FI96425B - Menetelmä uusien hepariinijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

96425

Menetelmä uusien hepariinijohdannaisten valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää uusien rakenteeltaan modifioitujen hepariinijohdannaisten valmistamiseksi kä-5 sittelemällä kaupallisia tai puhdistettuja tai pienimole-kyylipainoisia hepariineja emäksisessä väliaineessa, mahdollisesti suolan ja pelkistysaineen läsnä ollessa.

Näitä uusia hepariinijohdannaisia voidaan saada myös kuumentamalla hepariinijohdannaisia, jotka on kuvat-10 tu EP-patenttijulkaisussa 347 588 neutraalissa tai emäksisessä väliaineessa mahdollisesti suolan tai pelkistävän aineen läsnä ollessa. Uusilla hepariinijohdannaisilla on kemiallis-fysikaaliset ominaisuudet, jotka poikkeavat sekä kaupallisten hepariinien ominaisuuksista että EP-pa-15 tenttijulkaisussa 347 588 kuvattujen hepariinijohdannais ten ominaisuuksista ja lisäksi niillä esiintyy erilainen biologinen aktiivisuus kuin kummallakaan ylläkuvatun luokan tuotteilla. Erityisesti uusilla johdannaisilla ei enää esiinny hepariinirakenteille tyypillistä koaguloin-20 nin estoaktiivisuutta, koska ne pysyvät muuttumattomina tai jopa parantavat biologista aktiivisuutta, kuten esimerkiksi kivien vastaista aktiivisuutta, joka ominaisuus tekee niistä sopivia lääkkeitä munuaiskivien parantamisessa ja estämisessä. Bowyer R.G. et ai, Clin. Chim. Ac-25 ta, 95, 23, 1979, todellakin osoittivat, että hepariini on voimakas kalsiumoksalaattikiteiden muodostumisen ja toisiinsa liittymisen estäjä, kun taas Baggio B., Int. Meeting on "Inhibitors of crystallization in renal lithiasis and their clinical application ", Bologna, 30 Syyskuu 7-9, 1987, osoittivat, että hepariini laskee ok-salaatin erittymistä virtsateissä. Sen takia hepariini on mahdollinen lääke kivettymistä vastaan, mutta sitä ei voida varmasti käyttää yleisesti munuaiskiville ja erityisesti kalsiumoksaalille sen erityisten koaguloinnin 35 ja tromboosin estoaktiivisuuksien takia. Sitä vastoin 96425 ' 2 esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja tuotteita voidaan käyttää munuaiskivien hoidossa, jotka sairaudet ovat kroonisia sairauksia, jotka edellyttävät pitkiä hoitoaikoja hyvin spesifisillä lääkkeillä ilman sivu-5 vaikutuksia, koska niillä ei esiinny hepariinille tyypillisiä koaguloinnin esto-ominaisuuksia.

Keksinnön mukaisesti valmistetuilla hepariinijohdannaisilla on täysin erilaiset kemiallis-fysikaaliset ominaisuudet kuin niillä tuotteilla, jotka on kuvattu ΕΡΙΟ patenttijulkaisussa 133 078, Mardiguian J.S. ja julkaisussa Hirano S. et ai, Conn. Tissue. Res., 3, 73 - 79, 1975, kuten osoittaa se, että keskimääräinen molekyyli-paino pysyy olennaisesti muuttumattomana ja siten todistaa depolymeroinnin puuttumisen, ja se, että UV:11a 15 puuttuu absorptio alueella 225 - 230 nm ja kaksoissidos-ten resonansseja vastaavat piikit 13C-NMR spektrissä, jotka ovat osoituksena uronihapon asemien 4 ja 5 kaksois-sidoksen puuttumisesta. Lisäksi niillä ei esiinny edes niiden yhdisteiden kemiallis-fysikaalisia ominaisuuksia, 20 jotka yhdisteet ovat eristäneet Sampson P ja Meyer K.,

Proc. Nat♦ Acad. Sei♦, USA 68, 2329 - 31, 1971, koska nyt kuvattujen tuotteiden X3C-NMR spektri osoittaa glukoosia-*:· miinin aseman 6 hiiliatomin muuttumattoman aseman ja sig- ·*· naalin voimakkuuden ja siten osoittaa, että 6-sulfatoidun 25 hiiliatomin ja 6-desulfatoidun hiiliatomin suhde on muut-tumaton, jonka suhteen tulisi muuttua 3,6-anhydroglukoo-siamiinin muodostuksessa, koska 6-sulfatoitu hiiliatomi osallistuu vedettömän johdannaisen muodostumiseen. Lopuksi keksinnön mukaisesti valmistetut tuotteet eroavat ke-30 miallis-fysikaalisten ominaisuuksiensa suhteen niistä, jotka on kuvattu EP-patenttijulkaisussa 347 588, kuten osoittautuu esimerkiksi 13C-NMR spektrin 53 ja 54 ppm vastaavien piikkien puuttumisesta.

Keksintö koskee menetelmää uusien hepariinijohdan-35 naisten valmistamiseksi, joilla on erilainen 13C-NMR- 96425 3 spektri kuin kaupallisilla hepariineilla, erityisesti alueella 102 - 92 ppm, jolloin esiintyy ominainen signaali arvolla noin 101,3 ppm, ja joiden ominaiskiertokyky 546 nm:ssä on noin +15 - +40° vesiliuoksessa, rikkipitoi-5 suus on noin 6 - 9 %, sulfaatti/karboksylaatti-suhde on noin 1,20 - 1,70 ja vapaiden aminoryhmien määrä on noin 0,4 - 2,1 %. Menetelmälle on tunnusomaista, että vesi-liuosta, joka sisältää kaupallista tai puhdistettua tai pienimolekyylipainoista hepariinia, käsitellään alkaali-10 tai maa-alkaalimetalliemäksellä, jonka väkevyys on noin 0,01 - 1 N, mahdollisesti alkaali- tai maa-alkaalimetal-lisuolan läsnä ollessa aina 1 N väkevyyteen saakka ja katalyyttisella määrällä pelkistysainetta, noin 0,5 - 24 tunnin ajan lämpötilassa, joka on noin 75 eC:n ja reak-15 tioseoksen kiehumispisteen välillä, ja reaktioseokselle suoritetaan puhdistus valuttamalla se ioninvaihtokolonnin läpi tai dialyysillä, ja siten rakenteeltaan modifioidut tuotteet eristetään joko saostamalla lisäämällä noin 2-4 tilavuusosaa alkoholia, joka sisältää 1-3 hiili-20 atomia, noin neutraalissa pH:ssa tai pakastekuivaamalla.

Nyt kuvattuja uusia hepariinijohdannaisia voidaan saada myös kuumentamalla hepariinijohdannaisia, jotka on kuvattu EP-patenttijulkaisussa 347 588, neutraalissa tai emäksisessä väliaineessa, mahdollisesti suolojen ja pel-25 kistävän aineen läsnä ollessa. Kemiallinen muuntoreaktio suoritetaan kaupallisten tai puhdistettujen tai pienimo-lekyylipainoisten hepariinien emäksisellä käsittelyllä menetelmällä, joka muistuttaa EP-patenttijulkaisussa 347 588 kuvattua. Keksinnön mukaisessa menetelmässä joi-30 takin perusmuuttujia, pääasiassa lämpötilaa ja/tai aikaa, muunnetaan riittävässä määrin suhteessa yllä mainitussa EP-patenttijulkaisussa kuvattuun menetelmään. Tarkemmin sanoen lämpötilaa nostetaan ja/tai aikaa lisätään verrattuna aikaisempaan menetelmään siten, että kaupalliset tai 35 puhdistetut tai pienimolekyylipainoiset hepariinit, kah- 96425 4 den 'toisiaan seuraavan samassa väliaineessa tapahtuvan reaktion kautta, muuttuvat ensin yhdeksi yllä mainitussa EP-patenttijulkaisussa kuvatuksi tuotteeksi, ja sitten niiden kemiallisen lisäkäsittelyn jälkeen, yhdeksi nyt 5 kuvatuksi uudeksi tuotteeksi.

Toisin sanoen reaktion tietyt olosuhteet eivät vain salli lähtöainehepariinin muuttuvan väliaineyhdis-teeksi, jolla on EP-patenttijulkaisussa 347 588 kuvatut ominaisuudet, vaan ne saavat aikaan tämän väliaineen seulo raavan muuttumisen lopputuotteksi, jolla on nyt kuvatut kemiallis-fysikaaliset ominaisuudet. On ilmeistä, että valittujen tiettyjen tehokkaiden olosuhteiden perusteella, välituoteyhdiste voi esiintyä reaktion aikana enemmän tai vähemmän korkeina väkevyyksinä ja sen väkevyys voi 15 olla myös niin alhainen, että sitä ei voida havaita käytössä olevilla kemiallis-fysikaalisilla menetelmillä. Lisäksi voidaan käyttää myös muita muuttujia kuin lämpötilaa ja aikaa; esimerkiksi myös emäksen väkevyys voi siirtää reaktiotasapainoa nyt kuvatun tuotteen muodostumisen 20 suuntaan EP-patenttijulkaisussa 347 588 kuvattujen yhdisteiden muodostumisen sijasta. Itse asiassa reaktion tasapaino on selvästi verrannollinen kaikkiin reaktiomuuttu-jiin nähden ja siksi se muuttuu muuttujien muutoksien mukaisesti. Sen takia on pidettävä erityisen tärkeänä muut-25 tujien määritystä, ensin lämpötilaa ja sitten aikaa, joita on tulkittava operatiivisina ja valaisevina, mutta ei rajoittavina.

Kemiallinen muutosreaktio voidan suorittaa myös käyttäen lähtöaineina yhdisteitä, jotka on saatu EP-pa-30 tenttijulkaisussa 347 588 kuvatun menetelmän mukaisesti.

, Tässä toisessa tapauksessa näitä yhdisteitä lämmitetään neutraalissa tai emäksisessä väliaineessa, mahdollisesti suolan ja pelkistävän aineen läsnä ollessa.

Viimein, kemiallinen muunnosreaktio voidaan suo-35 rittaa eristämättä yllä mainittuja tuotteita, nimittäin 96425 5 se voidaan suoraan suorittaa reaktioseokssta, joka on saatu yhden tai useamman EP-patenttijulkaisussa kuvatun menetelmän mukaisesti. Tässä tapauksessa välituotereak-tioseokselle voidaan suorittaa kemiallinen käsittely, jo-5 ka tekee mahdolliseksi saada aikaan kemiallisen väliaineen, joka on välttämätön uudelle reaktiolle, kuten esimerkiksi pH korjaus hapon, emäksen tai ioninvaihto-hartsien avulla, suolojen poisto dialyysin tai ioninvaih-tohartsien tai geelikolonnien avulla, suolojen tai nii-10 den yhdistelmien lisäys.

Tällä tavalla saduilla uusilla tuotteilla, joilla on muunnettu hepariinirakenne, esiintyvät kemiallis-fysi-kaaliset ominaisuudet, kuten tietty ominaiskiertokyky ja 13C-NMR signaalit, jotka poikkeavat sekä lähtöaineiden 15 arvoista että niiden tuotteiden arvoista, jotka on kuvattu EP-patenttijulkaisussa 347 588. Erityisesti niille on luonteenomaista se, että niillä esiintyy täysin erilaiset 13C-NMR signaalit kuin kaupallisilla hepariineilla alueella 102 - 92 ppm, jolla alueella esiintyvät anomeeri-20 hiilien piikit, ja puuttuu piikit alueella noin 53 - 54 ppm, jotka piikit ovat tyypillisiä yllä mainitun EP-patentin mukaisille tuotteille. Edelleen uusille tuotteille on ominaista ominaiskiertokyvyn matalat arvot (noin 20° - 30 0 vähemmän) verrattuna kaupallisiin läh-25 tö-ainehepariineihin. Ominaiskiertokyvyn lasku on vielä suurempi, jos verrataan yllä mainitussa EP-patenttijulkaisussa kuvattuihin tuotteisiin, joilla esiintyy korkeampia arvoja kuin kaupallisten lähtöainehepariinien arvot.

30 Kaupallisten tai puhdistettujen tai pienimolekyy- lipainoisten hepariinien kemiallinen muunto saadaan aikaan korkeissa lämpötiloissa ja/tai pitkien aikojen kuluessa vesiväliaineessa emäksen, edullisesti alkali- tai maa-alkalimetallihydroksidin läsnä ollessa, mahdollises-35 ti alkali- tai maa-alkalimetallisuolan ja pelkistävän aineen, edullisesti natriumboorihydridin, läsnä ollessa.

96425 6 Käytettyjä emäksiä ja alkali- tai maa-alkalimetal-leja ovat edullisesti natrium, kalium, kalsium, magnesium ja barium.

Emäksinä käytetään edullisesti natrium-, kalium-5 ja bariumhydroksideja.

Suoloina voidaan suotuisasti käyttää natrium-, kalium-, barium-, kalsium- ja magnesiumasetaatteja ja -klorideja, ja natrium-, kalium- ja magnesiumsulfaatteja.

Kaupallinen tai puhdistettu tai pienimolekyylipai-10 noinen hepariini liuotetaan noin 0,01 - IN alkali- tai maa-alkalimetalliemäksen vesiliuokseen, edullisesti nat-riumhydroksidiin, mahdollisesti alkali- tai maa-alkali-suolan esiintyessä väkevyydessä, joka on yhtä suuri tai pienempi kuin IN, ja pelkistävän aineen, edullisesti 15 natriumboorihydridin, esiintyessä katalyyttisessä määrin.

Liuos termokäsitellään lämpötilassa, joka vaihtelee noin 75 °C:sta reaktioseoksen kiehumispisteeseen, noin 0,5 -24 h ajan. Reaktion lopussa liuos jäähdytetään huoneen lämpötilaan, neutraloidaan neutraaliin pH-arvoon ja suo-20 ritetaan mahdollisesti puhdistuskäsittely, esimerkiksi viedään se ioninvaihtokolonnin läpi tai suoritetaan dialyysi, ja lopulta muunnettu hepariinituote saadaan saos-tamalla lisäämällä noin 2-4 tilavuusosaa, edullisesti 2,5 tilavuusosaa alkoholia, joka sisältää 1-3 hiiliato-25 mia, kuten esimerkiksi etyylialkoholia, tai pakaste kui- vaarnalla.

Nyt kuvattuja uusia hepariinijohdannaisia voidaan saada myös käyttämällä lähtöaineena hepariinijohdannaisia, jotka on saatu EP-patenttijulkaisun 347 588 mukai-30 sesti tai niiden reaktioseosta.

Ensimmäisessä tapauksessa hepariinijohdannainen liuotetaan veteen tai noin 0,01 - 1 N alkali- tai maa-alkalimetalliemäksen vesiliuokseen alkali- tai maa-alka-lisuolan läsnä ollessa väkevyydessä, joka on yhtä suuri 35 tai pienempi kuin IN, ja katalyyttisen määrän pelkistä- 7 96425 vää ainetta läsnä ollessa, ja liuos lämpökäsitellään lämpötilassa, joka vaihtelee 74 eC:sta reaktioseoksen kiehumispisteeseen, noin 0,5 - 24 tunnin ajan.

Toisessa tapauksessa mainitun EP-patenttijulkaisun 5 mukaisesti saatu reaktioseos, mahdollisesti muunneltuna, esimerkiksi liuoksen pH:ta korjamalla, myös neutraloimalla lisäämällä happoa, kuten esimerkiksi vetykloridi- tai etikka- tai propionihappoa, tai poistamalla suolaa ja pelkistävää ainetta, siinä tapauksessa että niitä esiin-10 tyy, dialyysillä tai viemällä ensin anionisen hartsin läpi ja sitten kationisen hartsin läpi tai geelisuodatuk-sella, tai sopivasti yhdistämällä yhtä tai useampaa yllä mainittua käsittelyä, lämpökäsitellään lämpötilassa, joka vaihtelee 75 °C:sta reaktioseoksen kiehumispisteeseen, 15 noin 0,5 - 24 tunnin ajan.

Molemmissa tapauksissa haluttu lopputuote eristetään reaktion lopussa kuten aikaisemmin on kuvattu.

Keksinnön mukaisesti saaduilla muunnetuilla hepa-riineilla esiintyy joitakin tyypillisiä kemiallis-fysi-20 kaalisia ominaisuuksia, jotka johtavat sen täysin poikkeamaan tunnetun tekniikan kaltaisista emäksisten käsittelyjen tuotteina saatavista tuotteista.

Uusien hepariinijohdannaisten rakenteelliset muutokset verrattuna lähtöainehepariineihin, esiintyivät 25 erityisesti 13C-NMR- spektrin asemassa ja resonanssien suhteellisesta voimakkuudessa, elektroforeettisesta käyttäytymisessä, ominaiskiertokyvyn laskusta ja rikkipitoisuuden ja sulfaatti/karboksyyli-suhteen laskusta, jolloin karboksyylipitoisuus pysyi muuttumattomana, ja tietyn 30 määrän vapaita aminoryhmiä esiintymisessä.

Uusien hepariinijohdannaisten rakenteen vielä luonteenomaisempia muutoksia tarkasteltiin 13C-NMR-spektrissä tapahtuneiden syvien muutosten tutkimisella. Nämä muutokset viittaavat joihinkin kiinteisiin spektrin 35 alueisiin ja käsittävät sekä uusien piikkien esiintymisen 8 96425 että muiden piikkien muuttumisen tai häviämisen. Erityisen tärkeitä ovat signaalien siirtymät, jotka vastaavat iduroni- ja glukoosiaminiyksiköiden 1-hiiltä 92 - 102 ppm alueella sekä suhteessa kaupallisiin hepariineihin että 5 EP-patenttijulkaisussa 347 588 kuvattuihin tuotteisiin. Erityisen tärkeä on myös signaalien häviäminen arvoilla 53 ja 54 ppm, jotka signaalit ovat ominaisia yllä mainitussa EP-patenttijulkaisussa kuvatuille hepariinijohdannaisille.

10 Erityisesti uusi piikki arvolla noin 101,3 ppm esiintyy verrattuna kaupallisiin hepariineihin. Uusien tuotteiden Ja lähtöaineyhdisteiden 13C-NMR spektrien vertaileva tutkimus mahdollistaa selvittämään, että tietyt spektrin alueet pysyivat muuttumattomaan, ja siten osoit-15 tavat, että osa hepariinirakenteesta ei muuttunut lainkaan. Erityisesti signaalit, jotka liittyvät sulfatoidun ja desulfatoidun glukoosiamiiniyksiköiden asemaan 6 eivät muuttuneet. Lisäksi muuttuivat piikit, jotka liittyvät sulfatoitujen glukoosiamiiniyksiköiden, iduronihapon kar-20 boksyyliyksiköiden ja glukoronihaponyksiköiden asemaan 2, jotka muodostavat keskimäärin 20 % uronijäämistä.

Edelleen muunnetuille hepariineille on ominaista se, että niillä on erilainen elektroforeettinen käyttäytyminen bariumasetaattipuskurissa 0,1 M pH:ssa 5,8 kuin 25 lähtöaineella, eli niiden liikkuvuus on suurempi kuin kaupallisilla hepariineilla ja pienempi kuin EP-patenttijulkaisussa 347 588 muunnetuilla hepariineilla.

Uusille hepariineille on ominaista noin 6 - 9 % rikkipitoisuus, noin 1,20 - 1,70 sulfaatti/karboksyyli-30 suhde, ominaiskiertokyky 546 nm:ssa noin +10 -’ +40 *C:een vesiliuoksessa, ominaiskiertokyky 589 nm:ssa noin +20 - +30 °C:een vesiliuoksessa ja noin 0,4 - 2,1 %:n määrä vapaita aminoryhmiä.

Kemiallista muuntamista arvioidaan eri tavoin 35 riippuen käytetystä valmistusmenetelmästä.

< ! i«.t MU I I *-#* · 96425 9

Koska nyt valmistetut tuotteet on saatu kaupallisista hepariineista, on välttämätöntä vertailla kemial-lis-fysikaalisia ominaisuuksia sekä lähtöainehepariinin että EP-patenttijulkaisun 347 588 mukaisen muunnetun he-5 pariinin suhteen, joka hepariini muodostuu välituotteyh-disteenä. Silloin, kun tarkastellaan 13C-NMR spektriä on välttämätöntä ottaa huomioon kokonaismuutokset, jotka tapahtuvat koko spektrissä ja erityisesti anomeerihiilien väli 102 - 92 ppm arvoilla, kuten on alan ammattimiehelle 10 ilmeistä jäljempänä esitetyn kokeellisen osan esimerkeissä ilmoitettujen resonanssiarvojen tutkimisen perusteella. Yksinkertaisuuden vuoksi muutokset ominaiskiertoky-vyssä 546 tai 589 nm:ssa voidaan ottaa huomioon, jotta voitaisiin seurata reaktioiden edistymistä.

15 Itse asiassa ominaiskiertokyvyn arvot eri ajoilla osoittavat ominaisia muutoksia, joska ovat verrannollisia reaktiossa käytettyihin olosuhteisiin. Yleisesti (a)-arvot ensimmäisen ajan kuluessa kasvavat ja toisen ajan kuluessa laskevat, kuten selvästi havaitaan taulukosta 1, 20 jossa on taulukoitu mitatut ominaiskiertokyvyn arvoja 589 nm:ssa ja 546 nm:ssa eri aikoina kaupallisella 4 %:lla hepariinin liuoksella 1 N natriumhydroksidissa termostoi-tuna 80 °C:een lämpötilaan. Ominaiskiertokyvyn mittaus mahdollistaa erottamaan oleellisella tavalla nyt kuvatun 25 kemiallisen muunnoksen EP-patenttijulkaisussa 347 588 kuvatusta, kuten käy selvästi ilmi taulukoista 2 ja 3. Taulukoidut arvot osoittavat, että kuvattu muunnos ei tapahdu merkittävässä määrin matalammassa lämpötilassa, eli 60 °C:ssa, myöskään pitkien aikojen kuluessa, kun taas 30 vastoin edellistä, yllä mainitussa EP-patenttijulkaisussa kuvattua muunnosta ei voida merkittävästi havaita korkeammassa lämpötilassa, eli 95 °C:ssa.

Sekä 13C-NMR spektrin piikkien etenevä häviäminen arvoilla 53 ppm ja 54 ppm että ominaiskiertokyvyn lasku 35 voidaan ottaa huomioon, kun nyt kuvattuja hepariinijoh- 10 96425 dannaisia valmistetaan EP-patenttijulkaisun 347 588 mukaisista tuotteista, joko niiden eristyksen tai sopivan välituotereaktioseoksen kemiallisen käsittelyn jälkeen. Ensimmäisessä tapauksessa 53 ja 54 ppm piikkien integraa-5 lien summan ja glukosiamiinin noin 62,5 ja 69 ppm aseman 6 hiilien piikkien integraalien summan suhdetta arvioidaan. Valitaan piikit arvoilla 62,5 ja 69 mielivaltaiseksi verranteeksi, koska niiden voimakkuus pysyy vakiona, ja koska ne ovat spektrin sellaisella alueella, jossa ei 10 esiinny muita piikkejä.

Mainitun suhteen arvo laskee reaktion aikana mitättömään saakka reaktion lopussa. Vaihtoehtoisesti voidaan ottaa huomioon ominaiskiertokyvyn arvo, joka vähitellen laskee, kunnes saavuttaa vakioarvon, koska omi-15 naiskiertokyvyn lasku arvolla 589 nm tapahtuu samanaikaisesti kuin resonanssit arvoilla noin 53 ja 54 ppm laske vat.

Keksinnön mukaisesti valmistetuilla uusilla hepa-riinijohdannaisilla on huomattava kivien vastainen ak-20 tiivisuus sekä voimakas lähtöainehepariineille ominainen biologisen aktiivisuuden lasku. Kivien vastainen aktiivisuus mitattiin kahdella tietyllä biologisella kokeella: määritettiin oksalaatin membraanien välinen virtaus menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Baggio B. et. ai, Lancet, 25 1984, (II), 12 - 14, ja tutkittiin membraanin valkuaisai neiden fosforylaatiota perustuen kuvaukseen, jonka ovat esittäneet Baggio B. et. ai, 1RCS Med. Sei., 14, 368, 1986. Tulokset esitettiin nyt kuvattujen tuotteiden aikaansaamina estoprosentteina verrattuna oksalaatin mem-30 braanien väliseen virtausverranteeseen ja vastaavasti ' membraanin valkuaisaineiden fosforylaatio punasoluissa, jotka saatiin idiopaattisten potilaiden kivettymistä. Määritettiin oksalaatin erytrosyyttinen virtaus 12 tunnin öisen paaston jälkeen seuraavasti: kerättiin 10 ml verta 35 suonesta heparinisoituihin koeputkiin, jotka oli pesty >B - a«4l i:l«i illU ' k' 96425 11 kolme kertaa liuoksella, joka sisälsi 150 mM NaCl, 10 mM KC1 ja 20 mM TRIS-HC1 (pH 7,4). Näytteisiin suspendoitiin 50 % hematokriittiä samassa liuoksessa lisättynä 10 mM natriumoksalaatin kanssa. Tätä solususpensiota haudutet-5 tiin huoneen lämpötilassa kaksi tuntia. Seuraavat vaiheet suoritettiin 4 eC:ssa. Sentrifugoinnin jälkeen punasolut, jotka oli suspendoitu 20 %:seen yllä kuvattuun hematok-riittiliuokseen, jaettiin useisiin osiin, joihin lisättiin jonkin verran 14C oksalaattia (8000 - 10000 ppm).

10 Vastaavat osat sentrifugoitiin 10, 20, 30, 60, 90, 120 minuutin ja 24 tunnin jälkeen, Ja 14C aktiivisuus beta-laskurilla määritettiin sakan yllä olevasta nesteestä. Oksalaatin vaihdon virtausvakio arvioitiin lineaarisen funktion kulmakertoimesta 15 In( At-Aoc) / (A0-A00) = - Kt jossa t on aika, K on virtausvakio ja A on oksalaatin määrä aikana 0, t ja isotooppisessa tasapainossa (oo).

Kalsiumpitoisesta idiopaattisesta munuaiskivistä kärsiviltä potilailta saatuja varjokuvia, joissa esiin-20 tyi epänormaali oksalaatin membraanien välinen virtaus, käytettiin membraanin valkuaisaineiden fosforylaation tutkimisessa. Sisäsyntyinen fosforylaatio saatiin 37 °C:ssa vaihtelevilla hautomisajoilla väliaineessa, joka sisälsi 100 mM TRIS-HC1 pH:ssa 7,5, 8 mM MgCL2, 2 mM 25 (32p )ATP, noin 50 pg membraanin valkuaisaineita 125 μΐ lopputilavuudessa. Haudutus keskeytettiin lisäämällä 2 % natriumdodekyylisulfaattia ja 1 % merkaptoetanolia, ja seuraavaksi kiehutettiin 100 °C:ssa 5 minuuttia. Sitten lisättiin 20 μΐ kyllästettyä sakkaroosiliuosta ja 12 μΐ 30 0,05 %:sta pyroniinia merkkiaineeksi. Tällä käsiteltyjen valkuaisaineiden 20 pg näytteet asetettiin SDS-polyakryy-liamidigeelille elektroforeesiin. Sen jälkeen geelit värjättiin Coomassie-sinisellä, kuivattiin ja asetettiin au-toradiografiaan noin 20 tunniksi. Autoradiogrammit luet-35 tiin densitometrillä 32p proteiinisidokseen osallistumisen määrän määrittämiseksi.

96425 12

Muut biologiset aktiivisuudet määritettiin useilla hepariineille tyypillisillä kokeilla. Itse asiassa suoritettiin kokeet, jotka liittyvät anti-Xa-tekijään, APTT:hen, vuotoaikaan ja kokeelliseen tromboosilta suo-5 jaukseen. APTT aktiivisuus määritettiin Larrieu M.J. ja

Weiland G., Rev. Hematol., 12, 199, 1957 mukaisella menetelmällä. , kun taas anti-Xa-aktiivisuus määritettiin Yin E.T. ja Wessler S., Biochem. Biophys. Acta, 201, 387, 1970 mukaisella menetelmällä.

10 Kukin tutkittava tuote liuotettiin plasmaan, joka oli otettu paastonneilta rotilta, jonka jälkeen skaalatut laimennukset suoritettiin, jotta saataisiin menetelmässä aikaan saadut väkevyydet. Kustakin tuotteesta suoritettiin 10 määritystä molemmilla aktiivisuuksilla. Kustakin 15 tuotteesta arvioitiin mcg/ml:na määrä, joka määrää vastaavassa kokeessa hyvin voimakkaan vaihtelun. Erityisesti kunkin tuotteen aktiivisuus ilmoitettiin väkevyyden suhteen mcg/ml:na, joka vastaavasti kaksinkertaistaa APTT ajan ja lisää 30 %:lla anti-Xa:n arvoa. Kahdessa kokeessa 20 saadut arvot vahvistavat, että uusilla tuotteilla esiintyy koaguloinnin estovoiman lasku.

Vuotoaika suoritettiin rotalla Dejana E et. ai, Tromb. Haemost., 48, 108, 1982 kuvaaman menetelmän mukaisesti ja tulokset esitettiin laskemalla vuotamisen kes-25 toajan kasvun prosentti uusilla hepariineilla käsitel lyille rotille verrattuna vuotamisen kestoajan kasvuun verrannerotilla ja verrattuna samalla annosmäärällä (1 mg/kg/i.v.) vastaavalla lähtöainehepariinilla käsiteltyihin kestoajan kasvuihin.

30 Tromboosin estoaktiivisuus arvioitiin koestamalla suonensisäinen lepotromboosi, kuten on kuvattu julkaisussa Reyers S. et. ai, Thromb. Res. 18, 669 - 674, 1980. Uusilla tuotteilla aikaansaatu suojaus on laskettu prosenttina, ottamalla yhtäsuureksi kuin 100 lähtöaineen 35 tromboosin esto suojauksen.

96425’ 13

Saadut tulokset osoittavat kahden tyyppisten hepa-rlinien paremmuuden tai olennaisen samanarvoisuuden kuten kivien vastaisen aktiivisuuden kokeissa esitetään. Sitä vastoin kaupallisilla hepariineilla tietyissä kokeissa 5 osoitettuja koaguloitumisen estoaktiivisuuksia ei käytännöllisesti katsoen esiinny uusilla hepariineilla.

Yllä mainittujen biologisten kokeiden arvot on taulukoitu kokeellisessa osassa yhdessä keraiallis-fysi-kaalisten ominaisuuksien kanssa.

10 Näitä uusia hepariinijohdannaisia voidaan käyttää munuaissairauksien ja erityisesti munuaiskivien koidossa. Edullisia käyttötapoja ovat hepariineille tyypilliset käyttötavat, eli ruansulatuskanavan ulkopuoliset ja ihonalaiset reitit steriilin vesiliuoksen muodossa, joka 15 liuos mahdollisesti sisältää myös joitakin suoloja, jotka tekevät sen isotoniseksi liuokseksi, ja joitakin säilöntäaineita.

Nyt kuvattuja hepariinijohdannaisia voidaan käyttää myös muilla tavoin, edullisesti vatsankestävinä far-20 maseuttisina muodostelmina.

Nyt kuvattujen uusien tuotteiden saamiseksi käytettiin joko kaupallista hepariinia, kaupallista natrium-hepariinia käsittelemällä saatuja puhdistettuja heparii-neja tai pienimolekyylipainoisia hepariineja, jotka saa-25 tiin depolymeroimalla alalla tunnettuja menetelmiä käyt täen. Käytettyjen hepariinien puhdistus ja depolymeroin-timenetelmät on kuvattu ennen esimerkkejä, jotka edelleen valaisevat keksintöä, mutta joita ei ole tarkoitettu rajoittamaan sitä. Sulfaatti/karboksyyli-suhteen määritys 30 on suoritettu potentiometrisellä menetelmällä. Rikki-- ' prosentin määritys on suoritettu sekä potentiometrisellä että Schoeniger-menetelmällä. 13C-NMR spektri on määritetty 75,47 MHz Varian CFT-75 spektrometrillä käyttäen D20-liuotinta ja natrium-3-trimetyylisilyylipropaanisul-35 fonaattia sisäisenä referenssistandardina.

96425 14 TAULUKKO 1

Omina1skiertokyvyn vaihtelut arvoilla 589 ja 546 nm kaupallisen ALFA 87- 163 hepariinin 4 %:lla liuoksella 5 1 N:ssa NaOH-vesiliuoksessa termokäsiteltynä 80 °C lämpö tilassa.

Aika (h) 589 nm 546 nm 10 ________ 0 0 o 15· 37 32 30’ 39 36 45' 41 38 15 lh 43 39 2h 14 14 3h 9 1 4h -11 -12 5h -15 -17 6h -19 -19 7h -20 -26 8h -25 -30 is 96425 TAULUKKO 2

Ominaiskiertokyvyn vaihtelut arvolla 546 nm kaupallisen ALFA 87 - 163 hepariinin 4 %:lla liuoksella 0,225 N NaOH-5 vesiliuoksessa eri aikoina ja eri lämpötiloissa.

Aika [a]” Lämpötila °C

(h) 60 80 95 10 0 1 63 69 55 2 65 70 46 3 71 72 33 4 66 61 24 15 5 76 5Θ 25 6 77 57 ei määritelty 7 00 50 ei määritelty 8 03 45 ei määritelty 964?* 16 TAULUKKO 3

Ominaiskiertokyvyn vaihtelut arvolla 546 nm kaupallisen ALFA 87-163 hepariinin 4 %:lla liuoksella 1 N NaOH-vesi-5 liuoksessa eri aikoina ja eri lämpötiloissa.

[«]»

Aika Lämpötila °C

(h) 60 80 10 _ 0 60 60 * 8 2 99 2 93 74 m 3 97 61 15 4 93 40 5 88 43 6 89 41 7 78 34 8 83 30 20

Natriumhepariini ALFA 87 - 81

Liuotetaan 50 g kaupallista natriumhepariinia 4000 ml vettä ja kaadetaan noin 30 minuutissa liuokseen, joka sisältää 222,4 g kalsiumasetaattimonohydraattia 4000 25 ml:ssa vettä, 114 ml etikkahappoa ja 1200 ml etyylialkoholia, ja pidetään lämpötila noin 8-10 °C:ssa. Saatu suspensio suodatetaan 15 tunnin kuluttua 5 °C:ssa ja suo-dokseen lisätään 2000 ml etyylialkoholia ja 3 tunnin kuluttua 5 °C:ssa saatu sakka suodatetaan. Sen jälkeen sak-30 ka liuotetaan 400 ml vettä, liuos tuodaan pH-arvoon 7,0 lisäämällä 1 N natriumhydroksidia, ja sitten sitä käsitellään 200 ml:11a Dowex 50W X8, joka on natriummuodossa, hartsilla ja 140 ml:11a vettä 20 minuutin ajan. Liuos ja 96425 17 hartsi siirretään kromatografikolonniin (o = 4 cm, h = 13 cm), joka sisältää 160 ml samaa hartsia. Sen jälkeen kun liuos on laskettu läpi ja eluoitu tislatulla vedellä, kunnes liuoksen kokonaistilavuus on 800 ml, mainittuun 5 liuokseen lisätään 24 g natriumasetaattitrihydraattia ja 2000 ml etyylialkoholia. Saostuma suodatetaan ja kuivataan tyhjössä, jolloin saadaan 36,5 g puhdistettua nat-riumhepariinia, joka nimetään ALFA 87-81, ja jolla on seuraavat ominaisuudet: 10 13C-NMR spektri (ppm): 177,3, 104,7, 102,0, 99,5, 80,1, 78.6, 72,4, 72,0, 69,1, 60,7.

S = 10,6 %

Sulfaatti/karboksyyli-suhde = 2,20 [a]25°46 = +54° (C = 1 % vedessä) 15 [a]leg +47° (C = 1 % vedessä) vapaa NH2 = 0,0% APTT = 1,7 pg/ml

Anti Xa * 20,6 pg/ml

Vuotoajan keston kasvu > 200 % ( 1 mg/kg, i.v.) 20 Oksalaatin menbraanien välisen virtauksen esto = 73,5 % (C = 100 pg/ml)

Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 24 % (C = 10 pg/ml)

Kaupallinen natriumhepariini ALFA 88-247 25 13C NMR ppektri (ppm): 177,3, 177,1, 104,7, 102,0, 99,6, 79,2, 78,9, 78,7, 72,5, 71,9, 69,2, 62,2, 62,8, 61,0, 60.7, 60,3.

S - 10,9 %

Sulfaatti/karboksyylisuhde =2,1 30 [a] 5°46 = +54° ( C = 1 % vedessä) ' ' [a] 589 = +47° ( C = 1 % vedessä) vapaa NH2 = 0,27 % APTT = 0,7 pg/ml Anti Xa = 30,3 pg/ml 35 Vuotoajan keston kasvu > 200 % (1 mg/kg, i.v.) 96425 18

Oksalaatin membraanien välisen virtauksen esto = 69,2 % (C = 100 pg/ml)

Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 26 % (C = 10 pg/ml) 5 Kaupallinen natriumhepariini ALFA 87 - 120 13C NMR ppektri (ppm): 177,3, 104,7, 102,1, 99,5, 78,7, 72,5, 72,0, 69,2, 62,7, 60,8 S = 11,4 %

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 2,3 10 [a]25°46 = +57° ( C = 1 % vedessä) [a]|g9 = +55° ( C = 1 % vedessä) vapaa NH2 =0,4% APTT = 1,4 pg/ml Anti Xa = 26,4 pg/ml 15 Vuotoajan keston kasvu > 200 % (1 mg/kg, i.v.)

Oksalaatin membraanien välisen virtauksen esto = 61,0 % (C = 100 pg/ml)

Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 23 % (C = 10 pg/ml) 20 Kaupallinen hepariini ALFA 87-163 13C NMR ppektri (ppm): 177,6, 104,8, 102,0, 99,5, 78,6, 72,4, 72,0, 69,2, 62,7, 60,8 S = 11,0 %

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 2,0 25 [<*3 2546 = +60° ( C = 1 % vedessä) [et] 589 = +51° ( C = 1 % vedessä) vapaa NH2 * 0,6 % APTT =2,1 pg/ml Anti Xa = 23,4 pg/ml 30 Vuotoajan keston kasvu > 200 % (1 mg/kg, i.v.)

Oksalaatin membraanin välisen virtauksen esto = 79,2 % (C = 100 Mg/ml)

Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 20 % (C = 10 Mg/ml) 96425

Molekyylipainoltaan matala natriumhepariini LMW ALFA 87-198 * Valmistettiin molekyylipainoltaan matala natrium hepariini LMW ALFA 87-198 depolymeroimalla vetyperok-5 sidilla kupari-ionin läsnä ollessa kansainvälisessä patenttijulkaisussa no W0 86/06729 kuvatun menetelmän mukaisesti. Sillä esiintyi seuraavat kemiallis-fysikaaliset ominaisuudet: 13C NMR ppektri (ppm): 177,73, 104,87, 102,0, 99,6, 80,2, 10 78,6, 72,4, 71,9, 69,2, 62,7, 60,6

Molekyylipaino = 4400 Daltonia S = 11,60 %

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 2,31 [ci] 5°6 e +47° ( C = 1 % vedessä) 15 [ci] sag = +43° ( C = 1 % vedessä) vapaa NH2 * 0,0 % APTT = 8,5 pg/ml

Anti Xa = 40,6 pg/ml Esimerkki 1 20 Lisätään 1,8 grammaa ALFA 87-81 hepariinia 45 ml:aan liuosta, joka sisältää 0,4 g natriumhydroksidia (0,225 N), 2,3 g natriumasetaattia (0,625 N) ja 10 mg boorihydridiä.

Saatu liuos termostoidaan 3,5 tunnin ajaksi 25 95 °C:seen ja sen jälkeen jäähdytetään huoneen lämpöti laan, tehdään neutraaliksi jääetikkahapolla ja lisätään

2,5 tilavuusosaa etanolia. Saostuma kerätään suodattimel-le, pestään 2 %:lla (m/V) natriumasetaattiliuoksella 6:1 etanoli-vesi-seoksessa, sitten 6:1 etanoli-vedellä ja 30 kuivataan. Saadaan 1,77 grammaa tuotetta, jonka 13CNMR

spektrissä esiintyvät ominaiset signaalit seuraavilla δ (ilmoitettuna ppm:na): 177,7, 104,6, 101,8, 101,3, 100,3, 98,2, 80,7, 78,9, 74,5, 73,7, 72,8, 71,4, 68,9, 62,7, 61,4, 60,7 35 S = 7,35 % 96425 20

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 1,50 [α3 5°6 = +26° ( C = 1 % vedessä) [α] 5^g9 = +24° ( C 1 % vedessä) vapaa NH2 = 1,22 % 5 APTT = 124,0 pg/ml

Anti Xa = 41,2 pg/ml

Vuotoajan keston kasvu = 19 % (1 mg/kg, i.v.)

Tromboosin vastainen suojaus verrattuna lähtötuotteeseen = 10 % (1 mg/kg, i.v.) 10 Oksalaatin membraanien välisen virtauksen esto = 61,0 % (C = 100 pg/ml)

Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 20 % (C = 10 pg/ml)

Esimerkki 2 15 Lisätään 30 grammaa ALFA 88-247 hepariinia vesi- liuokseen, joka sisältää natriumhydroksidia (6,75 g; 0,225 N)( ja natriumboorihydridiä (200 mg).

Liuosta termostoidaan 90 °C:ssa 4 tunnin ajan, tehdään se neutraaliksi etikkahapolla ja dialysoidaan yh-20 den yön ajan paikallisella vedellä ja 6 tuntia tislatulla vedellä. Dialysaatti jäädytyskuivataan, jolloin saadaan 26,4 g tuotetta, jonka 13C-NMR spektrissä esiintyy ominaiset signaalit seuraavilla 6 (ilmoitettuna ppm:na): 177,8, 104,7, 101,4, 98,4, 80,6, 79,8, 79,3, 79,0, 74,0, 25 73,5, 72,8, 71,8, 69,0, 62,7, 61,3, 61,1, 60,8 S = 7,7 %

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 1,30 [a]25°6 = +33° ( C = 1 % vedessä) [a]|g9 = +28° ( C = 1 % vedessä) 30 vapaa NH2 = 1,20 % APTT = 16,7 pg/ml Anti Xa = 44,7 pg/ml

Vuotoajan keston kasvu = 46 % (1 mg/kg, i.v.)

Tromboosin vastainen suojaus verrattuna lähtötuotteeseen 35 = 70 % (1 mg/kg, i.v.) 21 96425

Oksalaatin membraanien välisen virtauksen esto = 74,4 % (C = 100 pg/ml)

Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 28 % (C = 10 pg/ml) 5 Esimerkki 3

Lisätään 39 grammaa ALFA 87-120 hepariinia 750 ml:aan vesiliuosta, joka sisältää natriumhydroksidia (6,75 g, 0,225 N). Liuosta termostoidaan 90 °C:ssa 4 tunnin ajan, jonka jälkeen reaktioseos tehdään neutraaliksi 10 etikkahapolla, dialysoidaan 24 tuntia paikallisella vedellä ja 6 tuntia tislatulla vedellä. Dialysaatti jäädy-tyskuivataan, jolloin saadaan 26,2 g tuotetta, jonka 13C-NMr spektrissä esiintyy ominaiset signaalit seuraavilla 6 (ilmoitettuna ppm:na): 177,7, 104,7, 101,9, 101,4, 80,6, 15 79,8, 79,0, 74,8, 73,4, 72,8, 71,8, 71,3, 69,0, 62,7, 61,3, 61,0 S = 7,7 %

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 1,38 [a]25°6 = +32° ( C = 1 % vedessä) 20 [a]25g9 = +30° ( C = 1 % vedessä) vapaa NH2 1,30 % APTT = 18,9 pg/ml Anti Xa = 44,8 pg/ml

Vuotoajan keston kasvu = 57 % (1 mg/kg, i.v.) 25 Tromboosin vastainen suojaus verrattuna lähtötuotteeseen ‘ = 37,5 % (1 mg/kg, i.v.)

Oksalaatin membraanien välisen virtauksen esto * 65,2 % (C = 100 pg/ml)

Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 21 % 30 (C = pg/ml)

Esimerkki 4

Lisätään 10 grammaa ALFA 87-163 hepariinia 250 ml:aan vesiliuosta, joka sisältää natriumhydroksidia (2,25 g, 0,225 N), natriumasetaattia (12,81 g; 0,625 N) 35 ja natriumboorihydridiä (50 mg).

96425 ' 22

Liuosta termostoidaan 90 °C:ssa 4 tunnin ajan, neutraloidaan etikkahapon vesiliuoksella ja dialysoidaan 24 tuntia paikallisella vedellä ja 6 tuntia tislatulla vedellä. Dialysaatti pakastekuivataan, jolloin saadaan 5 7,8 g tuotetta, jonka 13-CNMR spektrissä esintyy ominai set signaalit seuraavilla δ (ilmoitettuna ppm:na): 177,7, 104,6, 101,9, 101,4, 98,6, 98,4, 80,3, 79,8, 79,4, 79,0, 73,8, 72,9, 69,1, 62,6, 61,3, 60,6 S = 7,8 % 10 Sulfaatti/karboksyylisuhde = 1,35 [a]25°6 = +37° ( C = 1 % vedessä) [a]2589 = +30° ( C = 1 % vedessä) vapaa NH2 = 2,01 % APTT = 60,1 pg/ml 15 Anti Xa = 82,0 pg/ml

Vuotoajan keston kasvu = 18 % (1 mg/kg, i.v.)

Tromboosin vastainen suojaus verrattuna lähtötuotteeseen = 12,5 % (1 mg/kg, i.v.)

Oksalaatin membraanien välisen virtauksen esto = 62,6 % 20 (C = 100 pg/ml)

Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 19 % (C = 10 pg/ml)

Esimerkki 5

Termostoidaan 60 °C:ssa 3,5 tunnin ajan 450 ml ve-25 siliuosta, joka sisältää 4 g natriumhydroksidia (0,225N), 4 23 g natriumasetaattia (0,625 N), 100 mg natriumboorihyd-ridiä ja 18 g ALFA 87-163 hepariinia. Liuoksen tilavuudesta otetaan puolet, jäähdytetään huoneen lämpötilaan, tehdään neutraaliksi jääetikkahapolla ja kaadetaan 2,5 30 tilavuusosaan etanolia. Saostuma kerätään suodattimelle, pestään 6:1 etanoli/vesi-seoksella ja kuivataan. Saadaan 8 g tuotetta, joka on samanlaista kuin IT-patenttijulkaisussa nro 3504 A/88 kuvatut hepariinijohdannaiset. Tämän tuotteen 13C-NMR spektrissä esiintyy ominaiset signaalit 35 seuraavilla 6 (ilmoitettuna ppm:na): 177,3, 104,3, 101,9, „ 96425 99,5, 98,4, 97,2, 96,8, 79,8, 79,2, 78,6, 72,2, 71,9, 71,3, 68,9, 62,6, 60,6, 60,3, 54,2, 53,2.

’ Mainitulla tuotteella esiintyy seuraavat kemial- lis-fysikaaliset ominaisuudet: 5 S = 8,25 %

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 1,68 [a]25°6 = +68° ( C = 1 % vedessä) [o] 589 = +56° ( C = 1 % vedessä) vapaa NH2 = 0,67 % 10 Mainittu tuote liuotetaan 150 ml:aan tislattua vettä ja liuosta termostoidaan 75 °C:ssa 24 tuntia. Huoneen lämpötilaan jäähdytyksen jälkeen liuos tehdään neutraaliksi, siihen lisätään 3 g natriumasetaattia ja se kaadetaan 2,5 tilavuusosaan etanolia. Saatu saostuma pes-15 tään 6:1 etanoli/vesi-seoksella ja kuivataan.

Saadaan 6 g tuotetta, jonka 13C-NMr spektrissä esiintyy ominaiset signaalit seuraavilla 6 (ilmoitettuna ppm:na): 177,2, 104,8, 101,9, 101,3, 80,8, 80,5, 79,5, 78,9, 74,6, 73,8, 73,0, 71,8, 71,6, 69,0, 63,2, 61,4, 20 60,8.

S = 6,30 %

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 1,33 [a]z5°6 = +26° ( C = 1 % vedessä) [ot] 535 = +21° ( C = 1 % vedessä) ,, 25 vapaa NH2 = 1,5 % 1 APTT = 111,9 pg/ml

Anti Xa = 55,5 pg/ml

Vuotoajan keston kasvu = 16 % (1 mg/kg, i.v.)

Tromboosin vastainen suojaus verrattuna lähtötuotteeseen 30 = 12,5 % (1 mg/kg, i.v.) ’ Oksalaatin membraanien välisen virtauksen esto = 68,1 % (C = 100 pg/ml)

Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 32 % (C = 10 pg/ml) 96425 24

Esimerkki 6

Esimerkistä 5 saadun liuoksen toinen puoli neutraloidaan jääetikkahapolla ja termostoidaan 75 °C:ssa 24 tuntia. Huoneen lämpötilaan jäähdytyksen jälkeen liuos 5 kaadetaan hitaasti 2,5 tilavuusosaan etanolia. Saostuma kerätään suodattimelle, pestään 6:1 etanoli/vesi-seoksel-la ja kuivataan. Saadaan 7,2 g tuotetta, jonka 13C-NMR spektrissä esiintyy ominaiset signaalit seuraavilla δ (ilmoitettuna ppm:na): 177,3, 104,8, 101,8, 101,3, 80,8, 10 80,5, 79,5, 74,6, 73,8, 73,0, 71,8, 71,6, 68,9, 63,1, 61,4, 60,8.

S = 6,32 %

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 1,36 [ Q ]54g = +24° ( C = 1 % vedessä) 15 [at] sag = +20° ( C = 1 % vedessä) vapaa NH2 = 1,49 % APTT = 101,3 pg/ml Anti Xa = 53,9 pg/ml

Vuotoajan keston kasvu = 18 % (1 mg/kg, i.v.) 20 Tromboosin vastainen suojaus verrattuna lähtötuotteeseen = 20 % (1 mg/kg, i.v.)

Oksalaatin membraanien välisen virtauksen esto = 78,3 % (C = 100 pg/ml)

Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 26 % 25 (C = 10 pg/ml)

Esimerkki 7

Lisätään 12 grammaa molekyylipainoltaan matalaa hepariini LMW ALFA 87 - 198 300 mitään vesiliuosta, joka sisältää natriumhydroksidia (12 g; 1,0N), natriumasetaat-30 tia (15 g; 0,625 N) ja natriumboorihydridiä (60 mg).

liuosta termostoidaan 60 °C:ssa 4 tunnin ajan, jäähdytetään huoneen lämpötilaan, tehdään neutraaliksi, dialysoi-daan 24 tuntia paikallisella vedellä ja 6 tuntia tislatulla vedellä. Sen jälkeen liuos pakastekuivataan, jol-35 loin saadaan 10 g samanlaista tuotetta kuin IT-patentti- 96425 25 hakemuksessa nro 3 504 A/88, jonka tuotteen 13C-NMR spektrissä esiintyy ominaiset piikit seuraavilla 6 (ilmoitettuna ppm:na): 177,3, 104,8, 101,9, 100,3, 80,5, 80,1, 79,4, 72,7, 71,9, 69,0, 62,7, 60,6, 54,3, 53,2.

5 S = 8,25 %

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 1,53 [546 = +63° ( C = 1 % vedessä) [a]25gg = +55° ( C = 1 % vedessä) vapaa NH2 = 0,3 % 10 5 g tätä hepariinijohdannaista liuotetaan 100 ml:aan tislattua vettä ja liuosta termostoidaan 24 tuntia 75 °C:ssa, jäähdytetään huoneen lämpötilaan, tehdään neutraaliksi ja pakastekuivataan, jolloin saadaan 3,2 g tuotetta, jonka 13C-NMR-spektrissä esiintyy ominaiset 15 piikit seuraavilla δ (ilmoitettuna ppmrna): 177,6, 104,6, 101,8, 101,3, 80,7, 78,9, 74,4, 73,6, 72,7, 71,3, 69,1, 62,7, 61,3, 60,8.

S = 6,80

Sulfaatti/karboksyylisuhde = 1,52 20 [et] 5°6 - +19° ( C = 1 % vedessä) [ et J 539 = +16’ ( C = 1 % vedessä) vapaa NH2 = 0,4 %

Vuotoajan keston kasvu = 19 % (1 mg/kg, i.v.) APTT =71,2 pg/ml 25 Anti Xa = 71,2 pg/ml

Tromboosin vastainen suojaus verrattuna lähtötuotteeseen = 20 % (1 mg/kg, i.v.)

Oksalaatin membraanien välisen virtauksen esto = 68,9 % (C = 100 pg/ml) 30 Membraanin valkuaisaineiden fosforylaation esto = 20 % '· (C = 10 pg/ml)

Claims (4)

96425

1. Menetelmä uusien hepariinijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on erilainen 13C-NMR-spektri kuin kau-5 pallisilla hepariineilla, erityisesti alueella 102 - 92 ppm, jolloin esiintyy ominainen signaali arvolla noin 101,3 ppm, ja joiden ominaiskiertokyky 546 nm:ssä on noin +15 - +40° vesiliuoksessa, rikkipitoisuus on noin 6 -9 %, sulfaatti/karboksylaatti-suhde on noin 1,20 - 1,70 10 ja vapaiden aminoryhmien määrä on noin 0,4 - 2,1 %, tunnettu siitä, että vesiliuosta, joka sisältää kaupallista tai puhdistettua tai pienimolekyylipainoista hepariinia, käsitellään alkaali- tai maa-alkaalimetalli-emäksellä, jonka väkevyys on noin 0,01 - 1 N, mahdolli-15 sesti alkaali- tai maa-alkaalimetallisuolan läsnä ollessa aina 1 N väkevyyteen saakka ja katalyyttisella määrällä pelkistysainetta, noin 0,5 - 24 tunnin ajan lämpötilassa, joka on noin 75 °C:n ja reaktioseoksen kiehumispisteen välillä, ja reaktioseokselle suoritetaan mahdollisesti 20 puhdistus valuttamalla se ioninvaihtokolonnin läpi tai dialyysillä, ja siten rakenteeltaan modifioidut tuotteet eristetään joko saostamalla lisäämällä noin 2-4 tila-vuusosaa alkoholia, joka sisältää 1-3 hiiliatomia, noin neutraalissa pH:ssa tai pakastekuivaarnalla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuosta ensin käsitellään lämpötilassa 40 - 70 °C ja eristetään välituote puhdistamalla reaktioseos valuttamalla se ioninvaihtokolonnin läpi tai dialyysillä ja sen jälkeen saostamalla li-30 säämällä noin 2-4 tilavuusosaa alkoholia, joka sisältää * 1-3 hiiliatomia, noin neutraalissa pH:ssa tai pakaste- kuivaamalla, ja välituotteen vesiliuosta termokäsitellään lämpötilassa, joka on noin 75 °C:n ja reaktioseoksen kiehumispisteen välillä, noin 0,5 - 24 tunnin ajan. I · (Krl HU I i t* - - 96425

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuosta ensin käsitellään lämpötilassa 40 - 70 eC, reaktioseoksen pH säädetään neutraaliksi ja reaktioseosta termokäsitellään lämpöti- 5 lassa, joka on noin 75 °C:n ja reaktioseoksen kiehumispisteen välillä, noin 0,5 - 24 tunnin ajan.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että emäs on natrium-, kalium- tai bariumhydroksidi, suola on natrium-, kalium-, 10 barium-, kalsium- tai magnesiumasetaatti tai -kloridi, tai natrium-, kalium tai magnesiumsulfaatti, pelkistys-aine on natriumboorihydridi ja halutut tuotteet seostetaan 2,5 tilavuusosalla etyylialkoholia. 9642E