CZ20004735A3 - Antitrombotické látky - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových antitrombotických látek, způsobu jejich výroby, farmaceutických prostředků s obsahem těchto sloučenin jako účinných látek a použití těchto sloučenin pro výrobu farmaceutických výrobků.

Dosavadní stav techniky

Serinové proteázy jsou enzymy, které mají důležitou úlohu v kaskádě srážení krve. Členy této skupiny proteáz jsou například thrombin, trypsin, faktory Vila, IXa, Xa, Xla, XIla, a protein C.

Thrombin je konečným enzymem s funkcí serinové proteázy v koagulační kaskádě. Hlavní funkce thrombinu je štěpení fibrinogenu za vytvoření fibrinových monomerů, které se zesíťují za vytvoření nerozpustného gelu. Navíc řídí thrombin svou vlastní produkci aktivací faktorů V a Vlil v dřívějších fázích kaskády. Jeho působení je také důležité na buněčné úrovni, kde působí na specifické receptory a dochází tak k agregaci destiček, aktivaci endotheliálních buněk a proliferací fibroblastů. Thrombin má klíčovou řídící úlohu při hemostázi a tvorbě trombu. Protože inhibitory thrombinu mohou mít celou řadu terapeutických použití, v této oblasti se provádí intenzivní výzkum.

Další důležitá serinové proteáza, faktor Xa, katalyzuje přeměnu prothrombinu na thrombin.

Při vývoji syntetických inhibitorů serinových proteáz a zvláště thrombinu je jednou z klíčových struktur benzamidinová skupina. Napodobuje protonovaný postranní řetězec bazických aminokyselin Arg a Lys přirozených substrátů. Sloučeniny obsahující tuto skupinu • · · · byly důkladně a opakovaně studovány. Velmi účinným zástupcem tohoto typu inhibitorů thrombinu je derivát ‘aminokyseliny Na-(2-naftylsulfonyl)-glycyl-4-amidinofenylalaninpiperidin (NAPAP) (Stůrzebecher, J. a další, Thromb. Res. 29, 635 - 642, 1983). Sloučenina NAPAP však má nevhodný profil z terapeutického hlediska: tato sloučenina má například nízkou specificitu pro thrombin a je obtížně rozpustná. Dále byly připraveny deriváty NAPAP, jako jsou N-alkylsubstituované deriváty popisované v EP 0,236,163 nebo glykopeptidové deriváty popsané v EP 0,558,961, Proč. Am. Pept. Symp, 13th (60LXAW); 94; str. 643 - 5 (Stůber, W. a další, Pept. Chem. Struct. Biol.), Proč. Int. Symp. Controlled Release Bioact. Mater. (PCRMEY, 10220178); 94; díl 21 st; str. 712 - 12 (Walter, E. a další), a EP 0,513,543. I když tyto derivatizače mohly vést ke zlepšením farmakologického profilu ve srovnání s NAPAP, všechny tyto sloučeniny odvozené od NAPAP jsou stále účinné pouze jako přímé inhibitory thrombinu a mají omezený poločas v plazmě a rychle se vylučují (jejich antithrombinové účinky tedy trvají pouze po krátkou dobu).

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že sloučeniny obecného vzorce (I) Z

I

Q

R¹ je skupina fenyl, naftyl, 1,2,3,4-tetrahydronaftyl, (iso)chinolinyl, tetrahydro(iso)chinolinyl, 3,4-dihydro-1 H-isochinolinyl, chromanyl nebo • « ·· ···· · · ··· kafr, kde tyto skupiny mohou být popřípadě substituovány jedním nebo více substituenty zvolenými ze skupiny (1 -8C)álkyl nebo (1-8C)alkoxy; R² a R³ jsou nezávisle H nebo (1 -8C)alkyl;

R⁴ je (1-8C)alkyl nebo (3-8C)cykloalkyl; nebo

R³ a R⁴ spolu s atomem dusíku, na který jsou navázány, znamenají nearomatický 4 až 8 členný kruh popřípadě obsahující další heteroatom, kde tento kruh je popřípadě substituovaný skupinami (18C)alkyl nebo SO₂-(1 -8C)alkyl;

Q je mezerníková skupina (spacer) o délce řetězce 10 až 70 atomů; a

Z je záporně nabitý oligosacharidový zbytek obsahující dvě až šest monosacharidových jednotek, přičemž náboj je kompenzován kladně nabitými protiionty;

nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl nebo prekurzor, jsou silné a vysoce univerzální antitrombotické látky. Sloučeniny podle vynálezu mají antithrombinovou aktivitu, avšak struktura těchto sloučenin může být selektivně modifikována, takže mohou mít vyladitelný směsný profil jak nezprostředkované, přímé antithrombinové aktivity (faktor lla), tak i aktivitu anti-Xa zprostředkovanou antithrombinem III (ΑΤ-III). Sloučeniny podle vynálezu jsou tedy duální inhibitory. Sloučeniny podle vynálezu mají dlouhý poločas v plasmě a v důsledku toho vykazují prodlouženou antithrombinovou aktivitu ve srovnání s NAPAP nebo jeho deriváty popisovanými výše. Navíc mohou sloučeniny podle vynálezu uniknout neutralizačnímu působení destičkového faktoru 4 (PF4). Výhodným aspektem sloučenin podle předkládaného vynálezu je také nízká toxicita.

Další typ duálních inhibitorů se popisuje v EP 0,649,854. Na rozdíl od sloučenin podle předkládaného vynálezu vykazují konjugované sacharidové sloučeniny popisované v tomto dokumentu nepřímou, ΑΤ-III zprostředkovanou antithrombinovou aktivitu, navíc

k AT-III zprostředkované anti-Xa aktivitě.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro léčení a prevenci thrombinem zprostředkovaných a s thrombinem souvisejících onemocnění. Sem patří celá řada trombotických a protrombotických stavů, při kterých je aktivována koagulační kaaskáda, a které zahrnují bez omezení trombózu hlubokých žil, plicní embólii, tromboflebitidu, arteriální uzávěr způsobený trombózou nebo embólií, znovuuzavření arterií v průběhu nebo po angioplastice nebo trombolýze, restenóza po cévní chirurgii nebo invazivních kardiologických postupech, pooperační žifní trombóza nebo embólie, akutní nebo chronická ateroskleróza, mrtvice, infarkt myokardu, rakovina a metastázy a neurodegenerativní onemocnění. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také použity jako antikoagulační látky v obvodech pro mimotělní krevní oběh, tak jak je třeba při dialýze a chirurgických zákrocích. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také použity jako antikoagulanty in vitro.

Směsný profil sloučenin podle vynálezu může být vyladěn změnou povahy oligosacharidového zbytku Z a délkou mezerníkové skupiny Q. Tím je možné získat řadu profilů.

Ve sloučeninách podle předkládaného vynálezu může být použit jakýkoli negativně nabitý oligosacharidový zbytek s 2 až 6 sacharidovými jednotkami. Vhodné sloučeniny podle vynálezu jsou sloučeniny, ve kterých Z je sulfatovaný nebo fosforylovaný oligosacharidový zbytek. Oligosacharidový zbytek Z je s výhodou odvozen z oligosacharidu, který má sám o sobě anti-Xa aktivitu zprostředkovanou AT-III, jako jsou sacharidy popisované v EP 0,454,220 a EP 0,529,715. Zvláště výhodné oligosacharidové zbytky jsou pentasacharidové zbytky. Skupina Z má nejvýhodněji vzorec (II)

Další výhodné sloučeniny podle vynálezu jsou sloučeniny vzorce (I), kde skupina R¹ je fenyl, 4-methoxy-2,3,6-trimethylfenyl nebo naftyl. Ve výhodných sloučeninách znamená NR³R⁴ piperidinylovou skupinu. Skupina R² je s výhodou H.

Chemická struktura mezerníkové skupiny má pro antitrombotickou aktivitu sloučenin podle vynálezu malý nebo žádný význam, nemusí však být zcela rigidní. Mezi dalšími skupinami jsou výhodnější vysoce pružné mezerníkové skupiny.

Navíc jsou některé mezerníkové skupiny vhodnější než jiné ze syntetických důvodů.

Vhodné mezerníkové skupiny, které mohou být snadno použity, mají například vzorec (III):

-[(CH₂)2O]_m-[(CH₂)_n-NR³-C(O)]p-W-(CH₂)_s- (III), kde

W je -[1,4-fenylen-NR³-C(O)j_q-(CH₂)_r-Snebo

-(CH₂)t-S-(CH₂)_u-[O(CH₂)₂]_v-O-(CH₂)_w-C(O)-NR³-; a

R³ znamená nezávisle H nebo (1-8C)alkyl;

m = 1 až 12; n = 1 až 8; p = 0 až 4; q = 0 nebo 1; r = 1 až 8; s = až 8; t = 1 až 8; u = 1 až 8; v = 1 až 12; w = 1 až 8; celkový počet atomů je 10 až 70; a skupina -[(CH₂)₂O]_m- je koncová skupina, prostřednictvím které je skupina Q navázána na Z. Výhodné mezerníkové skupiny jsou následující:

• · ·· ···· • · · « · • « · · · · ·

-[(CH₂)2O]5-(CH2)2-NH-C(O)-CH2-S-CH₂-;

-[(CH2)₂O]₅-(CH2)2-NH-C(O)-CH2-S-(CH2)2-[O(éH₂)2]3-O-CH2-C(O)-NH-(CH₂)₄-; a

-[(CH₂)2O]₃-(CH2)2-NH-C(O)-1,4-fenylen-NH-C(O)-CH2-S-CH₂-.

Při popisu sloučenin vzorce (I) se používají následující definice:

Termín (1-8C)alkyl znamená rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, například methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sek-butyl, terc-butyl, hexyl a oktyl. Výhodné alkylové skupiny jsou methyl a ethyl.

Termín (1-8C)alkoxy znamená alkoxylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku, přičemž alkylová skupina má stejný význam jak bylo definováno výše. Výhodnou alkoxylovou skupinou je skupina methoxy.

Termín (3-8C)cykloalkyl znamená cykloalkylovou skupinu s 3 až 8 atomyuhlíku, jako je cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyi, cykloheptyl nebo cyklooktyl. Výhodné cykloalkylové skupiny jsou cyklopentyl a cyklohexyi.

Délka mezerníkové skupiny je počet atomů mezerníkové skupiny počítaný podél nejkratšího řetězce mezi skupinou Z a peptidovou částí molekuly, přičemž se nepočítá atom kyslíku oligosacharidu Z, který je navázán na mezerníkovou skupinu.

Termín „prekurzor“ znamená sloučeninu podle vynálezu, ve které je aminová skupina amidinové části chráněná, například skupinou hydroxy nebo (1-6C)alkoxykarbonyl.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se připravují derivatizací NAPAP (nebo analogu NAPAP) v poloze glycinu cysteinem nebo lysinem sw použitím způsobů obecně známých v oboru, přičemž sloučenina je potom (a) navázána na zbytek oligosacharidové mezerníkové skupiny, nebo (b) je navázána na mezerníkovou skupinu, která je potom derivatizována thiolovou skupinou a potom navázána • · na oligosacharidový zbytek. K tomuto účelu může být použit jakýkoli vhodný oligosacharid, například oligosacharidy známé z literatury (například z EP 0,454,220 a EP 0,529,715, avšak bez omezení na tyto zdroje) nebo komerčně dostupné oligosacharidy. Oligosacharidy mohou být ve vhodnou dobu fosforylovány způsoby, které jsou například popsány v Buijsman, R. a další (Abstracts of papers, 9th European Karbohydrate Symposium Utrecht 1997, Abstract A150). Vazba mezerníkové skupiny na oligosacharid může být provedena například metodami popsanými v EP 0,649,854.

Vazba peptidu, procedurální krok ve výše popsaném způsobu výroby sloučenin podle vynálezu, může být prováděna metodami běžně známými v oboru pro vazbu - nebo kondenzaci - peptidových frgmentů, jako je azidová metoda, metoda využívající směsného anhydridu, metoda aktivovaného esteru nebo s výhodou karbodiimidová metoda, zvláště s přídavkem katalytických a racemizaci potlačujících sloučenin jako je N-hydroxysukcinimid a Nhydroxybenzotriazol. Přehled se uvádí v publikaci The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, díl 3, E. Gross a J. Meienhofer, ed. (Academie Press, New York, 1981).

Aminové funkční skupiny přítomné ve sloučeninách mohou být v průběhu syntézy chráněny N-ochrannou skupinou, která znamená skupinu běžně používanou v chemii peptidů pro ochranu aaminoskupiny, jako je například skupina terc-butyloxykarbonyl (Boc), skupina benzyloxykarbonyl (Z), skupina 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc), nebo ftaloylová skupina (Phth). Ochranné skupiny mohou být odstraňovány různými způsoby v závislosti na povaze těchto ochranných skupin. Odstraňování ochranných skupin obvykle probíhá za kyselých podmínek a v přítomnosti vychytávajících látek. Přehled ochranných skupin aminoskupin a způsobů jejich odstraňování se uvádí ve výše zmíněné publikaci The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, díl 3.

V » * w » _ g _ ······ ····· · ·

Sloučeniny podle vynálezu, které se mohou vyskytovat ve formě volné báze, mohou být z reakční směsi izolovány ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Farmaceuticky přijatelné soli mohou být také získány působením organické nebo anorganické kyseliny, jako je HCI, HBr, Hl, H2SO4, H₃PO₄, kyselina octová, kyselina propionová, kyselina glykolová, kyselina maleinová, kyselina malonová, kyselina methansulfonová, kyselina fumarová, kyselina jantarová, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina askorbová apod. na volnou bázi vzorce (I).

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu obsahují chirální atomy uhlíku a mohou být proto získány ve formě čistého enantiomerů nebo jako směs enantiomerů jak je v oboru známo, například krystalizaci solí, které se získávají z opticky aktivních kyselin a racemické směsi, nebo chromatograficky s použitím chirálních kolon. Pro diastereomery mohou být použity kolony s normální nebo reverzní fází.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány enterálně nebo parenterálně. Přesné dávky a dávkovači režim těchto sloučenin a prostředků s jejich obsahem budou nutně záviset na potřebách jednotlivce, kterému se léčivo podává, stupně postižení nebo potřebě a úsudku ošetřujícího lékaře. Obecně vyžaduje parenterální podávání nižší dávky než jiné způsoby podávání, které jsou závislejší na absorpci. Denní dávky jsou pro člověka s výhodou 0,001 až 100 mg na kg tělesné hmotnosti, výhodněji 0,01 až 10 mg na kg tělesné hmotnosti.

Farmaceutický prostředek vyráběný s použitím sloučenin podle vynálezu může být také použit jako adjuvans v akutní antikoagulační terapii. V takovém případě se farmaceutický prostředek podává s dalšími sloučeninami použitelnými pro léčení těchto stavů onemocnění.

Ve směsi s farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami, např.

- 9 • · · · jak se popisuje ve standardní publikaci Gennaro a další, Remingtonů Pharmaceutical Sciences, (18, vyd., Mack Publishing Company, 1990, viz zvláště část 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture) mohou být sloučeniny podle vynálezu lisovány do pevných dávkovačích jednotek jako jsou pilulky, tablety, nebo mohou být zpracovány na kapsle nebo čípky. Pomocí farmaceuticky přijatelných kapalin mohou být tyto sloučeniny používány také ve formě roztoku, suspenze, emulze, například pro použití ve formě injekčního preparátu, nebo ve formě spreje, například pro použití jako nosního spreje.

Pro výrobu dávkovačích jednotek, například tablet, se předpokládá použití běžných aditivjako jsou plniva, barviva, polymemí pojivá apod. Obecně lze použít jakéhokoli farmaceuticky přijatelného aditiva, které neinterferuje s funkcí aktivních sloučenin.

Mezi vhodné nosiče použitelné pro tyto prostředky patří laktóza, škrob, deriváty celulózy apod., nebo jejich směsi, použité ve vhodných množstvích.

Vynález je dále ilustrován následujícími příklady,

Příklady provedení vynálezu

Použité zkratky:
DMAP	= N,N-dimethylaminopyridin
TEA	= triethylamin
Z	= benzyloxykarbonyi
Ac	= acetyl
MMTr	= monomethoxytrityl
Bn	= benzyl
DCHA	= dicyklohexylamonium
EDCI	= hydrochlorid 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl -karbodiimidu

»··♦

- 10 • · ···· · · ··· ·· ··

HOBt	= 1-hydroxybenzotriazol
DiPEA	=	diisopropylethylamin
Pyr	=	pyridinyl
TEG	=	tetraethylenglykol
HEG	=	hexaethylenglykol
APA	=	amidinofenylalanin
Cys	=	cystein

Čísla sloučenin se týkají sloučenin uvedených na listech vzorců.

4-O-(4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetvl-a-D-glukopvranosyl)-2,3,6-tri-O-acetvl-a-D-glukopvranosvl)-2,3₁6-tri-O-acetyl-a/3-D-glukopvranosvl-trichloracetimidát (4)

K míchanému roztoku maltotriózy (1) (2,0 g, 4,0 mmol) v pyridinu (100 ml_) byl přidán acetanhydrid (6,2 ml, 65 mmol) a katalytické množství DMAP (0,79 g, 6,5 mmol). Po 5 hod byla reakční směs vlita do vodného hydrogenuhličitanu sodného (1M, 250 ml) a extrahována třikrát ethylacetátem (200 ml). Spojené organické vrstvy byly sušeny nad síranem hořečnatým a zakoncentrovány ve vakuu. Produkt byl čištěn chromatografií na koloně (petrolether/ethylacetát, 1/1 až 0/1, obj./obj.) za získání sloučeniny 2 jako bílé pěny (91% výtěžek, 3,5 g). Anomerická deacetylace byla prováděna zpracováním sloučeniny 2 (3,0 g, 3,1 mmol) 0,1 M roztokem acetátu hydrazinu v dimethylformamidu (34 ml, 3,4 mmol) 1 hod. Po zakoncentrování ve vakuu byla reakční směs zředěna ethylacetátem (50 ml), promyta hydrogenuhličitanem sodným (1M, 3 x 25 ml), sušena (síran hořečnatý) a koncentrována. Čištění chromatografií na koloně silikagelu (petrolether/ethylacetát, 3/2 až 1/0, obj./obj.) poskytlo sloučeninu 3 (92% výtěžek, 2,7 g). Sloučenina 3 (2,7 g, 3,1 mmol) byla rozpuštěna v dichlormethanu (15 ml) a trichloracetonitrilu (1,7 ml) společně s katalytickým množstvím uhličitanu česného (0,2 g, 0,62 mmol). Po 1 hod byla reakční směs zfiltrována a filtrát byl

- 11 - ...... ..... ..

zakoncentrován za sníženého tlaku. Čištění surové sloučeniny 4 chromatografií na koloně (petrolether/ethylacetát/TEA, 50/49/1 až 0/99/1, obj./obj./obj.) poskytlo čistou sloučeninu 4 jako bílou pěnu (1,9 g, 71 %).

N-Benzvloxvkarbonvl-1-aminohexaethvlenglykol-4-Q-(4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetvl-a-D-glukopvranosyl)-2,3,6-tri-O-acetvl-a-D-gluko-pyranosvl)-2,3,6-tri-O-acetvl-3-D-glukopvranosid (6)

Roztok donoru 4 (0,69 g, 0,76 mmol) a akceptoru 5 (0,31 g, 0,76 mmol) v dichlormethanu (1,5 ml_) byl míchán 1 hod v proudu argonu v přítomnosti aktivovaných molekulových sít 4 A (0,4 nm) (250 mg). Roztok byl ochlazen na -20 °C a k reakční směsi byl po kapkách přidán roztok trimethylsilyltrifluormethansulfonátu (15 μΙ) v dichlormethanu (0,6 ml). Po 10 min ukázala analýza TLC (5% methanol v dichlormethanu) přítomnost produktu. Pevný hydrogenuhličitan sodný (0,3 g) byl přidán k reakční směsi, která byla míchána 10 min a potom zfiltrována. Filtrát byl zředěn dichlormethanem (50 ml), a potom promyt vodným hydrogenuhličitanem sodným (1M, 2 x 25 ml), sušen (síran hořečnatý) a zakoncentrován ve vakuu. Zbytek byl čištěn chromatografií na silikagelu (0 až 4% methanol v ethylacetátu) za získání čisté sloučeniny 6 (0,57 g, 56% výtěžek).

N-Benzyloxvkarbonvl-1-aminohexaethvlenglvkol-4-0-(4-Q-(a-D-qluko-pyranosyD-a-D-qlukopyranosyD-ú-D-glukopyranosid (7)

Sloučenina 6 (0,57 g, 0,43 mmol) byla smísena s roztokem tercbutylátu draselného (43 mg, 10 mg na mmol Ac) v methanolu (15 ml). Po 1 hod analýza TLC (ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda, 5/7/4/1,6, obj./obj./obj./obj.) ukázala úplnou přeměnu sloučeniny 6 na 7. Reakční směs byla neutralizována pryskyřicí Dowex 50 WX4-H⁺.

- 12 - ······ ..... ··

Pryskyřice byla odstraněna filtrací a filtrát byl zakoncentrován za sníženého tlaku, za poskytnutí sloučeniny 7'(0,37 g, 95% výtěžek), která byla použita bez dalšího čištění.

N-Benzvloxvkarbonvl-1-aminohexaethvlenqlykol-4-O-(4-Q-(a-D-gluko-PVranosyl-2,3,4,6-tetrakis-(dibenzvlfosfát))-a-D-glukopvranosyl-2,3,6-tris(dibenzylfosfát))-3-D-glukopvranosid-2,3₁6-tris(dibenzylfosfát) (9)

Roztok 1/7-tetrazolu (54 mg, 0,77 mmol) v acetonitrilu (1 ml) byl přidán ke směsi sloučeniny 7 (86 mg, 95 pmol) a 8 (450 mg, 1,4 mmol) ve směsi acetonitril/dioxan (2/1, obj./obj., 2 ml). Po 1 hod míchání při 20 °C byla reakční směs ochlazena v ledové lázni a byl přidán terc-butylhydroperoxid (0,75 ml). Míchání pokračovalo 45 min, poté analýza TLC ukázala přítomnost jednoho hlavního produktu. Čištění chromatografií na koloně silikagelu (100/0 až 95/5, dichlormethan/methanol, obj./obj.) poskytlo čistou sloučeninu 9 (311 mg, 92% výtěžek).

1-Aminohexaethvlenglykol-4-C>-(4-0-(a-D-glukopvranosvl-2,3,4,6-tetra-kisfosfát)-a-D-glukopvranosyl-2,3,6-trifosfát)-[3-D-glukopvranosid-2,3,6-trifosfát (10)

Sloučenina 9 (311 mg, 87 pmol) byla rozpuštěna ve směsi terc-butanol/voda (6/1, obj./obj., 20 ml) obsahující několik kapek kyseliny octové. Roztok byl míchán v kontinuálním proudu vodíku v přítomnosti 10% Pd/C (100 mg). Po 3 hod byl katalyzátor Pd/C odstraněn filtrací a filtrát byl zakoncentrován ve vakuu, lontoměničová pryskyřice Dowex 50 WX4-Na⁺ potom poskytla sloučeninu 10 (179 mg, 98% výtěžek).

• · · · · • · · · •· ···· ··

- 13 N-2-Naftalensulfonvl-S-4-monomethoxytrityl-(L)-cvstein (12)

K míchané směsi komerčně dostupného S-4-monomethoxytrityl-(L)-cysteinu (11) (0,34 g, 1 mmol), dioxanu (5 ml) a 10% vodného uhličitanu sodného (5 ml) byl přidán 2-naftalensulfonylchlorid (0,25 g, 1,1 mmol). Po 1 hod míchání byla reakční směs okyselena přidáním 5% vodné kyseliny citrónové (50 ml) a extrahována ethylacetátem (2 x 50 ml). Spojené organické vrstvy byly sušeny (síran hořečnatý) a koncentrovány za sníženého tlaku. Surový produkt byl čištěn chromatografií na silikagelu (methanol/dichlormethan/triethylamin, 0/99/1 až 4/95/1, obj./obj./obj.) za získání sloučeniny 12 (76% výtěžek, 0,44 g).

N-2-Naftalensulfonyl-S-2-pyridinsulfenyl-(L)-cystein (14)

Roztok kyseliny trifluoroctové a triisopropylsilanu v dichlor-methanu (1/1/18, obj./obj./obj.) byl přidán ke sloučenině 12 (0,44 g, 0,76 mmol). Po 20 min míchání byla směs vlita do vody a extrahována dichlormethanem (2 x 50 ml). Spojené organické vrstvy byly sušeny nad síranem hořečnatým a zakoncentrovány ve vakuu. Stopy kyseliny trifluoroctové v surové směsi byly odstraněny společným odpařováním s toluenem. Získaný volný thiol 13 byl znovu rozpuštěn v isopropanolu (2,5 ml) a přikapáván k roztoku Aldrithiolu™ (1,7 g, 7,6 mmol) ve směsi isopropanol/2N vodná kyselina octová (1/1, obj./obj., 20 ml). Po 1 hod analýza TLC ukázala, že reakce je ukončena a směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku. Stopy kyseliny octové ve zbytku byly odstraněny znovuodpařením v toluenu. Surový produkt byl rozpuštěn v acetonu (10 ml) a byl k němu přidán roztok dicyklohexylaminu (0,3 ml), a poté se sloučenina 14 vysrážela z reakční směsi jako sůl DCHA. Sraženina byla izolována, rozpuštěna v ethylacetátu (50 ml) a promyta 5% vodnou kyselinou citrónovou (2 x 30 ml). Organická vrstva byla sušena (síran hořečnatý) a zakoncentrována za sníženého tlaku, za poskytnutí čisté sloučeniny 14

- 14 (55 % výtěžek, 0,25 g).

N(N(N^a-2-Naftaiensulfonvl-S-2-pvridinsulfenvl-(L)-cvsteinvl)-(D,L)-4-amidinofenylalanyljpiperidin (16)

K roztoku dihydrochloridu N-((D,L)-4-amidinofenylalanyl)-piperidinu (15) (0,13 g, 0,39 mmol) a derivátu cysteinu 14 (0,16 g, 0,39 mmol) v dimethylformamidu (2 ml) byl přidán HOBt (58 mg, 0,42 mmol), EDCI (82 mg, 0,42 mmol) a N-ethylmorfolin (110 pl, 0,78 mmol). Po 16 hod míchání byla směs zředěna dichlormethanem (20 ml) a promyta vodou (2 x 10 ml). Organická vrstva byla sušena (síran hořečnatý) a koncentrována ve vakuu. Zbytek byl čištěn chromatografií na koloně silikagelu (nejprve 10% - 20% methanol v dichlormethanu k odstranění nečistot a potom směs ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda (16/7/1,6/4, obj./obj./obj./obj.) pro uvolnění produktu) a potom gelovou filtrací na materiálu Sephadex LH-20 (eluent: methanol/dichlormethan, 4/1, obj./obj.) za získání homogenní sloučeniny 16 (70 %, 0,19 g).

Kondenzace maltotrióza-dekafosfátu 18 s peptidem 16

K roztoku maltotrióza-dekafosfátu 18 (21 mg, 9,8 pmol) v 0,1 M pufru Na₂HPC>4 (1,0 ml, pH 7,5) byl přidán roztok N-hydroxy-sukcinimidyl-2-bromacetátu v methanolu (1 ml). Po 2 hod míchání byla reakční směs nanesena na kolonu Sephadex G25 a eluována 10% acetonitrilem ve vodě. Příslušné frakce byly spojeny a zakoncentrovány za sníženého tlaku při nízké teplotě (25 °C) za získání sloučeniny 19. Analog NAPAP 16 (10 mg, 15 pmol) byl rozpuštěn ve směsi methanolu (1 ml) a 0,1M pufru Na₂HPO₄ (0,75 ml, pH 7,0) odplyněné průchodem helia a sonikací. K tomuto roztoku byl přidán tributylfosfin (4,1 pl, 16 pmol) a reakční směs byla míchána v atmosféře argonu. Po 1 hod analýza HPLC (Lichrosfer® RP18column) ukázala úplné odštěpení 2-pyridinsulfenylové skupiny a k reakční směsi byl přidán roztok sloučeniny19 v dimethylformamidu (0,25 ml) a 0,1M pufru Na₂HPO₄ (0,50 ml, pH 7,0). Směs byla míchána 3 hod, potom byla surová směs čištěna gelovou filtrací (Fractogel HW40, eluent: 0,15M TEAB). Zakoncentrování příslušných frakcí a následná výměna iontů na materiálu Dowex 50 WX-Na⁺ poskytly po lyofilizaci homogenní konjugát I (10,1 mg, 47% výtěžek). Tyto dva diastereoisomery byly odděleny semipreparativní chromatografii HPLC (LiChrosfer® RP-18 column, gradient: 17,5 % - 22,5 % CH3CN v 0,05M vodném TEAA) za poskytnutí diastereoisomeru l-a (retenční čas: 28,6 min) a diastereoisomeru l-b (retenční čas: 33,0 min). Tyto dva isomery byly odsoleny gelovou filtrací (Sephadex G-25 DNA-grade Superfine), převedeny do Na⁺-formy s použitím iontoměničové pryskyřice Dowex 50 WX-Na⁺.

Diastereoisomer l-a: ¹H NMR (D₂O, 600 MHz, HH-COSY): maltotrióza: (redukující konec) 4,65 (bs, 1H, H1), 3,85 (m, 1H, H2),

4.35 (m, 1H, H3), 3,76 (m, 1H, H4); 5,50 (bs, 1H, H1’), 4,18 (m, 1H, H2’), 4,10 (m, 1H, H4’); (neredukující konec) 5,71 (bs, 1H, H1”), 4,09 (m, 1H, H2”), 4,45 (m, 1H, H3”), 4,15 (m, 1H, H4”); 3,95-3,84 (H5, maltotrióza); mezerníková skupina; 3,65-3,51 (m, 22H, OCH₂ HEG),

3.35 (m, 2H, CH₂NH₂), 3,15 (s, 2H, SCH₂(O)); peptid; 8,31 (s, 1H, HaromNAS), 8,06-7,67 (m, 6H, H_aromNAS), 7,70, 7,17 (2 x d, 4H, H_arom APA, J=7,Q Hz), 4,28 (m, 1H, aCH APA), 3,91 (m, 1H, ctCH Cys), 3,303,04 (m, 4H, CH₂N piperidin), 2,82-2,62 (m, 3H, pCH₂ Cys, pCH APA), 2,57 (m, 1H, pCH’ APA), 1,45-1,25 (m, 6H, CH₂ piperidin); ES-MS: [M3H]³' 724,1, [M-2H]²' 1086,7.

Diastereoisomer 1-b: ¹H NMR (D₂O, 600 MHz, HH-COSY): maltotrióza: (redukující konec) 3,80 (m, 1H, H2), 4,32 (m, 1H, H3), 3,89 (m, 1H, H4); 5,49 (bs, 1H, H1j, 4,22 (m, 1H, H2’), 4,11 (m, 1H, H4’); (neredukující konec) 5,70 (bs, 1H, H1”), 4,22 (m, 1H, H2”), 4,52 (m, 1H, H3”), 4,24 (m, 1H, H4’j; 3,91-3,84 (H5, maltotrióza);

• « · · 0 · · · · · »0 0 00000 « 0 0 mezerníková skupina; 3,63-3,52 (m, 22H, OCH₂ HEG), 3,35 (t, 2H, CH₂NH₂), 3,17 (AB, 2H, SCH₂(O)); peptid: 8;35 (s, 1H . Harom NAS), 8,07-7,65 (m, 6H, H_arom NAS), 7,77, 7,22 (2 x d, 4H, H_arom APA, J=7,8 Hz), 4,62 (t, 1H, aCH APA, J_aCH,pcH=7,3 Hz), 4,05 (m, 1H, aCH Cys), 3,05-3,00 (m, 4H, CH₂N piperidin), 2,85-2,67 (m, 4H, βΟΗ₂ Cys, pCH₂ APA), 1,88-1,24 (m, 6H, CH₂ piperidin);

ES-MS: [M-3H]³'724,0, [M-2H]²'1086,2.

N-Hydroxvsukcinimidyl-14-S-2-pyridinsulfenvl-14-merkapto-3,6,9,12-tetraoxatetradekanoát (22)

Mezerníková skupina 20 (0,75, 2,44 mmol) (P. Westerduin a další, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 3, str. 331 - 333) a Aldrithiol™ (2,6 g, 12,1 mmol) byly rozpuštěny v dichlormethanu (20 ml) a zpracovány n-butylamínem (4 ml). Po míchání 2 hod byla reakční směs zakoncentrována ve vakuu, znovu rozpuštěna v dichlormethanu (50 ml) a promyta 5% vodnou kyselinou citrónovou (2 x 50 ml). Organická vrstva byla sušena a zakoncentrována za sníženého tlaku. Chromatografie na koloně silikagelu (methanol/kyselina octová/dichlormethan, 0/1/99 až 6/1/93, obj./obj./obj.) zbytku poskytla čistou sloučeninu 21 (0,80 g, 88% výtěžek). Sloučenina 21 (0,80 g, 2,1 mmol) byla rozpuštěna v dichlormethanu (10 ml) a N-hydroxysukcinimidu (0,26 g, 2,3 mmol) a k tomuto roztoku byl přidán EDCI (0,45 mg, 2,3 mmol). Po 1 hod byla reakční směs zředěna dichlormethanem (50 ml), třikrát promyta ledovou vodou (20 ml), sušena (síran hořečnatý), zakoncentrována za získání látky 22 (0,98 mg, 98% výtěžek,), která byla použita bez dalšího čištění.

• fc

- 17 «· · · fc··· ·· · • ♦ » · · · » • « · » * fc · * « » -» • · · · · * fc··· * • · » · · · · · « • · · · · · ·· ··· ·· ·-*>

NMerc-Butvloxvkarbonyl-N^a-benzensulfonvl-(L)-lysin (24)

Tato sloučenina byla připravena podle popisu pro sloučeninu 12, s použitím látky 23 a benzensulfonylchloridu jako výchozích materiálů (0,86 g, 75% výtěžek).

N^e-(14-S-2-Pyridinsulfenyl-14-merkapto-3,6,9,12-tetraoxatetra-dekanoyl)-N^a-benzensulfonvl-(L)-lvsin (26)

Sloušenina 24 (0,86 g, 2,2 mmol) byla zpracována 3N chlorovodíkem v ethylacetátu. Po 15 min byla reakční směs zakoncentrována ve vakuu. Stopy kyseliny ve zbytku byly odstraněny společným odpařením s toluenem. Surová látka 25 byla rozpuštěna ve směsi dioxan/voda (4/1, obj./obj., 2,5 ml) a k tomuto roztoku byly přidány sloučenina 22 (0,98 g, 2,1 mmol) a DiPEA (1,1 ml, 6,6 mmol). Po 1 hod byla reakční směs zředěna dichlormethanem (100 ml) a promyta 5% vodnou kyselinou citrónovou (2 x 50 ml). Organická vrstva byla sušena (síran hořečnatý) a zakoncentrována ve vakuu. Zbylý olej byl čištěn chromatografií na koloně silikagelu (0 - 10% methanol/ethylacetát) za získání homogenní sloučeniny 26 (0,95 g, 67% výtěžek).

N(N(N^E-(14-S-2-Pyridinsulfenyl-14-merkapto-3,6,9,12-tetraoxatetra-dekanovl)-N^0c-benzensulfonvl-(L)-lvsinyl)-(D,L)-4-amidinofenvlalanyl)-piperidin (27)

Tato sloučenina byla připravena podle popisu uvedeného pro sloučeninu 16, s použitím látek 26 a 15 jako výchozích materiálů (87 mg, 70% výtěžek).

• ·Μ • * « « « · · » >» * · * « « a * 9 · * a a a < ···« a a · « · · » »· « · ·

- 18 - .....* ·· *·· ·*

Kondenzační vazba maltotrióza-dekafosfátu 18 s peptidem 27 (II)

Příprava probíhala tak jak bylo popsáno pro I, s použitím látek 18 a 27 jako výchozích materiálů. Čištění surové látky II bylo prováděno semipreparativní HPLC (LiChrosfer® RP-18 column). Následné odsolení gelovou filtrací (Sephadex G-25 DNA-grade Superfine), převedení na Na⁺-formu použitím iontoměničové pryskyřice Dowex 50 WX4-Na⁺ a lyofilizace poskytly čistou látku II jako bílou sypkou pevnou látku (8,5 mg, 23% výtěžek z 18).

¹H NMR (D₂O, 600 MHz, HH-COSY): maltotrióza: (redukující konec) 4,67 (m, 1H, H1), 4,07 (m, 1H, H2), 4,40 (m, 1H, H3), 4,06 (m, 1H, H4); 5,49 (bs, 1H, H1 ’), 4,24 (m, 1H, H2’), 4,66 (m, 1H, H3’), 4,10 (m, 1H, H4’); (neredukující konec) 5,73 (bs, 1H, H1”), 4,17 (m, 1H, H2”), 4,38 (m, 1H, H3”), 4,22 (m, 1H, H4”); 3,95-3,82 (H5, maltotrióza); mezerníková skupina: 4,03, 4,02 (2 x s, 2H, OCH₂C(O)), 3,73-3,59 (m, 36H, OCH₂ TEG, HEG), 3,38 (t, 2H, CH₂NH₂), 3,27, 3,26 (2 x s, 2H, SCH₂(O)), 2,75 (2 x t, 2H, CH₂S); peptid: 7,81-7,52 (m, 5H, HaromBS), 7,79, 7,76, 7,42, 7,41, (4 x d, 4H, H_arom APA), 4,87, 4,66 (2 x t, 1H, aCH APA, J_aCH,pc_H=7,4 Hz), 4,07 (m, 1H, aCH Lys), 3,37-3,73 (m, 8H, sCH₂ Lys, βΟΗ₂ APA, CH₂N piperidin), 1,96-1,46 (m, 12H, CH₂ piperidin, β/γ, δ CH₂ Lys);

ES-MS: [M+3H]³⁺ 801,2, [M+2H]²⁺ 1200,8.

Částečně chráněny pentasacharid 30

Známý pentasacharid 29 (53 mg, 49 μιτιοΙ) (R. C. Buijsman a další, Chem. Eur. J. 1996, 2, 12, str. 1572 - 1577) byl rozpuštěn v dimethylformamidu (0,25 ml) a vodě (1 ml) a byl zpracován N-(benzyloxykarbonyloxy)-sukcinimidem (18 mg, 72 pmol) a N-ethylmorfolinem (18,6 ml). Po míchání 15 min odhalila analýza TLC (ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda, 5/7/1,6/4, obj./obj./obj./obj.) ukončení reakce a reakční směs byla přímo nanesena na kolonu RP• 9 ·· ·

Τ 9 · v • · · · · « · · • * * · ·· ·

- 19 18, která byla eluována směsí voda/methanol (90/10 až 60/40). Vodné frakce byly spojeny a zakoncentrovány na maíý objem a naneseny na iontoměničovou kolonu Dowex 50 WX4-H' ve vodě. Eluát byl zakoncentrován ve vakuu za získání čisté sloučeniny 30 (54 mg, 91% výtěžek).

Sulfatovany pentasacharid 32

Sloučenina 30 (54 mg, 45 pmol) byla rozpuštěna v dimethylformamidu (1 ml). Byl přidán komplex triethylamin-oxid sírový (0,51 g, 5 ekv. na každou hydroxylovou skupinu) a směs byla míchána v atmosféře dusíku při 55 °C 16 hod. Potom byla směs ochlazena na 0 °C a byl přidán vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (5 ekv. na každý ekvivalent komplexu triethylamin-oxid sírový). Směs byla míchána 1 hod, zakoncentrována na malý objem a nanesena na kolonu Sephadex G-25, která byla eluována 10% acetonitrilem ve vodě. Vhodné frakce byly spojeny a zakoncentrovány na malý objem, který byl potom nanesen na kolonu Dowex 50 WX4 (Na⁺ forma) s elucí vodou. Eluát byl zakoncentrován a znovu rozpuštěn v 0,2N chlorovodíku (1 ml) a ponechán stát 16 hod při 4 °C. Reakční směs byla neutralizována 0,1N hydroxidem sodným a odsolena na koloně Sephadex G-25 a eluována 10% acetonitrilem ve vodě za získání homogenní sloučeniny 31. Sloučenina 31 byla rozpuštěna ve směsi terc-butanol/voda (6/1, obj./obj., 20 ml) obsahující několik kapek kyseliny octové. Roztok byl míchán v kontinuálním proudu vodíku v přítomnosti 10% Pd/C (100 mg). Po 3 hod byl katalyzátor Pd/C odstraněn filtrací a filtrát byl zakoncentrován ve vakuu za poskytnutí čisté látky 32 (60 mg, 60% výtěžek).

»« *··· • · · * • ς · #··<·* e · » · · * · _ 20 - ’··* ···· ·· ··· ’·

Kondenzace pentasacharidu 32 s peptidem 16

Pentasacharid 32 (15 mg, 6,5 pmol) byl rozpuštěn v 0,1M NaH2PO₄ pufru (2 ml, pH 7,5) a k tomuto roztoku byl přidán sulfoSIAB™ (16 mg, 33 pmol). Po míchání 3 hod v temnu ukázala analýza HPLC (monoQ, aniontová pryskyřice), že reakce je úplná, a surová sloučenina 34 byla čištěna na koloně Superdex 30 (10% acetonitril ve vodě). Příslušné frakce byly spojeny a zakoncentrovány ve vakuu při nízké teplotě (25 °C). K roztoku NAPAP analogu 16 (9 mg, 14 pmol) ve směsi methanolu (1 ml) a 0,1M Na2HPO₄ pufru (0,75 ml, pH 7,0), odplyněnému průchodem helia a sonikací před použitím, byl přidán tributylfosfin (3,9 pl, 15 pmol). Po míchání 1 hod v atmosféře argonu ukázala analýza HPLC (Lichrospher® RP-18) úplné odštěpení 2-pyridinsulfenylové skupiny. Roztok derivatizovaného pentasacharidu 34 v dimethylformamidu (0,25 ml) a 0,1M Na₂HPO₄ pufru (0,50 ml, pH 7,0) byly přidány a směs byla míchána 3 hodiny. Surový produkt byl nanesen na kolonu Sephadex G-50, která byla eluována 10% acetonitrilem ve vodě. Vhodné frakce byly spojeny, zakoncentrovány na malý objem a odsoleny na koloně Superdex 30, která byla eluována 10% methanolem ve vodě. Zakoncentrování a lyofilizace poskytly konjugát III jako bílou pevnou látku (9 mg, 52 % výtěžek).

¹H NMR (D₂O, 600 MHz, HH-COSY): δ 3,60, 3,53, 3,43 (3 x s, 9H, CH₃O_e,g,h): kruh D: 5,53 (m, 1H, H1), 4,15 (m, 1H, H2), 4,58 (m, 1H, H3), 3,56 (m, 1H, H4), 3,92 (m, 1H, H5), 4,26, 4,13 (2 x m, 2H, H6, H6’); kruh E: 4,70 (d, 1H, H1, /₂ =8,1 Hz,), 4,21 (m, 1H, H2), 3,62 (m, 1H, H3), 3,92 (m, 1H, H4), 3,74 (m, 1H, H5); kruh F: 5,39 (d, 1H, H1, J_1>2=3,8 Hz), 4,22 (m, 1H, H2), 4,56 (m, 1H, H3), 3,83 (t, 1H, H4, J₃,₄=J_4i5=9,8 Hz), 4,12 (m, 1H, H5); kruh G: 5,15 (bs, 1H, H1), 4,35 (m, 1H, H2), 3,76 (m, 1H, H3), 4,21 (m, 1H, H4), 4,80 (m, 1H, H5); kruh H: 5,10 (d, 1H, H1, J_1>2=3,6 Hz), 4,31 (m, 1H, H2), 4,54 (m, 1H, H3), 4,21 (m, 1H, H4); mezerníková skupina: 7,51, 7,53, 7,13, 7,12 (4 x d, 4H, H_ar_Om SIAB), 3,73 (m, 2H, CH₂CH₂NH₂), 3,66 (m, 12H,

- 21 OCH₂ TEG), 3,31 (m, 2H, CH₂NH₂); peptid: 8,27, 8,22 (2 x s, 1H, HaromNAS) 7,98-7,60 (m, 6H, H_arom NAS), 7,71>7,64, 7,46, 7,44 (4 x d, 4H, H_arOm APA), 4,60, 4,45 (2 x t, 1H, aCH APA, J_aCH,pcH=6,6 Hz), 4,00, 3,97 (2 x m, 1H, aCH Cys), 3,10-2,85 (m, 4H, CH₂N piperidin), 2,82-2,70 (m, 3H, βΟΗ₂ Cys, pCH APA), 2,61 (m, 1H, βΟΗ’ APA), 1,55-1,15 (m, 6H, CH₂ piperidin);

ES-MS: [M-H]’2680,6.

Použitím podobných způsobů byly připraveny následující sloučeniny:

HN (IV);

• · • · · · • · · · ·

HN (VI).

- 23 Biologické aktivity sloučenin podle předkládaného vynálezu byly stanoveny následujícími testy.

I. Antithrombinovy test

Thrombin (faktor lla) je faktor, který se účastní koagulační kaskády.

Antithrombinová aktivita sloučenin podle předkládaného vynálezu byla testována spektrofotometrickým měřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu s-2238 uskutečňované thrombinem. Tento test na antithrombinovou aktivitu v systému pufru byl použit pro zjištění hodnoty IC₅o pro testovanou sloučeninu.

Testovací medium: Pufr tromethamin-NaCI-polyethylenglykol

6000 (TNP)

Referenční sloučenina: 12581 (Kabi)

Vehikulum: Pufr TNP

Je možno napomáhat solubilizaci pomocí dimethylsulfoxidu, methanolu, ethanolu, acetonitrilu nebo terc.-butylalkoholu, které nemají nepříznivá vliv v koncentracích až do 2,5 % v hotové reakční směsi.

Technika: Reagencie*

1. Pufr tromethamin-NaCI (TN)

Složení pufru:

Tromethamin (Tris) 6,057 g (50 mmol)

NaCl 5,844 g (100 mmol)

Voda do 1 I pH roztoku se nastaví na 7,4 při 37 °C pomocí HCI (10 mmol.l'¹).

• ·

- 24 2. PufrTNP

Polyethylenglykol 6000 se 'rozpustí v pufru TN pro dosažení koncentrace 3 g.l'¹.

3. Roztok S-2238.

Jedna lahvička S-2238 (25 mg; Kabi Diagnostica, Švédsko) se rozpustí ve 20 ml pufru TN za získání koncentrace 1,25 mg.ml·¹ (2 mmol.l·¹).

4. Roztok thrombinu.

Lidský thrombin (16 000 nKat.lahvička'¹; Centraal Laboratorium voor Bloedtransfusie, Amsterdam, Holandsko) se rozpustí v pufru TNP za poskytnutí zásobního roztoku 835 nKat.ml'¹.

Bezprostředně před použitím se tento roztok zředí pufrem TNP pro dosažení koncentrace 3,34 nKat.ml'¹.

* Všechny použité chemikálie jsou čistoty pro analýzu.

Pro přípravu vodných roztoků se používá ultračistá voda (jakost Milli-Q).

Výroba roztoků testovaných a referenčních sloučenin

Testované a referenční sloučeniny se rozpustí ve vodě Milli-Q za získání koncentrací zásobních roztoků 10'² mol.l'¹. Každá koncentrace se postupně ředí vehikulem za získání koncentrací 10'³, 10'⁴ a 10'⁵ mol.l'¹. Ředění včetně zásobního roztoku se použijí při testu (konečné koncentrace v reakční směsi 3.10'³; 10'³; 3.10'⁴; 10'⁴; 3.10'⁵; 10'⁵; 3.10'⁶a 10'⁶ mol.l'¹.

Postup

Při laboratorní teplotě se 0,075 ml a 0,025 ml roztoků

- 25 testované sloučeniny nebo referenční sloučeniny nebo vehikula střídavě pipetuje do jamek mikrotítrační destičky a tyto roztoky se ředí 0,115 ml a 0,0165 ml pufru TNP. Do každé jamky se přidá alikvot 0,030 ml roztoku S-2238 a destička se předehřeje a předinkubuje za třepání v inkubátoru (Amersham) po dobu 10 min při 37 °C. Po předinkubaci se zahájí hydrolýza S-2238 přídavkem 0,030 ml roztoku thrombinu do každé jamky. Destička se inkubuje (za třepání 30 s) při 37 °C. Počínaje 1 min po začátku inkubace se měří absorbance každého vzorku při 405 nm každé 2 min po dobu 90 min s použitím čtečky mikrotitračních destiček pro kinetická měření (Twinreader plus, Flow Laboratories).

Všechny údaje se shromažďují na osobním počítači IBM s použitím softwaru LOTUS-MEASURE. U každé koncentrace sloučeniny (vyjádřené v mol.l'¹ reakční směsi) a pro blank se vynese absorbance proti době reakce v minutách.

Vyhodnocení výsledků

Pro každou konečnou koncentraci byla z vynesených výsledků testu vypočtena maximální absorbance. Hodnota IC₅₀ (konečná koncentrace, vyjádřená v μιτιοΙ.Γ¹, která způsobí 50% inhibici maximální absorbance blanku) byla vypočtena s použitím transformační analýzy logit podle Hafner a další (Arzneim.Forsch./Drug Res. 1977; 27 (II): 1871-3).

- 26 Antithrombinová aktivita:

Příklad	IC5o (mol.I'1)
I (jeden diastereomer)	2 x 10'7
II	8 x 10'6
III	3,5 x 10’7

11. Test anti-Xa aktivity

Aktivovaný faktor X (Xa) je faktor v koagulační kaskádě. Aktivita sloučenin podle předkládaného vynálezu proti faktoru Xa byla zjišťována spektrofotometrickým měřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu S-2222 působením Xa. Tento test na anti-Xa aktivitu v systému pufru byl použit pro zjištění hodnoty IC₅₀ testované sloučeniny.

Obecně byly následující postup a podmínky testu analogické jako v případě antothrombinového testu popsaného výše. Rozdíly jsou uvedeny níže.

Referenční sloučenina: Be n z a m i d i n

Vehikulum: pufr TNP

Solubilizaci je možno usnadnit použitím dimethylsulfoxidu, methanolu, ethanolu, acetonitrilu nebo terc.-butylalkoholu, které nemají nepříznivý vliv v koncentracích až do 1 % (pro DMSO) a 2,5 % (pro jiná rozpouštědla) v konečné reakční směsi.

Technika: Reagencie*:

3. Roztok S-2222

- 27 * · · · ·

Jedna lahvička S-2222 (15 mg; Kabi Diagnostica, Švédsko) se rozpustí v 10 ml vody za získání koncentrace 1,5 mg.ml'¹ (2 mmol.l'¹).

4. Roztok Xa

Látka Bovine Factor Xa Human (71 nKat.lahvička'¹; Kabi Diagnostica) se rozpustí v 10 ml pufru TNP a potom se dále zředí 30 ml pufru TNP za získání koncentrace 1,77 nKat.ml'¹. Roztok musí být připraven vždy čerstvý.

Postup:

Namísto roztoku S-2238 (při antithrombinovém testu se do každé jamky přidá při tomto testu výše definovaný roztok S-2222.

Aktivita anti-Xa

Příklad	U/mg
III	885

List vzorců 1

IV

• «

- 29 List vzorců 2

HN • · « · • · • · · · * ·

List vzorců 3

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   - 33 1. Sloučenina obecného vzorce (I) Z kde R¹ je skupina fenyl, naftyl, 1,2,3,4-tetrahydronaftyl, (iso)ch inolinyl, tetrahydro(iso)chinolinyl, 3,4-dihydro-1 H-isochinolinyl, chromanyl nebo kafr, kde tyto skupiny mohou být popřípadě substituovány jedním nebo více substituenty zvolenými ze skupiny (1 -8C)alkyl nebo (1-8C)alkoxy;

   R² a R³ jsou nezávisle H nebo (1 -8C)alkyl;

   R⁴ je (1-8C)alkyl nebo (3-8C)cykloalkyl; nebo

   R³ a R⁴ spolu s atomem dusíku, na který jsou navázány, znamenají nearomatický 4 až 8 členný kruh popřípadě obsahující další heteroatom, kde tento kruh je popřípadě substituovaný skupinami (1 -8C)alkyl nebo SO2-(1-8C)alkyl;

   Q je mezerníková skupina o délce řetězce 10 až 70 atomů; a

   Z je záporně nabitý oligosacharidový zbytek obsahující dvě až šest monosacharidových jednotek, přičemž náboj je kompenzován kladně nabitými protiionty;

   nebo její farmaceuticky přijatelná sůl nebo prekurzor.

   • · · · · · • · · · * • · · ····· ·
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde skupina Z je odvozena z oligosacharidu, který má sám o · sobě anti-Xa aktivitu zprostředkovanou AT-III.
3. 3. Sloučenina podle nároku 2, kde Z je pentasacharidový zbytek.
4. 4. Sloučenina podle nároku 3, kde Z má vzorec (II) kde skupina R⁵ znamená nezávisle OSO3· nebo (1-8C)alkoxy.
5. 5. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 4, kde skupina R¹ je fenyl, 4-methoxy-2,3,6-trimethylfenyl nebo naftyl; R² je H; a NR³R⁴ znamená piperidinyiovou skupinu. ⁶
6. 6. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 5, kde Q má vzorec (NI)

   -[(CH₂)₂O]_m-[(CH₂)_n-NR³-C(O)]p-W-(CH₂)_s- (III), kde

   W je -[1,4-fenylen-NR³-C(O)j_q-(CH₂)_r-Snebo

   -(CH₂)t-S-(CH₂)_u-[O(CH₂)₂]_v-O-(CH₂)_w-C(O)-NR³-; a R³ znamená nezávisle H nebo (1 -8C)alkyl;

   - 35 m = 1 až 12; η = 1 až 8; ρ = Ο až 4; q = Ο nebo 1; r = 1 až 8; s = 1 až 8; t = 1 až 8; u = 1 až 8; v = 1 až 12; w = 1 až 8; celkový počet atomů je 10 až 70; a skupina -[(CH₂)₂O]m- je koncová skupina, prostřednictvím které je skupina Q navázána na Z.
7. 7. Sloučenina podle nároku 6, kde skupina Q je zvolena z

   -[(CH₂)2O]₅-(CH2)2-NH-C(O)-CH₂-S-CH2-;

   -[(CH₂)₂O]5-(CH₂)2-NH-C(O)-CH₂-S-(CH₂)2-[O(CH₂)₂]3-O-CH₂-C(O)-NH-(CH₂)₄-; a

   -[(CH₂)2O]3-(CH2)2-NH-C(O)-1,4-fenylen-NH-C(O)-CH2-S-CH₂-.
8. 8. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, ž e obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 7 a farmaceuticky vhodné pomocné látky.
9. 9. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 7 pro použití při léčení.
10. 10. Použití sloučeniny podle některého z nároků 1 až 7 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci trombózy nebo jiných onemocnění souvisejících s thrombinem.