ES2325549T3 - Oligosacaridos, procedimiento de preparacion, utilizacion y composiciones farmaceuticas que los contienen. - Google Patents
Oligosacaridos, procedimiento de preparacion, utilizacion y composiciones farmaceuticas que los contienen. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de despolimerización de un polisacárido con propiedad anti-trombótica, para la obtención de un producto que tiene propiedades anticancerosas, caracterizado porque comprende una etapa en la que el polisacárido se despolimeriza por la heparinasa I hasta que su actividad anti-trombótica, debida principalmente a la inhibición de los factores Xa y IIa, es esencialmente anulada (<35 Ul/mg)y porque la despolimerización se realiza a una temperatura comprendida entre 10 y 20ºC.
Description
Oligosacáridos, procedimiento de preparación,
utilización y composiciones farmacéuticas que los contienen.
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos químicos, particularmente nuevos oligosacáridos, a su
procedimiento de preparación, a su utilización y a las composiciones
farmacéuticas que los contienen. Estos oligosacáridos son útiles
para el tratamiento del cáncer, en particular la prevención e
inhibición de la formación de metástasis.
Más particularmente, la invención se refiere,
según un primer aspecto, a un procedimiento de despolimerización de
un polisacárido que tiene en un principio propiedades
anti-trombóticas.
Son conocidos los procedimientos de
despolimerización de polisacáridos con propiedades
anti-trombóticas. Estos procedimientos tienen en
común:
- -
- el objetivo de obtener oligosacáridos de masa molecular media inferior, con el fin de limitar los efectos secundarios que sobrevienen cuando los polisacáridos de partida se utilizan como medicamentos;
- -
- mantener una actividad antitrombótica satisfactoria después de la despolimerización.
Los polisacáridos con propiedades
anti-trombóticas comerciales tales como la heparina
o las heparinas de bajo peso molecular tales como Enoxaparina,
tinzaparina, fragmina, son todos inhibidores de la heparanasa.
En condiciones fisiológicas normales, las
células expresan la enzima heparanasa. Esta enzima permite regular
indirectamente la mitogénesis, la
neo-vascularización y la reparación de los tejidos.
Uno de los mecanismos de acción de la heparanasa es escindir el
proteoglicano de sulfato de heparán (el heparán sulfato
proteoglicano (HSPG)). Este glicosaminoglicano está presente en la
superficie de las células endoteliales y asegura la cohesión de la
membrana basal (matriz extracelular). La escisión del proteoglicano
de sulfato de heparán conlleva la liberación de factores de
crecimiento tales como el FGF2. La liberación de los factores de
crecimiento es necesaria para la mitogénesis y la angiogénesis. Sin
embargo, esto no es suficiente para desencadenar estos mecanismos
biológicos, es necesario que el FGF2 se fije a un glicosaminoglicano
para generar una modificación alostérica de la proteína y favorecer
su interacción con su receptor. De hecho, mediante la escisión de
HSPG, la heparanasa genera fragmentos de sulfato de heparán que se
van a fijar al FGF2 y van a favorecer la interacción con sus
receptores y así inducir los mecanismos biológicos mencionados
anteriormente. La escisión del HSPG de la matriz extracelular y la
desestructuración de los capilares permite la extravasación
celular.
La heparanasa está sobreexpresada por las
células tumorales y favorece por lo tanto las metástasis y su
neovascularización. Estos fenómenos son esenciales para la
propagación y la supervivencia del tumor canceroso.
La heparina, un glicosaminoglicano
estructuralmente cercano al sulfato de heparán es conocida por ser
un inhibidor potente de la heparanasa. Este efecto se ha atribuido
durante mucho tiempo a la presencia de la secuencia específica de
unión a ATIII. En efecto, esta secuencia, aunque menos presente en
el sulfato de heparán, es común a estos dos glicosaminoglicanos. La
zona de escisión de la heparanasa está representada a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El punto de escisión de esta
\beta-endo glicosidasa está situado en el centro
de la secuencia mínima de fijación a ATIII. Se puede pensar por lo
tanto que las propiedades antitrombóticas y de inhibición de la
heparanasa están íntimamente asociadas (de hecho la heparina es un
sustrato competitivo del sulfato de heparán). Debido a ello, es
difícil utilizar este glicosaminoglicano como agente
anti-metastásico. En efecto, sus fuertes propiedades
anti-coagulantes limitan su margen terapéutico e
inducen efectos secundarios graves tales como hemorragias severas.
Además, la inyección repetida de heparina puede conllevar en ciertos
casos trombocitopenias que conllevan un resultado fatal (reacción
inmunológica ligada a la asociación entre la heparina y el factor
plaquetario 4 (PF4)).
Pocos documentos revelan los vínculos entre la
estructura de los oligosacáridos y sus propiedades
anti-heparanasa, en correlación con una actividad
anti-metastásica. Así, Bitan et al. (Isr. J.
Med. Sci. 1995; 31: 106-118) precisa las
condiciones estructurales requeridas para la inhibición de la
colonización de melanomas pulmonares por especies de heparina que
inhiben la heparanasa: La heparanasa es inhibida eficazmente por
fragmentos de heparina que contienen 16 azúcares o más (resumen;
fig.2, p.110; fig.3, p.111; p. 116, col. de la derecha, 2^{a}
frase). Los hexasacáridos se describen como malos inhibidores de la
heparanasa (Fig.8, p.115). Además, se dice que la inhibición de la
heparanasa no es posible más que con moléculas que tienen una masa
molecular superior o igual a al menos 4.000 daltons (resumen,
p.116, col. de la derecha, 4^{a} frase). Sin embargo, el método
de determinación de la inhibición de la heparanasa es un método
indirecto, ya que consiste en la evaluación de la aptitud de las
células para degradar la matriz extra-celular en
presencia de diferentes productos a ensayar (p.108; col. de la
derecha, 2º párrafo "Degradation of Sulfated Proteoglycans").
No es por lo tanto específica de la heparanasa. Además, todos los
productos descritos se obtienen por un método de escisión de la
heparina por vía química (ácido nitroso) (p.108; col. de la
izquierda, 2^{0} párrafo "Heparin-Derived
Oligosaccharides").
Véanse también:
- Vlodavski I, et al. Modulation of neovascularization and metastasis by species of heparin, Heparin and related Polysaccharides, D.A. Lane, et al., Editor, Plenum Press, Nueva York, 1992;
- Parish C R, et al. Evidence that sulphated polysaccharides inhibit tumor metastasis by blocking tumor-cell-derived heparanases, Int. J. Cancer 40: 511-518, 1987.
\vskip1.000000\baselineskip
Hasta la fecha, existe una necesidad importante
de compuestos anti-metastásicos, y para la que no
hay una solución comercialmente aceptable. Los poli- y
oligo-sacáridos inhibidores de la heparanasa
conocidos en la actualidad provienen directamente de fuentes
naturales (heparina) o de procedimientos más o menos difíciles de
poner en práctica (algunas heparinas de bajo peso molecular) y que
presentan un componente anti-trombótico marcado,
que no es compatible con un tratamiento anticanceroso,
principalmente cuando el paciente que se va a tratar es sensible a
las hemorragias.
Uno de los problemas actuales es por lo tanto
obtener un producto que presenta una actividad
anti-heparanasa significativa, esencialmente
desprovisto de actividad anti-trombótica, a través
de un método simple y reproducible.
Con este fin, y de manera sorprendente, se ha
encontrado que un nuevo procedimiento de despolimerización de un
polisacárido que tiene en un principio propiedades
anti-trombóticas, en el que el polisacárido se
despolimeriza por la heparinasa I a una temperatura comprendida
entre 10ºC y 20ºC hasta que su actividad
anti-trombótica, debida principalmente a la
inhibición de los factores Xa y IIa, se anula esencialmente (<35
Ul/mg), permite obtener un producto que conserva una actividad
anti-heparanasa significativa.
Este procedimiento constituye por lo tanto un
medio eficaz de obtención de productos enriquecidos en sitio
anti-heparanasa del polisacárido, eliminando su
componente anti-trombótico. El procedimiento se
explota más ventajosamente cuando la despolimerización del
polisacárido se continúa hasta que su actividad
anti-trombótica es inferior a 20 UI/mg.
Más particularmente, la despolimerización se
continúa hasta alcanzar una masa molecular media inferior a 5.000
Da, preferentemente inferior a 3.000 Da.
Contra toda previsión, el producto obtenido por
este procedimiento simple de poner en práctica, contiene
principalmente hexasacáridos que son buenos inhibidores de la
heparanasa. Además, estos hexasacáridos tienen una masa molecular
media claramente inferior a 4.000 daltons, porque está generalmente
comprendida entre 1.000 y 2.000 daltons.
El polisacárido es preferentemente una
heparina.
La despolimerización se continúa ventajosamente
hasta que la mezcla de la fracción hexacarídica esté esencialmente
exenta de hexasacáridos sulfatados
\DeltaIs-Is_{id}-Is_{id} y.
\DeltaIs-Is_{id}-IIS_{glu}.
Las enzimas se utilizan habitualmente en
condiciones denominadas "fisiológicas", es decir, en las
condiciones en las que funcionan habitualmente
in-vivo en los organismos a partir de los
cuales se extraen (principalmente: pH, temperatura, fuerza iónica,
opcionalmente cofactores físicos (luz...) o químicos
(coenzimas...). La mayoría de las enzimas pueden utilizarse
corrientemente a temperaturas superiores a su temperatura
fisiológica, por ejemplo 45-50ºC. En nuestra
situación, y contra toda previsión, se ha observado que la
despolimerización puede incluso tener lugar a una temperatura
comprendida entre 10 y 20ºC, en particular de 16ºC, en condiciones
de selectividad y de cinética aceptables, conservando así de la
mejor forma los compuestos inhibidores de la heparanasa formados
durante la reacción de despolimerización. Además, esto permite
limitar la concentración final de heparinasa I en el medio de
reacción al final de la reacción. En efecto, la realización de la
reacción a una temperatura inferior a la temperatura óptima de
reacción de la heparinasa I, que se puede situar aproximadamente a
25-45ºC, permite evitar proceder a adiciones
excesivas de enzima durante la reacción. Las adiciones de enzima se
efectúan habitualmente cuando se observa una bajada de la cinética
de reacción diferente de la debida al empobrecimiento en sustrato.
Por consiguiente, la utilización de una temperatura de reacción
relativamente baja permite indirectamente facilitar una etapa
posterior de purificación opcional, debido principalmente a la
presencia limitada de enzima. La despolimerización puede realizarse
por lo tanto debido a esto a una temperatura comprendida entre 10 y
20ºC.
Con el fin de eliminar posibles oligosacáridos
de baja masa molecular que se formarían durante la
despolimerización, en particular disacáridos y tetrasacáridos, el
procedimiento según la invención se continúa ventajosamente con una
etapa en la que el producto de despolimerización del polisacárido se
purifica por cromatografía por permeación de gel (GPC) a un pH
inferior a 8 y superior a 5.
El procedimiento según la invención comprende
ventajosamente una etapa posterior de purificación por cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) en la que una fase estacionaria,
por ejemplo una sílice, es una fase inversa injertada (i) de C18 y
(ii) de cetil trimetil amonio (CTA-SAX).
El procedimiento comprende además una primera
etapa de desalado, que comprende ventajosamente la utilización de
una fase móvil que contiene un electrolito en disolución acuosa,
siendo dicho electrolito preferentemente esencialmente transparente
entre 200 y 250 nm. Los electrolitos aceptables comprenden NaCl,
pero para una utilización con un detector UV entre
200-250 nM, es preferible utilizar percloratos,
metanosulfonatos o fosfatos de metales alcalinos tales como Na. Una
fase estacionaria aceptable para la primera etapa de desalado es una
resina intercambiadora de aniones. Una resina particularmente
preferida es una resina Sepharosa Q ®.
El procedimiento puede comprender además una
segunda etapa de desalado, preferentemente mediante un gel de
exclusión molecular, por ejemplo y preferentemente de tipo Sephadex
G10 ®.
Otra solución para detectar los productos según
la invención en las fracciones recogidas a la salida de la columna
de HPLC puede consistir opcionalmente en la utilización de un
difractómetro.
Otras técnicas de desalado aceptables incluyen
la utilización de técnicas de ósmosis, por ejemplo mediante
membranas poliméricas.
Según un segundo aspecto, la invención se
refiere a los productos obtenidos por un procedimiento según su
primer aspecto.
Petitou et al. en J. Biol. Chem. (1988),
263(18), 8685-8690 divulgan un hexasacárido
de fórmula
\DeltaIs-II_{idu}-IIs_{glu}
en forma de sal de sodio aislado a partir de un producto obtenido
por un procedimiento de despolimerización parcial de la heparina
por la heparinasa I. Este producto se describe como que no presenta
actividad anti-trombótica. No se ha puesto de
manifiesto ninguna otra propiedad de este producto. EEUU 4 916 219
describe también un procedimiento de despolimerización de la
heparina por la heparinasa. Estos dos procedimientos se efectúan a
30ºC.
Según un tercer aspecto, la invención se refiere
a productos de fórmula general (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
R se elige entre H y SO_{3}M, y
M se elige entre H, Li, Na y K;
con la excepción del producto para el que n = 0,
R = SO_{3}M y M = Na.
\newpage
De forma inesperada, se ha observado que los
productos conformes al tercer aspecto de la invención, presentan
mejores propiedades físico-químicas cuando M se
elige entre Li, Na y K, preferentemente Na. En particular, se
mejoran la solubilidad y la estabilidad.
Los productos de fórmula general (I) preferidos
son aquellos para los que n=0.
Según un cuarto aspecto, la invención se refiere
a hexasacáridos. Un producto de fórmula (la) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la invención según su
cuarto
aspecto.
\vskip1.000000\baselineskip
Un producto de fórmula (Ib) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la invención según su
tercer
aspecto.
\vskip1.000000\baselineskip
Un producto de fórmula (Ic) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la invención según su
tercer
aspecto.
\newpage
Un producto de fórmula (Id) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Un producto de fórmula (Ie) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Un producto de fórmula (If) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la invención según su
tercer
aspecto.
\vskip1.000000\baselineskip
Un producto de fórmula (Ig) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la invención según su
tercer
aspecto.
\newpage
Un producto de fórmula (Ih) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Un producto de fórmula (Ij) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Un producto de fórmula (Ik) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Un producto de fórmula (Im) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
es conforme a la invención según su
cuarto
aspecto.
\newpage
Según un quinto aspecto, la invención se refiere
a la utilización de un producto según uno cualquiera de los
aspectos segundo a cuarto, para modular una proliferación celular,
en particular asociada al cáncer, principalmente un cáncer de mama,
de pulmón, de próstata, de colon o de páncreas.
Una utilización de un producto según el quinto
aspecto de la invención es particularmente ventajosa cuando la
proliferación celular está asociada a un proceso metastásico, así
como cuando la utilización se efectúa en un estadio precoz de la
enfermedad.
Una utilización de un producto según el quinto
aspecto de la invención es particularmente ventajosa en combinación
con un segundo producto anticanceroso, preferentemente
citotóxico.
Un segundo producto anticanceroso se elige
ventajosamente entre derivados del platino tales como cisplatino u
oxaliplatino, taxoides tales como docetaxel o paclitaxel, derivados
de bases púricas o pirimídicas tales como 5-FU,
capecitabina o gemcitabina, vincas tales como vincristina o
vinblastina, mostazas, heterociclos aromáticos condensados tales
como estaurosporina, elipticina o camptotecinas tales como
irinotecan, topotecan, combretastatinas tales como CA4P, derivados
de la colchicina, tales como fosfato de colchinol.
El segundo producto anticanceroso es
preferentemente docetaxel, oxaliplatino o irinotecan.
Cuando se estudia la inhibición de la heparanasa
por diversas heparinas comerciales de bajo peso molecular, se
evidencia que son todas inhibidoras de la heparanasa (Enoxaparina,
tinzaparina, fragmina, etc ...). Sin embargo, hemos podido
constatar que una nueva heparina de muy bajo peso molecular (ULMWH =
Ultra Low Molecular Weight Heparin) (WO 02/08295; y la solicitud
internacional aún sin publicar PCT/FR03/02960) no inhibe la
heparanasa aunque contiene más secuencias afines a ATIII que la
Enoxaparina. Hay ahí por consiguiente una incoherencia respecto a
la teoría enunciada más arriba.
El procedimiento realizado según la invención da
lugar principalmente a la formación de un hexasacárido que es el
IsoATIII, de estructura Is-IIa-IIs,
a continuación:
Hexasacárido Is-IIa-IIs
(Iso ATIII):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados siguientes muestran que este
hexasacárido Iso ATIII es un muy buen inhibidor de la heparanasa.
Presenta además la ventaja considerable de no tener ninguna afinidad
por ATIII y por consiguiente estar desprovisto de actividad
anti-trombótica. La ventaja principal de esta
invención es la desconexión de las propiedades antitrombóticas de
los heparinoides de sus propiedades inhibidoras de la heparanasa.
Comparativamente con la heparina y las HBPM, el margen terapéutico
del hexasacárido Iso ATIII está muy aumentado y le hace ser
potencialmente utilizable como agente antimetastásico. En la
presente invención, reivindicamos su utilización como tal y la
preparación del hexasacárido Iso ATIII solo o mezclado con otros
hexasacáridos procedentes de la despolimerización controlada de la
heparina por la heparinasa I. Además, reivindicamos la idea de
despolimerizar la heparina por la heparinasa I hasta el punto de
extinción de su actividad aXa y la utilización de esta mezcla como
agente antimetastásico. Será en este caso una HBPM no antitrombótica
y específicamente inhibidora de la heparanasa.
\newpage
Reivindicamos la preparación y la utilización
como agente antimetastásico de los productos siguientes aislados o
mezclados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cromatografía de exclusión en gel se realiza
con 2 columnas de TSK Super SW2000 (300 x 4,6 mm) y una columna de
seguridad de TSK Super (35 x 4,6 mm) (TOSOH BIOSEP). La detección se
realiza por absorciometría en UV a 232 nm. La fase móvil es acetato
de amonio 0,1 M. El volumen inyectado es 5 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
El seguimiento HPLC se realiza por el método de
CTA-SAX. La columna utilizada es una Hypersil BDS
(150 x 2,1 mm) de partículas de 3 \mum sobre la que se ha
adsorbido cetil trimetil amonio por percolación de una disolución
de hidrógenofosfato de cetil trimetil amonio 1 mM en una mezcla agua
- metanol (68-32) v/v a 45ºC a 0,2 ml/min durante 4
horas.
Las condiciones de separación sobre este tipo de
columna son las siguientes: la temperatura de la columna injertada
se mantiene a 40ºC. Se procede a un gradiente de elución en el que
el disolvente A es agua ajustada a pH 3 por adición de ácido metano
sulfónico. El disolvente B es una disolución 2N de metano sulfonato
de amonio ajustada a pH 2,6. El gradiente de elución es el
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La detección utilizada es absorciometría en UV a
232 nm. Se utiliza también 202-247 nm como detección
específica de los oligosacáridos acetilados.
\vskip1.000000\baselineskip
Cromatografía en columna Hypersil BDS (250 x 20
mm) de partículas de 5 \mum, sobre la que se han injertado
cadenas cetil trimetil amonio por percolación de una disolución de
hidrógenofosfato de cetil trimetil amonio 1 mM en una mezcla
agua-metanol (68-32) v/v a 45ºC a 2
ml/min durante 4 horas.
\newpage
La separación se efectúa a temperatura ambiente.
Se utiliza un gradiente de elución: el disolvente A es agua
ajustada a pH 2,5 por adición de HCl. El disolvente B es una
disolución de NaCl 2N ajustada a pH 2,5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La detección es en UV a 232 nm. Se pueden
inyectar 100 mg de fracción hexasacárido en cada separación.
\vskip1.000000\baselineskip
El hexasacárido
\DeltaIs-IIa_{id}-IIs_{glu}
(hexasacárido iso ATIII) se obtiene por escisión por la heparinasa
1 del sitio afín ATIII de la heparina. La despolimerización de la
heparina por la heparinasa 1 es endolítica: da lugar a una mezcla
de oligosacáridos insaturados sobre su extremo no reductor. Al final
de la reacción, se obtiene una mezcla de disacáridos, de
tetrasacáridos y de hexasacáridos. Todas las zonas más sulfatadas
de la heparina se escinden y se transforman en disacáridos y en
tetrasacáridos. Sólo las partes acetiladas se quedan en forma de
hexasacáridos y sobre todo los encadenamientos del tipo
-GlcNS(6S ó
60H)-IdoA-GlcNAc(6S ó
6OH)-GlcA-GlcNS(3S ó 3OH, 6S
ó 6OH)-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La despolimerización de la heparina se hace en
las condiciones siguientes: 3 g de heparina de mucosidad de cerdo
se disuelven en 30 ml de una disolución 0,2M NaCl, 0,02% BSA,
Na_{2}HPO_{4} 5 mM ajustada a pH 7. La temperatura de
despolimerización es 16ºC. Se introducen inicialmente 2UI de
heparinasa 1. Al cabo de 7 días, se añade una unidad suplementaria
de heparinasa 1. Al cabo de 15 días, se considera alcanzada la
despolimerización de la heparina. El seguimiento de la reacción se
realiza bien con GPC analítica sobre columna de TSK Super SW 2000
(Figura 1), bien sobre columna de CTA-SAX (Figura
2a). Se puede considerar que la reacción enzimática está
suficientemente avanzada cuando la proporción de oligosacáridos de
tamaño superior al octasacárido está limitada y cuando los 2
principales hexasacáridos sulfatados
\DeltaIs-Is_{id}-Is_{id} y
\DeltaIs-Is_{id}-IIs_{glu} de
la mezcla se han despolimerizado a tetrasacáridos. Cuando la
reacción enzimática ha terminado, la disolución se filtra sobre
membrana de 0,2 \mum y se inyecta en 2 veces en una columna de GPC
llena de Biogel P10 (Bio Rad) en la que circula una fase móvil de
NaCl 0,2N (Figura 3). El hexasacárido
\DeltaIs-IIa_{id}-IIs_{glu} es
extremadamente frágil en medio alcalino: pierde su glucosamina
terminal 3-0 sulfatada y se transforma en
pentasacárido
\DeltaIs-IIa_{id}-GlcA una vez
que el pH excede 8. Por lo tanto es muy importante acidificar
ligeramente (pH entre 5 y 6) toda la fracción hexasacárida. El
cromatograma de la fracción hexasacárida entera se proporciona en
la Figura 4.
La última fase consiste en una separación
semi-preparativa en columna 25x2,1 cm llena de
Hypersil BDS C18 (5 \mum) injertada con CTA-SAX
(Figura 5). El control de las fracciones se realiza por CLHP (HPLC).
Al ser la fase móvil utilizada en cromatografía
semi-preparativa una disolución de cloruro de sodio,
es necesario hacer un desalado final de la muestra. Éste se realiza
en 2 etapas. La primera etapa, que elimina 95% del NaCl, consiste
en una re-concentración de las fracciones que
contienen el hexasacárido aislado en fase intercambiadora de
aniones de Flujo Elevado Q-Sepharosa (Pharmacia)
(columna 40 x 2,6 cm) haciéndolas percolar en la columna después de
su dilución a 1/10 en agua. El hexasacárido se eluye en un volumen
mínimo (aproximadamente 50 ml) con una disolución de NaClO_{4}
1,5N para obtener una disolución de perclorato de hexasacárido.
\newpage
La segunda etapa de desalado final se realiza
inyectando la disolución de perclorato de hexasacárido obtenida
anteriormente en una columna Sephadex G10 (100 x 7 cm). El
seguimiento se realiza por detección UV a 232 nm y por un
conductímetro que permite detectar la sal.
Puede considerarse necesario reiterar esta
operación si la calidad de la separación entre el hexasacárido y el
perclorato es insuficiente. La disolución de hexasacárido se
liofiliza. Se obtienen así 108 mg del hexasacárido
\DeltaIs-IIa_{id}-IIs_{glu} en forma de
sal de sodio. La pureza HPLC es de 92% (Figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
El sulfato de heparina/heparán radiomarcado (HS)
es degradado por heparanasas, produciéndose fragmentos de HS de
bajo peso molecular que pueden medirse por cromatografía por
permeación de gel (FPLC) y contaje de las fracciones recogidas por
centelleo líquido.
La heparina no fraccionada (sal de sodio) de
mucosa intestinal de cerdo (calidad Ia, 183 USP/mg) se ha obtenido
de Sigma Biochemicals (Deisenhofen, Alemania).
La heparitinasa (HP liasa; (EC 4.2.2.8)) se ha
obtenido de Seigaku (Tokio, Japón).
TSK 4000 proviene de Toso Haas y las columnas
Sepharosa Q equipadas con pre-columnas se han
obtenido de Pharmacia/LKB (Freiburg, Alemania).
Una línea celular de fibroblastos de útero se ha
utilizado para preparar el sulfato de heparán (proteoglicano)
marcado con 35-S mediante marcaje metabólico. Se ha
mostrado que esta línea celular produce cantidades relativamente
importantes de diferentes proteoglicanos de sulfato de heparán
(HS-PG = Heparan sulfate proteoglycans), tales como
sindecanos y glipicano (Drzeniek et al., Blood
93:2884-2897, 1999).
El marcaje se realiza por incubación de las
células con una densidad celular de aproximadamente 1 x 10^{6}
células/ml en presencia de
35-S-sulfato a 33 \muCi/ml en el
medio de cultivo tisular durante 24 horas. Los sobrenadantes se
recogen y se añade un inhibidor de proteasa PMSF
(phenylmethylsulfonyl fluoride = fluoruro de fenilmetilsulfonilo)
(1 mmol/L). Las HS-PG se purifican por cromatografía
de intercambio aniónico en Sepharosa Q, no siendo necesaria la
eliminación del sulfato de condriotina y del sulfato de dermatán
(proteoglicanos), ya que la muestra contiene una cantidad
relativamente importante de proteoglicanos de sulfato de heparán, y
también debido a la especificidad de la enzima heparanasa.
La heparanasa se ha aislado de leucocitos
sanguíneos humanos (human peripheral blood leukocytes = PBL, buffy
coats) y se ha enriquecido en células polimorfonucleares (PMN =
polymorphonuclear cells) por procedimientos de gradiente de ficoll.
La concentración de las PMN aisladas se ajusta a 2,5 x 10^{7}
células/ml y se incuban durante 1 hora a 4ºC. Los sobrenadantes que
contienen la heparanasa se recogen, el pH se ajusta a 6,2 (20 mM de
tampón citrato-fosfato) y se utilizan bien
inmediatamente, o bien se guardan congelados en alícuotas a
-20ºC.
Se incuban 200 \mul de sulfato de heparán
marcado con 35-S (proteoglicanos) ajustados a
aproximadamente 2.200 cpm/ml (cpm = cuentas por minuto (counts per
minute)) a 37ºC durante 18 horas con 1 \mul de sobrenadante PMN
que contiene la heparanasa. Se muestrean 200 \mul de la mezcla
obtenida anteriormente en una columna de cromatografía por
permeación de gel TSK 4000 (FPLC), las fracciones se recogen y se
analizan por medida de centelleo líquido. La degradación se ha
medido según la fórmula siguiente:
% \
degradación = [[\sum \ cuentas \ (cpm) \ frac. \
20-33 \ (HEP) - \sum \ cuentas \ (cpm) \ frac. \
20-33 \ (CONT)] / [cuentas \ totales \ (cpm)
\ frac. \ 12-33 \ (CONT)]] x
100
Por ejemplo, el porcentaje de degradación se
calcula como sigue: la suma de las cuentas (cpm) en las fracciones
20-33 de la muestra después de tratamiento con la
heparanasa restado de las cuentas del ruido de fondo (cpm)
(fracciones 20-33) de la muestra control, se divide
por las cuentas totales (fracciones 12-33) aplicadas
a la columna. Se han utilizado factores de corrección para
normalizar las cuentas totales de diferentes cromatografías a 2.200
cuentas/cpm. Los resultados se dan en porcentaje de degradación. En
los ensayos de inhibición, la degradación de la muestra control
(con heparanasa) se ha fijado en 100% (degradación), y los valores
de % de inhibición se han calculado sobre esta base. No es
necesaria una corrección para la actividad sulfatasa, ya que no ha
podido detectarse ninguna actividad sulfatasa.
Los inhibidores de la heparanasa siguientes:
heparina no fraccionada (UF-H) y Hexa Iso ATIII se
han ensayado mediante el protocolo descrito anteriormente a tres
concentraciones diferentes. La comparación se ha efectuado sobre
una base de masa. Los datos se expresan en porcentaje de inhibición
de la actividad heparanasa.
En primer lugar, el ensayo heparanasa se ha
optimizado para las necesidades de este estudio. Por razones
prácticas, el tiempo de incubación en el ensayo de degradación se
ha establecido en 18 horas. Según la eficacia del marcaje y el
contenido de sulfato de heparán (proteoglicanos), las cuentas
totales de sulfato de heparán (proteoglicanos) se ha fijado en
aproximadamente 2.200 cpm por muestra, para permitir efectuar todos
los ensayos con un lote de sulfato de heparán (proteoglicano). La
figura 1a presenta una cromatografía por permeación de gel sobre
TSK 4000 de una muestra nativa. La figura 1b presenta el
desplazamiento de la distribución molecular de la muestra inducido
por la heparanasa. Se determina la cantidad de heparanasa que
permite una degradación de aproximadamente 80% de proteoglicano de
sulfato de heparán (conteniendo la muestra aproximadamente 35% de
proteoglicanos de sulfato de heparán y aproximadamente 65% de
proteoglicanos de sulfato de condroitina-/dermatán). Por
consiguiente, una degradación en un campo de 10-80%
es relativamente lineal y es aceptable para determinar el efecto de
los inhibidores. La figura 1c presenta el efecto de la heparina no
fraccionada a 1 \mug/ml (UFH =UnFractionned Heparin) sobre la
actividad heparanasa con una inhibición de 97,3%.
Después de haber determinado las condiciones del
ensayo, se ha medido el efecto de la heparina no fraccionada (UFH)
procedente de mucosa de intestino de cerdo. La figura 2 presenta una
inhibición dependiente de la dosis. A una concentración de 1
\mug/ml de heparina no fraccionada (UFH) (concentración final), se
ha observado una inhibición casi completa de la actividad
heparanasa. La figura 7 presenta la inhibición dependiente de la
dosis de Hexa Iso ATIII. Puede concluirse sobre la base de estos
datos que el Hexa Iso ATIII presenta una fuerte actividad
inhibidora de la heparanasa.
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- Z. Drzeniek, et al., Blood (1999) 2884-2897
\vskip1.000000\baselineskip
Otras fracciones ricas en oligosacáridos pueden
aislarse del producto de degradación de la heparina por la
heparinasa I. Así, en el caso de los hexasacáridos, una sola
purificación cromatográfica CTA-SAX es suficiente.
Este método utiliza una columna Hypersil BDS (250 x 20 mm) de
partículas de 5 \mum, sobre la que se han injertado cadenas cetil
trimetil amonio por percolación de una disolución de
hidrógenofosfato de cetil trimetil amonio 1 mM en una mezcla
agua-metanol (68-32) v/v a 45ºC a 2
ml/min durante 4 horas.
La separación se efectúa a temperatura ambiente.
Se utiliza un gradiente de elución: el disolvente A es agua
ajustada a pH 2,5 por adición de HCl. El disolvente B es una
disolución de NaCl 2N ajustada a pH 2,5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La detección es en UV a 232 nm. Se pueden
inyectar 100 mg de fracción hexasacárido en cada separación.
La purificación de las fracciones octasacáridas
y decasacáridas es más compleja que la de las fracciones
hexasacáridas. Necesita generalmente una purificación suplementaria
en columna IonPac ®AS11 (250x20 mm) (Dionex). La separación se
efectúa a temperatura ambiente. Se utiliza un gradiente de elución.
El disolvente A es agua ajustada a pH 3 por adición de ácido
perclórico. El disolvente B es una disolución de NaClO_{4} 1M
ajustada a pH3.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 8 permite identificar los productos
aislados de las fracciones ricas en oligosacáridos, para cada una
de las facciones hexasacárida, octasacárida y decasacárida aisladas
por GPC.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de la heparanasa se pone de
manifiesto por su capacidad para degradar el fondaparinux. La
concentración de fondaparinux se determina gracias a su actividad
anti-factor Xa.
La heparanasa es producida por
Sanofi-Synthelabo (Labège, Francia).
Los reactivos de dosificaciones del factor Xa
están comercializados por Chromogenix (Montpellier, Francia).
Se mezclan concentraciones crecientes de un
compuesto según la invención, inhibidor de heparanasas (diluciones
variables: de 1 nM a 10 \muM) a una concentración fija de
heparanasa (para cada lote, experimentos preliminares permiten
determinar la actividad enzimática suficiente para la degradación de
0,45 \mug/ml de fondaparinux añadido). Después de 5 minutos a
37ºC la mezcla se pone en presencia del fondaparinux y se deja 1
hora a 37ºC. La reacción se detiene por calentamiento a 95ºC
durante 5 minutos. La concentración de fondaparinux residual se
mide por último por adición de factor Xa y de su sustrato cromógeno
específico (Ref. S2222).
Las diferentes mezclas se efectúan según el
procedimiento siguiente:
Se mezclan 50 \mul de tampón acetato de sodio
(0,2 M, pH 4,2), con 50 \mul de fondaparinux (0,45 \mug/ml) y
59 \mul de una disolución de heparanasa. Se incuba 1 hora a 37ºC y
5 minutos a 95ºC. Se pasa así de pH 4,2 a pH 7. Se mezclan 100
\mul de la mezcla de reacción con 50 \mul de tampón Tris 50 mM,
NaCl 175 mM EDTA 75 mM, pH 14.
La actividad anti-factor Xa del
fondaparinux se mide de la forma siguiente:
Se mezclan 100 \mul de la disolución obtenida
en la etapa a) con 100 \mul de AT (0,5 \mu/ml). Se mantiene
durante 2 minutos a 37ºC y se añaden 100 \mul de factor Xa
(7nkat/ml). Se mantiene durante 2 minutos a 37ºC y se añaden 100
\mul de sustrato cromogénico (Ref.: S2222) (1 mM). Se mantiene
durante 2 minutos a 37ºC y se añaden 100 \mul de ácido acético
(50%).
La lectura de la densidad óptica se efectúa a
405 nm.
Se determina un porcentaje de inhibición
respecto al control sin inhibidor. Una curva de porcentajes de
inhibición permite calcular una CI_{50}.
Claims (41)
1. Procedimiento de despolimerización de un
polisacárido con propiedad anti-trombótica, para la
obtención de un producto que tiene propiedades anticancerosas,
caracterizado porque comprende una etapa en la que el
polisacárido se despolimeriza por la heparinasa I hasta que su
actividad anti-trombótica, debida principalmente a
la inhibición de los factores Xa y IIa, es esencialmente anulada
(<35 Ul/mg)y porque la despolimerización se realiza a una
temperatura comprendida entre 10 y 20ºC.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el polisacárido es una heparina.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, caracterizado porque la despolimerización
se continúa hasta que la mezcla comprende una fracción
hexasacarídica esencialmente exenta de hexasacáridos sulfatados
\DeltaIs-Is_{id}-Is_{id} y
\DeltaIs-Is_{id}-IIs_{glu}.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la
despolimerización se continúa hasta alcanzar una masa molecular
media inferior a 5.000 Da.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la
despolimerización se continúa hasta alcanzar una masa molecular
media inferior a 3.000 Da.
6. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, caracterizado porque comprende además una
etapa en la que el producto de despolimerización del polisacárido se
purifica por cromatografía por permeación de gel a un pH inferior a
8 y superior a 5.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque comprende además una etapa de
purificación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en
la que una fase estacionaria es una fase inversa injertada (i) de
C18 y (ii) de cetil trimetil amonio (CTA-SAX).
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque comprende además una etapa de
desalado.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que la etapa de desalado comprende la utilización de una fase
móvil que contiene un electrolito en disolución acuosa,
esencialmente transparente entre 200 y 250 nm.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque el electrolito se elige entre
percloratos, metanosulfonatos o fosfatos de metales alcalinos tales
como Na.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque el desalado se efectúa mediante una
resina intercambiadora de aniones, por ejemplo de tipo Sepharosa Q
®.
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque comprende una
segunda etapa de desalado mediante un gel de exclusión molecular, en
particular de tipo Sephadex G10 ®.
13. Producto obtenido por el procedimiento según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Producto de fórmula general (I)
en la
que:
R se elige entre H y SO_{3}M, y
M se elige entre H, Li, Na y K;
con la excepción del producto para el que n = 0,
R = SO3M y M = Na.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Producto según la reivindicación 14,
caracterizado porque M se elige entre Li, Na y K.
16. Producto según la reivindicación 14 o la
reivindicación 15, caracterizado porque n=0.
17. Producto según la reivindicación 15 o la
reivindicación 16, caracterizado porque M=Na.
18. Producto según la reivindicación 17, de
fórmula (Ia) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
19. Producto según la reivindicación 14, de
fórmula (Ib) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
20. Producto según la reivindicación 14, de
fórmula (Ic) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
21. Producto de fórmula (Id) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
22. Producto de fórmula (Ie) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
23. Producto según la reivindicación 14, de
fórmula (If) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
24. Producto según la reivindicación 14, de
fórmula (Ig) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
25. Producto de fórmula (Ih) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
26. Producto de fórmula (Ij) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
27. Producto según la reivindicación 14, de
fórmula (Ik) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
28. Producto de fórmula (Im) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
29. Utilización de un producto de fórmula
general (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
R se elige entre H y SO_{3}M, y
M se elige entre H, Li, Na y K;
como inhibidor de la heparanasa.
\newpage
30. Utilización de un producto de fórmula
general (I) según la reivindicación 29, caracterizado porque
se trata de:
31. Utilización de un producto de fórmula la,
Ib, Ic, Id, le, If, Ig, Ih, Ij, Ik, o Im como inhibidor de la
heparanasa.
32. Utilización de un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, para modular una
proliferación celular.
33. Utilización de un producto según la
reivindicación 32, caracterizada porque la proliferación
celular está asociada al cáncer.
34. Utilización de un producto según la
reivindicación 33, caracterizada porque la proliferación
celular está asociada a un proceso metastásico.
35. Utilización de un producto según la
reivindicación 33 o la reivindicación 34, como agente
citostático.
36. Utilización de un producto según la
reivindicación 34 o la reivindicación 35, caracterizada
porque se efectúa en un estadio precoz de la enfermedad.
37. Utilización de un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 35 a 36, en combinación con un
segundo producto anticanceroso.
38. Utilización de un producto según la
reivindicación 37, caracterizada porque el segundo producto
anticanceroso es citotóxico.
39. Utilización de un producto según la
reivindicación 38, caracterizada porque el segundo producto
anticanceroso se elige entre derivados del platino tales como
cisplatino u oxaliplatino, taxoides tales como docetaxel o
paclitaxel, derivados de bases púricas o pirimídicas tales como
5-FU, capecitabina o gemcitabina, vincas tales como
vincristina o vinblastina, mostazas, heterociclos aromáticos
condensados tales como estaurosporina, elipticina o camptotecinas
tales como irinotecan, topotecan, combretastatinas tales como CA4P,
derivados de la colchicina, tales como fosfato de colchinol.
40. Utilización de un producto según la
reivindicación 39, caracterizada porque el segundo producto
anticanceroso es docetaxel, oxaliplatino o irinotecan.
41. Utilización de un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 32 a 40, caracterizada
porque el cáncer es un cáncer de mama, de pulmón, de próstata, de
colon o de páncreas.
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