NO174259B

NO174259B - Fremgangsm}te til fremstilling av heparinderivater

Info

Publication number: NO174259B
Application number: NO892366A
Authority: NO
Inventors: Silvano Piani; Gianfranco Tamagnone; Paul Roberto Alpino; Maria Rita Milani; Marinella Fantuz
Original assignee: Alfa Wassermann Spa
Priority date: 1988-06-10
Filing date: 1989-06-09
Publication date: 1993-12-27
Also published as: NO892366D0; FI892850A; IE891762L; DK285089D0; AU611028B2; KR910000771A; US5010063A; ES2012748T3; FI94534B; PT90817B; JPH0739442B2; NZ229212A; ZA893882B; ATE109164T1; GR900300018T1; PT90817A; IT1234508B; EP0347588A1; CA1309402C; FI892850A0

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av heparinderivater som er kjennetegnet ved signaler i <13>C-NMR-spektret på ca. 53 og ca. 54 ppm, spesifikk dreining på mellom +50° og +90° i vandig løsning, svovelinnhold på mellom 8% og 11% og forhold sulfat/karboksyl på mellom 1,50 og 2,20.

Det er kjent at heparinliknende strukturer kan modifiseres på forskjellige måter ved å behandle dem i et basisk medium.

Ifølge Europeisk patentpublikasjon EP 0133078 depolymeriseres heparinet til oligosakkaridfraksjoner som inneholder 4-20 sakkaridenheter, ved å behandle benzylesteren av heparinet med en organisk eller uorganisk base i en konsentrasjon på mellom 0,1 og 0,6 molar ved en temperatur på mellom 20°C og 80°C. Slik depolymerisasjon følges av dannelse av en dobbeltbinding i uronsyrens 4- og 5-stillinger, noe som kan påvises ved UV-absorbsjon ved 230 nm.

Ifølge S. Hirano et al., Conn. Tissue Res., Vol 3, 1975, p. 73-79 depolymeriseres heparinet og andre glykosaminoglykaner i sterkt basisk medium ved anvendelse av fra 2 til 10 molare konsentrasjoner av natrium- eller bariumhydroksid ved temperaturer på over 80°C. På denne måte oppnås en sterk depolymerisasjon som følge av spaltingen av glukosidbindingen mellom 1-stillingen i glukosaminenhetene og 4-stillingen i nabo-uronenhetene. Dessuten følges slik depolymerisasjon av dannelsen av en dobbeltbinding i uronsyrens 4- og 5-stillinger, noe som kan påvises ved hjelp av en absorbsjon ved 225-230 nm i UV-spektret.

P. Sampson og K. Meyer, Proe. Nat. Acad. Sei. USA, vol 68, 1971, p. 2329-2331 oppnådde en strukturell modifikasjon i glukosaminenheten under dannelse av 3,6-anhydroglukosamin ved behandling av heparin med IN natriumhydroksid i nærvær av natriumborhydrid ved 80°C i 7 timer.

Heparinderivatene som fremstilles ifølge den foreliggende oppfinnelse avviker totalt fra de som er beskrevet tidligere. Faktisk har de ikke de kjemisk-fysikalske egenskaper til forbindelsene som oppnås ifølge ovennevnte EP-patentpublikasjon, slik det er vist med den midlere molekylvekt som blir værende stort sett uforandret og derved beviser uteblivelse av depolymerisasjon, og manglende absorbsjon ved 225-230 nm i UV, og

13

topper som svarer til dobbeltbindingens resonanser i C-NMR indikerer manglende dobbeltbinding i 4- og 5-stillingene i uron-syren. Dessuten oppviser de heller ikke de kjemisk-fysikalske egenskaper til forbindelsene som ble isolert av P. Samson og K.

13

Meyer, idet C-NMR-spektret til forbindelsene som fremstilles ifølge den foreliggende oppfinnelse oppviser uforandret stillingen og intensiteten til signalet for karbonatomet i glukos-aminets 6-stilling og oppviser uforandret intensitetsforhold mellom det 6-sulfaterte karbonatom og det 6-desulfaterte karbonatom, som skulle ha forandret seg ved dannelse av 3,6-anhydroglukosamin, på grunn av det 6-sulfaterte karbonatoms deltakelse i dannelsen av anhydroderivatet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved at en vandig løsning av et heparinmateriale behandles med en base av et alkali- eller jordalkalimetall med en konsentrasjon på mellom 0,01 N og 1 N i nærvær av et salt av et alkali- eller jordalkalimetall i en konsentrasjon på mellom 0 og 1 N, eventuelt i nærvær av en katalytisk mengde av et reduksjonsmiddel, i et tidsrom på mellom 0,5 og 24 timer ved en temperatur på mellom 35°C og 70°C, at reaksjonsblandingen eventuelt renses ved perkolering gjennom en ionebytterharpiks eller ved dialyse, og at forbindelsene som har den således modifiserte struktur utfelles ved tilsetning av fra 2 til 4 volumer av en alkohol, som inneholder fra 1 til 3 karbonatomer, ved omtrent nøytral pH.

Forbindelsene, som har en modifisert heparinstruktur, har kjemisk-fysikalske egenskaper, såsom spesifikk dreining og ^-C-NMR-topper, som avviker fra samme for utgangsforbindelsene og oppviser også en annen biologisk aktivitet idet de oppviser en bedre virkningsaktivitet mens de bibeholder praktisk talt uforandret antitromboseegenskaper mens blødningseffekten og den antikoagulerende styrke senkes.

Den kjemiske modifikasjon av heparinstrukturen oppnås i vandig medium ved høyere pH-verdier enn nøytral i nærvær av en base, fortrinnsvis et alkali- eller jordalkalimetallhydroksid, eventuelt i nærvær av et alkali- eller jordalkalimetallsalt og en reduserende substans, fortrinnsvis natriumborhydrid.

Reaksjonen utføres i et tidsrom på mellom 0,5 til 24 timer ved en temperatur på mellom 3 5°C og 70°C under anvendelse av basekonsentrasjoner på mellom 0,01N og IN og saltkonsentrasjoner på mellom 0 og IN, eventuelt i nærvær av en reduserende substans, som f.eks. natriumborhydrid.

Alkali- eller jordalkalimetallbaser og -salter anvendes fortrinnsvis, hovedsaklig de av natrium, kalium, kalsium, magnesium og barium.

Hydroksidene av natrium, kalium og barium er de baser som med fordel anvendes.

Acetatene og kloridene av natrium, kalium, barium, kalsium og magnesium, og sulfatene av natrium, kalium og magnesium er de salter som med fordel anvendes.

De modifiserte hepariner som oppnås ved denne fremgangsmåte har noen spesielle kjemisk-fysikalske egenskaper som er totalt forskjellige fra de som kommer fra de kjente alkalibehandlinger. Dette skyldes reaksjonsbetingelsene som benyttes ifølge oppfinnelsen, hvor verdiene på parametrene, hovedsaklig når det gjelder basekonsentrasjonen, temperaturen og det eventuelle nærvær av et salt, er vesentlig forskjellig fra de som tidligere ble benyttet.

De strukturelle forandringer i de nye heparinderivater frem-går i hovedsak ved posisjonen og den relative intensitet av

. 13

resonansene i C-NMR-spektret og elektroforeseoppførsel, ved økning av verdiene av den spesifikke dreining og ved økning av svovelinnholdet og av forholdet mellom sulfat og karboksyl, idet karboksylinnholdet er uforandret.

De mer kjennetegnende forandringer i strukturen hos heparinderivatene er blitt undersøkt ved undersøkelse av de store for-13

andringer som forekom i C-NMR-spektret. Disse variasjoner ved-rører noen spesifikke soner i spektret og omfatter både forekomst

av nye topper og modifikasjon av andre topper. Av nevneverdig betydning er opptreden av to nye signaler ved ca. 53 og ca. 54 ppm og forskyvningene av toppene som svarer til karbonatom 1 i iduron- og glukosaminenheten i sonen mellom 92 ppm og 102 ppm. Sammenlikning av "^C-NMR-spektret for derivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen og spektrene for utgangsforbindelsene gjør det mulig å påvise at noen soner i spektret er uforandret, og at følgelig noen deler av heparinstrukturen ikke er blitt modifisert i det hele tatt. Spesielt er signalene knyttet til 6-stillingen i den sulfaterte eller desulfaterte glukosaminenhet ikke blitt modifisert. Dessuten er toppene som vedrører 2-stillingen i glukosaminenhetene, sulfatert eller acetylert, karboksygruppen i iduronsyren og enhetene i glukuronsyren, som i heparinet utgjør et gjennomsnitt på 20% av uronenhetene, uforandret.

De kjemisk-fysikalske egenskaper til heparinderivatene som fremstilles ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremkommer jo mer modifisert og jo mer drastisk reaksjonsbetingelsene er, slik det kan utledes av de etterfølgende eksempler. Derfor gjør modifisering av parametrene i reaksjonen det mulig å oppnå forbind-elser som er mer eller mindre sterkt modifisert i sin struktur.

Graden av kjemisk modifisering kan beregnes ved å beregne forholdet mellom summen av integralene av toppene ved ca. 53 og ca. 54 ppm og summen av integralene av toppene for karbonatomet i 6-stillingen i glukosaminenheten, ved ca. 62,5 og ca. 69 ppm, hvorved disse sistnevnte velges som vilkårlig referanse på grunn av at deres intensitet blir værende stabil og på grunn av at de er i en spektrumsone uten andre topper. Parallelt med økningen i resonansen ved ca. 53 og ca. 54 ppm er det en økning i dreiningen ved 589 nm (D-linjen for natrium), og av den grunn kan målingen av den spesifikke dreining benyttes direkte for evaluering av graden av kjemisk modifikasjon som har foregått i heparinstrukturen. Idet optisk aktive reaktanter ikke anvendes i reaksjons-mediet kan målingen av dreiningen benyttes direkte for å overvåke reaksjonsforløpet.

Både forholdene for integralene av toppen av ^C-NMR-spekteret og økningen av den spesifikke dreining i forhold til utgangsforbindelsen er angitt i tabell 1 nedenfor.

Disse modifiserte hepariner er dessuten kjennetegnet ved at de har en annen elektroforeseoppførsel enn utgangsforbindelsene, kjennetegnet ved en større mobilitet i bariumacetatbuffer, 0,1M ved pH 5,8 (P. Oreste og G. Torri, J. Chrom, Vol 195, 1980, p.

398), og ved at de har et svovelinnhold på mellom 8% og 11%, et forhold mellom sulfat og karboksyl på mellom 1,50 og 2,20 og en spesifikk dreining [$] D 20 på mellom +50° og +90°C, slik det er vist i tabell 2 nedenfor, hvor verdiene for de tilsvarende ut-gangsf orbindelser er angitt i parentes.

Heparinderivatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen har en markert antitrombotisk aktivitet sammen med en lavere antikoagulerende virkning i forhold til utgangsheparinene. Deres biologiske aktivitet ble bestemt ved hjelp av mange typiske tester for hepariner. Nærmere bestemt ble anti-Xa-faktoren, APTT, blødningstiden og beskyttelsen mot forsøkstrombose utført. APTT-aktiviteten ble bestemt ved fremgangsmåten til M.J. Larrieu og G. Weiland, Rev. Hematol., vol 12, 1957, p. 199, mens anti-Xa-aktiviteten ble bestemt ved fremgangsmåten til E.T. Yin og S. Wessler, Biochem. Biohpys. Acta, vol 201, 1970, p. 387.

Hver undersøkt forbindelse ble løst i plasma tatt fra fastende rotter, hvoretter det ble fremstilt proposjonale for-tynninger for å oppnå de konsentrasjoner som foreskrives i metoden. Ti bestemmelser ble utført for begge aktiviteter for hver forbindelse, og den mengde som forårsaker en meget betydelig forandring i testen ble beregnet i mcg/ml. Spesielt ble aktiviteten til hvert produkt uttrykt som den konsentrasjon, i mcg/ml, som henholdsvis dobler APTT-tiden og øker anti-Xa-verdien med 30%. De oppnådde verdier i de to tester (se tabell 3) bekrefter at derivatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen oppviser en minskning av den antikoagulerende kraft.

Blødningsforsøket ble utført på rotter ved fremgangsmåten som beskrevet av E. Dejana et al, Thromb. Haemost., vol 48, 19 82, p. 198. Resultatene ble uttrykt ved å beregne prosent blødnings-tidsforlengelse hos rotter behandlet med heparinderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen i sammenlikning med blødningstids-forlengelsen hos rotter som var behandlet med de tilsvarende hepariner satt til 100%. Alle derivatene som ble fremstilt ifølge oppfinnelsen, som har modifisert heparinstruktur, oppviste en minskning, ofte meget markert, av blødningstiden sammenliknet med de tilsvarende utgangshepariner.

Den antitrombotiske aktivitet ble bestemt ved hjelp av stasisvenetrombosetesten beskrevet av S. Reyers et al., Thromb. Res., Vol 18, 1980, p. 669-74. Beskyttelsen som ble oppnådd med forbindelsene som var fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble beregnet i prosent på basis av den antitrombotiske beskyttelse som oppnås med utgangsheparinene satt til 100%.

De oppnådde resultater viste stort sett ekvivalens mellom de to serier av hepariner vedrørende denne test av antitrombotisk aktivitet.

Verdiene for de ovenfor beskrevne biologiske tester er oppsummert i tabell 3 nedenfor, hvor anti-Xa- og APTT-verdiene for de tilsvarende utgangshepariner er angitt i parentes.

På basis av de farmakologiske egenskaper som er angitt ovenfor er heparinderivatene som ble fremstilt ifølge oppfinnelsen anvendbare til behandling av trombotiske patologier. De foretrukne administreringsveier er de parenterale og subkutane i form av sterile vandige løsninger, eventuelt også innehold av noen salter for å gjøre løsningene isotoniske, samt noen konser-veringsmidler .

Doseringsmengden avhenger av den anvendte farmasøytiske formulering og av pasientens tilstand. I en foretrukket utførelse administreres en mengde heparinderivat tilsvarende til mellom 5000 og 20000 enheter av anti-Xa-faktor (U.A.Xa) én eller flere ganger daglig.

Som utgangsmaterialer kan det anvendes heparinmaterialer av forskjellig opprinnelse. F.eks. blir kommersielle hepariner og hepariner renset ved behandling av kommersielle hepariner, samt lavmolekylære hepariner fremstilt ved depolymerisasjon ved kjente fremgangsmåter anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Nedenfor beskrives fremstillingen av utgangsheparinmaterialer som anvendes i oppfinnelsen.

Natrium- heparin, ALFA 87- 78

25 gram kommersielt natriumheparin ble løst i 2000 ml vann og i løpet av 30 minutter helt i en løsning som inneholdt 111,2 g kalsiumacetatmonohydrat i 2000 ml vann, 57 ml eddiksyre og 600 ml etylalkohol mens temperaturen ble holdt på 8°-10°C. Den oppnådde suspensjon ble filtrert etter 15 timer ved 5°C, og filtratet ble tilsatt 1000 ml etylalkohol, og etter 3 timer ved 5°C ble det oppnådde bunnfall filtrert. Bunnfallet ble deretter løst i 200 ml vann, løsningen ble brakt til pH 7,0 ved hjelp av IN natriumhydroksid, og deretter ble den behandlet med 100 ml "Dowex 50W X8"-harpiks i natriumform og med 70 ml vann i 20 minutter. Løsningen og harpiksen ble overført til en kromatografikolonne (diameter = 1,6 cm, høyde = 10 cm) som inneholdt 80 ml av den samme harpiks. Etter at løsningen var silet gjennom kolonnen og

eluert med destillert vann til et totalt volum løsning på 400 ml, ble det til løsningen tilsatt 12 g natriumacetattrihydrat og 1000 ml etylalkohol. Bunnfallet ble filtrert og tørket i vakuum, hvorved det ble oppnådd 19,2 g renset natriumheparin, benevnt ALFA

87-78, som hadde følgende kjemisk-fysikalske data:

S = 10,09%, forhold sulfat/karbok syl = 2,13

[6] <D>° = +43° (C = 1% i H 0)

<13>C-NMR-spektrum (ppm): 177,3; 104,7; 102,0; 99,4; 80,0; 78,6; 72,3; 71,9; 69,0; 62,5; 60,6.

Natriumheparin, ALFA 87- 81

Dette ble oppnådd ved samme rensemetode som den som ble benyttet for ALFA 87-78 ut fra 50 g av det samme kommersielle heparin.

36,5 g renset heparin ble oppnådd og hadde følgende kjemisk-fysikalske data:

S = 10,56%; forhold sulfat/karboksyl = 2,20

[6] d° = +47° (C = 1% i H20)

<13>C-NMR-spektrum (ppm): 177,3; 104,7; 102,0; 99,5; 80,1; 78,6; 72,4; 72,0; 69,1; 62,7; 60,7.

Kommersielt natriumheparin

Dette var et heparin som har de følgende kjemisk-fysikalske data:

S = 11,0%; forhold sulfat/karboksyl = 2

[6] <20> = +44<0> (c = 1% i H 0)

<13>C-NMR-spektrum (ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 79,9; 78,6; 72,2; 71,8; 69,0; 62,6; 60,6.

Lavmolekylært natriumheparin, LMW ALFA 86- 02

Det lavmolekylære natriumheparin LMW ALFA 86-02 ble fremstilt ved depolymerisasjon med hydrogenperoksid i nærvær av kobber-II-ioner ved fremgangsmåten ifølge Internasjonal patentpublikasjon WO 86/06729.

Det hadde følgende kjemisk-fysikalske data:

Midlere molekylvekt: 4200 dalton,

S = 11,40%; forhold sulfat/karboksyl = 2,27

[ S] d° = + 45° (C = 1% i H20)

<13>C-NMR-spektrum (ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 79,9; 78,6; 72,6; 72,2; 71,9; 69,1; 62,7; 60,7.

Lavmolekylært natriumheparin LMW ALFA 87- 19 8

Det lavmolekylære natriumheparin LMW ALFA 87-198 ble fremstilt ved depolymerisasjon ved fremgangsmåten som ble benyttet for LMW 86-02.

Det hadde følgende kjemisk-fysikalske data:

S = 11,60%; forhold sulfat/karboksyl = 2,32

[6] 1° = +47° (C = 1% i H20)

<13>C-NMR-spektrum (ppm): 177,7; 104,8; 102,0; 99,6; 80,2; 78,6; 72,4; 71,9; 69,2; 62,7; 60,6.

20 Bestemmelsen av verdiene for den spesifikke dreining [ 6 ] D ble utført i vandig medium ved en konsentrasjon på 1%.

Bestemmelsen av forholdet sulfat/karboksyl ble utført potensiometrisk.

Bestemmelsen av svovelprosentinnholdet ble utført både ved den potensiometriske metode og med Schoeniger-metoden.

<13>C-NMR-spektra ble opptatt ved 75,47 MHz med et Varian CFT-75 spektrometer under anvendelse av D20 som løsningsmiddel og natrium-3-trimetylsilylpropansulfonat som intern referanse-standard.

Oppfinnelsen vil ble nærmere belyst i de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

1,8 g heparin ALFA 87-81 ble tilsatt til 45 ml av en vandig løsning som inneholdt 0,4 g (0,225 N) natriumhydroksid, 2,3 g (0,62 5 N) natriumacetat og 10 mg natriumborhydrid. Den oppnådde løsning ble ved hjelp av termostat holdt på 60°C i 3,5 timer, hvoretter den ble avkjølt til romtemperatur, brakt på nøytral tilstand med iseddik og tilsatt 2,5 volumer etanol. Bunnfallet

ble avfiltrert, vasket på filteret med en 6:1 etanol/vannblanding og tørket. 1,7 g produkt ble oppnådd og hadde et <13>C-NMR-spektrum som oppviste karakteristiske signaler ved følgende (uttrykt som ppm): 177,3; 104,3; 101,9; 99,4; 98,4; 97,2; 96,8; 79,7; 79,1;

78,5; 72,1; 71,8; 71,2; 68,8; 62,4; 60,6; 60,3; 54,1; 53,1.

Eksempel 2

1,8 g heparin ALFA 87-78 ble tilsatt til 45 ml av en vandig løsning som inneholdt 0,4 g (0,225 N) natriumhydrid, 2,3 g (0,625 N) natriumacetat og 10 ml natriumborhydrid. Løsningen ble ved

hjelp av termostat holdt på 60°C i 15 timer, og etter avkjøling ble den brakt på nøytral tilstand med eddiksyre, og deretter ble den percolert gjennom en kolonne (diameter = 1,2 cm, høyde = 8 cm) som inneholdt anionisk harpiks "Dowex 1X2" i kloridform. Percolatet og vaskevæskene ble kombinert og tilsatt 2,5 volumer etanol. Bunnfallet ble filtrert, og vasket på filteret med en 6:1 etanol/vannblanding og tørket. 1,65 g produkt ble oppnådd og hadde et ^<3>C-NMR-spektrum som oppviste karakteristiske signaler ved følgende (uttrykt som ppm): 177,4; 104,6; 101,8; 98,6; 97,2; 96,8; 79,6; 79,1; 78,9; 72,2; 71,5; 71,2; 68,8; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

Eksempel 3

1,8 g heparin ALFA 87-78 ble tilsatt til 120 ml av en vandig løsning som inneholdt 4,8 g (1 N) natriumhydroksid. Løsningen ble ved hjelp av en termostat holdt på 60°C i 3,5 timer, brakt til nøytral tilstand med eddiksyre og dialysert i én natt med rennende vann og i 6 timer med destillert vann. Til løsningen ble det deretter tilsatt 3,5 g natriumacetat, hvoretter løsningen ble brakt til nøytral tilstand med eddiksyre og tilsatt 2,5 volumer etanol. Bunnfallet ble filtrert, vasket med en 6:1 etanol/vann-blanding og tørket. 1,7 g produkt ble oppnådd og hadde et <13>C-NMR-spektrum som viste karakteristiske topper ved følgende

(uttrykt som ppm): 177,4; 104,6; 101,7; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,7; 79,1; 78,6; 73,5; 72,5; 72,3; 72,1; 71,5; 68,8; 62,6; 60,4; 60,2; 54,0; 53,1.

Eksempel 4

4 g heparin ALFA 87-81 ble tilsatt til 120 ml av en vandig løsning som inneholdt 4,8 g (1 N) natriumhydroksid, 6,2 (0,625 N) natriumacetat og 25 ml natriumborhydrid. Reaksjonsblandingen ble deretter ved hjelp av en termostat holdt på 60°C i 3,5 timer, og deretter ble den nøytralisert med eddiksyre, dialysert i 24 timer med rennende vann og percolert gjennom en "Dowex 1 X 4" anionisk harpiks i klorid form (diameter = 1,6 cm, høyde = 15 cm). Percolatet og vaskevæskene ble tilsatt 4 g natriumacetat og 2,5 volumer etanol. Bunnfallet ble filtrert og vasket på filteret med en 6:1 etanol/vannblanding og tørket. 3,55 g produkt ble oppnådd og hadde et ^"<3>C-NMR-spektrum som viste karakteristiske topper ved følgende 6 (uttrykt som ppm): 177,4; 104,5; 101,8; 99,4; 98,7; 97,1; 79,5; 78,6; 73,5; 71,8; 68,8; 62,4; 60,3; 54,0; 53,1.

Eksempel 5

1,8 g heparin LMW ALFA 86-02 ble tilsatt til 50 ml av en vandig løsning som inneholdt 0,08 g (0,04 N) natriumhydroksid, 2,6 g (0,625 N) natriumacetat og 10 mg natriumborhydrid. Reaksjonsblandingen ble ved hjelp av en termostat holdt på 60°C i 210 minutter, hvoretter den ble avkjølt til romtemperatur og percolert først i en kolonne av den anioniske harpiks "Dowex 1X4", OH -form (diameter =1,2 cm, høyde = 10 cm) og deretter i en kolonne av kationisk harpiks "Dowex 50 WX8", H+<->form (diameter = 1,2 cm, høyde = 10 cm). Percolatet og vaskevæskene ble brakt til nøytral tilstand ved hjelp av en 2 N vandig løsning av natr iumhydroksid og deretter tilsatt 4 g natriumacetat og 2,5 volumer etanol. Det oppnådde bunnfall ble vasket med en 6:1 etanol/vannblanding og tørket. 1,4 g produkt ble oppnådd og hadde et <13>C-NMR-spektrum som viste karakteristiske topper ved følgende 6 (uttrykt som ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,4; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,9; 78,6; 72,3; 71,9; 68,8; 62,6; 60,3; 54,1; 53,1.

Eksempel 6

10 g heparin LMW ALFA 87-198 ble tilsatt til 300 ml av en vandig løsning som inneholdt 2,7 g (0,225 N) natriumhydroksid, 15 g (0,62 5 N) natriumacetat og 60 ml natriumborhydrid. Løsningen ble ved hjelp av en termostat holdt på 60°C i 50 minutter, avkjølt til romtemperatur, tynnet til 500 ml med destillert vann og percolert først på en anionisk harpiks "Dowex 1 X 2", OH -form (diameter = 2 cm, høyde = 15 cm) og deretter på en kationisk harpiks "Dowex 50 W X 8", H+<->form (diameter = 2 cm, høyde = 15 cm). Percolatet og vaskevæskene ble brakt til nøytral tilstand ved hjelp av 4 N vandig løsning av natriumhydroksid og ble deretter tilsatt 20 g natriumacetat og 2,5 volumer etanol. Det oppnådde bunnfall ble vasket med en 6:1 etanol/vannblanding og tørket. 9,1 g produkt ble oppnådd og hadde et ^C-NMR-spektrum som viste karakteristiske topper ved følgende 6 (uttrykt som ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,8; 78,6; 72,2; 71,8; 68,9? 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

Eksempel 7

15 g kommersielt natriumheparin ble tilsatt til 600 ml av en vandig løsning som inneholdt 5,4 g (0,225 N) natriumhydroksid, 30 g (0,625 N) natriumacetat og 120 mg natriumborhydrid. Løsningen ble ved hjelp av en termostat holdt på 42°C i 4 timer, avkjølt til romtemperatur og brakt til nøytral tilstand med eddiksyre. Løsningen ble dialysert i en natt med rennende vann og deretter percolert på en kolonne av anionisk harpiks "Dowex 1 X 2", kloridform (diameter = 2,8 cm, høyde = 15 cm). Percolatet og vaskevæskene ble tilsatt 10 g natriumacetat, brakt til pH 7 ved hjelp av 2N vandig løsning av natriumhydroksid og tilsatt 2,5 volumer etanol. Det oppnådde bunnfall ble vasket med en 6:1 etanol/vannblanding og tørket. 13,9 g produkt ble oppnådd og hadde et <13>CNMR-spektrum som viste karakteristiske topper ved følgende (uttrykt som ppm): 177,3; 104,6; 101,9; 99,8; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,9; 78,6; 72,2; 71,8; 69,0; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av heparinderivater som er kjennetegnet ved signaler i "^C-NMR-spektret på ca. 53 og ca. 54 ppm, spesifikk dreining på mellom +50° og +90° i vandig løsning, svovelinnhold på mellom 8% og 11% og forhold sulfat/karboksyl på mellom 1,50 og 2,20, karakterisert ved at en vandig løsning av et heparinmateriale behandles med en base av et alkali- eller jordalkalimetall med en konsentrasjon på mellom 0,01 N og 1 N i nærvær av et salt av et alkali- eller jordalkalimetall i en konsentrasjon på mellom 0 og 1 N, eventuelt i nærvær av en katalytisk mengde av et reduksjonsmiddel, i et tidsrom på mellom 0,5 og 24 timer ved en temperatur på mellom 35°C og 70°C, at reaksjonsblandingen eventuelt renses ved perkolering gjennom en ionebytterharpiks eller ved dialyse, og at forbindelsene som har den således modifiserte struktur utfelles ved tilsetning av fra 2 til 4 volumer av en alkohol, som inneholder fra 1 til 3 karbonatomer, ved omtrent nøytral pH.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det som base anvendes natrium-, kalium-eller bariumhydroksid.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det som salt anvendes natrium-, kalium-, barium-, kalsium- eller magnesiumklorider og -acetater eller natrium-, kalium- og magnesiumsulfater.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at reduksjonsmidlet er natriumborhydrid.

5. Fremgangsmåte i samsvar, med krav 1, karakterisert ved at forbindelsene utfelles ved tilsetning av ca.

2 volumer etylalkohol.