CN1261450C - 抗血栓形成化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)化合物或其可药用盐或其前药：其中R1是苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基、(异)喹啉基、四氢(异)喹啉基、3，4-二氢-1H-异喹啉基、苯并二氢吡喃基、或樟脑基，所述基团可选择性地被一个或多个选自(1-8C)烷基或(1-8C)烷氧基的取代基取代；R2和R3独立地为H或(1-8C)烷基；R4是(1-8C)烷基或(3-8C)环烷基；或者R3和R4与它们所连的氮原子形成可选择性地包含另外的杂原子的非芳香(4-8)元环，该环可选择性地被(1-8C)烷基或SO2-(1-8C)烷基取代；Q是链长为10-70个原子的间隔基；Z是包含2-6个单糖单元的带负电荷的低聚糖残基，其中的负电荷由带正电荷的抗衡离子抵消。本发明化合物具有抗血栓形成活性，因此可用于治疗或预防与凝血酶有关的疾病。

Description

抗血栓形成化合物
本发明涉及新的抗血栓形成化合物、其制备方法、含有所述化合物作为活性组分的药物组合物、以及所述化合物在制备药物中的应用。
丝氨酸蛋白酶是在血凝级联中起重要作用的酶。这组蛋白酶的成员有例如凝血酶、胰蛋白酶、VIIa因子、IXa因子、Xa因子、XIa因子、XIIa因子、和C蛋白。
凝血酶是血凝级联中最后的丝氨酸蛋白酶。凝血酶的主要功能是将血纤维蛋白原裂解以生成血纤维蛋白单体，血纤维蛋白单体会交联以形成不溶性凝胶。此外，凝血酶通过活化该交联前期中的V和VIII因子来调节其自身生成。凝血酶在细胞水平上也具有重要作用，在细胞水平上凝血酶作用于特异性受体，以引起血小板聚集、内皮细胞活化以及成纤维细胞增殖。因此凝血酶在止血和血栓形成中起中枢调节作用。因为凝血酶抑制剂可能具有广泛医疗应用，因此人们在该领域作了大量研究。
Xa因子—另一重要丝氨酸蛋白酶催化凝血酶原转化成凝血酶。
在丝氨酸蛋白酶合成抑制剂、更具体说是凝血酶合成抑制剂的开发中，苄脒部分是其中一个关键结构。其模拟它的天然底物的碱性氨基酸Arg和Lys的质子化侧链。人们已经对具有苄脒部分的化合物作了广泛和反复研究。在这类凝血酶抑制剂当中，一种非常有效的代表性化合物是氨基酸衍生物Nα-(2-萘基磺酰基)-甘氨酰基-4-脒基苯基丙氨酸哌啶(NAPAP) J.等人，Thromb.Res.29，635-642，1983)。然而，NAPAP的特性对于治疗应用没有吸引力：例如，该化合物具有低的凝血酶特异性，并且溶解性很差。此后制备了NAPAP的衍生物，例如EP 0236163中公开的N-烷基取代衍生物，或EP 0558961、Proc.Am.Pept.Symp.，13th(60LXAW)；94；pp.643-5(Stüber，W.等人，Pept：Chem.，Struct.Biol.，)、Proc.Int.Symp.Controlled Release Bioact.Mater.(PCRMEY，10220178)；94；Vol.21st；pp.712-12(Walter，E.等人)、和EP0513543中公开的糖肽衍生物。然而，虽然与NAPAP相比这些衍生物具有改善的药理特性，但是所有这些由NAPAP衍生的化合物仍然仅具有直接凝血酶抑制剂活性，并且具有有限的血浆半衰期和快的清除速度(因此仅在很短时间内表现出其抗凝血酶活性)。
现在已经发现，式(I)化合物或其可药用盐或其前药是有效的多用途抗血栓形成剂：
其中R1是苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基、(异)喹啉基、四氢(异)喹啉基、3，4-二氢-1H-异喹啉基、苯并二氢吡喃基、或樟脑基，所述基团可选择性地被一个或多个选自(1-8C)烷基或(1-8C)烷氧基的取代基取代；
R2和R3独立地为H或(1-8C)烷基；
R4是(1-8C)烷基或(3-8C)环烷基；
或者R3和R4与它们所连的氮原子形成可选择性地包含另外的杂原子的非芳香(4-8)元环，该环可选择性地被(1-8C)烷基或SO2-(1-8C)烷基取代；
Q是链长为10-70个原子的间隔基；
Z是包含2-6个单糖单元的带负电荷的低聚糖残基，其中的负电荷由带正电荷的抗衡离子抵消。
本发明化合物具有抗凝血酶活性，但是本发明化合物的结构可选择性地被修饰，因此本发明化合物具有可调节的、由非介导的直接抗凝血酶(IIa因子)活性和抗凝血酶III(AT-III)介导的抗Xa活性组成的混合特性。因此本发明化合物是双重抑制剂。本发明化合物具有长的血浆半衰期，因此与NAPAP或其上述衍生物相比，本发明化合物具有延长的抗凝血酶活性。此外，本发明化合物可避免血小板因子4(PF4)的抵消作用。低毒性也是本发明化合物的优点。
EP 0649854中公开了另一种双重抑制剂。与本发明化合物不同，除了表现出AT-III介导的抗xa活性之外，在该文献中公开的结合糖化合物还表现出间接的、AT-III介导的抗凝血酶活性。
本发明化合物可用于治疗和预防凝血酶介导的以及与凝血酶有关的疾病。包括其中凝结级联被激活的多种血栓形成和前血栓形成病症，例如但不限于深度静脉血栓形成、肺栓塞、血栓静脉炎、血栓形成或栓塞所致的动脉闭塞、血管成形术或血栓溶解期间或之后的动脉再闭塞、动脉损伤或侵袭性心脏操作后的再狭窄、手术后静脉血栓形成或栓塞、急性或慢性动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞、癌症和癌转移、和神经变性疾病。本发明化合物还可在体外血循环、例如透析和手术所需的体外循环中用作抗凝血剂。
本发明化合物的混合特性可通过改变低聚糖残基Z的性质和间隔基Q的长度来调节。因此可获得一定范围的性质。
在本发明化合物中，具有2-6个糖单元、带有负电荷的所有低聚糖残基都是适用的。合适的本发明化合物是其中Z是硫酸化或磷酸化低聚糖残基的化合物。低聚糖残基Z优选衍生自本身具有AT-III介导的抗Xa活性的低聚糖，例如在EP 0454220和EP 0529715中公开的糖。特别优选的低聚糖残基是五聚糖残基。Z最优选具有式(II)所示结构：
其中R5独立地为OSO3 -或(1-8C)烷氧基。
其它优选的本发明化合物是其中R1是苯基、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基或萘基的式I化合物。在优选的化合物中，NR3R4代表哌啶基。R2优选为H。
对于本发明化合物的抗血栓形成活性来说，间隔基的化学结构的重要性不大或不重要，然而，其不能是完全的刚性结构。高柔顺性间隔基比其它基团更合适。
此外，出于合成方面的原因，某些间隔基比其它间隔基更合适。
易于使用的合适的间隔基具有例如式(III)所示结构：
-[(CH2)2O]m-[(CH2)n-NR3-C(O)]p-W-(CH2)s-      (III)
其中
W是-[1，4-亚苯基-NR3-C(O)]q-(CH2)r-S-或
-(CH2)t-S-(CH2)u-[0(CH2)2]v-O-(CH2)w-C(O)-NR3-；
且R3独立地为H或(1-8C)烷基；
m＝1-12；n＝1-8；p＝0-4；q＝0或1；r＝1-8；s＝1-8；t＝1-8；u＝1-8；v＝1-12；w＝1-8；总的原子数是10-70；-[(CH2)2O]m-部分是末端，Q通过该部分连接在Z上。
优选的间隔基如下：
-[(CH2)2O]5-(CH2)2-NH-C(O)-CH2-S-CH2-；
-[(CH2)2O]5-(CH2)2-NH-C(O)-CH2-S-(CH2)2-[O(CH2)2]3-O-CH2-C(O)-NH-(CH2)4-；和
-[(CH2)2O]3-(CH2)2-NH-C(O)-1，4-亚苯基-NH-C(O)-CH2-S-CH2-。
在描述式(I)化合物时使用下述定义。
术语(1-8C)烷基表示具有1-8个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、己基和辛基。甲基和乙基是优选的烷基。
术语(1-8C)烷氧基表示具有1-8个碳原子的烷氧基，其中的烷基部分具有如上所述的含义。甲氧基是优选的烷氧基。
术语(3-8C)环烷基表示具有3-8个碳原子的环烷基，它们是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。环戊基和环己基是优选的环烷基。
间隔基的长度是指间隔基的原子数目，所述原子数目是沿着Z和该分子的肽部分之间的最短链计数的，不包括连接到间隔基上的低聚糖Z的氧原子。
术语“前药”是指其中脒基部分的氨基被保护、例如被羟基或(1-6C)烷氧基羰基保护的本发明化合物。
本发明化合物是这样制得的：通过本领域的公知方法用半胱氨酸或赖氨酸将NAPAP(或NAPAP类似物)在甘氨酸位点上衍化，然后将所得化合物(a)偶联到低聚糖-间隔基残基上，或者(b)偶联到间隔基上，然后用硫醇衍化，之后再偶联到低聚糖残基上。可使用任意合适的低聚糖，例如文献中记载的低聚糖(例如EP 0454220和EP 0529715中记载的低聚糖，但是并不限于这些来源)，或市售低聚糖。可通过例如Buijsman，R.等人描述的方法(Abstracts of papers，9thEuropean Carbohydrate Symposium Utrecht 1997，Abstract A150)在适当时刻将低聚糖磷酸化。可例如使用在EP 0649854中描述的方法将间隔基偶联到低聚糖上。
上述制备本发明化合物的方法中的步骤—肽偶联可通过用于偶联或缩合肽片段的本领域公知方法来进行，例如叠氮化物方法、混合酐方法、活化酯方法，或优选地碳化二亚胺方法，尤其是还加入催化和外消旋抑制化合物例如N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基苯并三唑的方法。The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol 3，E.Gross和J.Meienhofer，eds(Academic Press，New York，1981)。
在合成期间可用N-保护基将化合物中的胺官能团保护，所述N-保护基表示通常用来在肽化学中保护α-氨基的基团，例如叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Z)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)或邻苯二甲酰基(Phth)。根据保护基的性质，可通过不同方法除去保护基。通常在酸性条件下、在清除剂存在下进行脱保护。上述The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol 3中记载了氨基保护基及其除去方法的综述。
可以以游离碱形式存在的本发明化合物可以以可药用盐的形式从反应混合物中分离出来。所述可药用盐可通过用有机酸或无机酸处理式(I)游离碱来制得，所述酸有例如HCl、HBr、HI、H2SO4、H3PO4、乙酸、丙酸、乙醇酸、马来酸、丙二酸、甲磺酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、抗坏血酸等。
本发明化合物具有手性碳原子，因此可以以纯对映异构体、对映异构体混合物、含有非对映异构体的混合物的形式获得。获得纯对映异构体的方法在本领域内是众所周知的，例如将用旋光性酸和外消旋混合物获得的盐结晶，或者使用手性柱的色谱法。对于非对映异构体，可使用正相或反相柱。
本发明化合物可肠内给药或非胃肠道给药。本发明化合物和组合物的准确剂量和使用方案必然取决于对其施用药物的具体个体的需要、疾病严重程度、或临床医师的需要和判断。非胃肠道给药需要的剂量通常比更依赖于吸收的其它给药方法所需要的剂量低。然而，对于人，日剂量优选为0.001-100mg/kg体重、更优选为0.01-10mg/kg体重。
用本发明化合物制备的药物也可在急性抗凝血治疗中用作佐药。在这种情况下，将该药物与用于治疗这种病症的其它化合物一起给药。
与可药用辅料、例如在标准参考书—Gennaro等人的Remington′sPharmaceutical Sciences(第18版，Mack Publishing Company，1990，尤其参见第8部分：药物制剂及其制备)中记载的药物辅料混合的本发明化合物可压制成固体剂量单位，例如丸剂、片剂，或可加工成胶囊或栓剂。利用可药用液体，本发明化合物还可以以溶液剂、悬浮剂、乳剂的形式使用，例如用作注射剂、或喷雾剂如鼻内喷雾剂。
为了制备剂量单位例如片剂，可考虑使用常规添加剂例如填充剂、着色剂、聚合粘合剂等。通常可使用不影响活性化合物功能的所有可药用添加剂。可与本发明组合物一起给药的合适载体包括以适当量使用的乳糖、淀粉、纤维素衍生物等、或它们的混合物。
通过下述实施例进一步举例说明本发明。
实施例
所用缩写：
DMAP＝N，N-二甲基氨基吡啶
TEA＝三乙胺
Z＝苄氧基羰基
Ac＝乙酰基
MMTr＝一甲氧基三苯甲游基
Bn＝苄基
DCHA＝二环己基铵
EDCI＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐
HOBt＝1-羟基苯并三唑
DiPEA＝二异丙基乙胺
Pyr＝吡啶基
TEG＝四甘醇
HEG＝六甘醇
APA＝脒基苯基丙氨酸
Cys＝半胱氨酸
化合物编号是指在结构式图表中的化合物。
4-O-(4-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-2，3，6-三-0-乙酰基-α/β-D-吡喃葡萄糖基三氯亚氨逐乙酸酯 (4)
在搅拌下，向麦芽三糖 (1)(2.0g，4.0mmol)的吡啶(100mL)溶液中加入乙酸酐(6.2mL，65mmol)和催化量的DMAP(0.79g，6.5mmol)。5小时后，将该反应混合物倒入碳酸氢钠水溶液(1M，250mL)中，用乙酸乙酯(200mL)萃取3次。合并有机层，用硫酸镁干燥并真空浓缩。通过柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯，1/1-0/1，v/v)将产物纯化，获得了 (2)，为白色泡沫状物(产率为91％，3.5g)。通过用0.1M乙酸肼的二甲基甲酰胺溶液(34mL，3.4mmol)将 2(3.0g，3.1mmol)处理1小时，来实现端基异构脱乙酰化。将该反应混合物真空浓缩，然后用乙酸乙酯(50mL)稀释，用碳酸氢钠溶液(1M，3×25mL)洗涤，干燥(硫酸镁)并浓缩。通过硅胶柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯，3/2-1/0，v/v)将产物纯化，获得了 (3)(产率为92％，2.7g)。将化合物 3(2.7g，3.1mmol)溶于二氯甲烷(15mL)，加入三氯乙腈(1.7mL)和催化量的碳酸铯(0.2g，0.62mmol)。1小时后，将该反应混合物过滤，将滤液减压浓缩。通过柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯/TEA，50/49/1-0/99/1，v/v/v)将粗产物 4纯化，获得了纯 4，为白色泡沫状物(1.9g，91％)。
N-苄氧基羰基-1-氨基六甘醇4-O-(4-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-2，3，6-三-O-乙酰基-B-D-吡喃葡萄糖 (6)
在氩气流下、在活化分子筛4(250mg)存在下，将供体 4(0.69g，0.76mmol)和受体 5(0.31g，0.76mmol)在二氯甲烷(1.5mL)中的溶液搅拌1小时。将该溶液冷却至-20℃，向该反应混合物中滴加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(15μL)在二氯甲烷(0.6mL)中的溶液。10分钟后，TLC分析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)表明存在一个产物。将碳酸氢钠固体(0.3g)加到该反应混合物中，搅拌10分钟，然后过滤。将滤液用二氯甲烷(50mL)稀释，然后用碳酸氢钠水溶液(1M，2×25ml)洗涤，干燥(硫酸镁)，并真空浓缩。通过硅胶色谱法(0-4％甲醇的乙酸乙酯溶液)将残余物纯化，获得了纯 6(0.57g，产率为56％)。
N-苄氧基羰基-1-氨基六甘醇4-O-(4-O-(α-D-吡喃葡萄糖基)-α-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖 (7)
用叔丁钾(43mg，10mg/mmol Ac)的甲醇(15mL)溶液处理化合物 6(0.57g，0.43mmol)。1小时后，TLC分析(乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水，5/7/4/1.6，v/v/v/v)表明 6完全转化成了 7。用Dowex50 WX4-H+树脂将该反应混合物中和。通过过滤除去树脂，将滤液减压浓缩，获得了 7(0.37g，产率为95％)，无需进一步纯化直接使用。
N-苄氧基羰基-1-氨基六甘醇4-O-(4-O-(α-D-吡喃葡萄糖基-2，3，4，6-四(磷酸二苄酯))-α-D-吡喃葡萄糖基-2，3，6-三(磷酸二苄酯))-β-D-吡喃葡萄糖2，3，6-三(磷酸二苄酯) (9)
将1H-四唑(54mg，0.77mmol)的乙腈(1mL)溶液加到7(86mg，95μmol)和 8(450mg，1.4mmol)在乙腈/二噁烷(2/1，v/v，2ml)内的混合物中。在20℃搅拌1小时后，用冰浴将该反应混合物冷却，加入叔于基过氧化氢(0.75mL)。继续搅拌45分钟，TLC分析表明存在一个主要产物。通过硅胶柱色谱法(100/0-95/5，二氯甲烷/甲醇，v/v)纯化，获得了纯 9(311mg，产率为92％)。
1-氨基六甘醇4-O-(4-O-(α-D-吡喃葡萄糖基2，3，4，6-四磷酸酯)-α-D-吡喃葡萄糖基2，3，6-三磷酸酯)-β-D-吡喃葡萄糖2，3，6-三磷酸酯) (10)
将化合物 9(311mg，87μmol)溶于含有少量乙酸的叔丁醇/水(6/1，v/v，20mL)中。在连续氢气流下、在10％Pd/C(100mg)存在下，将该溶液搅拌。3小时后，通过过滤除去Pd/C催化剂，将滤液真空浓缩。进行Dowex 50 WX4-Na+离子交换，获得了 10(179mg，产率为98％)。
N-2-萘磺酰基-S-4-一甲氧基三苯甲游基-(L)-半胱氨酸 (12)
在搅拌下，向市售S-4-一甲氧基三苯甲游基-(L)-半胱氨酸 (11)(0.34g，1mmol)、二噁烷(5mL)和10％碳酸钠水溶液(5mL)的混合物中加入2-萘磺酰氯(0.25g，1.1mmol)。搅拌1小时后，加入5％柠檬酸水溶液(50mL)将该反应混合物酸化，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。合并有机层，干燥(硫酸镁)并减压浓缩。通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷/三乙胺，0/99/1-4/95/1，v/v/v)将该粗产物纯化，获得了 12(产率为76％，0.44g)。
N-2-萘磺酰基-S-2-吡啶亚磺酰基-(L)-半胱氨酸 (14)
将三氟乙酸和三异丙基甲硅烷在二氯甲烷中的溶液(1/1/18，v/v/v)加到化合物 12(0.44g，0.76mmol)中。搅拌20分钟后，将该混合物倒入水中，并用二氯甲烷(2×50mL)萃取。合并有机层，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。通过与甲苯共蒸发除去该粗混合物中的微量三氟乙酸。将所得游离硫醇 13再溶于异丙醇(2.5mL)，并滴加到AldrithiolTM(1.7g，7.6mmol)在异丙醇/2N乙酸水溶液(1/1，v/v，20ml)中的溶液内。1小时后，TLC分析表明已经反应完全，将该混合物减压浓缩。通过与甲苯共蒸发除去该残余物中的微量乙酸。将该粗产物溶于丙酮(10mL)，向该溶液中加入二环己基胺(0.3mL)，化合物 14以DCHA-盐的形式从该反应混合物中沉淀出来。分离出该沉淀物，溶于乙酸乙酯(50mL)，用5％柠檬酸水溶液(2×30mL)洗涤。将有机层干燥(硫酸镁)，并减压浓缩，获得了纯 14(产率为55％，0.25g)。
N(N(Nα-2-萘磺酰基-S-2-吡啶亚磺酰基-(L)-半胱氨酰基)-(D，L)-4-脒基苯基丙氨酰基)哌啶 (16)
向N-((D，L)-4-脒基苯基丙氨酰基)哌啶二盐酸盐 (15)(0.13g，0.39mmol)和半胱氨酸衍生物 14(0.16g，0.39mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)内的溶液中加入HOBt(58mg，0.42mmol)、EDCI(82mg，0.42mmol)和N-乙基吗啉(110μL，0.78mmol)。搅拌16小时后，将该混合物用二氯甲烷(20mL)稀释，然后用水(2×10mL)洗涤。将有机层干燥(硫酸镁)，并真空浓缩。将该残余物通过硅胶柱色谱法(首先是10-20％甲醇的二氯甲烷溶液以除去杂质，然后是乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水(16/7/1.6/4，v/v/v/v)以释放产物)纯化，然后通过Sephadex LH-20凝胶过滤(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷，4/1，v/v)进行纯化，获得了均质 16(70％，0.19g)。
麦芽三糖十磷酸酯 18与肽 16的缩合偶联
向麦芽三糖十磷酸酯 18(21mg，9.8μmol)在0.1M Na2HPO4缓冲液(1.0mL，pH7.5)内的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚氨基-2-溴乙酸酯的甲醇(1mL)溶液。搅拌2小时后，将该反应混合物施加到Sephadex G25柱上，用10％乙腈(在水中)洗脱。合并合适的级分，并在低温下(25℃)减压浓缩，获得了化合物 19。将NAPAP类似物 16(10mg，15μmol)溶于甲醇(1mL)和0.1M Na2HPO4缓冲液(0.75mL，pH7.0)的混合物中，通过通入氦气和声处理来脱气。向该溶液中加入三丁基膦(4.1μL，16μmol)，将该反应混合物在氩气氛下搅拌。1小时后，HPLC分析(LichrospherRP18-柱)表明2-吡啶亚磺酰基已完全裂解，将化合物 19在二甲基甲酰胺(0.25mL)和0.1MNa2HPO4缓冲液(0.50mL，pH7.0)中的溶液加到该反应混合物中。将该混合物搅拌3小时，然后通过凝胶过滤(Fractogel HW-40，洗脱剂：0.15M TEAB)纯化该粗混合物。将合适的级分浓缩，并进行Dowex50WX-Na+离子交换，冷冻干燥后获得了均匀偶联物 I(10.1mg，产率为47％)。通过半制备HPLC柱色谱法(LiChrospher RP18-柱，梯度洗脱：17.5％-22.5％CH3CN(在0.05M TEAA水溶液中))将这两种非对映异构体分离，获得了非对映异构体 I-a(保留时间：28.6分钟)和非对映异构体 I-b(保留时间：33.0分钟)。通过凝胶过滤(SephadexG-25 DNA-级Superfine)将这两种非对映异构体脱盐，用Dowex 50WX4-Na+离子交换树脂转化成Na+-型。
非对映异构体I-a：1H NMR(D20，600MHz，HH-COSY)：麦芽三糖：(还原末端)4.65(bs，1H，H1)，3.85(m，1H，H2)，4.35(m，1H，H3)，3.76(m，1H，H4)；5.50(bs，1H，H1′)，4.18(m，1H，H2′)，4.10(m，1H，H4′)；(非还原末端)5.71(bs，1H，H1″)，4.09(m，1H，H2″)，4.45(m，1H，H3″)，4.15(m，1H，H4″)；3.95-3.84(H5，麦芽三糖)；间隔基：3.65-3.51(m，22H，OCH2HEG)，3.35(m，2H，CH2NH2)，3.15(s，2H，SCH2(O))；肽：8.31(s，1H，HaromNAS)，8.06-7.67(m，6H，HaromNAS)，7.70，7.17(2x d，4H，HaromAPA，J＝7.8Hz)，4.28(m，1H，αCHAPA)，3.91(m，1H，αCH Cys)，3.30-3.04(m，4H，CH2N哌啶)，2.82-2.62(m，3H，βCH2Cys，βCH APA)，2.57(m，1H，βCH APA)，1.45-1.25(m，6H，CH2哌啶)；
ES-MS：[M-3H]3-724.1，[M-2H]2-1086-7.
非对映异构体I-b：1H NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：麦芽三糖：(还原末端)3.80(m，1H，H2)，4.32(m，1H，H3)，3.89(m，1H，H4)；5.49(bs，1H，H1′)，4.22(m，1H，H2′)，4.11(m，1H，H4′)；(非还原末端)5.70(bs，1H，H1″)，4.22(m，1H，H2″)，4.52(m，1H，H3″)，4.24(m，1H，H4″)；3.91-3.84(H5，麦芽三糖)；间隔基3.63-3.52(m，22H，OCH2HEG)，3.35(t，，2H，CH2NH2)，3.17(AB，2H，SCH2(O))；肽：8.35(s，1H，HaromNAS)，8.07-7.65(m，6H，HaromNAS)，7.77，7.22(2 x d，4H，HaromAPA，J＝7.8Hz)，4.62(t，1H，αCH APA，JαCH，βCH＝7.3Hz)，4.05(m，1H，αCH Cys)，3.05-3.00(m，4H，CH2N哌啶)，2.85-2.67(m，4H，βCH2Cys，βCH2APA)，1.88-1.24(m，6H，CH2哌啶)；
ES-MS：[M-3H]3-724.0，[M-2H]2-1086.2.
N-羟基琥珀酰亚氨基-14-S-2-吡啶亚磺酰基-14-巯基-3，6，9，12-四氧杂十四烷酸酯 (22)
将间隔物 20(0.75，2.4mmol)(P.Westerduin等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1996，35，3，p331-333)和AldrithiolTM(2.6g，12.1mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，并用正丁基胺(4mL)处理。搅拌2小时后，将该反应混合物真空浓缩，再溶于二氯甲烷(50mL)，用5％柠檬酸水溶液(2×50mL)洗涤。将有机层干燥，并减压浓缩。通过硅胶柱色谱法(甲醇/乙酸/二氯甲烷，0/1/99-6/1/93，v/v/v)将残余物纯化，获得了纯 21(0.80g，产率为88％)。将化合物 21(0.80g，2.1mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，将N-羟基琥珀酰亚胺(0.26g，2.3mmol)和EDCI(0.45mg，2.3mmol)加到该溶液中。1小时后，将该反应混合物用二氯甲烷(50mL)稀释，用冰水(20mL)洗涤3次，干燥(硫酸镁)并浓缩，获得了 22(0.98g，产率为98％)，无需纯化直接使用。
Nε-叔丁氧基羰基-Nα-苯磺酰基-(L)-赖氨酸 (24)
使用 23和苯磺酰氯作为原料，按照制备 12所采用的方法进行制备(0.86g，产率为75％)。
Nε-(14-S-2-吡啶亚磺酰基-14-巯基-3，6，9，12-四氧杂十四烷酰基)-Nα-苯磺酰基-(L)-赖氨酸 (26)
用3N HCl(在乙酸乙酯中)处理化合物 24(0.86g，2.2mmol)。15分钟后，将该反应混合物真空浓缩。通过与甲苯共蒸发除去残余物中的微量酸。将粗产物25溶于二噁烷/水(4/1，v/v，2.5mL)中，向该溶液中加入化合物 22(0.98g，2.1mmol)和DiPEA(1.1mL，6.6mmol)。1小时后，将该反应混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，用5％柠檬酸水溶液(2×50mL)洗涤。将有机层干燥(硫酸镁)，并真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(0-10％甲醇/乙酸乙酯)将残余油状物纯化，获得了均质 26(0.95g，产率为67％)。
N(N(Nε-(14-S-2-吡啶亚磺酰基-14-巯基-3，6，9，12-四氧杂十四烷酰基)-Nα-苯磺酰基-(L)-赖氨酰基)-(D，L)-4-脒基苯基丙氨酰基)哌啶(27)
使用 26和 15作为原料，按照制备 16所采用的方法进行制备(87mg，产率为70％)。
麦芽三糖十磷酸酯18与肽27的缩合偶联 (II)
使用18和27作为原料，按照制备 I所采用的方法进行制备。通过半制备HPLC(LiChrospherRP18-柱)纯化粗产物 II。然后通过凝胶过滤(Sephadex G-25DNA-级Superfine)脱盐，用Dowex 50 WX4-Na+离子交换树脂转化成Na+-型，冷冻干燥后获得了纯II，为白色蓬松固体(8.5mg，按 18计算产率为23％。)
1H NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：麦芽三糖：(还原末端)4.67(m，1H，H1)，4.07(m，1H，H2)，4.40(m，1H，H3)，4.06(m，1H，H4)；5.49(bs，1H，H1′)，4.24(m，1H，H2′)，4.66(m，1H，H3′)，4.10(m，1H，H4′)；(非还原末端)5.73(bs，1H，H1″)，4.17(m，1H，H2″)，4.38(m，1H，H3″)，4.22(m，1H，H4″)；3.95-3.82(H5，麦芽三糖)；间隔基：4.03，4.02(2 x s，2H，OCH2C(O))，3.73-3.59(m，36H，OCH2TEG，HEG)，3.38(t，2H，CH2NH2)，3.27，3.26(2 x s，2H，SCH2(O))，2.75(2 x t，2H，CH2S)；肽：7.81-7.52(m，5H，HaromBS)，7.79，7.76，7.42，7.41，(4 x d，4H，HaromAPA)，4.87，4.66(2 x t，1H，αCH APA，JαCH，βCH＝7.4Hz)，4.07(m，1H，αCH Lys)，3.37-3.73(m，8H，εCH2Lys，β3CH2APA，CH2N哌啶)，1.96-1.46(m，12H，CH2哌啶，β/γ，δCH2Lys)；
ES-M：[M+3H]3+801.2，[M+2H]2+1200.8.
部分保护的五糖 30
将已知的五糖 29(53mg，49μmol)(R.C.Buijsman等人，Chem.Eur.J.1996，2，12，p1572-1577)溶于二甲基甲酰胺(0.25mL)和水(1mL)中，并用N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(18mg，72μmol)和N-乙基吗啉(18.6mL)处理。搅拌15分钟后，TLC分析(乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水，5/7/1.6/4，v/v/v/v)表明反应已完全，将该反应混合物直接置于RP-18柱上，用水/甲醇(90/10-60/40)洗脱。合并适当的级分，浓缩至小体积，置于在水中的Dowex 50 WX4-H+离子交换柱上。将洗脱液真空浓缩，获得了纯 30(54mg，产率为91％)。
硫酸化五糖 32
将化合物 30(54mg，45μmol)溶于二甲基甲酰胺(1mL)。加入三乙胺三氧化硫复合物(0.51g，对于每一羟基是5当量)，将该混合物在氮气氛下于55℃搅拌16小时。然后将该混合物冷却至0℃，加入碳酸氢钠水溶液(对于每当量三乙胺三氧化硫复合物是5当量)。将该混合物搅拌1小时，浓缩至小体积，并置于Sephadex G-25柱上，用10％乙腈(在水中)洗脱。合并适当的级分，浓缩至小体积，然后过Dowex 50 WX4(Na+形式)柱，用水洗脱。将洗脱液浓缩，再溶于0.2N盐酸(1mL)中，在4℃放置16小时。用0.1N氢氧化钠溶液将该反应混合物中和，在Sephadex G-25柱上脱盐，用10％乙腈(在水中)洗脱。获得了均质的 31。将化合物 31-溶于含有几滴乙酸的叔丁醇/水(6/1，v/v，20mL)中。在连续氢气流下、在10％ Pd/C(100mg)存在下，将该溶液搅拌。3小时后，通过过滤除去Pd/C催化剂，将滤液真空浓缩。获得了纯 32(60mg，产率为60％)。
五糖 32与肽 16的缩合偶联
将五糖32(15mg，6.5μmol)溶于0.1M NaH2PO4缓冲液(2mL，pH7.5)，向该溶液中加入sulfo-SIABTM(16mg，33μmol)溶液。在暗处搅拌3小时后，HPLC分析(单Q阴离子交换)表明反应已完全，用Superdex 30柱(10％乙腈(在水中))纯化粗产物34。合并合适的级分，并在低温下(25℃)减压浓缩。向NAPAP类似物 16(9mg，14μmol)在甲醇(1mL)和0.1M Na2HPO4缓冲液(0.75mL，pH7.0)的混合物中的溶液内(使用前通过通入氦气和声处理来脱气)加入三丁基膦(3.9μL，15μmol)。在氩气氛下搅拌1小时后，HPLC分析(LichrospherRP18-柱)表明2-吡啶亚磺酰基已完全裂解。将衍生的五糖34在二甲基甲酰胺(0.25mL)和0.1M Na2HPO4缓冲液(0.50mL，pH7.0)中的溶液加到该反应混合物中，并将该混合物搅拌3小时。将该粗产物置于Sephadex G-50柱上，用10％乙腈(在水中)洗脱。合并合适的级分，浓缩至小体积，用Superdex 30柱脱盐，用10％甲醇(在水中)洗脱。浓缩并冷冻干燥，获得了偶联物III，为白色固体(9mg，产率为52％)。
1H NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：63.60，3.53，3.43(3 x s，9H，CH3OE，G，H)；环D：5.53(m，1H，H1)，4.15(m，1H，H2)，4.58(m，1H，H3)，3.56(m，1H，H4)，3.92(m，1H，H5)，4.26，4.13(2 x m，2H，H6，H6′)；环E：4.70(d，1H，H1，J1，2＝8.1Hz，)，4.21(m，1H，H2)，3.62(m，1H，H3)，3.92(m，1H，H4)，3.74(m，1H，H5)；环F：5.39(d，1H，H1，J1，2＝3.8Hz)，4.22(m，1H，H2)，4.56(m，1H，H3)，3.83(t，1H，H4，J3，4＝J4，5＝9.8Hz)，4.12(m，1H，H5)；环G：5.15(bs，1H，H1)，4.35(m，1H，H2)，3.76(m，1H，H3)，4.21(m，1H，H4)，4.80(m，1H，H5)；环H：5.10(d，1H，H1，J1，2＝3.6Hz)，4.31(m，1H，H2)，4.54(m，1H，H3)，4.21(m，1H，H4)；间隔基；7.51，7.53，7.13，712(4 x d，4H，H aromSIAB)，3.73(m，2H，CH2CH2NH2)，3.66(m，12H，OCH2TEG)，3.31(m，，2H，CH2NH2)；肽：8.27，8.22(2 x s，1H，HaromNAS)，7.98-7.60(m，6H，HaromNAS)，7.71，7.64，7.46，7.44(4 x d，4H，HaromAPA)，4.60，4.45(2 x t，1H，αCH APA，JαCH，βCH＝6.6Hz)，4.00，3.97(2 x m，1H，αCH Cys)，3.10-2.85(m，4H，CH2N哌啶)，2.82-2.70(m，3H，βCH2 Cys，βCH APA)，2.61(m，1H，βCH′APA)，1.55-1.15(m，6H，CH2哌啶)；
ES-MS：[M-H]-2680.6
使用类似方法，制得了下述化合物：
通过下述测试方法测定本发明化合物的生物活性。
I.抗凝血酶分析
凝血酶(IIa因子)是血凝级联中的因子。
通过分光光度法测定由凝血酶导致的产色底物s-2238水解的速率来评价本发明化合物的抗凝血酶活性。使用在缓冲系统中进行的抗凝血酶活性分析来评价测试化合物的IC50值。
测试介质：氨丁三醇-NaCl-聚乙二醇6000(TNP)缓冲液
参照化合物：12581(Kabi)
载体：TNP缓冲液
可用二甲亚砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇促进溶解，这些溶剂在最终的反应混合物中高达2.5％的浓度下没有不利作用。
技术  试剂*
1.氨丁三醇-NaCl(TN)缓冲液
该缓冲液组分：
氨丁三醇(Tris)   6.057g(50mmol)
NaCl      5.844g(100mmol)
水至       1升
在37℃用HCl(10mmol/升)将该溶液的pH调节至7.4。
2. TNP缓冲液
将聚乙二醇6000溶于该TN缓冲液，使其浓度为3g/升。
3. S-2238溶液
将一瓶S-2238(25mg；Kabi Diagnostica，Sweden)溶于20mlTN缓冲液，使其浓度为1.25mg/ml(2mmol/升)。
4.凝血酶溶液
人凝血酶(16000nKat/瓶；Centraal Laboratorium voorBloedtransfusie，Amsterdam，The Netherlands)溶于TNP缓冲液，获得了浓度为835nKat/ml的贮备液。
使用前立即用TNP缓冲液将该溶液稀释至浓度为3.34nKat/ml。
*-使用的所有组分都是分析级
-对于水溶液使用超纯水(Mili-Q质量)
制备测试化合物和参照化合物溶液
将测试化合物和参照化合物溶于Mili-Q水，以获得浓度为10-2mol/升的贮备液。用载体将每一浓度进行梯度稀释，以获得10-3、10-4和10-5mol/升的浓度。在该分析中使用包括贮备液在内的稀释液(在反应混合物中的终浓度分别为：3×10-3；10-3；3×10-4；10-4；3×10-5；10-5；3×10-5；和10-6mol/升)。
操作
在室温用吸量管将0.075ml和0.025ml测试化合物或参照化合物溶液或载体置于微量滴定板的孔中，分别用0.115ml和0.0165mlTNP缓冲液将这些溶液稀释。向每一孔中加入等分试样的0.030mlS-2238溶液，在振摇条件下将该微量滴定板在恒温箱(Amersham)中于37℃预加热和预保温10分钟。预保温后，通过向每一孔中加入0.030ml凝血酶溶液来使S-2238开始水解。将该微量滴定板在37℃保温(振摇30秒)。保温后1分钟，用动力学微量滴定板读数器(Twinreaderplus，Flow Laboratories)在405nm测定每一样本的吸光度，在90分钟期间内每2分钟测定一次。
所有数据均用LOTUS-MEASURE收集在IBM个人计算机中。对于所有化合物浓度(以mol/升反应混合物表示)以及空白，将反应时间(min)对吸收度作图。
反应评价：对于每一终浓度，由测定图计算最大吸收度。依据Hafner等人的方法(Arzneim-Forsch./Drug Res.1977；27(II)；1871-3)使用对数转化分析计算IC50-值(使空白的最大吸收度抑制50％的终浓度，以μmol/升表示)。
抗凝血酶活性；
  实施例   IC50(mol/升)
  I(一种非对映异构体)   2×10-7
  II   8×10-6
  III   3.5×10-7
II.抗Xa因子分析
活化因子X(Xa)是血凝级联中的因子。
通过分光光度法测定由Xa导致的产色底物s-2222水解的速率来评价本发明化合物的抗Xa活性。使用在缓冲系统中进行的抗Xa活性分析来评价测试化合物的IC50值。
下述操作和测试条件一般与上述抗凝血酶分析类似。不同之处如下。
参照化合物：苄脒
载体：TNP缓冲液
可用二甲亚砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇促进溶解，这些溶剂在最终的反应混合物中高达1％(对于DMSO)和2.5％(对于其它溶剂)的浓度下没有不利作用。
技术  试剂*
3.S-2222溶液
将一瓶S-2222(15mg；Kabi Diagnostica，Sweden)溶于10ml水，使其浓度为1.5mg/ml(2mmol/升)。
4. Xa溶液
牛Xa因子人(Bovine Factor Xa Human)(71nKat/瓶；KabiDiagnostica)溶于10ml TNP缓冲液，然后用30ml TNP缓冲液进一步稀释，使浓度为1.77nkat/ml。稀释液必须临用现配。
操作
替代S-2238溶液(在抗凝血酶分析中)，在该分析中将S-2222溶液加到每一孔中。
抗Xa因子活性
  实施例   U/mg
  III   885
                   结构式图表1
Figure C9980739900251
                   结构式图表2
                    结构式图表3
                    结构式图表4
                   结构式图表5

Claims (9)

1.式(I)化合物或其可药用盐或其前药：
其中R1是苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、3，4-二氢-1H-异喹啉基、苯并二氢吡喃基、或樟脑基，所述基团可非必须地被一个或多个选自(1-8C)烷基或(1-8C)烷氧基的取代基取代；
R2和R3独立地为H或(1-8C)烷基；
R4是(1-8C)烷基或(3-8C)环烷基；
或者R3和R4与它们所连的氮原子形成可非必须地包含另外的杂原子的非芳香(4-8)元环，该环可非必须地被(1-8C)烷基或SO2-(1-8C)烷基取代；
Q是链长为10-70个原子的间隔基，其中，对于式(I)化合物的抗血栓形成活性来说，该间隔基的化学结构的重要性不大或不重要，且该间隔基不是完全刚性的；
Z是包含2-6个单糖单元的带负电荷的低聚糖残基，其中的负电荷由带正电荷的抗衡离子抵消，其中Z是本身具有AT-III介导的抗-Xa活性的低聚糖残基，
其中，前药是其中脒基部分的氨基被保护的式(I)化合物或其可药用盐。
2.权利要求1的化合物，其中脒基部分的氨基被羟基或(1-6C)烷氧基羰基保护。
3.权利要求1的化合物，其中Z是五糖残基。
4.权利要求3的化合物，其中Z具有式(II)所示结构：
Figure C998073990003C1
其中R5独立地为OSO3 -或(1-8C)烷氧基。
5.权利要求1-4任一项的化合物，其中R1是苯基、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基或萘基；R2是H；且NR3R4代表哌啶基。
6.权利要求1-4任一项的化合物，其中Q具有式(III)所示结构：
-[(CH2)2O]m-[(CH2)n-NR3-C(O)]p-W-(CH2)s-  (III)
其中
W是-[1，4-亚苯基-NR3-C(O)]q-(CH2)r-S-或
-(CH2)t-S-(CH2)u-[O(CH2)2]v-O-(CH2)w-C(O)-NR3-；
且R3独立地为H或(1-8C)烷基；
m＝1-12；n＝1-8；p＝0-4；q＝0或1；r＝1-8；s＝1-8；t＝1-8；u＝1-8；v＝1-12；w＝1-8；总的原子数是10-70；且-[(CH2)2O]m-部分是末端，Q通过该部分连接在Z上。
7.权利要求6的化合物，其中Q选自：
-[(CH2)2O]5-(CH2)2-NH-C(O)-CH2-S-CH2-；
-[(CH2)2O]5-(CH2)2-NH-C(O)-CH2-S-(CH2)2-[O(CH2)2]3-O-CH2-C(O)-NH-(CH2)4-；和
-[(CH2)2O]3-(CH2)2-NH-C(O)-1，4-亚苯基-NH-C(O)-CH2-S-CH2-。
8.包含权利要求1-7任一项的化合物和可药用辅料的药物组合物。
9.权利要求1-7任一项的化合物在制备用于治疗或预防血栓形成或其它与凝血酶有关的疾病的药物中的应用。
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