または難溶の対象物質を水、緩衝液などの分散媒に溶解させる可溶化剤、３）水に不溶または難溶の対象物質を水、緩衝液などの分散媒に分散させる分散剤、４）対象物質に親水性基および疎水性基を導入する両親媒性化学修飾剤などとして好適に用いることができる。
【００２０】
本発明の界面活性剤を用いて、乳化液、可溶化液または分散液を得ることができる。
本発明の界面活性剤を乳化剤、可溶化剤または分散剤として用いる場合、乳化剤、可溶化剤または分散剤は、本発明の界面活性剤のみを用いてもよく、また乳化、可溶化または分散に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。
【００２１】
可溶化液または分散液の形態は限定されず、水または緩衝液などの分散媒に生理活性物質等を溶解させた溶解液、水または緩衝液などの分散媒に生理活性物質等を分散させた分散液等があげられる。
乳化液または可溶化液の形態は限定されず、本発明の界面活性剤によって形成されたミセル溶液、すなわちミセルの内部に親油性の生理活性物質を含有したミセル溶液、あるいは水または緩衝液などの分散媒に本発明の界面活性剤と親油性の生理活性物質等による分散粒子が、コロイド粒子またはそれ以上の大きな粒子として存在するエマルション溶液等があげられる。ミセル溶液としては、分散粒子径が１０〜３００ｎｍであるものを特に高分子ミセル溶液としてあげられる。エマルション溶液は、油相に生理活性物質を配合した水中油滴（Ｏ／Ｗ）型または水相に生理活性物質を配合した多層水中油滴（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型でもよい。
【００２２】
本発明の界面活性剤は、ポリオキシアルキレン基に由来する親水性と、アシル基に由来する疎水性とを有しているので乳化剤または可溶化剤として使用することができ、保存安定性にも優れている。さらに、生体細胞構成成分と同等のリン脂質および毒性の低いポリオキシアルキレン基からなるとともに、生体毒性があると言われているモノアシルリン脂質の含有量が少ないのでより安全性が高い。このようなポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む乳化剤または可溶化剤を使用することにより、例えば安全性の高い生理活性物質の乳化液または可溶化液を得ることができる。
【００２３】
乳化、可溶化または分散する対象物質としては、生理活性物質、脂溶性物質などが挙げられる。
生理活性物質としては具体的には、酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質またはホルモンなどが挙げられる。
脂溶性物質としてはリン脂質等の脂質、タキソールなどの脂溶性薬剤、あるいは通常油相に用いられる高級アルコール、エステル油、トリグリセリン、トコフェロールおよび高級脂肪酸等が挙げられる。
本発明の界面活性剤は、本発明の目的が損なわれない範囲において、グリセリン、プロピレングリコール等の多価アルコール、脂肪酸エステル、防腐剤、抗酸化剤等の公知の他の成分を含有することができる。
【００２４】
本発明のポリオキシアルキレン鎖を含有する高分子界面活性剤を使用して、粒径１０〜３００ｎｍの微粒子がミセルとして存在する高分子ミセル溶液を得ることができる。
高分子ミセルとしては、前記式（１）で示される高分子界面活性剤のみを用いてもよく、また他の公知の成分を含んでいてもよい。後述するように前記式（１）における反応性基Ｙを介して他の公知の高分子を結合させた高分子界面活性剤を用いてもよい。高分子ミセル溶液中に含有される高分子ミセルは脂溶性薬剤の可溶化などに用いることができる。
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、上記記載のように生体細胞構成成分に近く、さらに高分子のポリアルキレンオキシド鎖を含有するため、調製された高分子ミセル溶液は、従来の界面活性剤を使用して得られるミセル溶液に比べて、水和層を有することにより安定性が高く、生体に対する毒性も低い。
【００２５】
高分子ミセルは、対象物質を０．０５〜２重量％、本発明の界面活性剤を全量に対して０．２〜８重量％配合したものが好ましい。
得られた高分子ミセルの動的光散乱測定による重量平均粒径は１０〜３００ｎｍ、好ましくは２０〜１００ｎｍである。
【００２６】
乳化液の調製は、水に対して乳化させる対象物質と本発明の界面活性剤を３０〜９０℃、好ましくは４５〜８５℃、より好ましくは６０〜８０℃に加温して混練りし、それに水または緩衝液などの水相を徐々に添加して混合し乳化液を得ることができる。水相には必要に応じて、公知の水溶性物質を溶解させておくこともできる。
乳化液の調製は上記のように油相と水相を分けて混合してもよいし、すべての成分をホモジナイザー、ソニケーター等で混合してもよい。通常対象物質は、全量に対して０．０１〜３０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％、本発明の界面活性剤は全量に対して０．１〜４０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％配合して用いるのがよい。
【００２７】
可溶化液の調製は、水に対して溶解させる対象物質と本発明の界面活性剤を通常室温〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃において混合し、それに水または緩衝液などの水相を徐々に添加して混合し均一な可溶化液を得る。水相には必要に応じて、公知の水溶性物質を溶解させておくこともできる。
混合については、ホモジナイザーおよびソニケーター等を用いることができる。通常対象物質は、全量に対して０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％、本発明の界面活性剤は全量に対して０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％配合して用いるのがよい。
【００２８】
前記式（１）のＹが水素原子以外の反応性官能基である場合、本発明の界面活性剤を生理活性物質の両親媒性化学修飾剤として用いることができる。
両親媒性化学修飾剤は本発明の界面活性剤を１種または２種以上を含んでもよく、さらに生理活性物質の化学修飾に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。
化学修飾される生理活性物質はアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などの官能基を有するものであれば特に限定されない。例えば酵素、抗体、その他のオリゴおよびポリペプチド、タンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等が挙げられる。
【００２９】
本発明の界面活性剤を生理活性物質の両親媒性化学修飾剤として使用する場合、前記式（１）のＹとしてはアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基およびチオール基が好ましい。アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基およびチオール基を有する場合、生理活性物質中に存在する官能基と容易に反応させることができる。例えば、Ｙがカルボキシル基の場合、生理活性物質中のアミノ基とＣＯＮＨ結合を形成させることにより、生理活性物質にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質骨格を導入することができる。
【００３０】
生理活性物質の両親媒性化学修飾剤を、可溶化液、乳化液、分散液、高分子ミセル溶液として用いることができる。例えば脂溶性薬物を本発明ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を用いて前記方法により高分子ミセル溶液を調製し、さらに前記式（１）のＹがカルボキシル基等の反応性官能基である揚合、抗体タンパク質のアミノ基と反応させて結合させることにより標的部位への投与を可能にした高分子ミセル製剤を得ることができる。
【００３１】
本発明の両親媒性化学修飾剤を用いて化学修飾された生理活性物質をリポソーム成分として用いることができる。この場合、生理活性物質をリポソーム表面に存在させることができる。例えば生理活性物質が抗体のタンパク質の場合には生理活性物質を標的細胞のリガンドとして用いることができるので、リポソームを標的細胞へ集中して輸送することができる。
生理活性物質の両親媒性化学修飾剤として用いる場合、可溶化液、乳化液、分散液、高分子ミセル溶液およびリポソーム溶液として用いることができる。
【００３２】
本発明のリポソームは、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含むリポソーム形成剤からなるリポソームである。またリポソーム膜の形成に用いられている公知の他の脂質を成分として含んでいてもよい。
通常は、リン脂質１モルに対して本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を０．００２〜０．２モル、好ましくは０．０１〜０．１モル配合して使用することが望ましい。ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はリポソームの全組成に対しては０．１〜２０重量％配合して使用することが好ましい。
【００３３】
本発明のリポソーム形成剤を用いて得られるリポソームは、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質と他の脂質を用いて製造することができる。
他の脂質としては、リン脂質、ステロール類、その炭素数８〜２２の飽和または不飽和のアシル基を有する化合物などが挙げられる。他の脂質はホスファチジルコリンを含むリン脂質単独であってもよいし、それ以外の脂質との混合脂質であってもよい。
【００３４】
リン脂質とは、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロ糖脂質を意味し、ステロール類とは、コレステロール、ジヒドロコレステロール、エルゴステロール、ラノステロールなどを意味する。
グリセロリン脂質としては、炭素数４〜２４、好ましくは１２〜２０の飽和または不飽和の直鎖または分岐のアシル基を有するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンが挙げられる。また卵黄レシチンおよび大豆レシチンのように天然物由来の混合脂質体としても用いることができる。
【００３５】
炭素数４〜２４のアシル基は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸等のカルボン酸由来のアシル基が挙げられる。
他の脂質は、具体的には例えば下記に示す組成比の混合脂質からなるものでもよい
ホスファチジルコリン／コレステロール／ホスファチジルグリセロールが２０〜９０／１０〜６０／２〜４０モル％、好ましくは３０〜６０／２０〜５０／１５〜２５モル％である。
【００３６】
本発明のリポソーム形成剤から得られるリポソームは、公知の方法で製造することができる。
例えば一般的なＢａｎｇａｈｍ法として、原料の脂質を溶解可能な有機溶媒に溶解し、エバポレーター等を用いて溶媒を除去して脂質薄膜を形成し、相点移転以上の温度で水和乳化後、超音波処理にてリポソーム溶液を得ることができる。また、上記原料の脂質を水和し、ホモジナイザー等を用いて相転移点以上の温度で乳化後、ポリカーボネートのメンブランを用いて加圧ろ過する方法（Hope M.J. et al, Biochimica et Biophysica Acta, 812, 55 (1985)）にてリポソーム溶液を得ることができる。また得られたリポソームはマルチラメラリポソームでも、シングルラメラリポソームでも適当な粒径に調節してもよい。好ましくは粒径６０〜３０ｎｍ、より好ましくは９０〜２００ｎｍのシングルラメラリポソームである。
【００３７】
本発明のリポソーム形成剤は、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含んでいるので、リポソーム溶液として保存安定性に優れるとともに、生体毒性が強いモノアシルリン脂質の含有量が少なく、しかもトリエチルアミンなどの窒素を含有する不純物の含有量が少ないので生体にとって安全である。このため本発明のリポソーム形成剤を使用することにより、安全性の高いドラッグデリバリーシステムとして利用することができるリポソームを得ることができる。
【００３８】
リポソーム溶液として保存安定性に優れる理由としては、次のことが推測される。モノアシルリン脂質はジアシルリン脂質に比べて疎水性が低いので、リポソーム表面から脱離しやすい。このためモノアシルリン脂質の含有量が多い従来のリポソームはモノアシルリン脂質がリポソーム表面から脱離してリポソーム表面の水和層が減少するので、リポソーム粒子の凝集が起こり相分離を起こして不安定となりやすい。これに対して本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はモノアシル体含有量が少ないので、リポソーム表面からのリン脂質の脱離が起こりにくい。このためリポソーム溶液の保存安定性に優れたものとなる。
【００３９】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の合成法では、触媒としてトリエチルアミンなどの窒素を含有する塩基を使用していない。したがって、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質中には触媒に由来する有害な塩基が残存することなく、生体に安全で、かつ純度の高い、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を得ることができる。
【００４０】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は次の工程（Ａ）により容易に製造することができる。
工程（Ａ）：前記式(２)で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化体と前記式（３）で示されるリン脂質を、水溶液がアルカリ性を示すアルカリ金属塩であって窒素を含まない固体塩の存在下、有機溶媒中にて反応させる工程。
【００４１】
工程（Ａ）で使用する前記式（２）で示される活性化ポリアルキレンオキシド化合物および前記式（３）で示されるリン脂質において、Ｒ¹ＣＯ、Ｒ²ＣＯ、Ｒ³Ｏ、ｋ、ｎ、Ｘ、ｐおよびＹは前記式（１）で説明したものと同じである。
【００４２】
前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物において、Ｚは活性付与基であって、ポリアルキレンオキシド化合物に前記式（３）で示されるリン脂質との反応活性を付与する基であり、電子吸引性基、その他の基が含まれる。このような基として、具体的には、イミダゾール基、４−ニトロフェニルオキシ基、ベンゾトリアゾール基、塩素、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、カルボニロキシ−Ｎ−２−ピロリジノン基、カルボニル−２−オキシピリミジン基、Ｎ−スクシンイミジルオキシ基、ペンタフルオロベンゾイル基などが挙げられる。この中でも、イミダゾール基、４−ニトロフェニルオキシ基、ベンゾトリアゾール基、塩素、Ｎ−スクシンイミジルオキシ基が好ましく、特に４−ニトロフェニルオキシ基が特に好ましい。
【００４３】
前記式（３）で示されるリン脂質は天然リン脂質でも合成リン脂質でもよい。具体例として、例えば大豆および大豆水添ホスファチジルエタノールアミン、卵黄および卵黄水添ホスファチジルエタノールアミン等の天然および合成ホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。前記式（３）で示されるリン脂質としては、ｋが２であるホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００４４】
工程（Ａ）で使用する固体塩は、水溶液がアルカリ性を示すアルカリ金属塩であって窒素を含まない固体塩である。固体塩としては、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化体と、前記式（３）のリン脂質のアミノ基とを結合させることができ、水に溶解して水溶液にした場合のｐＨが７．１〜１３、好ましくは７．１〜１１のアルカリ性を示すアルカリ金属の炭酸塩、リン酸塩または酢酸塩である。固体塩としてはナトリウムまたはカリウムを含む固体塩であることが好ましい。具体的には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどである。この中でも好ましくは、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムであり、特に炭酸ナトリウムが好ましい。
固体塩の使用量は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の０．１〜１０００倍モルであることが好ましい。１０００倍モル以下であると攪拌が容易であるので好ましい。固体塩の使用量は特に、１〜５００倍モルであるのが望ましい。
【００４５】
使用する前記式（２）のポリアルキレンオキシド化合物の活性化体と前記式（３）のリン脂質の仕込み量は、モル比が１：１ないしリン脂質が過剰となるように設定することが望ましい。具体的には、ポリアルキレンオキシド化合物の活性化体とリン脂質のモル比が１：１〜１：５、好ましくは１：１．１〜１：２、さらに好ましくは１：１が望ましい。
リン脂質が過剰となる場合、後に述べる工程において生成物から除去することが可能である。一方、ポリアルキレンオキシド化合物が過剰となる場合、反応終了後に未反応のポリアルキレンオキシド化合物が残存する。この場合、ポリアルキレンオキシド化合物の分子量が約１００〜約３０００の場合は残存するポリアルキレンオキシド化合物を再結晶や晶析等の方法により除去することができる。ただしポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の収率が低下する場合がある。一方、ポリアルキレンオキシド化合物の分子量が約３０００以上の場合、残存するポリアルキレンオキシド化合物の除去は困難であることが多く、高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を得るのが難しくなるので、前記モル比が好ましい。
【００４６】
本発明の製造方法は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、上記のように前記固体塩の存在下に反応させることができる。ただし、場合によっては本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、リン脂質の活性化体と、ポリアルキレンオキシド化合物を反応させて得ることもできる。
【００４７】
工程（Ａ）の反応に使用する有機溶媒は、出発原料および反応生成物と反応しないか、ほとんど反応しないものであれば特に制限なく使用することができる。例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼンおよびトルエンなどの非プロトン性溶媒などが挙げられる。これらの中ではトルエン、クロロホルムが好ましい。エタノールなどの水酸基を有する有機溶媒は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化体の末端活性基と反応するので好ましくない。ジクロロメタン等でも反応性には問題はないが、低沸点であるため作業上好ましくない。
【００４８】
工程（Ａ）の反応の反応温度は３０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は１時間以上、好ましくは２〜１０時間とするのが望ましい。
【００４９】
このようにして前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と前記式（３）で示されるリン脂質とを反応させることにより、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が得られる。
【００５０】
なお工程（Ａ）において、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の末端がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基、特にアミノ基の場合にはこれらの基を保護して反応に供するのが好ましい。例えば、アミノ基の場合にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基または９−フルオレニルメチルカルボニル基等の保護基を付け、カルボキシル基の場合にはメチル基等によりエステル化して保護し、またチオール基の場合にはＳ−ｔ−ブチルスルフィド基等の保護基を付けて保護するのが好ましい。
【００５１】
工程（Ａ）で得られた反応液から固体塩を濾過後、濾液を濃縮または貧溶媒に投入して結晶化するなどの方法により、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度かつ高収率で得ることができる。濾過に使用する濾材は、被処理液の不溶物を除去することができるものであれば特に制限はなく、通常は保留粒子細孔径が１〜１０μｍで耐溶媒性を有する紙、ガラスなど各種の材質のフィルターを使用することができる。濾過方法には制限なく、例えば減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過などの方法を用いることができる。
また、工程（Ａ）で得られた濾液をｐＨ調整することにより、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を、前記式（１）のリン酸基部のＭが水素である水素タイプおよびＭがナトリウムやカリウムであるアルカリ塩タイプに変換することもできる。
【００５２】
得られたポリアルキレンオキシド修飾リン脂質またはポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む工程（Ａ）の溶液を、下記のような工程（Ｂ）〜（Ｄ）を経ることにより、さらに高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を得ることができる。なお、工程（Ｂ）〜（Ｄ）は、前記の濾過により工程（Ａ）の反応液から固体塩を除去した後に行うことが好ましい。
【００５３】
工程（Ｂ）では、工程（Ａ）で得られた結晶を有機溶媒に溶解した時に不溶物として存在する前記式（３）で示される過剰のリン脂質、すなわち未反応のリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンを除去する。
使用する有機溶媒としては、目的物であるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を溶解するが、過剰に存在するリン脂質を溶解しない溶媒、またはリン脂質の溶解度が低い溶媒が好ましい。有機溶媒としては酢酸エチルまたはアセトンが好ましく、特にアセトンが好ましい。
工程（Ｂ）の溶解温度は０〜８０℃が好ましく、特に２０〜７０℃が好ましい。
有機溶媒の使用量は結晶に対して、１〜１００重量倍であり、好ましくは２〜５０重量倍である。
【００５４】
工程（Ｂ）の溶液から不溶物を濾過後、濾液を濃縮または貧溶媒に投入して結晶化するなどの方法により、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度かつ高収率で得ることができる。
なお得られた濾液を冷却するだけでも結晶化を行うことはできるが、溶媒の種類によっては、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が十分に析出せず溶液中に残存し、収率が低下する可能性がある。
また、蒸留等により有機溶媒を除去して結晶化してもよい。有機溶媒を留去する場合、８０℃以下で減圧下で行うことが望ましい。有機溶媒の留去温度が８０℃を越えると、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のアシル基が分解するなど望ましくない副反応が起こる可能性がある。
【００５５】
また、前述のように、工程（Ｂ）で得られた濾液をｐＨ調整することにより、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を水素タイプやアルカリ塩タイプに変換することもできる。
【００５６】
工程（Ｂ）は工程（Ａ）の後、または以下に述べる工程（Ｃ）、工程（Ｄ）の前のいずれに行ってもよいし、工程（Ｃ）および／または工程（Ｄ）の後に行ってもよい。
【００５７】
工程（Ｂ）で得られた結晶はそのまま本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、さらに精製に供してもよい。
【００５８】
本発明の方法において、工程（Ａ）の後に、以下に述べる工程（Ｃ）および／または（Ｄ）を行うことにより、工程（Ａ）中で原料である前記式（２）で示される活性化ポリアルキレンオキシド化合物の活性付与基Ｚより生成したＺ由来の化合物を除去することが好ましい。工程（Ｃ）、（Ｄ）は、それぞれ工程（Ａ）の後において、工程（Ｂ）の前または後であってもよく、工程（Ｃ）と工程（Ｄ）はどちらが先であってもよい。ただし、工程（Ｂ）の後に、工程（Ｃ）、（Ｄ）が行われることが好ましく、また工程（Ｃ）の後に工程（Ｄ）が行われることが好ましい。
【００５９】
工程（Ｃ）では、工程（Ａ）で得られた結晶を溶解し、冷却しまたは貧溶媒を加えてポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶を析出させることによりＺ由来の化合物を除去して精製を行う。
工程（Ｃ）で使用する溶媒は、工程（Ａ）で得られた結晶を溶解し、冷却によってポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶が析出する溶媒、または貧溶媒を加えることによりポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を結晶化させることのできる溶媒が好ましい。結晶が析出する際、目的物であるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は結晶化し、Ｚ由来の化合物は溶解したままであるような溶媒が特に好ましい。
工程（Ｃ）で使用する溶媒量は結晶に対して１〜１００重量倍であり、好ましくは２〜５０重量倍である。
【００６０】
工程（Ｃ）では、再結晶した後、冷却を行うか、または貧溶媒を用いて結晶化を行う。好ましくは、１０℃以下に冷却して行えば結晶化が十分に行われ、良好な収率で結晶が得られる。
溶媒を留去して結晶化してもよい。溶媒を留去する場合、８０℃以下で減圧下で行うことが望ましい。有機溶媒の留去温度が８０℃を越えると、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のアシル基が分解するなど望ましくない副反応が起こる恐れがある。
【００６１】
工程（Ｃ）の具体的な方法としては、以下の方法を挙げることができる。
（i）酢酸エチル、アセトンから選ばれる少なくとも１種の溶媒に溶解後、冷却によってポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶を析出させる。
（ii）酢酸エチル、アセトンから選ばれる少なくとも１種の溶媒に溶解後、エーテルまたは炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を用いてポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶を析出させる。
（iii）酢酸エチル、アセトンから選ばれる少なくとも１種の溶媒とエーテルまたは炭素数５〜８の脂肪族炭化水素の溶媒を組み合わせ、溶解した後、冷却することでポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶を析出させる。
以上の方法の中でも、特に好ましくは、（i）の酢酸エチルを用いて溶解後、冷却し、結晶化させる方法が好ましい。
【００６２】
なお工程（Ｃ）で使用する前記炭素数５〜８の脂肪族炭化水素には特に制限はない。例えば、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ヘキサン、イソヘキサン、３−メチルペンタン、ネオヘキサン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、３−エチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、３，３−ジメチルペンタン、２，３，３−トリメチルブタン、オクタン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、３−エチルヘキサン、２，２−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン、２，４−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチルヘキサン、３，３−ジメチルヘキサン、３，４−ジメチルヘキサン、２−メチル−３−エチルペンタン、３−メチル−３−エチルペンタン、２，２，３−トリメチルペンタン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，２，３，３−テトラメチルブタンなどを挙げることができる。これらの中でヘキサンおよびヘプタンが好ましい。
【００６３】
工程（Ｃ）を行うにあたり、さらに純度を上げたい場合、同様に工程（Ｃ）を数回繰り返すことにより、さらに純度の優れたポリアルキレンオキサイド修飾リン脂質を得ることができる。
工程（Ｃ）により得られた結晶は、そのまま本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、さらに他の精製工程に供することもできる。
【００６４】
工程（Ｄ）では、結晶を溶媒に溶解後、吸着剤を添加して攪拌する等の方法によりＺ由来の化合物の除去行う。なお工程（Ｄ）は、工程（Ａ）で得られた反応液を濾過した濾液を用いても行うことができる。
工程（Ｄ）で用いる溶剤は、酢酸エチル、クロロホルム、トルエン、アセトンなどが好ましく、特に酢酸エチルが好ましい。
【００６５】
吸着剤を用いて処理する温度は１０〜８５℃、好ましくは４０〜７０℃、時間は１０分〜５時間、好ましくは３０分〜３時間とするのが望ましい。
工程（Ａ）で得られた結晶を加熱溶解し、吸着剤処理してもよいが、上記温度で結晶が溶解しない場合や溶液の粘度が高い場合が多いため、酢酸エチルなどの本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を溶解する溶媒に希釈して処理することが好ましい。処理する温度が１０℃未満ではポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が析出する場合があり、吸着剤を除去する場合にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質も一緒に除去されて収率が下がるので好ましくない。また、８５℃を超えると、微量の水分が存在する場合、吸着剤処理中にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の加水分解等が起こる可能性がある。
吸着剤の使用量は処理する結晶１００重量部に対して０．１〜２００重量部、好ましくは１〜５０重量部とするのが望ましい。吸着剤量が０．１〜２００重量部であると、Ｚ由来の化合物を充分に効率よく除去することができる。
【００６６】
工程（Ｄ）で吸着剤処理を行い、濾過などの方法により吸着剤を除去した後、冷却を行うか、または貧溶媒を用いて結晶化させることができる。好ましくは、１０℃以下に冷却して行えば結晶化が十分に行われ、良好な収率で結晶が得られる。
吸着剤除去後、溶媒を留去して結晶化してもよいが、溶媒を留去する場合、８０℃以下で減圧下で行うことが望ましい。有機溶媒の留去温度が８０℃を越えると、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のアシル基が分解するなど望ましくない副反応が起こる恐れがある。
【００６７】
工程（Ｄ）で用いる吸着剤としては、アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウム若しくはケイ素を含有する吸着剤または活性炭であり、例えば水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化ケイ素等を含有する吸着剤、活性炭などが挙げられる。これらの化合物を含有する吸着剤の市販品としては、キョーワード２００、キョーワード３００、キョーワード５００、キョーワード６００、キョーワード７００、キョーワード１０００、キョーワード２０００（協和化学工業（株）製、商標）、トミックス−ＡＤ３００、トミックス−ＡＤ５００、トミックス−ＡＤ７００（冨田製薬（株）製、商標）などが挙げられる。吸着剤は１種単独で使用することもできるし、２種以上を組み合せて使用することもできる。
【００６８】
工程（Ｄ）において得られた結晶は、そのまま本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、工程（Ｄ）の濾液を結晶化させずに、さらに吸着剤処理を行うなどして、さらに精製することもできる。
【００６９】
上記のような製造方法により、副生するモノアシルリン脂質の含有量が少なく、かつ従来の製造方法では触媒として利用され、最終生成物中から完全に分離することが困難であり、このため最終生成物中に残留していた窒素原子を有する塩基などの不純物含有量が少ない、高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を容易に高収率で製造することができる。
【００７０】
【発明の効果】
本発明で製造されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は新規かつ有用である。本発明で製造されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はモノアシルリン脂質体や窒素原子を有する不純物の含有量が少なく、生体に対する安全性の高い高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であるので、界面活性剤、特に乳化剤、可溶化剤、高分子ミセル形成剤、分散剤、両親媒性化学修飾剤およびリポソーム形成剤などとして好適に利用することができる。さらにこれらの中でもリポソーム形成剤として好適に利用することができる。
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法では、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、水に溶解したときに水溶液がｐＨ７．１〜１３のアルカリ性を示すアルカリ金属塩の炭酸塩、リン酸塩または酢酸塩であって窒素を含まない固体塩の存在下、有機溶媒中にて反応させるので、モノアシルリン脂質体の含有量が少なく、窒素原子を有する不純物含有量が少ないポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度かつ高収率で、容易に製造することができる。
【００７１】
【実施例】
以下、本発明の実施例について説明する。各例中、％は特別な言及がない限り、重量％である。
【００７２】
実施例１
（１）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（下記に示す式（４））の合成
【００７３】
【化９】

【００７４】
ポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量２０００、２０ｇ、１０ｍｍｏｌ）にトルエン（８０ｍＬ）を加え、１１０℃で還流し、１時間脱水した。50℃に冷却後、１，１’−カルボニルジイミダゾール（１．９５ｇ、１２ｍｍｏｌ）を加え、２時間反応させることにより、活性化体を得た。次に、炭酸ナトリウム（４２．４ｇ、４００ｍｍｏｌ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（１１．２２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、６５℃に昇温後、８時間反応させた。
炭酸ナトリウムを濾過後、濾液にヘキサン（３００ｍL）を入れ、結晶化させた。結晶を濾過後（この結晶１ｇをサンプリングした。これを工程（Ａ）におけるサンプル▲１▼とする：以下、同様にサンプリングしたものをサンプル▲２▼〜▲６▼とする）、結晶にアセトン（８０ｍL）を加え、５０℃に加温した。グラスフィルターにて濾過し、不溶物を除去した。濾液にヘキサン（１６０ｍL）を加え、晶析させ、５℃まで冷却した。その後、結晶を濾過した（工程（Ｂ）におけるサンプル▲２▼）。
【００７５】
結晶に酢酸エチル（４００ｍL）を加え、６５℃で溶解し３０分攪拌後、５℃に冷却した。析出した結晶を濾過した（工程（Ｃ）におけるサンプル▲３▼）。同様に酢酸エチルでの工程をもう１回行った（工程（Ｃ）におけるサンプル▲４▼）。
結晶を酢酸エチル（４００ｍL）にて溶解し、吸着剤としてキョーワード＃２０００（５ｇ）、キョーワード＃７００（０．８ｇ）を加え、６５℃にて１時間攪拌した。吸着剤を濾過後、５℃に冷却し、結晶化させた（サンプル▲５▼）。結晶を濾過後、同様に、吸着剤処理を１回行った。ヘキサン（２００ｍL）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物１４．６ｇ（収率５２．２％）を得た（工程（Ｄ）におけるサンプル▲６▼）。最終的に得られた結晶の純度は９８．４％であった。
【００７６】
各段階における生成物の分析は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５容量比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。
同様に、展開溶媒としてクロロホルム、メタノール、水、アンモニア水の混合比が６５：２５：４：０．１の混合溶媒を用いてＴＬＣを行った。
前者は、不純物として、リゾ体、フリーのリン脂質、フリーのポリエチレングリコール誘導体、トリエチルアミンの定量ができ、後者は、ポリオキシエチレン修飾リン脂質中のリン酸部のトリエチルアミン塩中のトリエチルアミン量を定量できる。
これらの方法により純度を求めた結果を表１に示す。
【００７７】
一方、各工程での物質中に含まれるＺ由来の化合物量を測定するため、サンプル▲１▼〜▲６▼についても分析を行った。サンプル▲１▼〜▲６▼を減圧下で乾燥後、それぞれ５０ｍｇをサンプル管にとり、エタノールで全量を５ｇにし、溶解した。分光光度計にて、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）由来の２４８ｎｍの吸光度を測定した。それぞれのサンプルの測定値から、各工程での１，１’−カルボニルイミダゾール由来の化合物の除去率を求め、得られたそれぞれの除去率を表２に示す。
【００７８】
表２の結果より、各工程において、Ｚ由来の化合物が減少し、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が精製されていることが確認できた。なお最終的には０．０２％程度の１，１’−カルボニルジイミダゾール由来の化合物を含んでいることとなるが、この程度の値は、不純物含有量としては無視できる値である。
【００７９】
実施例２
（２）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（下記に示す式（５））の合成
【００８０】
【化１０】

【００８１】
反応器にポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量２０００、５０ｇ、２５ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（５３ｇ、５００ｍｍｏｌ）およびトルエン（２００ｍL）を入れ、７５℃に加温した。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（１２．６ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）を添加し、９時間反応させることにより、活性化体を得た。６５℃に冷却後、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（２８．１ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を入れ、７．５時間反応させた。
炭酸ナトリウムを濾過後、濾液にヘキサン（５００ｍL）を入れ、５℃に冷却後、析出した結晶を濾過した。この結晶にアセトン（２００ｍL）を加え、５０℃に加温した後、グラスフィルターにて濾過し、不溶物を除去した（工程（Ｂ））。
【００８２】
濾液にヘキサン（５００ｍL）を加えた後、５℃まで冷却した。析出した結晶を濾過後、工程（Ｃ）へ供した。工程（Ｃ）では、酢酸エチル（７５０ｍL）を加えて６５℃にて溶解し、３０分攪拌後、５℃に冷却し、析出した結晶を濾過した。同様に酢酸エチルを用いた工程（Ｃ）をもう１回行った。
結晶を酢酸エチル（７５０ｍL）にて溶解し、吸着剤としてキョーワード＃２０００（12ｇ）、キョーワード＃７００（1ｇ）を加え、６０℃で１時間攪拌した。吸着剤を濾過後、５℃に冷却し、析出した結晶を濾過した（工程（Ｄ））。同様に、工程（Ｄ）の吸着剤による処理を２回行った。
ヘキサン（３００ｍL）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物３８．２ｇ（収率５４．６％）を得た。純度は９９．５％であった。純度の結果を表１に示す。
【００８３】
実施例３
（３）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（下記に示す式（６））の合成
【００８４】
【化１１】

【００８５】
ポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量５０００、２０ｇ、４ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１７．０ｇ、１６０ｍｍｏｌ）およびトルエン（７５ｍL）を入れ、７５℃に加温した。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（２．７ｇ、１３.２ｍｍｏｌ）を添加し、９時間反応させることにより、活性化体を得た。６５℃に冷却後、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（４．５ｇ、６ｍｍｏｌ）を入れ、６時間反応させた。
炭酸ナトリウムを濾過後、濾液にヘキサン（２００ｍL）を入れ、析出した結晶を濾過した。結晶にアセトン（１５０ｍL）を加え、５０℃に加温した後、グラスフィルターにて不溶物を除去した（工程（Ｂ））。
【００８６】
ヘキサン（３００ｍL）を加え、晶析させた。濾過後、得られた結晶に酢酸エチル（４００ｍＬ）を加え、６５℃にて溶解し、３０分攪拌後、５℃に冷却し、析出した結晶を濾過した（工程（Ｃ））。さらに酢酸エチルを用いた工程（Ｃ）を２回行った。
結晶を酢酸エチル（３６０ｍL）にて溶解後、吸着剤としてキョーワード＃２０００（４ｇ）、キョーワード＃７００（０．２ｇ）を加え、６５℃で１時間攪拌した。吸着剤を濾過後、５℃に冷却し、析出した結晶を濾過した（工程（Ｄ））。同様に、工程（Ｄ）の吸着剤による処理を２回行った。
ヘキサン（９０ｍL）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物１５．２ｇ（収率６５．４％）を得た。純度は９８．４％であった。純度の結果を表１に示す。
【００８７】
実施例４
（４）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（下記に示す式（７））の合成
【００８８】
【化１２】

【００８９】
ポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量５０００、２０ｇ、４ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（３３．９ｇ、３２０ｍｍｏｌ）およびトルエン（７５ｍＬ）を入れ、７５℃に加温した。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（２．８２ｇ、１４ｍｍｏｌ）を添加し、９時間反応させることにより、活性化体を得た。６５℃に冷却後、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（３．２ｇ、６ｍｍｏｌ）を入れ、５時間反応させた。
炭酸ナトリウムを濾過後、濾液にヘキサン（２００ｍL）を入れ、５℃に冷却した。析出した結晶を濾過し、結晶を得た。結晶にアセトン（１５０ｍL）を加え、５０℃に加温した後、グラスフィルターにて不溶物を除去した（工程（Ｂ））。
【００９０】
濾液にヘキサン（３００ｍL）を加え、晶析させた。濾過後、得られた結晶に酢酸エチル（４００ｍＬ）を加え、６５℃にて溶解し、３０分攪拌した。５℃に冷却後、析出した結晶を濾過した（工程（Ｃ））。さらに酢酸エチルを用いた工程（Ｃ）を２回行った。
結晶を酢酸エチル（３６０ｍL）にて溶解し、吸着剤としてキョーワード＃２０００（４ｇ）、キョーワード＃７００（０．２ｇ）を加えた。吸着剤を濾過後、５℃に冷却し、析出した結晶を濾過した（工程（Ｄ））。同様に、工程（Ｄ）の吸着剤による処理を２回行った。
ヘキサン（９０ｍL）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物１５．２ｇ（収率６５．６％）を得た。純度は９８．５％であった。純度の結果を表１に示す。
【００９１】
比較例１
（１）ピリジルジチオプロピオノイルアミノ ポリエチレングリコール ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ピリジルジチオプロピオノイルアミノ ポリエチレングリコール サクシンイミジルカーボネート（１ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１０ｍＬ）に溶解し、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（０．３６ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、次にトリエチルアミン（０．３３ｍＬ、２．３７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を４０℃で１０分間攪拌した。反応液を減圧下、エバポレーターにて濃縮後、アセトニトリル（５０ｍＬ）を加え、この溶液を４℃で一晩冷蔵した。次に、遠心分離を行い、透明な溶液を分離した。溶液をエバポレーターにて濃縮後、結晶を乾燥した。収量は１．１５ｇであった。収率は９０．８％であった。純度の結果を表３に示す。
【００９２】
表３で示したフリートリエチルアミン含有量、およびフリー塩含有量は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）のスポットにおいては、５％までは定量が可能であるが、それ以上については定量性がない。そのため、５％を超えるものについては、＞５とした。
【００９３】
比較例２
（２）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量２０００、２０ｇ、１０ｍｍｏｌ）にベンゼン（７５ｍＬ）を加え、還流し、脱水した。カルボニルジイミダゾール（１．７８ｇ、１１ｍｍｏｌ）を加え、２時間還流し、活性化体を得た。ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（７ｇ、９．３６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３．１ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）を加え、２０時間還流した。反応溶液をエバポレーターにて濃縮し粗生成物を得た。
この粗生成物をＣ−１８逆相シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。Ｃ−１８逆相シリカゲルは（Ｂｉｏ-Gel Ａ-１．５m）を使用し、溶離液はエタノール／水＝４／１を用いた。収量は ５．０ｇ、収率は１８％であった。純度の結果を表３に示す。
【００９４】
比較例３
（３）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル １−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量２０００、５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）をクロロホルム/トルエン＝５０／２（ｗｔ／ｗｔ）（２５ｍＬ）に溶解後、トリホスゲン（０．８９ｇ、３ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で３時間反応させた。この溶液に、ジエチルエーテル（７５ｍＬ）を加え、沈殿させた。この沈殿物を濾過後、乾燥し、モノメチルポリオキシエチレン クロロホルメート（４．７ｇ、９１％）を得た。
モノメチルポリオキシエチレン クロロホルメート（４ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）および１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（１．６５ｇ、２．３ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３９ｍＬ、２．７６ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で３時間反応させた。
不溶物を濾過後、反応溶液をエバポレーターにて濃縮した。残渣に水（２０ｍＬ）を入れて溶解し、０．１Ｎ塩酸（５．０ｍＬ）を加えて水溶液を酸性にした。水溶液に塩化メチレン（２５ｍＬ）を加え、抽出した。同様に抽出を２回繰り返し、組み合わせた抽出液に硫酸ナトリウム（３０ｇ）を入れ、脱水した。硫酸ナトリウムを濾過後、エバポレーターにて濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的化合物１．５ｇを得た。収率は２８％であった。純度の結果を表３に示す。
【００９５】
比較例４
（４）ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド ポリオキシエチレンスクシニル ホスファチジルエタノールアミンの合成
ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド ポリオキシエチレン サクシンイミジルカーボネート（１ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（６ｍＬ）に溶解した。ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（０．２９２ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１４４ｍＬ、１．０４ｍｍｏｌ）を入れ、４５℃で１０分間反応させた。
反応液に酢酸（０．０６ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）を加え、エバポレーターにて濃縮した。残渣に水（７．５ｍＬ）を加え、溶解後、エバポレーターにて少量のクロロホルムを留去した。反応液をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ ＣＥ 透析チューブ（ＭＷＣＯ ３０万）に入れ、５０ｍＭの生理食塩水（１５００ｍＬ×３）にて４℃で透析を行った（８−１６時間／１回透析）。さらに、イオン交換水にて透析後、０．２μｍの滅菌フィルターで濾過した。凍結乾燥後、目的物を得た。収量は０．５５ｇ、収率は４３．３％であった。純度の結果を表３に示す。
【００９６】
【表１】

【００９７】
【表２】

【００９８】
【表３】

【００９９】
表１、表３の注
＊１ 純度１：前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の純度。（単位％）
＊２ リゾ体含有量：モノアシルリン脂質体の含有量。（単位％）
＊３ フリーＰＥ含有量：未反応のリン脂質の含有量。（単位％）
＊４ フリーＰＥＧ誘導体含有量：ポリエチレングリコールおよび、その誘導体の含有量。（単位％）
＊５ フリートリエチルアミン含有量：トリエチルアミン含有量。（単位％）
＊６ フリー塩中のトリエチルアミンの含有量：リン酸トリエチルアミン塩中のトリエチルアミン含有量。（単位％）
【０１００】
表１、表３の結果から、実施例の製造方法は比較例に比べて、リゾ体やトリエチルアミンなどの不純物の含有量が少なく、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度で製造することができることがわかる。
【０１０１】
実施例５
実施例３のモノメチルポリオキシエチレンカルバミル ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用して乳液を作製した。すなわち、表４の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、撹拌しながら水相部を同温度で添加した。
【０１０２】
【表４】

【０１０３】
作製した乳液を４０℃で一か月保存した後、乳化状態を下記の基準により評価した。結果を表６に示す。
３：安定な状態
２：やや不均一な状態
１：クリーミングまたは分離している状態
【０１０４】
また、作製した直後の乳液を皮膚に塗布し、官能試験を行った。官能評価は５人の専門パネラーで行った。評価方法は、上腕部を洗浄した後に試料を塗布し、塗布直後および一晩経過後の皮膚刺激についての評価を下記３段階評価でそれぞれ行った。５人の合計点を表６に記す。
３：普通である。全く異常がない。
２：違和感がある。少し痒みを感じる。
１：痒みがある。皮膚に発赤を認める。
【０１０５】
実施例６
実施例２のモノメチルポリオキシエチレンカルバミル ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用してクリームを作製した。すなわち、表５の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、撹拌しながら水相部を同温度で添加した。
【０１０６】
【表５】

【０１０７】
作製したクリームについて実施例５と同様の評価を行った。結果を表６に示す。
【０１０８】
比較例５および６
比較例３のモノメチルポリオキシエチレンカルバミル ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いて実施例５および実施例６と同様の試験を行った。結果を表６に示す。
【０１０９】
【表６】

【０１１０】
実施例７
リポソーム溶液の安定性評価
ジパルミトイルホスファチジルコリン（１．９２ｇ、２．６４ｍｍｏｌ）、コレステロール（０．４５ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）、実施例２で得たモノメチルポリオキシエチレン カルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（０．４２ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をナス型フラスコに入れ、クロロホルム５０ｍＬを加えて溶解し、ロータリーエバポレーターにて脱溶剤し、フラスコ内壁に脂質の薄膜を形成した。減圧下にて溶剤除去を十分に行い、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水液３０ｍＬを加えて分散し、さらに超音波洗浄器にて５分間処理を行いリポソーム溶液とした。
得られたリポソーム溶液を室温にて１か月間放置した。１か月後のリポソーム溶液の分散状態は、目視では変化が認められず、均一なリポソーム溶液であった。
【０１１１】
比較例７
比較例２で得たモノメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いて、実施例７と同様の評価を行った。その結果、リポソーム溶液は均一ではなく、脂質粒子が沈降していた。
【０１１２】
実施例８
カルボキシメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いたアスパラギナーゼの修飾
実施例３と同様にして得られたカルボキシメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（５ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）をクロロホルム５０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（０．１５ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を添加し、少量のクロロホルムに溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２７ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を添加して室温にて２時間撹拌した。その後、濾過して不溶物を除去した溶液にジエチルエーテルを添加し、析出した結晶を濾過して得た。減圧にて溶剤を除去し、次の工程に用いた。
【０１１３】
アスパラギナーゼ０．１ｇをｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水液５０ｍＬに溶解し、上記で得られたサクシンイミジルカルボキシメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを添加し、５℃で４時間撹拌した。この反応液を、ｐＨ７．４、４℃のリン酸緩衝生理食塩水液に対して透析して未反応物を除去し、その後凍結乾燥し、カルボキシメチルポリオキシエチレン カルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンがアスパラギナーゼに結合した乾燥品を得ることができた。
【０１１４】
実施例９
カルボキシメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いた大豆水添ホスファチジルコリンの高分子ミセル溶液の調製
大豆水添ホスファチジルコリン（０．１ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と実施例３と同様にして得られたカルボキシメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（１ｇ、１７ｍｍｏｌ）を蒸留水（５ｍＬ）に添加し攪拌混合した。均一な混合溶液に蒸留水（９５ｍＬ）を徐々に添加攪拌し、透明で均一な高分子ミセル溶液を得た。得られた溶液について粒度測定装置（NICOMP Model 370：野崎産業株式会社製）を用いて粒度分布を測定した。その結果平均粒径は３５ｎｍであった。
得られた高子ミセル溶液を室温にて１か月間放置した。１か月後の高分子ミセル溶液の状態は、目視では変化が認められず沈殿物のない均一な高分子ミセル溶液であった。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention is a novel and useful polyalkylene oxide modified phospholipid.ofManufacturing methodTo the lawIn particular, polyalkylene oxide-modified phospholipids that can be used in drug delivery systems such as chemical modification and emulsification of bioactive substances, or liposomesQualityManufacturing methodTo the lawRelated.
[0002]
[Prior art]
In recent years, research on liposome preparations such as anticancer agents has been widely conducted, and water-soluble polymer modification of liposomes has been actively performed for the purpose of improving the retention in blood. As one of them, a liposome-modified polyethylene oxide-modified phospholipid is used. Since these are used for pharmaceutical use, it is preferable that there are as few impurities as possible or no impurities exist.
[0003]
In the synthesis reaction of the liposome-modified polyethylene oxide-modified phospholipid, a nitrogen-containing base such as triethylamine is often used as a catalyst. In this case, it was necessary to make the system acidic in order to remove the excess base after the reaction. During this process, degradation of the liposome-modified polyethylene oxide-modified phospholipid occurred, and it was difficult to obtain a high-purity product.
In addition, nitrogen-containing bases such as triethylamine often have an ammonia odor or a unique odor. It is desirable not to use such a base in the working environment.
[0004]
MCWoodle (Biochimica et Biophysica Acta, 1105, 193-200 (1992) et al. And S. Zalipsky (Bioconjugate Chem, 4,296-299 (1994)) et al. Report on methods for synthesizing polyethylene oxide-modified phospholipids. Specifically, the end of polyethylene glycol is activated with 1,1′-carbonyldiimidazole or disuccinimidyl carbonate in an organic solvent, then reacted with a phospholipid in the presence of a base such as triethylamine, and then reversed. In this method, polyethylene oxide-modified phospholipid is obtained by purification by phase silica gel chromatography or dialysis.
Also in this method, immediately after the reaction, the system is acidified in order to remove excess base such as triethylamine. At this time, monoacyl phospholipid (generally called lysophospholipid) is produced. This is highly biotoxic and causes a problem when used as a medicine, for example, as a drug delivery system.
In addition, if reverse-phase silica gel chromatography or dialysis is performed in the purification step after synthesis, the product may deteriorate during elution from the column (such as the production of monoacylphospholipids described above) or the product may hydrolyze during dialysis. Occurs. Therefore, it is difficult to obtain a high-purity product, which is a problem from an industrial viewpoint.
[0005]
As described above, in the conventional method, it is difficult to obtain a high-purity product because a base such as triethylamine is contained or lysophospholipid is contained when it is removed. Further, in the conventional method, it is difficult to develop the product for industrial production from the viewpoint of poor product yield and a large amount of solvent used.
Therefore, a simple method for synthesizing a high-purity polyalkylene oxide-modified phospholipid that does not contain impurities such as a base having a nitrogen atom such as triethylamine or a monoacyl phospholipid is desired.
[0006]
In addition, since phospholipids have an excellent effect as an emulsifier and a moisturizer, many studies have been made on blending them into cosmetics as well as pharmaceuticals. In the cosmetic field, its use has been studied as a liposome or by the addition of other surfactants. However, application to emulsions, lotions and the like has been difficult due to problems such as insolubility when the addition amount is increased due to solubility problems. Therefore, the amount of surfactants other than the surfactant of the present invention must be increased.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
  An object of the present invention is to provide a polyalkylene oxide-modified phospholipid having a high purity and a low impurity content such as a base having a nitrogen atom or a monoacyl phospholipid.QualityManufacturing methodThe lawIs to provide.
  Furthermore, the present inventionMy goal is,Because it has the effect of phospholipid and is soluble in aqueous solution, it can be used as a surfactant.It is to provide a method for producing polyalkylene oxide-modified phospholipids.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
  The present invention provides the following polyalkylene oxide-modified phospholipidsQualityManufacturing methodIn lawis there.
  (1)  The manufacturing method of the polyalkylene oxide modification phospholipid which has the following process (A).
  Step (A):underAn activated form of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2);underThe phospholipid represented by the formula (3) is organically treated in the presence of a solid salt containing an alkali metal carbonate, phosphate or acetate whose pH is 7.1 to 13 and does not contain nitrogen. The process made to react in a solvent.
[Formula 4]

  (In formula (2), R^ThreeO is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and n is an average added mole number of an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, which is a number of 10 to 800. X is a divalent hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms or —C (═O) (CH₂) q- (where q is 1 to 4), p is 0 or 1. When p is 0, Y is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. When p is 1, Y is a hydrogen atom, amino group, carboxyl group, aldehyde group, glycidyl group or thiol group. Z is an activity imparting group. )
[Chemical formula 5]

  (In formula (3), R¹CO and R²CO is each independently an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, and k is 1 to 6. )
  (2)  R¹CO and R²The above, wherein CO is an acyl group having 12 to 20 carbon atoms(1)The manufacturing method as described.
  (3)  p is 0 and Y is a methyl group(1)Or(2)The manufacturing method as described.
  (4)  The solid salt used in step (A) is sodium carbonate, and the organic solvent is toluene or chloroform(1) to (3)The manufacturing method in any one of.
  (5)  After the step (A), the following step (B) is included.(1) to (4)The manufacturing method in any one of.
Process (B): The process of removing the unreacted phospholipid shown by Formula (3) using ethyl acetate or acetone.
  (6)  After the step (A), the above step (C)(1) to (5)The manufacturing method in any one of.
Step (C): A step of recrystallization using ethyl acetate and / or acetone as a solvent.
  (7)  In the step (C), at least one compound selected from the group consisting of an aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms and an ether is used as a solvent.(6)The manufacturing method as described.
  (8)  The step (C) is performed after the step (B).(6)Or(7)The manufacturing method as described.
  (9)  After the step (A), the above step (D)(1) to (8)The manufacturing method in any one of.
Step (D): A step of performing purification using an adsorbent.
  (10)  The adsorbent used in the step (D) is an alkaline earth metal oxide, an alkaline earth metal hydroxide, an adsorbent containing aluminum or silicon, or activated carbon(9)The manufacturing method as described.
  (11)  The step (D) is performed after the step (B).(9)Or(10)The manufacturing method as described.
  (12)  The polyalkylene oxide-modified phospholipid has a monoacyl phospholipid content of 3% by weight or less and a content of a base having a nitrogen atom of 0.02% by weight or less.underThe compound represented by the formula (1)(1) to (11)The manufacturing method in any one of.
[Chemical 6]

  (In formula (1), R¹CO and R²CO is independently an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, k is 1 to 6, R^ThreeO is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and n is an average added mole number of an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, which is a number of 10 to 800. M is a hydrogen atom, sodium or potassium, X is a divalent hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms, or -C (= O) (CH₂) q- (where q is 1 to 4), p is 0 or 1. When p is 0, Y is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. When p is 1, Y is a hydrogen atom, amino group, carboxyl group, aldehyde group, glycidyl group or thiol group. )
  (13)  The content of the monoacylphospholipid body is 2% by weight or less(12)DescribedProduction method.
  (14)  p is 0, Y is a methyl group, and the monoacylphospholipid content is 0.5 wt% or less(12)DescribedProduction method.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention represented by the formula (1), R¹CO and R²CO is an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, preferably 12 to 20 carbon atoms. This acyl group is usually derived from fatty acids. R¹CO and R²Specific examples of CO include butyric acid, isobutyric acid, caproic acid, caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, isostearic acid, oleic acid, linoleic acid, arachidic acid And acyl groups derived from saturated and unsaturated linear or branched fatty acids such as behenic acid, erucic acid, and lignoceric acid. R¹CO and R²CO may be the same as or different from each other.
[0010]
In the formula (1), R^ThreeThe oxyalkylene group represented by O is an oxyalkylene group having 2 to 4, preferably 2 or 3, carbon atoms. R^ThreeExamples of O include an oxyethylene group, an oxypropylene group, an oxytrimethylene group, and an oxybutylene group. Among these, an oxyethylene group and an oxypropylene group are preferable, and an oxyethylene group is particularly preferable. There are as many oxyalkylene groups in the molecule as there are n, but these oxyalkylene groups may be used singly or in combination of two or more, and there is no limitation on the combination. Further, it may be a block shape or a random shape.
[0011]
In said Formula (1), n represents the average addition mole number of an oxyalkylene group, and is the number of 10-800, Preferably it is 20-500. When n is 10 or more, the delivery effect is enhanced when the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention is used in a drug delivery system. When n is 800 or less, when the polyalkylene oxide-modified phospholipid is produced, the viscosity of the polyalkylene oxide compound of the formula (2), which is a raw material, does not increase so much, so that workability is improved.
[0012]
In the formula (1), M is a hydrogen atom, sodium or potassium. The polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention represented by the formula (1) may be a mixture thereof.
Sodium or potassium which forms a salt with the phosphate group moiety is usually contained in a physiological saline buffer used for preparation of drugs and the like, and is also present in the living body. Therefore, even when the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention is used in a drug delivery system, there are few problems such as toxicity in the body. When M is a metal ion other than sodium or potassium, for example, a divalent metal ion such as calcium or magnesium, a structure in which two phospholipid molecules are associated is not preferable.
[0013]
In said Formula (1), k is an integer of 1-6, Preferably it is 1-4, More preferably, it is 2-4, More preferably, it is 2.
In the formula (1), X is a divalent hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms or —C (═O) (CH₂) q- (where q is 1 to 4). Specific examples of the hydrocarbon group include —CH₂-, -CH₂CH₂-,-(CH₂)_Three-, -CH (CH_Three) CH₂-Etc. are mentioned. p is 0 or 1;
[0014]
In the above formula (1), when p is 0, Y is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, preferably an alkyl group. Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and a butyl group. Of these, a methyl group is preferred.
When p is 1, Y is a hydrogen atom, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a glycidyl group or a thiol group, preferably an amino group.
Xp-Y is preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group or an aminomethyl group, and particularly preferably a methyl group.
[0015]
The polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention has a low content of impurities such as a base having a nitrogen atom which is a residue derived from a monoacyl phospholipid body or a catalyst.
The content of the monoacyl phospholipid body present in the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention is 3% by weight or less, preferably 2% by weight or less, more preferably 0.5% by weight or less.
[0016]
Further, the content of the base having a nitrogen atom is 0.02% by weight or less, more preferably 0.01% by weight or less, and still more preferably substantially not contained.
The base having a nitrogen atom is a residue derived from the catalyst, for example, derived from a base such as triethylamine, and has at least one nitrogen atom. Examples of the base having a nitrogen atom include pyridine, triethylamine, diisopropylamine, dimethylaminopyridine, imidazole, diethylamine, diisobutylamine, tri-n-octylamine, di-2-ethylhexylamine and the like. Among these, it is desired that triethylamine is particularly small in terms of toxicity. The phospholipid represented by the formula (3) has a nitrogen atom, but is not a base having a nitrogen atom because it is neutralized in the molecule.
[0017]
Since the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention has a low content of monoacyl phospholipid, which is considered to be highly biotoxic, and a low content of impurities having nitrogen atoms such as triethylamine, it is highly safe for the living body.
Moreover, since the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention contains a monovalent metal cation of sodium ion or potassium ion that is also present in the living body, it is highly safe for the living body.
Thus, since the safety | security with respect to a biological body is high, it can utilize as surfactant, especially surfactant for biological bodies. Among them, it can be suitably used as a surfactant for physiologically active substances.
[0018]
The surfactant of the present invention is a surfactant containing the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention. Usually, it is desirable to use 0.01 to 30% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight of the polyalkylene oxide-modified phospholipid based on the total composition such as a composition containing a surfactant. It is desirable to mix and use. In addition, the usage-amount of surfactant is suitably selected by the use purpose of a surfactant, the difference in a composition, etc.
[0019]
In the surfactant of the present invention, one or more polyalkylene oxide-modified phospholipids represented by the formula (1) may be used in combination, or may be used in combination with other surfactants.
The surfactant of the present invention includes 1) an emulsifier that emulsifies a target substance that is insoluble or hardly soluble in water in a dispersion medium such as water or a buffer solution, and 2) water, a buffer solution, or the like that is a target substance that is insoluble or hardly soluble in water. 3) Solubilizers that can be dissolved in a dispersion medium, 3) Dispersants that disperse target substances that are insoluble or sparingly soluble in water in dispersion media such as water and buffer solutions, and 4) Introduce hydrophilic groups and hydrophobic groups into the target substances. It can be suitably used as an amphiphilic chemical modifier.
[0020]
By using the surfactant of the present invention, an emulsion, a solubilized solution or a dispersion can be obtained.
When the surfactant of the present invention is used as an emulsifier, solubilizer or dispersant, only the surfactant of the present invention may be used as the emulsifier, solubilizer or dispersant, and for emulsification, solubilization or dispersion. It may contain other known ingredients used.
[0021]
The form of the solubilizing liquid or dispersion is not limited, and a physiologically active substance or the like is dispersed in a solution obtained by dissolving a physiologically active substance or the like in a dispersion medium such as water or a buffer. Examples thereof include a dispersion liquid.
The form of the emulsified solution or the solubilized solution is not limited, and the micelle solution formed by the surfactant of the present invention, that is, a micelle solution containing a lipophilic physiologically active substance inside the micelle, or water or a buffer solution, etc. Examples thereof include an emulsion solution in which dispersed particles of the surfactant of the present invention and a lipophilic physiologically active substance are present as colloidal particles or larger particles in the dispersion medium. As the micelle solution, a polymer micelle solution having a dispersed particle size of 10 to 300 nm is particularly mentioned. The emulsion solution may be an oil-in-water (O / W) type in which a physiologically active substance is blended in the oil phase or a multilayer oil-in-water droplet (W / O / W) type in which a physiologically active substance is blended in the aqueous phase.
[0022]
Since the surfactant of the present invention has hydrophilicity derived from a polyoxyalkylene group and hydrophobicity derived from an acyl group, it can be used as an emulsifier or solubilizer, and also has storage stability. Are better. In addition, it is composed of a phospholipid equivalent to a biological cell component and a polyoxyalkylene group having low toxicity, and the content of monoacylphospholipid, which is said to be biotoxic, is low, so that safety is higher. By using an emulsifier or solubilizer containing such a polyalkylene oxide-modified phospholipid, for example, a highly safe emulsion or solubilized solution of a physiologically active substance can be obtained.
[0023]
Examples of target substances to be emulsified, solubilized or dispersed include physiologically active substances and fat-soluble substances.
Specific examples of the physiologically active substance include enzymes, antibodies, other proteins, sugars, lipids, glycoproteins, glycolipids or hormones.
Examples of the fat-soluble substance include lipids such as phospholipids, fat-soluble drugs such as taxol, or higher alcohols, ester oils, triglycerin, tocopherols and higher fatty acids which are usually used in the oil phase.
The surfactant of the present invention may contain other known components such as polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol, fatty acid esters, preservatives, and antioxidants, as long as the object of the present invention is not impaired. it can.
[0024]
By using the polymer surfactant containing the polyoxyalkylene chain of the present invention, a polymer micelle solution in which fine particles having a particle size of 10 to 300 nm are present as micelles can be obtained.
As the polymer micelle, only the polymer surfactant represented by the formula (1) may be used, or other known components may be included. As will be described later, a polymer surfactant obtained by binding another known polymer via the reactive group Y in the formula (1) may be used. The polymer micelle contained in the polymer micelle solution can be used for solubilization of a fat-soluble drug.
Since the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention is close to a biological cell component as described above, and further contains a polymer polyalkylene oxide chain, the prepared polymer micelle solution is a conventional surfactant. Compared to the micelle solution obtained by using, the hydration layer provides high stability and low toxicity to the living body.
[0025]
The polymer micelle preferably contains 0.05 to 2% by weight of the target substance and 0.2 to 8% by weight of the surfactant of the present invention based on the total amount.
The polymer micelle obtained has a weight average particle diameter of 10 to 300 nm, preferably 20 to 100 nm, as measured by dynamic light scattering.
[0026]
The preparation of the emulsified liquid is carried out by kneading the target substance to be emulsified with water and the surfactant of the present invention at 30 to 90 ° C, preferably 45 to 85 ° C, more preferably 60 to 80 ° C. An aqueous phase such as water or a buffer solution can be gradually added thereto and mixed to obtain an emulsion. A known water-soluble substance can be dissolved in the aqueous phase as necessary.
As described above, the emulsion may be prepared by mixing the oil phase and the aqueous phase separately, or all components may be mixed by a homogenizer, a sonicator or the like. Usually, the target substance is 0.01 to 30% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight, and the surfactant of the present invention is 0.1 to 40% by weight, preferably 0. It is preferable to use 5 to 10% by weight.
[0027]
The solubilized solution is prepared by mixing the target substance to be dissolved in water and the surfactant of the present invention usually at room temperature to 50 ° C., preferably 30 to 45 ° C., and gradually adding an aqueous phase such as water or a buffer solution thereto. And mixed to obtain a uniform solubilized solution. A known water-soluble substance can be dissolved in the aqueous phase as necessary.
For mixing, a homogenizer, a sonicator, or the like can be used. Usually, the target substance is 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight relative to the total amount, and the surfactant of the present invention is 0.1 to 30% by weight based on the total amount, preferably 1 to It is preferable to use 10% by weight.
[0028]
When Y in the formula (1) is a reactive functional group other than a hydrogen atom, the surfactant of the present invention can be used as an amphiphilic chemical modifier for a physiologically active substance.
The amphiphilic chemical modifier may contain one or more surfactants of the present invention, and may further contain other known components used for chemical modification of physiologically active substances.
The physiologically active substance to be chemically modified is not particularly limited as long as it has a functional group such as amino group, carboxyl group, hydroxyl group, and thiol group. Examples include enzymes, antibodies, other oligos and polypeptides, proteins, sugars, lipids, glycoproteins, glycolipids, hormones and the like.
[0029]
When the surfactant of the present invention is used as an amphiphilic chemical modifier for physiologically active substances, Y in the formula (1) is preferably an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, or a thiol group. When it has an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, and a thiol group, it can be easily reacted with a functional group present in a physiologically active substance. For example, when Y is a carboxyl group, a polyalkylene oxide-modified phospholipid skeleton can be introduced into the physiologically active substance by forming a CONH bond with an amino group in the physiologically active substance.
[0030]
The amphiphilic chemical modifier of a physiologically active substance can be used as a solubilized solution, an emulsion, a dispersion, or a polymer micelle solution. For example, a polymer micelle solution is prepared by the above-described method using a polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention as a fat-soluble drug, and further, Y is a reactive functional group such as a carboxyl group, antibody A polymer micelle preparation that can be administered to a target site can be obtained by reacting with an amino group of a protein and binding.
[0031]
A physiologically active substance chemically modified using the amphiphilic chemical modifier of the present invention can be used as the liposome component. In this case, the physiologically active substance can be present on the liposome surface. For example, when the physiologically active substance is an antibody protein, the physiologically active substance can be used as a ligand for the target cell, so that liposomes can be concentrated and transported to the target cell.
When used as an amphiphilic chemical modifier for a physiologically active substance, it can be used as a solubilized solution, an emulsion, a dispersion, a polymer micelle solution, and a liposome solution.
[0032]
The liposome of the present invention is a liposome comprising a liposome forming agent containing the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention. Moreover, the other well-known lipid currently used for formation of a liposome membrane may be included as a component.
Usually, it is desirable to use the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention in an amount of 0.002 to 0.2 mol, preferably 0.01 to 0.1 mol, per 1 mol of phospholipid. The polyalkylene oxide-modified phospholipid is preferably used in an amount of 0.1 to 20% by weight based on the total composition of the liposome.
[0033]
Liposomes obtained using the liposome-forming agent of the present invention can be produced using the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention and other lipids.
Examples of other lipids include phospholipids, sterols, and compounds having a saturated or unsaturated acyl group having 8 to 22 carbon atoms. The other lipid may be a phospholipid alone including phosphatidylcholine, or a mixed lipid with other lipids.
[0034]
Phospholipid means glycerophospholipid, sphingophospholipid, glyceroglycolipid, and sterols means cholesterol, dihydrocholesterol, ergosterol, lanosterol and the like.
Examples of the glycerophospholipid include phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol and phosphatidylserine having a saturated or unsaturated linear or branched acyl group having 4 to 24 carbon atoms, preferably 12 to 20 carbon atoms. It can also be used as a mixed lipid body derived from natural products such as egg yolk lecithin and soybean lecithin.
[0035]
The acyl group having 4 to 24 carbon atoms is derived from carboxylic acids such as caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, isostearic acid, oleic acid, linoleic acid, arachidic acid, and behenic acid. Of the acyl group.
The other lipids may be specifically composed of mixed lipids having the composition ratio shown below, for example.
The phosphatidylcholine / cholesterol / phosphatidylglycerol is 20 to 90/10 to 60/2 to 40 mol%, preferably 30 to 60/20 to 50/15 to 25 mol%.
[0036]
Liposomes obtained from the liposome-forming agent of the present invention can be produced by a known method.
For example, as a general Bangham method, a raw material lipid is dissolved in a soluble organic solvent, and the solvent is removed using an evaporator or the like to form a lipid thin film. A liposome solution can be obtained by sonication. In addition, the lipids of the above raw materials are hydrated, emulsified at a temperature above the phase transition point using a homogenizer, etc., and then pressure filtered using a polycarbonate membrane (Hope MJ et al, Biochimica et Biophysica Acta, 812, 55 (1985)), a liposome solution can be obtained. The obtained liposome may be a multilamellar liposome or a single lamellar liposome and may be adjusted to an appropriate particle size. Preferably, it is a single lamellar liposome having a particle size of 60 to 30 nm, more preferably 90 to 200 nm.
[0037]
Since the liposome-forming agent of the present invention contains the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, it is excellent in storage stability as a liposome solution, has a low content of monoacylphospholipid having strong biotoxicity, and has a nitrogen content such as triethylamine. Since the content of impurities containing is small, it is safe for living bodies. For this reason, the liposome which can be utilized as a highly safe drug delivery system can be obtained by using the liposome formation agent of this invention.
[0038]
The reason for the excellent storage stability as a liposome solution is presumed as follows. Monoacyl phospholipids are less hydrophobic than diacyl phospholipids and are therefore easily detached from the liposome surface. For this reason, in conventional liposomes with a high monoacylphospholipid content, monoacylphospholipids are detached from the liposome surface and the hydration layer on the liposome surface is reduced, so that aggregation of the liposome particles occurs and phase separation is likely to cause instability. In contrast, since the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention has a low monoacyl content, detachment of the phospholipid from the liposome surface hardly occurs. Therefore, the storage stability of the liposome solution is excellent.
[0039]
In the method for synthesizing the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, a base containing nitrogen such as triethylamine is not used as a catalyst. Therefore, no harmful base derived from the catalyst remains in the polyalkylene oxide-modified phospholipid, and a polyalkylene oxide-modified phospholipid that is safe for the living body and high in purity can be obtained.
[0040]
The polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention can be easily produced by the following step (A).
Step (A): An activated form of the polyalkylene oxide compound represented by the above formula (2) and the phospholipid represented by the above formula (3) are solids that are alkaline metal salts whose aqueous solution is alkaline and do not contain nitrogen. A step of reacting in an organic solvent in the presence of a salt.
[0041]
In the activated polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) and the phospholipid represented by the formula (3) used in the step (A), R¹CO, R²CO, R^ThreeO, k, n, X, p and Y are the same as those described in the above formula (1).
[0042]
In the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2), Z is an activity-imparting group, and is a group that imparts a reaction activity with the phospholipid represented by the formula (3) to the polyalkylene oxide compound. Includes attractive groups and other groups. Specific examples of such groups include imidazole group, 4-nitrophenyloxy group, benzotriazole group, chlorine, methoxy group, ethoxy group, propyloxy group, carbonyloxy-N-2-pyrrolidinone group, carbonyl-2- Examples thereof include an oxypyrimidine group, an N-succinimidyloxy group, and a pentafluorobenzoyl group. Among these, an imidazole group, a 4-nitrophenyloxy group, a benzotriazole group, chlorine, and an N-succinimidyloxy group are preferable, and a 4-nitrophenyloxy group is particularly preferable.
[0043]
The phospholipid represented by the formula (3) may be a natural phospholipid or a synthetic phospholipid. Specific examples include natural and synthetic phosphatidylethanolamines such as soybean and soybean hydrogenated phosphatidylethanolamine, egg yolk and egg yolk hydrogenated phosphatidylethanolamine. As the phospholipid represented by the formula (3), phosphatidylethanolamine in which k is 2 is preferable.
[0044]
  The solid salt used in the step (A) is an alkali metal salt whose aqueous solution exhibits alkalinity and does not contain nitrogen. As the solid salt, an activated form of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) and an amino group of the phospholipid of the formula (3) are bonded.CanPH when dissolved in water to form an aqueous solution7.1-13, preferably 7.1-11Show alkalinityAlkali metal carbonates, phosphates or acetates.The solid salt is preferably a solid salt containing sodium or potassium.Yes. IngredientsSpecifically, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate and the like. Among these, sodium hydrogen carbonate and sodium carbonate are preferable, and sodium carbonate is particularly preferable.
  The amount of the solid salt used is preferably 0.1 to 1000 times mol of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2). Since it is easy to stir, it is preferable that it is 1000 times mole or less. The amount of the solid salt used is particularly preferably 1 to 500 times mol.
[0045]
The charged amount of the activated product of the polyalkylene oxide compound of the formula (2) and the phospholipid of the formula (3) to be used is preferably set so that the molar ratio is 1: 1 or the phospholipid is excessive. . Specifically, the molar ratio of the activated polyalkylene oxide compound to the phospholipid is 1: 1 to 1: 5, preferably 1: 1.1 to 1: 2, and more preferably 1: 1.
If the phospholipid is in excess, it can be removed from the product in a later step. On the other hand, when the polyalkylene oxide compound becomes excessive, an unreacted polyalkylene oxide compound remains after completion of the reaction. In this case, when the molecular weight of the polyalkylene oxide compound is about 100 to about 3000, the remaining polyalkylene oxide compound can be removed by a method such as recrystallization or crystallization. However, the yield of polyalkylene oxide-modified phospholipid may decrease. On the other hand, when the molecular weight of the polyalkylene oxide compound is about 3000 or more, it is often difficult to remove the remaining polyalkylene oxide compound, and it becomes difficult to obtain a high-purity polyalkylene oxide-modified phospholipid. A ratio is preferred.
[0046]
In the production method of the present invention, the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) and the phospholipid represented by the formula (3) can be reacted in the presence of the solid salt as described above. . However, in some cases, the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention can be obtained by reacting an activated form of phospholipid with a polyalkylene oxide compound.
[0047]
The organic solvent used in the reaction in the step (A) can be used without particular limitation as long as it does not react with the starting materials and the reaction product or hardly reacts. Examples thereof include aprotic solvents such as ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, benzene and toluene. Of these, toluene and chloroform are preferred. An organic solvent having a hydroxyl group such as ethanol is not preferable because it reacts with the terminal active group of the activated product of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2). Dichloromethane or the like has no problem in reactivity, but is low in work because of its low boiling point.
[0048]
The reaction temperature of the reaction in step (A) is 30 to 90 ° C, preferably 40 to 80 ° C. The reaction time is 1 hour or longer, preferably 2 to 10 hours.
[0049]
Thus, by reacting the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) with the phospholipid represented by the formula (3), the polyalkylene oxide-modified phosphorus of the present invention represented by the formula (1) is reacted. Lipid is obtained.
[0050]
In the step (A), when the terminal of the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) is an amino group, a carboxyl group or a thiol group, particularly an amino group, these groups are protected and used for the reaction. preferable. For example, in the case of an amino group, a protective group such as tert-butoxycarbonyl group or 9-fluorenylmethylcarbonyl group is attached, and in the case of a carboxyl group, it is protected by esterification with a methyl group or the like. Is preferably protected by attaching a protecting group such as an St-butyl sulfide group.
[0051]
After the solid salt is filtered from the reaction solution obtained in the step (A), the polyalkylene oxide modification of the present invention represented by the formula (1) is modified by a method such as concentrating the filtrate or introducing the filtrate into a poor solvent for crystallization. Phospholipids can be obtained with high purity and high yield. The filter medium used for filtration is not particularly limited as long as it can remove the insoluble matter in the liquid to be treated. Usually, various kinds of media such as paper and glass having a reserved particle pore diameter of 1 to 10 μm and solvent resistance. Material filters can be used. There is no restriction | limiting in the filtration method, For example, methods, such as reduced pressure filtration, pressure filtration, and centrifugal filtration, can be used.
In addition, by adjusting the pH of the filtrate obtained in the step (A), the polyalkylene oxide-modified phospholipid can be converted into a hydrogen type in which M in the phosphate group of the formula (1) is hydrogen, and M is sodium or potassium. It can also be converted to some alkali salt type.
[0052]
The obtained polyalkylene oxide-modified phospholipid or the solution of the step (A) containing the polyalkylene oxide-modified phospholipid is subjected to the following steps (B) to (D), thereby further purifying polyalkylene oxide. Modified phospholipids can be obtained. In addition, it is preferable to perform process (B)-(D), after removing solid salt from the reaction liquid of a process (A) by said filtration.
[0053]
In the step (B), an excess of the phospholipid represented by the above formula (3) existing as an insoluble substance when the crystal obtained in the step (A) is dissolved in an organic solvent, that is, an unreacted phospholipid such as phosphatidylethanol. Remove the amine.
As the organic solvent to be used, a solvent that dissolves the target polyalkylene oxide-modified phospholipid but does not dissolve excess phospholipid, or a solvent having low phospholipid solubility is preferable. As the organic solvent, ethyl acetate or acetone is preferable, and acetone is particularly preferable.
0-80 degreeC is preferable and, as for the melting temperature of a process (B), 20-70 degreeC is especially preferable.
The usage-amount of an organic solvent is 1-100 weight times with respect to a crystal | crystallization, Preferably it is 2-50 weight times.
[0054]
After filtering the insoluble matter from the solution of step (B), the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention represented by the above formula (1) is increased by a method such as crystallization by concentrating the filtrate or throwing it into a poor solvent. Purity and high yield can be obtained.
Crystallization can be performed only by cooling the obtained filtrate, but depending on the type of solvent, the polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the formula (1) does not sufficiently precipitate and remains in the solution. The yield may be reduced.
Alternatively, the organic solvent may be removed by distillation or the like for crystallization. When distilling off the organic solvent, it is desirable to carry out under reduced pressure at 80 degrees C or less. When the distillation temperature of the organic solvent exceeds 80 ° C., undesirable side reactions such as decomposition of the acyl group of the polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the formula (1) may occur.
[0055]
In addition, as described above, the pH of the filtrate obtained in the step (B) can be adjusted to convert the polyalkylene oxide-modified phospholipid into a hydrogen type or an alkali salt type.
[0056]
The step (B) may be performed after the step (A) or before the step (C) or the step (D) described below, or after the step (C) and / or the step (D). May be.
[0057]
The crystal obtained in the step (B) can be used as it is as the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, or further subjected to purification.
[0058]
In the method of the present invention, after the step (A), by performing the step (C) and / or (D) described below, the activation represented by the formula (2) as a raw material in the step (A) It is preferable to remove the Z-derived compound formed from the activity-imparting group Z of the polyalkylene oxide compound. Steps (C) and (D) may be after step (A) and before or after step (B), and either step (C) or step (D) may be first. . However, the steps (C) and (D) are preferably performed after the step (B), and the step (D) is preferably performed after the step (C).
[0059]
In the step (C), the crystals obtained in the step (A) are dissolved, cooled or added with a poor solvent to precipitate the polyalkylene oxide-modified phospholipid crystals, thereby removing the compound derived from Z and purification. Do.
The solvent used in the step (C) dissolves the crystals obtained in the step (A) and adds a solvent in which the polyalkylene oxide-modified phospholipid crystals are precipitated by cooling or a poor solvent, thereby adding a polyalkylene oxide-modified phosphorus. A solvent capable of crystallizing the lipid is preferred. A solvent in which the target polyalkylene oxide-modified phospholipid crystallizes and the Z-derived compound remains dissolved when crystals are precipitated is particularly preferred.
The amount of solvent used in the step (C) is 1 to 100 times by weight, preferably 2 to 50 times by weight with respect to the crystal.
[0060]
In the step (C), after recrystallization, cooling is performed, or crystallization is performed using a poor solvent. Preferably, when cooled to 10 ° C. or lower, crystallization is sufficiently performed, and crystals are obtained in a good yield.
The solvent may be distilled off for crystallization. When distilling off the solvent, it is desirable to carry out under reduced pressure at 80 ° C. or lower. If the distillation temperature of the organic solvent exceeds 80 ° C., an undesirable side reaction such as decomposition of the acyl group of the polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the formula (1) may occur.
[0061]
Specific examples of the step (C) include the following methods.
(I) After dissolving in at least one solvent selected from ethyl acetate and acetone, crystals of polyalkylene oxide-modified phospholipid are precipitated by cooling.
(Ii) After dissolving in at least one solvent selected from ethyl acetate and acetone, crystals of polyalkylene oxide-modified phospholipid are precipitated using ether or an aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms.
(Iii) Combining and dissolving at least one solvent selected from ethyl acetate and acetone and a solvent of ether or an aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms, and then cooling the polyalkylene oxide-modified phospholipid crystals. Precipitate.
Among the above methods, the method (i) of dissolving with ethyl acetate, cooling and crystallizing is particularly preferable.
[0062]
In addition, there is no restriction | limiting in particular in the said C5-C8 aliphatic hydrocarbon used at a process (C). For example, pentane, isopentane, neopentane, hexane, isohexane, 3-methylpentane, neohexane, 2,3-dimethylbutane, heptane, 2-methylhexane, 3-methylhexane, 3-ethylpentane, 2,2-dimethylpentane 2,3-dimethylpentane, 3,3-dimethylpentane, 2,3,3-trimethylbutane, octane, 2-methylheptane, 3-methylheptane, 4-methylheptane, 3-ethylhexane, 2,2- Dimethylhexane, 2,3-dimethylhexane, 2,4-dimethylhexane, 2,5-dimethylhexane, 3,3-dimethylhexane, 3,4-dimethylhexane, 2-methyl-3-ethylpentane, 3-methyl -3-ethylpentane, 2,2,3-trimethylpentane, 2,2,4-trime Dimethylolpentane, and the like 2,2,3,3-tetramethyl-butane. Of these, hexane and heptane are preferred.
[0063]
In the step (C), when it is desired to further increase the purity, the polyalkylene oxide-modified phospholipid having a further excellent purity can be obtained by repeating the step (C) several times in the same manner.
The crystal obtained by the step (C) can be used as it is as the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, or can be subjected to other purification steps.
[0064]
In the step (D), after the crystal is dissolved in a solvent, the compound derived from Z is removed by a method such as adding an adsorbent and stirring. Step (D) can also be carried out using a filtrate obtained by filtering the reaction solution obtained in step (A).
The solvent used in the step (D) is preferably ethyl acetate, chloroform, toluene, acetone or the like, and particularly preferably ethyl acetate.
[0065]
The treatment temperature using the adsorbent is 10 to 85 ° C, preferably 40 to 70 ° C, and the time is 10 minutes to 5 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
The crystals obtained in the step (A) may be heated and dissolved and treated with an adsorbent. However, since the crystals do not dissolve at the above temperature or the viscosity of the solution is often high, the polyester of the present invention such as ethyl acetate is often used. It is preferable to dilute in a solvent that dissolves the alkylene oxide-modified phospholipid. When the treatment temperature is less than 10 ° C., polyalkylene oxide-modified phospholipid may be precipitated, and when the adsorbent is removed, the polyalkylene oxide-modified phospholipid is also removed together and the yield is lowered, which is not preferable. Moreover, when it exceeds 85 degreeC, when a trace amount of water | moisture content exists, a hydrolysis etc. of polyalkylene oxide modification phospholipid may occur during adsorption agent processing.
The amount of the adsorbent used is 0.1 to 200 parts by weight, preferably 1 to 50 parts by weight, based on 100 parts by weight of the crystal to be treated. When the adsorbent amount is 0.1 to 200 parts by weight, the Z-derived compound can be removed sufficiently efficiently.
[0066]
After performing the adsorbent treatment in the step (D) and removing the adsorbent by a method such as filtration, it can be cooled or crystallized using a poor solvent. Preferably, when cooled to 10 ° C. or lower, crystallization is sufficiently performed, and crystals are obtained in a good yield.
After removing the adsorbent, the solvent may be distilled off for crystallization, but when the solvent is distilled off, it is desirable to carry out the reaction at 80 ° C. or lower under reduced pressure. If the distillation temperature of the organic solvent exceeds 80 ° C., an undesirable side reaction such as decomposition of the acyl group of the polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the formula (1) may occur.
[0067]
The adsorbent used in the step (D) is an alkaline earth metal oxide, an alkaline earth metal hydroxide, an adsorbent containing aluminum or silicon, or activated carbon, such as aluminum hydroxide, aluminum oxide, magnesium oxide, Examples include adsorbents containing activated carbon such as magnesium hydroxide and silicon oxide. Commercially available adsorbents containing these compounds include Kyoward 200, Kyoward 300, Kyoward 500, Kyoward 600, Kyoward 700, Kyoward 1000, Kyoward 2000 (manufactured by Kyowa Chemical Industry Co., Ltd., Trademark), Tomix-AD300, Tomix-AD500, Tomix-AD700 (trade name, manufactured by Iwata Pharmaceutical Co., Ltd.), and the like. Adsorbents can be used alone or in combination of two or more.
[0068]
The crystal obtained in the step (D) can be used as it is as the polyalkylene oxide-modified phospholipid of the present invention, or the adsorbent treatment is further performed without crystallizing the filtrate of the step (D). Further purification is also possible.
[0069]
By the production method as described above, the content of by-product monoacylphospholipid is low, and it is used as a catalyst in the conventional production method, and it is difficult to completely separate from the final product. A high-purity polyalkylene oxide-modified phospholipid having a low content of impurities such as a base having a nitrogen atom remaining therein can be easily produced in a high yield.
[0070]
【The invention's effect】
  The present inventionManufactured inPolyalkylene oxide modified phospholipids are new and useful. The present inventionManufactured inPolyalkylene oxide-modified phospholipid is a high purity polyalkylene oxide-modified phospholipid with a low content of monoacyl phospholipids and nitrogen atoms and high safety for living organisms. It can be suitably used as an agent, polymer micelle forming agent, dispersing agent, amphiphilic chemical modifier, liposome forming agent and the like. Furthermore, among these, it can utilize suitably as a liposome formation agent.
  Of the present inventionOf polyalkylene oxide modified phospholipidsIn the production method, when the polyalkylene oxide compound represented by the formula (2) and the phospholipid represented by the formula (3) are dissolved in water,The aqueous solution is pH 7.1-13Alkali metal salt showing alkalinityCarbonate, phosphate or acetateIn an organic solvent in the presence of a solid salt that does not contain nitrogenBecausePolyalkylene oxide-modified phospholipids with a low monoacylphospholipid content and a low content of nitrogen atoms can be easily produced with high purity and high yield.
[0071]
【Example】
Examples of the present invention will be described below. In each example,% is% by weight unless otherwise stated.
[0072]
Example 1
(1) Synthesis of monomethyl polyoxyethylene carbamyl distearoylphosphatidylethanolamine (formula (4) shown below)
[0073]
[Chemical 9]

[0074]
Toluene (80 mL) was added to polyoxyethylene monomethyl ether (molecular weight 2000, 20 g, 10 mmol), refluxed at 110 ° C., and dehydrated for 1 hour. After cooling to 50 ° C., 1,1′-carbonyldiimidazole (1.95 g, 12 mmol) was added and reacted for 2 hours to obtain an activated product. Next, sodium carbonate (42.4 g, 400 mmol) and distearoylphosphatidylethanolamine (11.22 g, 15 mmol) were added, and the mixture was heated to 65 ° C. and reacted for 8 hours.
After filtering sodium carbonate, hexane (300 mL) was added to the filtrate for crystallization. After filtering the crystal (1 g of this crystal was sampled. This is designated as sample (1) in step (A): hereinafter, sampled in the same manner as samples (2) to (6)), and acetone ( 80 mL) was added and warmed to 50 ° C. It filtered with the glass filter and the insoluble matter was removed. Hexane (160 mL) was added to the filtrate for crystallization and cooled to 5 ° C. Thereafter, the crystals were filtered (sample (2) in step (B)).
[0075]
Ethyl acetate (400 mL) was added to the crystals, dissolved at 65 ° C., stirred for 30 minutes, and cooled to 5 ° C. The precipitated crystals were filtered (sample (3) in step (C)). Similarly, the step with ethyl acetate was performed once again (sample (4) in step (C)).
The crystals were dissolved in ethyl acetate (400 mL), and Kyoward # 2000 (5 g) and Kyoword # 700 (0.8 g) were added as adsorbents, followed by stirring at 65 ° C. for 1 hour. The adsorbent was filtered, cooled to 5 ° C., and crystallized (sample (5)). Similarly, after the crystals were filtered, the adsorbent treatment was performed once. The crystals were washed with hexane (200 mL), filtered and dried to obtain 14.6 g (yield 52.2%) of the target compound (sample (6) in step (D)). The purity of the finally obtained crystal was 98.4%.
[0076]
Analysis of the product at each stage was performed by thin layer chromatography (TLC) using silica gel plates. As a developing solvent, a mixed solvent having a mixing ratio of chloroform and methanol of 85:15 volume ratio was used, and coloring was performed with iodine vapor, and the contained substances were quantified by comparison with a known amount of standard substance.
Similarly, TLC was performed using a mixed solvent having a mixing ratio of 65: 25: 4: 0.1 of chloroform, methanol, water and ammonia water as a developing solvent.
The former can quantify lysates, free phospholipids, free polyethylene glycol derivatives, and triethylamine as impurities, and the latter can quantify the amount of triethylamine in the triethylamine salt of the phosphoric acid moiety in polyoxyethylene-modified phospholipids. .
Table 1 shows the results obtained for the purity by these methods.
[0077]
On the other hand, samples (1) to (6) were also analyzed in order to measure the amount of Z-derived compound contained in the substance in each step. Samples (1) to (6) were dried under reduced pressure, 50 mg each was taken into a sample tube, and the total amount was made 5 g with ethanol and dissolved. Absorbance at 248 nm derived from 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) was measured with a spectrophotometer. From the measured value of each sample, the removal rate of the compound derived from 1,1′-carbonylimidazole in each step was determined, and the obtained removal rates are shown in Table 2.
[0078]
From the results in Table 2, it was confirmed that the compound derived from Z decreased and the polyalkylene oxide-modified phospholipid was purified in each step. In the end, about 0.02% of the compound derived from 1,1'-carbonyldiimidazole is contained, but this value is negligible as the impurity content.
[0079]
Example 2
(2) Synthesis of monomethyl polyoxyethylene carbamyl distearoylphosphatidylethanolamine (formula (5) shown below)
[0080]
[Chemical Formula 10]

[0081]
Polyoxyethylene monomethyl ether (molecular weight 2000, 50 g, 25 mmol), sodium carbonate (53 g, 500 mmol) and toluene (200 mL) were placed in the reactor and heated to 75 ° C. p-Nitrophenyl chloroformate (12.6 g, 62.5 mmol) was added and reacted for 9 hours to obtain an activated product. After cooling to 65 ° C., distearoylphosphatidylethanolamine (28.1 g, 37.5 mmol) was added and reacted for 7.5 hours.
After filtering sodium carbonate, hexane (500 mL) was added to the filtrate, and after cooling to 5 ° C., the precipitated crystals were filtered. Acetone (200 mL) was added to the crystals and heated to 50 ° C., and then filtered through a glass filter to remove insoluble matters (step (B)).
[0082]
Hexane (500 mL) was added to the filtrate and then cooled to 5 ° C. The precipitated crystals were filtered and subjected to step (C). In step (C), ethyl acetate (750 mL) was added and dissolved at 65 ° C., stirred for 30 minutes, cooled to 5 ° C., and the precipitated crystals were filtered. Similarly, the step (C) using ethyl acetate was performed once more.
The crystals were dissolved in ethyl acetate (750 mL), and Kyoward # 2000 (12 g) and Kyoword # 700 (1 g) were added as adsorbents, followed by stirring at 60 ° C. for 1 hour. The adsorbent was filtered and then cooled to 5 ° C., and the precipitated crystals were filtered (step (D)). Similarly, the treatment with the adsorbent in the step (D) was performed twice.
The crystals were washed with hexane (300 mL), filtered and dried to obtain 38.2 g (yield 54.6%) of the target compound. The purity was 99.5%. The purity results are shown in Table 1.
[0083]
Example 3
(3) Synthesis of monomethyl polyoxyethylene carbamyl distearoylphosphatidylethanolamine (formula (6) shown below)
[0084]
Embedded image

[0085]
Polyoxyethylene monomethyl ether (molecular weight 5000, 20 g, 4 mmol), sodium carbonate (17.0 g, 160 mmol) and toluene (75 mL) were added and heated to 75 ° C. p-Nitrophenyl chloroformate (2.7 g, 13.2 mmol) was added and reacted for 9 hours to obtain an activated product. After cooling to 65 ° C., distearoylphosphatidylethanolamine (4.5 g, 6 mmol) was added and reacted for 6 hours.
After filtering sodium carbonate, hexane (200 mL) was added to the filtrate, and the precipitated crystals were filtered. Acetone (150 mL) was added to the crystals and heated to 50 ° C., and then insoluble matters were removed with a glass filter (step (B)).
[0086]
Hexane (300 mL) was added for crystallization. After filtration, ethyl acetate (400 mL) was added to the obtained crystal, dissolved at 65 ° C., stirred for 30 minutes, cooled to 5 ° C., and the precipitated crystal was filtered (step (C)). Furthermore, the process (C) using ethyl acetate was performed twice.
The crystals were dissolved in ethyl acetate (360 mL), then Kyoward # 2000 (4 g) and Kyoword # 700 (0.2 g) were added as adsorbents, and the mixture was stirred at 65 ° C. for 1 hour. The adsorbent was filtered and then cooled to 5 ° C., and the precipitated crystals were filtered (step (D)). Similarly, the treatment with the adsorbent in the step (D) was performed twice.
The crystals were washed with hexane (90 mL), filtered and dried to obtain 15.2 g (yield 65.4%) of the target compound. The purity was 98.4%. The purity results are shown in Table 1.
[0087]
Example 4
(4) Synthesis of monomethyl polyoxyethylene carbamyl dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (formula (7) shown below)
[0088]
Embedded image

[0089]
Polyoxyethylene monomethyl ether (molecular weight 5000, 20 g, 4 mmol), sodium carbonate (33.9 g, 320 mmol) and toluene (75 mL) were added and heated to 75 ° C. p-Nitrophenyl chloroformate (2.82 g, 14 mmol) was added and reacted for 9 hours to obtain an activated product. After cooling to 65 ° C., dipalmitoylphosphatidylethanolamine (3.2 g, 6 mmol) was added and allowed to react for 5 hours.
After filtering sodium carbonate, hexane (200 mL) was added to the filtrate and cooled to 5 ° C. The precipitated crystals were filtered to obtain crystals. Acetone (150 mL) was added to the crystals and heated to 50 ° C., and then insoluble matters were removed with a glass filter (step (B)).
[0090]
Hexane (300 mL) was added to the filtrate for crystallization. After filtration, ethyl acetate (400 mL) was added to the obtained crystals, dissolved at 65 ° C., and stirred for 30 minutes. After cooling to 5 ° C., the precipitated crystals were filtered (step (C)). Furthermore, the process (C) using ethyl acetate was performed twice.
The crystals were dissolved in ethyl acetate (360 mL), and Kyoward # 2000 (4 g) and Kyoword # 700 (0.2 g) were added as adsorbents. The adsorbent was filtered and then cooled to 5 ° C., and the precipitated crystals were filtered (step (D)). Similarly, the treatment with the adsorbent in the step (D) was performed twice.
The crystals were washed with hexane (90 mL), filtered and dried to obtain 15.2 g (yield 65.6%) of the target compound. The purity was 98.5%. The purity results are shown in Table 1.
[0091]
Comparative Example 1
(1) Synthesis of pyridyldithiopropionoylamino polyethylene glycol distearoylphosphatidylethanolamine
Pyridyldithiopropionoylamino polyethylene glycol succinimidyl carbonate (1 g, 0.42 mmol) is dissolved in chloroform (10 mL), distearoylphosphatidylethanolamine (0.36 g, 0.44 mmol), then triethylamine (0.33 mL). 2.37 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at 40 ° C. for 10 minutes. The reaction solution was concentrated with an evaporator under reduced pressure, acetonitrile (50 mL) was added, and the solution was refrigerated at 4 ° C. overnight. Next, centrifugation was performed to separate a clear solution. After concentrating the solution with an evaporator, the crystals were dried. The yield was 1.15g. The yield was 90.8%. The purity results are shown in Table 3.
[0092]
The free triethylamine content and free salt content shown in Table 3 can be quantified up to 5% in a thin layer chromatography (TLC) spot, but there is no quantification beyond that. Therefore, about 5%, it was set as> 5.
[0093]
Comparative Example 2
(2) Synthesis of monomethylpolyoxyethylenecarbamyl distearoylphosphatidylethanolamine
Benzene (75 mL) was added to polyoxyethylene monomethyl ether (molecular weight 2000, 20 g, 10 mmol), refluxed and dehydrated. Carbonyldiimidazole (1.78 g, 11 mmol) was added, and the mixture was refluxed for 2 hours to obtain an activated product. Distearoylphosphatidylethanolamine (7 g, 9.36 mmol) and triethylamine (3.1 mL, 22 mmol) were added and refluxed for 20 hours. The reaction solution was concentrated with an evaporator to obtain a crude product.
The crude product was purified by C-18 reverse phase silica gel chromatography. (Bio-Gel A-1.5m) was used for C-18 reverse phase silica gel, and ethanol / water = 4/1 was used as an eluent. The yield was 5.0 g and the yield was 18%. The purity results are shown in Table 3.
[0094]
Comparative Example 3
(3) Synthesis of monomethyl polyoxyethylene carbamyl 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylethanolamine
After dissolving polyoxyethylene monomethyl ether (molecular weight 2000, 5 g, 2.5 mmol) in chloroform / toluene = 50/2 (wt / wt) (25 mL), triphosgene (0.89 g, 3 mmol) was added, Reacted for hours. To this solution was added diethyl ether (75 mL) to precipitate. The precipitate was filtered and dried to obtain monomethyl polyoxyethylene chloroformate (4.7 g, 91%).
Monomethyl polyoxyethylene chloroformate (4 g, 1.94 mmol) and 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylethanolamine (1.65 g, 2.3 mmol) were dissolved in chloroform (20 mL) and triethylamine (0.39 mL, 2.76 mmol) was added and reacted at 60 ° C. for 3 hours.
After filtering the insoluble material, the reaction solution was concentrated with an evaporator. Water (20 mL) was dissolved in the residue, and 0.1 N hydrochloric acid (5.0 mL) was added to acidify the aqueous solution. Methylene chloride (25 mL) was added to the aqueous solution and extracted. Similarly, extraction was repeated twice, sodium sulfate (30 g) was added to the combined extract, and dehydrated. After filtering sodium sulfate, it concentrated with the evaporator. The residue was purified by silica gel column chromatography to obtain 1.5 g of the target compound. The yield was 28%. The purity results are shown in Table 3.
[0095]
Comparative Example 4
(4) Synthesis of t-butoxycarbonylhydrazide polyoxyethylene succinyl phosphatidylethanolamine
t-Butoxycarbonylhydrazide polyoxyethylene succinimidyl carbonate (1 g, 0.42 mmol) was dissolved in chloroform (6 mL). Distearoylphosphatidylethanolamine (0.292 g, 0.39 mmol) and triethylamine (0.144 mL, 1.04 mmol) were added and reacted at 45 ° C. for 10 minutes.
Acetic acid (0.06 mL, 1.05 mmol) was added to the reaction solution, and the mixture was concentrated with an evaporator. Water (7.5 mL) was added to the residue, and after dissolution, a small amount of chloroform was distilled off with an evaporator. The reaction solution was placed in a Spectrapor CE dialysis tube (MWCO 300,000), and dialyzed at 4 ° C. with 50 mM physiological saline (1500 mL × 3) (dialysis for 8 to 16 hours / time). Further, after dialysis with ion-exchanged water, the solution was filtered through a 0.2 μm sterilizing filter. The target product was obtained after lyophilization. The yield was 0.55 g, and the yield was 43.3%. The purity results are shown in Table 3.
[0096]
[Table 1]

[0097]
[Table 2]

[0098]
[Table 3]

[0099]
Notes on Table 1 and Table 3
* 1 Purity 1: The purity of the polyalkylene oxide-modified phospholipid represented by the formula (1). (unit%)
* 2 Lyso form content: Content of monoacyl phospholipid form. (unit%)
* 3 Free PE content: Content of unreacted phospholipids. (unit%)
* 4 Free PEG derivative content: Content of polyethylene glycol and its derivatives. (unit%)
* 5 Free triethylamine content: Triethylamine content. (unit%)
* 6 Triethylamine content in free salt: Triethylamine content in triethylamine phosphate. (unit%)
[0100]
From the results of Tables 1 and 3, the production methods of the examples have a lower content of impurities such as lyso form and triethylamine than the comparative examples, and can produce polyalkylene oxide-modified phospholipids with high purity. Recognize.
[0101]
Example 5
An emulsion was prepared using the monomethyl polyoxyethylene carbamyl distearoyl phosphatidylethanolamine of Example 3. That is, after heating the oil phase part containing an emulsifier among the base materials which consist of a composition of Table 4 to 60 degreeC, and melt | dissolving uniformly, the water phase part was added at the same temperature, stirring.
[0102]
[Table 4]

[0103]
After the produced emulsion was stored at 40 ° C. for one month, the emulsified state was evaluated according to the following criteria. The results are shown in Table 6.
3: Stable state
2: Slightly non-uniform state
1: Creaming or separated
[0104]
Moreover, the emulsion immediately after preparation was apply | coated to skin and the sensory test was done. The sensory evaluation was conducted by five expert panelists. In the evaluation method, the upper arm was washed and then the sample was applied, and the evaluation of skin irritation immediately after application and after overnight was evaluated according to the following three-stage evaluation. The total score for the five people is shown in Table 6.
3: Normal. There is no abnormality at all.
2: There is a sense of incongruity. I feel a little grudge.
1: There is itch. Redness is observed on the skin.
[0105]
Example 6
A cream was made using the monomethyl polyoxyethylene carbamyl distearoyl phosphatidylethanolamine of Example 2. That is, after heating the oil phase part containing an emulsifier among the base materials which consist of a composition of Table 5 to 60 degreeC, and melt | dissolving uniformly, the water phase part was added at the same temperature, stirring.
[0106]
[Table 5]

[0107]
Evaluation similar to Example 5 was performed about the produced cream. The results are shown in Table 6.
[0108]
Comparative Examples 5 and 6
Using the monomethyl polyoxyethylene carbamyl distearoylphosphatidylethanolamine of Comparative Example 3, the same tests as in Example 5 and Example 6 were performed. The results are shown in Table 6.
[0109]
[Table 6]

[0110]
Example 7
Liposome solution stability evaluation
Dipalmitoylphosphatidylcholine (1.92 g, 2.64 mmol), cholesterol (0.45 g, 1.32 mmol), monomethyl polyoxyethylene carbamyl distearoylphosphatidylethanolamine obtained in Example 2 (0.42 g, 0.15 mmol) Was added to an eggplant-shaped flask and dissolved by adding 50 mL of chloroform, and the solvent was removed by a rotary evaporator to form a lipid thin film on the inner wall of the flask. The solvent was sufficiently removed under reduced pressure, 30 mL of a phosphate buffered saline solution having a pH of 7 was added and dispersed, and further treated with an ultrasonic cleaner for 5 minutes to obtain a liposome solution.
The resulting liposome solution was left at room temperature for 1 month. The dispersion state of the liposome solution after one month was not visually changed, and was a uniform liposome solution.
[0111]
Comparative Example 7
The same evaluation as in Example 7 was performed using the monomethyl polyoxyethylene carbamyl distearoyl phosphatidylethanolamine obtained in Comparative Example 2. As a result, the liposome solution was not uniform, and lipid particles were precipitated.
[0112]
Example 8
Modification of asparaginase with carboxymethyl polyoxyethylene carbamyl distearoylphosphatidylethanolamine
Carboxymethyl polyoxyethylene carbamyl distearoyl phosphatidylethanolamine (5 g, 0.86 mmol) obtained in the same manner as in Example 3 was dissolved in 50 mL of chloroform, and N-hydroxysuccinimide (0.15 g, 1.29 mmol) was dissolved. ), Dicyclohexylcarbodiimide (0.27 g, 1.29 mmol) dissolved in a small amount of chloroform was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Then, diethyl ether was added to the solution from which insoluble matter was removed by filtration, and the precipitated crystals were obtained by filtration. The solvent was removed under reduced pressure and used in the next step.
[0113]
0.1 g of asparaginase was dissolved in 50 mL of phosphate buffered saline at pH 7.4, succinimidyl carboxymethyl polyoxyethylene carbamyl distearoyl phosphatidylethanolamine obtained above was added, and 4 hours at 5 ° C. Stir. This reaction solution was dialyzed against phosphate buffered saline solution at pH 7.4, 4 ° C. to remove unreacted substances, and then lyophilized to obtain carboxymethyl polyoxyethylene carbamyl distearoyl phosphatidylethanolamine. A dried product bound to asparaginase could be obtained.
[0114]
Example 9
Preparation of polymeric micelle solution of soybean hydrogenated phosphatidylcholine using carboxymethylpolyoxyethylenecarbamyl distearoylphosphatidylethanolamine
Soybean hydrogenated phosphatidylcholine (0.1 g, 0.13 mmol) and carboxymethyl polyoxyethylenecarbamyl distearoylphosphatidylethanolamine (1 g, 17 mmol) obtained in the same manner as in Example 3 were added to distilled water (5 mL). Stir and mix. Distilled water (95 mL) was gradually added and stirred into the uniform mixed solution to obtain a transparent and uniform polymer micelle solution. The particle size distribution of the obtained solution was measured using a particle size measuring device (NICOMP Model 370: manufactured by Nozaki Sangyo Co., Ltd.). As a result, the average particle size was 35 nm.
The obtained Takako micelle solution was allowed to stand at room temperature for 1 month. The state of the polymer micelle solution after one month was a uniform polymer micelle solution with no visible change and no precipitate.

Claims (14)

The manufacturing method of the polyalkylene oxide modification phospholipid which has the following process (A).
Step (A): An activated product of a polyalkylene oxide compound represented by the following formula (2) and a phospholipid represented by the following formula (3) are mixed with an alkali metal whose aqueous solution exhibits pH 7.1 to 13 alkalinity. A step of reacting in an organic solvent in the presence of a solid salt that is carbonate, phosphate or acetate and does not contain nitrogen.

(In the formula (2), R ³ O is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, n is an average added mole number of an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and X is the number of carbon atoms. 1 to 3 divalent hydrocarbon groups or —C (═O) (CH ₂ ) q— (where q is 1 to 4), p is 0 or 1. When p is 0, Y is hydrogen An atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and when p is 1, Y is a hydrogen atom, an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a glycidyl group, or a thiol group, and Z is an activity-imparting group.)

(In Formula (3), R ¹ CO and R ² CO are each independently an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, and k is 1 to 6). The production method according to claim 1 , wherein R ¹ CO and R ² CO are acyl groups having 12 to 20 carbon atoms. The production method according to claim 1 or 2 , wherein p is 0 and Y is a methyl group. The production method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the solid salt used in the step (A) is sodium carbonate, and the organic solvent is toluene or chloroform. The manufacturing method in any one of Claims 1 thru | or 4 which has the following process (B) after a process (A).
Process (B): The process of removing the unreacted phospholipid shown by Formula (3) using ethyl acetate or acetone. The manufacturing method according to any one of claims 1 to 5 which has the following process (C) after a process (A).
Step (C): A step of recrystallization using ethyl acetate and / or acetone as a solvent. The production method according to claim 6 , wherein in the step (C), at least one compound selected from the group consisting of an aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms and an ether is used as a solvent. The process according to claim 6 or 7 , wherein the step (C) is performed after the step (B). The manufacturing method in any one of Claim 1 thru | or 8 which has the following process (D) after a process (A).
Step (D): A step of performing purification using an adsorbent. The production method according to claim 9 , wherein the adsorbent used in the step (D) is an alkaline earth metal oxide, an alkaline earth metal hydroxide, an adsorbent containing aluminum or silicon, or activated carbon. The method according to claim 9 or 10 , wherein the step (D) is performed after the step (B). The polyalkylene oxide-modified phospholipid is a compound represented by the following formula (1), wherein the content of the monoacyl phospholipid body is 3% by weight or less and the content of the base having a nitrogen atom is 0.02% by weight or less. The manufacturing method according to any one of claims 1 to 11 .

(In the formula (1), R ¹ CO and R ² CO are each independently an acyl group having 4 to 24 carbon atoms, k is 1 to 6, R ³ O is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and n is carbon. The average added mole number of the oxyalkylene group having 2 to 4 is a number of 10 to 800. M is a hydrogen atom, sodium or potassium, X is a divalent hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms or -C (= O) (CH ₂₎ q- (wherein q is 1 to 4), when p is 0 or 1 .p is 0, Y is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms .p is In the case of 1, Y is a hydrogen atom, amino group, carboxyl group, aldehyde group, glycidyl group or thiol group.) The production method according to claim 12 , wherein the content of the monoacylphospholipid body is 2% by weight or less . The production method according to claim 12 , wherein p is 0, Y is a methyl group, and the content of the monoacylphospholipid body is 0.5% by weight or less .