NO301719B1

NO301719B1 - Analogifremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk aktive heparinderivater

Info

Publication number: NO301719B1
Application number: NO900392A
Authority: NO
Inventors: Silvano Piani; Gian Franco Tamagnone; Raul Roberto Alpino; Maria Rita Milani
Original assignee: Alfa Wassermann Spa
Priority date: 1989-01-30
Filing date: 1990-01-29
Publication date: 1997-12-01
Also published as: NO900392L; DK0380943T3; IL92912A; US5104860A; PT92991A; IL92912A0; JPH0678369B2; FI900446A0; FI96425B; ATE111107T1; DE69012154T2; CA2007616A1; FI96425C; IE900316L; CA2007616C; DE69012154D1; ZA90263B; ES2058609T3; JPH02240102A; KR0161667B1

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en anlogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive heparinderivater som har

13

et C-NMR-spektrum som skiller seg fra tilsvarende spektrum til de kommersielle hepariner, spesielt i sonen mellom 102 ppm og 92 ppm, ved nærvær av et karakteristisk signal ved 101,3 ppm, en spesifikk dreining ved 546 nm mellom +15° og +40° i vandig opp-løsning, et svovelinnhold mellom 6% og 9%, et sulfat:karboksyl-forhold mellom 1,20 og 1,70 og et innhold av frie aminogrupper mellom 0,4% og 2,1%.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er å frembringe

nye heparinderivater med en modifisert struktur, oppnådd ved behandling av kommersielle eller rensede hepariner eller hepariner med lav molekylvekt.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet

ved at den omfatter å behandle en vandig oppløsning inneholdende kommersielt eller et renset heparin eller heparin med lav molekylvekt med en base av et alkali- eller jordalkalimetall i en konsentrasjon av 0,01 N til 1 N, eventuelt i nærvær av et salt av et alkali- eller jordalkalimetall i en konsentrasjon av ca. 1 N

og av en katalytisk mengde av et reduserende middel, i et tidsrom mellom 0,5 og 24 timer ved en temperatur mellom 75°C og reaksjonsblandingens koketemperatur, eventuelt å underkaste reaksjonsblandingen perkolering gjennom en ionebytterkolonne eller ved dialyse og isolering av produktene med den således modifiserte struktur enten ved utfelling ved tilsetning av fra 2 til 4

volumer av en alkohol med fra 1 til 3 karbonatomer ved omtrent nøytral pH-verdi, eller ved frysetørking. Ifølge en foretrukket utførelse av analogifremgangsmåten velges basen blant natrium-, kalium- og bariumhydroksider, saltet velges blant acetater og klorider av natrium, kalium, barium, kalsium og magnesium og sulfater av natrium, kalium og magnesium, som reduksjonsmiddel anvendes natriumborhydrid, og de ønskede produkter felles ut ved hjelp av 2,5 volumer etylalkohol.

Produktene fremstilt ifølge analogifremgangsmåten anvendes som farmasøytiske preparater for behandling av nefrolitiaser.

Heparinderivater fremstilt ifølge oppfinnelsen har kjemisk-fysikalske egenskaper som skiller seg både fra egenskapene til til kommersielle hepariner og fra egenskapene til de heparinderivater som er beskrevet i US-patentskrift 5.010.063. I tillegg oppviser disse heparinderivater som er fremstilt ifølge oppfinnelsen, biologiske aktiviteter som er forskjellige fra aktivitetene til begge klasser av de ovenfor nevnte produkter. Spesielt har derivatene som er fremstilt ifølge oppfinnelsen ikke lenger de antikoagulerende aktiviteter som er typiske for heparinstrukturen, mens de allikevel beholder uendrete eller sågar forbedrete spesielle biologiske egenskaper, som f.eks. den antikalkulose aktivitet, som gjør dem egnet som medikamenter for helbredelse og prevensjon av nefrolitiaser (antikalkulos aktivitet betyr at middelet kan løse opp nyresteiner). R.G. Bowyer et al viser i "Clin. Chim. Acta" 95, 23, 1979 at heparin er en sterk inhibitor for dannelse av, og aggregering av krystaller av kalsiumoksalat, mens B. Baggio i "Int. Meeting on: Inhibitors of crystallization in renal lithiasis and their clinical appli-cation", Bologna, september 7-9, 1987, viser at heparin reduserer den urinære sekresjon av oksalatet. Heparin er derfor et potensi-elt medikament mot kalkulose, men kan, på grunn av den spesifikke antikoagulerende og antitrombotiske virkning, ikke med sikkerhet benyttes i nefrolitiaser generelt, og spesielt ikke i de som er kalsiumoksaliske. De produkter som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan i motsetning til dette benyttes ved behandling av nefrolitiaser som er kroniske sykdommer som krever langtids-behandlinger med meget spesifikke medikamenter uten bivirkninger, fordi de ikke lenger har de antikoagulerende egenskaper som er karakteristisk for heparin.

Heparinderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen har kjemisk-fysikalske egenskaper som skiller seg helt fra egenskapene til de produkter som beskrives av J.S. Mardiguian i EP publ. EP0133078 samt av S. Hirano et al i "Conn. Tissue Res." 3, 73-79, 1975. Således forblir den midlere molekylvekt stort sett uendret, noe som indikerer en mangel på depolymerisering. Videre uteblir både absorbsjonen ved 225-230 nm ved UV-spektro-skopi samt signaler svarende til resonansen til dobbeltbindingen i "^C-NMR-spekteret, og dette indikerer en manglende dobbelt-binding i 4- og 5-posisjon i uronsyren. Heparinderivatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen har heller ikke de samme kjemisk-fysikalske egenskaper som forbindelsene som tidligere er isolert av P. Sampson og K. Meyer, ifølge "Proe. Nat. Acad. Sei", USA, 68, 2329-31, 1971. Dette som følge av at<13>C-MMR-spekteret til forbindelsene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse viser uendret posisjon og intensitet når det gjelder signalet svarende til glukosaminets karbonatom i 6-posisjonen. Det oppnås dessuten et uendret intensitetsforhold mellom det 6-sulfaterte karbonatom og det 6-desulfaterte karbonatom. Dette forhold skulle egentlig endres i tilfelle dannelse av 3,6-anhydroglukosamin, på grunn av deltakelsen av det 6-sulfaterte karbonatom ved dannelsen av anhydroderivatet. Til slutt skiller produktene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse seg i kjemisk-fysikalske egenskaper fra de produkter som kreves i US-patentskrift 5.010.063, idet signaler ved ca. 53 og 54 ppm i<3>C-NMR-spekteret, eksempel-vis mangler.

De produkter med modifisert heparinstruktur som fremstilles ifølge oppfinnelsen, har kjemisk-fysikalske egenskaper som en spesifikk dreining og<13>C-NMR-signaler som skiller seg både fra tilsvarende egenskaper hos utgangsforbindelsene og fra tilsvarende egenskaper hos de produkter som beskrives i US-patentskrift 5.010.063. Spesielt karakteriseres de hepariner som fremstilles ifølge oppfinnelsen ved at de viser<13>C-NMR-signaler som er totalt forskjellige fra tilsvarende signaler hos kommersielle hepariner i sonen mellom 102 og 92 ppm, der toppene til de anomere karbonatomer opptrer. Dessuten er toppene ved 53 og 54 ppm, som er typiske for produktet beskrevet i ovennevnte US-patent, fraværende. Videre karakteriseres de produkter som fremstilles ifølge oppfinnelsen ved den lavere verdi av den spesi fikke dreining (20-30° mindre) sammenliknet med de kommersielle utgangshepariner. Reduksjonen av den spesifikke dreining er enda større, hvis man refererer til forbindelsene beskrevet i ovennevnte US-patent og som hadde verdier som var høyere enn verdiene hos de kommersielle utgangshepariner.

De kjemiske modifikasjoner av de kommersielle eller rensede hepariner eller hepariner med lav molekylvekt oppnås ved høye temperaturer og/eller ved opphold i lang tid i vandig medium i-nærvær av en base, fortrinnsvis av et alkali- eller jordalkalimetallhydroksid, eventuelt i nærvær av et salt av et alkali- eller jordalkalimetall eller av et reduksjonsmiddel og fortrinnsvis natriumborhydrid.

Basene og saltene av alkali- eller jordalkalimetallene som fortrinnsvis benyttes, er baser eller salter av natrium, kalium, kalsium, magnesium og barium.

Hydroksidene av natrium, kalium og barium er foretrukket som baser.

Acetater og klorider av natrium, kalium, barium, kalsium og magnesium, samt sulfater av natrium, kalium og magnesium kan med fordel benyttes som salter.

Kommersielle eller rensede hepariner eller hepariner med lav molekylvekt oppløses i en vandig oppløsning fra 0,01 N til 1 N av en base av et alkali- eller jordalkalimetall, fortrinnsvis natriumhydroksid, eventuelt i nærvær av et salt av et alkali-eller jordalkalimetall, ved en konsentrasjon lik eller under IN, og av en katalytisk mengde av et reduserende middel og fortrinnsvis natriumborhydrid. Oppløsningen termostatreguleres til en temperatur mellom 75°C og koketemperaturen for reaksjonsblandingen i et tidsrom mellom 0,5 og 24 timer. Ved slutten av reaksjonen blir oppløsningen avkjølt til romtemperatur, brakt til nøytral pH-verdi og eventuelt underkastet en rensebehandling, f.eks. ved å føres gjennom ionebyttekolonner eller ved hjelp av dialyse, og til slutt oppnås det modifiserte heparinprodukt ved utfelling ved tilsetning av fra 2 til 4 volumer, fortrinnsvis 2,5 volumer av en alkohol inneholdende fra 1 til 3 karbonatomer, f.eks. av etylalkohol, eller ved frysetørking.

De modifiserte hepariner som oppnås ifølge den analogifremgangsmåte som er beskrevet i foreliggende søknad viser visse spesielle kjemisk-fysikalske karakteristika som gir resultater som er helt forskjellige fra resultatene som oppnås ved de alkaliske behandlingsmåter som er kjent i teknikken.

De strukturelle endringer av de heparinderivater som fremstilles iflge oppfinnelsen sammenliknet med utgangsheparinene fremgår spesielt ved posisjonen til og den relative intensitet av resonansene i "^C-NMR-spekteret, ved den elektroforetiske opp-førsel, ved at verdiene for den spesifikke dreining og reduseres, ved at innholdet av svovel og sulfat:karboksylforholdet reduseres, ved at innholdet av karboksyl opprettholdes uendret, og ved at det registreres nærvær av en viss' mengde frie aminogrupper.

De mere karakteristiske modifiseringer av strukturen i heparinderivatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen ble over-våket via studium av de store endringer som opptrådte i<13>C-NMR-spekteret. Disse variasjoner refererer til enkelte fikserte soner i spekteret, og involverer både opptreden av nye topper og modifisering eller fravær av andre topper. Særlig viktige er skiftene i signalene tilsvarende karbonatom nr 1 i iduron- og glukosaminenheter i sonen mellom 92 og 102 ppm, begge i forhold til de kommersielle hepariner og de produkter som er beskrevet i US-patent 5.010.063. Også bortfallet av de to signaler ved 53 og 54 ppm, som er karakteristiske for heparinderivatene som er beskrevet i det ovenfor nevnte US-patent, er av spesiell viktighet.

Spesielt viktig er en ny topp ved ca. 101,3 ppm i heparinderivatene som er fremstilt ifølge oppfinnelsen, og som ikke forekommer i de kommesielle heparinene. Den sammenliknende under-søkelse av<13>C-NMR-spektra for de nye produkter og tilsvarende spektra hos utgangsforbindelsene, gjør det mulig å fastslå at enkelte soner i spekteret er uendret og at den avgjørende del av heparinstrukturen derfor ikke i det hele tatt er påvirket. Spesielt ble de signaler som er relatert til 6-stillingen i de sulfaterte eller desulfaterte glukosaminenheter, ikke modifisert. I forbindelse med 2-stillingen i de sulfaterte glukosamin- enhetene enheter, i forbindelse med karboksyl i iduronsyren og i forbindelse med enhetene av glukuronsyren, som i heparinet utgjør et middel på 20% av uronrestene, er dessuten toppene modifisert.

Videre er de nye modifiserte hepariner som er fremstilt ifølge oppfinnelsenkarakterisert vedat de har en oppførsel ved elektroforese i 0,1 M bariumacetatbuffer ved pH 5,8, som skiller seg fra oppførselen hos utgangsproduktet, dvs. at de har en mobilitet som er større enn mobiliteten til de kommersielle hepariner og mindre enn for de hepariner som er modifisert som beskrevet i US-patentet.

De heparinderivater som fremstilles ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved et svovelinnhold som ligger mellom 6% og 9%,

et sulfat:karboksylforhold mellom 1,20 og 1,70, en spesifikk dreining ved 546 nm på mellom +10 og +40° i vandig oppløsning en spesifikk dreining ved 589 nm på mellom +20° og +30° i vandig oppløsning, og en mengdeandel av frie aminogrupper på mellom 0,4% og 2,1%.

Når produktene som fremstilles ifølge oppfinnelsen oppnås

fra kommersielle hepariner er det nødvendig å sammenlikne de kjemikalsk-fysikalske egenskaper både med utgangsheparinet og det modifiserte heparin som er beskrevet i US-patentskrift 5.010.063

og som utgjør et mellomprodukt. Når det gjelder "^C-NMR er det nødvendig å ta med i betraktning de totale endringer som skjer i hele spekteret, og spesielt i intervallet for de anomere karbonatomer mellom 102 og 92 ppm, slik disse vil fremtre for en fag-mann under granskning av resonansverdiene som er angitt i søk-nadens eksempler. For enkelhets skyld kan endringene i spesifikk dreining ved 54 6 nm og ved 589 nm brukes som et hjelpemiddel for å følge reaksjonsforløpet.

Verdiene for den spesifikke dreining på forskjellige tids-punkter avslører karakteristiske endringer som er avhengig av de anvendte reaksjonsbetingelser. Generelt øker a -verdiene til å begynne med, og reduseres deretter, slik det klart fremgår av tabell 1 der verdiene for den spesifikke dreining ved 589 nm og 546 nm er angitt. Disse verdier er målt på forskjellige tids-punkter for en 4%-ig oppløsning av et kommersielt heparin i 1 N natriumhydroksid i en termostat ved en temperatur på 80°C. Måling-a av verdiene for dreiningen gjør det mulig å differensiere den kjemiske modifisering ifølge foreliggende søknad sammenliknet med modifiseringen som framgår av US-patentskrift 5.010.063, slik dette tydelig fremgår av tabellene 2 og 3.

De rapporterte verdier viser at modifiseringen som skjer med forbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, ikke skjer i nevneverdig grad ved lavere temperaturer såsom ved 60°C, og heller ikke over lengre tidsrom. I motsetning til dette kan den modifiseringen som angis ifølge det ovenfor angitte US-patent, ikke registreres i nevneverdig grad ved høyere temperaturer, såsom ved 95°C.

Både det progressive bortfall av toppene ved 53 ppm og 54

13

ppm i C-NMR-spekteret og reduksjonen av den spesifikke dreining kan tas med i betraktning, når heparinderivatene som er fremstilt ifølge oppfinnelsen oppnås ut fra produktene som er beskrevet i det ovennevnte US-patentet, enten etter at derivatene er isolert eller via en egnet kjemisk behandling av den mellomliggende reaksjonsblanding. I det første tilfellet tar en utgangspunkt i forholdet mellom summen av integralene av toppene ved 53 ppm og 54 ppm og summen av integralene av toppene av karbonatomet i 6-stillingen i glukosaminet ved 62,5 pmm og 69 ppm. Toppene ved 62,5 ppm bg 69 ppm velges som en vilkårlig referanse, fordi deres intensitet forblir konstant, og fordi de ligger i en sone i spekteret som er fritt for andre topper.

Verdien av forholdet reduseres under reaksjonen, inntil den blir 0 ved slutten av reaksjonen. Alternativt kan man ta utgangspunkt i verdien av den spesifikke dreining som gradvis reduseres til en konstant verdi, fordi en reduksjon av dreiningen ved 589 nm skjer parallelt med reduksjonen av resonans ved 53 ppm og 54pm.

De heparinderivater som fremstilles ifølge oppfinnelsen har en bemerkelsesverdig anti-kalkuløs aktivitet sammen med en sterk reduksjon av de biologiske aktiviteter som er karakteristiske for utgangsheparinene. Den anti-kalkulose aktivitet måles ved hjelp av to spesifikke biologiske prøver: bestemmelsen av den membran-gjennomgående strøm av oksalatet som gjennomføres i henhold til den metode som er beskrevet av B. Baggio et al, i "Lancet", 1984, (II), 12-14, og studiet av fosforyleringen av proteinene i mem-branet i henhold til beskrivelsen til B. Baggio et al, i "IRCS Med. Sei", 14, 368, 1986. Resultatene uttrykkes som den prosentvise inhiberingsvirkning som produktene fremstilt ifølge oppfinnelsen sammenliknet ned kontrollprøvene, har på:

- oksalatets membrangjennomstrømning,

- fosforyleringen av proteinene i membranen, og

- erytrocytter fra kalkuløse idiopatiske pasienter.

Oksalat i erytrocytt-strømmen ble bestemt etter 12 timers nattlig faste som følger: 10 ml veneblod tilsatt heparin, i prøverør, ble vasket 3 ganger i en oppløsning inneholdende 150 mM NaCl, 10 mM KC1 og 20 mM TRIS HCl (pH 7,4). Prøvene ble suspendert til en 50% hematokrit-løsning i den samme oppløsning tilsatt 10 mM natriumoksalat. Denne cellesuspensjon ble så inkubert ved romtemperatur i 2 timer. De etterfølgende trinn ble utført ved 40°C. Etter sentrifugering ble erytrocyttene, suspendert til en 20% hematokrit-løsning i den tidligere beskrevne oppløsning,

14

oppdelt i en rekke porsjoner som ble tilsatt noe C-oksalat (8000-10000 tellinger pr. minutt (cpm)). Etter 10, 20, 30, 60, 90 og 120 minutter og 24 timer ble den aktuelle porsjon sentrifugert

14

og C-aktiviteten bestemt i supernatanten med en

ø-teller. Strømningskonstanten for utbyttingen av oksalat ble bedømt utifrå fra hellingen til den lineære funksjon

der t er lik tiden, K er lik strømningskonstanten og A er lik mengden oksalat på tidspunktene 0, t og ved isotop-likevekten (oo) .

Cellevegger fra erytrocytter ("Ghosts") fra pasienter som lider av kalsemi-idiopatisk nefrolitiase med abnorm transmem-branstrøm for oksalat ble benyttet for studium av fosforyleringen av membranproteinene. Den endogene fosforylering av disse "ghosts" ble oppnådd ved 37°C med varierende tider for inkubering i et medium inneholdende 100 mM TRIS HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl-, 2

32

mM ( P)AT? (adenosintrifosfat) og ca. 50 ug membranproteiner i et sluttvolum på 125 ul. Inkuberingen ble avbrudt ved tilsetning av 2% natriumdodecylsulfat og 1% merkaptoetanol, fulgt av koking ved 100°C i 5 minutter.

Deretter ble 20 ul av en mettet oppløsning av sakkarose og 12 ul av 0,05% pyronin som sporstoff, tilsatt. Alikvoter på ca. 20 ug av de således behandlete proteiner ble underkastet elektroforese på SDS-polyakrylamidgel. Gelene ble så farget ved hjelp av Coomassie-blått, tørket og så underkastet autoradiografi i ca. 20 timer. Autoradiogrammene ble så avlest ved hjelp av et densito-meter for kvantifisering av innarbeidingen av<32>Pi protem-båndene.

De andre biologiske aktiviteter ble bestemt ved mange prøver som er typiske for hepariner. Således utførte man prøver relatert til anti-Xa-faktoren, APTT, blødetiden og beskyttelsen mot eksperimentell trombose. APTT-aktiviteten ble bestemt i henhold til metoden ifølge M.J. Larrieu og G. Weiland, "Rev. Hematol", 12, 199, 1957, mens anti-Xa-aktiviteten ble bestemt i henhold til metoden til E.T. Yin og S. Wessler, ''Biochem. Biophys. Acta", 201, 387, 1970.

Hvert produkt som skulle undersøkes ble oppløst i plasma fra fastende rotter. Deretter ble skalar-fortynninger (dvs. i tier-potenser) gjennomført for å oppnå de ønskede konsentrasjoner ved metoden. Ti bestemmelser for hvert produkt ble gjennomført for begge aktiviteter. Mengden, uttrykt som ug pr. ml, som viser en meget stor variasjon i den respektive prøve, ble evaluert for hvert produkt. Spesielt ble aktiviteten for hvert produkt uttrykt i form av den konsentrasjon i ug pr. ml, som henholdsvis for-dobler APTT-ticen og øker anti-Xa-verdien med 30%. Verdiene som oppnås ved de to prøver bekrefter at de nye produkter som fremstilles ifølge oppfinnelsen viser en reduksjon av den antikoagulerende evne.

Blødetid-testen ble gjennomført på rotter i henhold til den metode som er beskrevet av E. Dejana et al, "Thromb. Haemost.", 48, 108, 1982, og resultatene er uttrykt ved å beregne prosent-andelene av forlenget tid for blødning hos rotter behandlet med hepariner fremstilt ifølge oppfinnelsen, i forhold til forlenget blødningstid for kontrollrotter, og sammenlikning av disse med forlenget blødningstid for de tilsvarende utgangshepariner administrert i samme dose (1-mg pr. kg intravenøst).

Den antitrombotiske aktivitet ble bedømt ved hjelp av prøven på stasivenøs trombose, beskrevet av S. Reyers et al., "Thromb. Res." 18, 669-674, 1980. Beskyttelsen som gis av produktene frem stilt ifølge oppfinnelsen er bedømt prosentuelt ved å angi den antitrombotiske beskyttelse som gis av utgangsforbindelsene med 100%.

De oppnådde resultater viste en forbedring eller i det vesentlige en ekvivalens for de to typer hepariner når det hen-vises til prøver på den antikalkuløse aktivitet. I motsetning til dette er den antikoagulerende virkning, vist ved de spesifikke prøver for kommersielle hepariner, praktisk talt fraværende i de nye hepariner.

Verdiene for de ovenfor angitte biologiske prøver angis i den eksperimentelle del sammen med de kjemisk-fysikalske karakteristika.

Heparinderivater som er fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan

anvendes ved behandling av renale patologier og spesielt i nefrolitiaser. De foretrukne administrasjonsmåter er de som er typiske for hepariner, dvs. parenteral og subkutan administrasjon, i form av vandige, sterile oppløsninger som eventuelt også inneholder

noen salter for å gjøre oppløsningene isotoniske, og videre enkelte konserveringsmidler.

Heparinderivatene som er fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også administreres på annen måte, fortrinnsvis i gastrointesti-nale, farmasøytiske preparater.

Hvert kommersielt heparin eller heariner som er renset ved behandling av kommersielt natriumheparin, eller hepariner med lav molekylvekt som oppnås ved depolymerisering ifølge i og for seg kjente metoder, ble benyttet for å oppnå de modifiserte hepariner som fremstilles ifølge opfinnelsen. Fremgangsmåtene for rensing og depolymerisering av de benyttede heariner er angitt foran de eksempler som ytterligere illustrerer opfinnelsen. Bestemmelsene av sulfat:karboksylforholdet ble utført på potensiometrisk måte. Den prosentuale bestemmelse av svovelet ble utført både ved den

13 potensiometriske metode og Schoeniger-metoden. C-NMR-spektra ble målt ved 75,47 MHz med et Varian CFT-75-spektrometer ved bruk av D^O som oppløsningsmiddel og natrium- 3-trimetylsilyl-propansulfonat som indre referansestandard.

Natriumheparin ALFA 87- 81

50 g kommersielt natriumheparin oppløses i 4000 ml vann og helles i løpet av ca. 30 minutter i en oppløsning inneholdende 222,4 g kalsiumacetatmonohydrat i 4000 ml vann, 114 ml eddiksyre og 1200 ml etylalkohol mens man hele tiden holder temperaturen ved 8-10°C. Den oppnådde suspensjon filtreres etter 15 timer ved 5°C og filtratet tilsettes 2000 ml etylalkohol og etter 3 timer ved 5°C blir det oppnådde bunnfall filtrert. Dette oppløses så i 400 ml vann, oppløsningen bringes til pH 7 ved hjelp av 1 N natriumhydroksid og den behandles deretter med 200 ml av natriumformen av Dowex 50V7 X8-harpiks og med 140 ml vann i 20 minutter. Oppløsning og harpiks overføres til en kromatografikolonne med diameter 4 cm og høyde 13 cm, inneholdende 160 ml av den samme harpiks. Etter oerkolering av oppløsningen og eluering med destillert vann til et totalt oppløsningsvolum på 800 ml ble det til oppløsningen satt 24 g natriumacetattrihydrat og 2000 ml etylalkohol. Bunnfalet filtreres og tørkes under vakuum og man oppnår 36,5 g renset natriumheparin av typen ALFA 87-81 og med følgende kjemisk-fysiske karakteristika:<13>C-NMR-spektrum (p.p.m.): 177,3; 104,7; 102,0; 99,5; 80,1; 78,6; 72,4; 72,0; 69,1; 60,7.

S = 10,6%.

Sulfat:karboksylforhold = 2,20.

|P6= +54°(C = 1% iH20)

[«]|g9= +47° (C = 1% i H20)

fri NH2=0,0%

APTT = 1,7 ug/ml

Anti Xa =20,6 ug/ml

Forlengelse av blødningstiden: > 200% (lmg/kg, i.v.)

Inhibering av oksalatets transmembranstrømning = 73,5%

(C = 100 ug/ml)

Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 24%

(C = 10 ug/ml)

Kommersielt natriumheparin ALFA 88- 247

<13>C-NMR-spektrum (p.p.m.): 177,3; 177,1; 104,7; 102,0; 99,6; 79,2; 78,9; 78,7; 72,5; 71,9; 69,2; 62,8; 61,0; 60,7; 60,3.

S = 10,9%.

Sulfat:karboksylforhold = 2,1.

f ° ^546 = +54° (C = 1% i H-0)

[°J589 = +47°(C = 1% i H20)

fri NH2= 0,27%

APTT = 0,7 ug/ml

Anti Xa =30,3 ug/ml

Forlengelse av blødningstiden: > 200% (lrtig/kg, i.v.)

Inhibering av transmembranstrømmen til oksalatet = 69,2%

(C = 100 ug/ml)

Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 26%

(C = 10 ug/ml)

Kommersielt natriumheparin ALFA 87- 120

<13>C-NMR-spektrum (p.p.m.): 177,3; 104,7; 102,1; 99,5; 78,7; 72,5; 72,0; 69,2; 62,7; 60,8.

S = 11,4%.

Sulfat-.karboksylforhold = 2,3.

[a] 54% = +57° (C = 1% i H20)

[a] sl? = +55° (C = 1% iH20)

fri NH2= 0,4%

APTT= 1,4 ug/ml

Anti Xa =26,4 ug/ml

Forlengelse av blødningstiden: > 200% (lmg/kg, i.v.)

Inhibering av transmembranstrømmen til oksalatet = 61,0%

(C = 100 ug/ml)

Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 23%

(C = 10 ug/ml)

Kommersielt natriumheparin ALFA 87- 163

<13>C-NMR-spektrum (p.p.m.): 177,6; 104,8; 102,0; 99,5; 78,6; 72,4; 72,0; 69,2; 62,7; 60,8.

S = 11,0%.

Sulfat:karboksylforhold =2,0.

<[aJ>546<=><+>60° (C = 1%i H-O)

<[a]>589=+51c (C=1% i H20)

fri NH2=0,6%

APTT = 2,1 ug/ml

Anti Xa =23,4 ug/ml

Forlengelse av blødningstiden: > 200% (lmg/kg, i.v.)

Inhibering av transmembranstrømmen til oksalatet = 79,2%

(C = 100 ug/ml)

Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 20%

(C = 10 ug/ml)

Natriumheparin LMW ALFA 87- 198 med lav molekylvekt

Natriumformen av heparin LMW ALFA 87-198 med lav molekylvekt ble fremstilt ved depolymerisering med hydrogenperoksid i nærvær av kobber-II-ioner i henhold til den metode som er beskrevet i den internasjonale publikasjon WO86/06729. Dette viser de følgende kjemisk-fysiske karakteristika:<13>C-NMR-spektrum (p.p.m.): 177,73; 104,87; 102,0; 99,6; 80,2; 78,6; 72,4; 71,9; 69,2; 62,7; 60,6.

Molekylvekt = 4400 Dalton

S = 11,60%

Sulfatrkarboksylforhold = 2,31.

20

[°1546= +47° (C = 1% i H20)

<[a]>528°9<=>+43° (C = 1% i H20)

fri NH2=0,0%

APTT = 8,5 ug/ml

Anti Xa =40,6 ug/ml

EKSEMPEL 1

1,8 g ALFA 87-81-heparin tilsettes til 45 ml av en vandig oppløsning inneholdende 0,4 g natriumhydroksid (0,225 N), 2,3 g natriumacetat (0,625 N) og 10 mg av natriumborhydrid.

Den oppnådde oppløsning termostatreguleres i et tidsrom på 3,5 timer til 95°C og avkjøles så til romtemperatur, bringes til nøytral tilstand med iseddik og tilsettes så 2,5 volumer etanol. Bunnfallet samles på er filter, vaskes med en 2 vekt% oppløsning av natriumacetat i etanol:vann 6:1, deretter med etanol:vann 6:1 og tørkes. 1,77 g produkt oppnås og C-NMR-spekteret viste karakteristiske signaler ved de følgende 6-verdier, (uttrykt som p.p.m.): 177,7; 104,6; 101,3; 101,3; 100,3; 98,2; 80,7; 78,9;

74,5: 73,7; 72,8; 71,4; 68,9; 62,7; 61,4; 60,7.

, S = 7,35%

Sulfat:karboksylforhold = 1,50.

[ct] 546 = +26° (C = 1% i H20)

[ a] 5%°9 = +24° (C = 1% i H20)

fri NH2= 1,22%

APTT = 124,0 ug/ml

Anti Xa = 41,2 ug/ml

Forlengelse av blødningstiden: 19% (lmg/kg, i.v.)

Beskyttelse mot trombose i forhold til utgangsproduktet = 10%

(1 mg/kg, i.v.)

Inhibering av transmembranstrømmen til oksalatet = 61,0%

(C = 100 ug/ml)

Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 20%

(C = 10 ug/ml)

EKSEMPEL 2

30 g ALFA 88-247-heparin tilsettes til en vandig oppløsning inneholdende natriumhydroksid (6,75 g; 0,225 N) og natriumborhydrid (200 mg). Denne oppløsning termostatreguleres til 90°C i 4 timer, bringes til nøytral tilstand med eddiksyre og dialyseres i en natt med ledningsvann og 6 timer med destillert vann. Dialysatet frysetørkes og man oppnår 2 6,4 g av produktet hvis C-NMR-spektrum viser karakteristiske signaler ved følgende 6 -verdier, (uttrykt som p.p.m.): 177,8; 104,7;■101,9; 101,4; 98,4; 80,6; 79,8; 79,3; 79,0; 74,0; 73,5; 72,8; 71,3; 69,0; 62,7; 61,3; 61,1; 60 , 8 .

S = 7,7%

Sulfat:karboksylforhold = 1,30

M 546 = +33° (C = 1% i H,0)

<[a]>5<g>^=+28° (C = 1% i H20>

fri NH2= 1,20%

APTT= 16,7 ug/ml

Anti Xa =44,7 (ag/ml

Forlengelse av blødningstiden: 46% (lmg/kg,.i.v.)

Beskyttelse mot trombose i forhold til utgangsproduktet = 70%

(1 mg/kg, i.v.)

Inhibering av transmembranstrømmen til oksalatet = 74,4%

(C = 100 ug/ml)

Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 28%

(C = 10 ug/ml)

EKSEMPEL 3

30 g ALFA 87-120-heparin ble tilsatt til 750 ml av en vandig oppløsning inneholdende natriumhydroksid (6,75 g; 0,225 N). Denne oppløsning termostatreguleres til 90°C i 4 timer, bringes til nøytral tilstand med eddiksyre og dialyseres i 24 timer med ledningsvann og 6 timer med destillert vann. Dialysatet frysetørkes og man oppnår 2 6,2 g av produktet hvis ^<3>C-NMR-spektrum viser karakteristiske signaler ved følgende6-verdier, (uttrykt som p.p.m.): 177,7; 104,7; 101,9; 101,4; 80,6; 79,8; 79,0; 74,8; 73,4; 72,8; 71,8; 71,3; 69,0; 62,7; 61,3; 61,0.

S = 7,7%

Sulfat:karboksylforhold = 1,38

[<a>] 546<=><+>32° (C = 1% i H_0)

20

[<a>] 589=+3 0° (C = 1% i H20)

fri NH2= 1,3 0%

APTT = 18,9 ug/ml

Anti Xa =44,8 ug/ml

Forlengelse av blødningstiden: 57% (lmg/kg, i.v.)

Beskyttelse mot trombose i forhold til utgangsproduktet = 37,5%

(1 mg/kg, i.v.)

Inhibering av transmembranstrømmen til oksalatet = 65,2%

(C = 100 ug/ml)

Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 21%

(C = 10 ug/ml)

EKSEMPEL 4

10 g ALFA 87-163-heparin tilsettes til 250 ml av en vandig oppløsning inneholdende natriumhydroksid (2,25 g; 0,225 N), natriumacetat (12,81 g; 0,625 N) og natriumborhydrid (50 mg). Denne oppløsning termostatreguleres til 90°C i 4 timer, nedkjøles deretter til romtemperatur, bringes til nøytral tilstand med ev vandig løsning av eddiksyre og dialyseres i 24 timer med ledningsvann og 6 timer med destillert vann. Dialysatet frysetørkes og man oppnår 7,8 g av produktet hvis<13>C-NMR-spektrum viser karakteristiske signaler ved følgende6-verdier, (uttrykt som p.p.m.): 177,7; 104,6; 101,9; 101,4; 98,6; 98,4; 80,3; 79,8; 79,4; 79,0; 73,8; 72,9; 69,1; 62,6; 61,3; 60,6.

S = 7,8%

Sulfat:karboksylforhold = 1,38

[«]546= +37° (C = 1% i H20)

[<*] 5<2>8°9 = +3 0° (C = 1% i H20) ;fri NH2= 2,01% ;APTT= 60,1 ug/ml ;Anti Xa =82,0 ug/ml ;Forlengelse av blødningstiden: 18% (lmg/kg, i.v.) ;Beskyttelse mot trombose i forhold til utgangsproduktet = 12,5% ;(1 mg/kg, i.v.) ;Inhibering av transmembranstrømmen til oksalatet = 62,6% ;(C = 100 ug/ml) ;Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 19% ;(C = 10 ug/ml) ;EKSEMPEL 5 ;450 ml av en vandig oppløsning inneholdende 4 g natriumhydroksid (0,225 N), 23 g natriumacetat (0,625 N), 100 mg natriumborhydrid og 18 g ALFA 87-163-heparin termostatreguleres ;til 60°C i 3,5 timer. Halve volumet av oppløsningen taes ut, avkjøles til romtemperatur, bringes til nøytral tilstand med iseddik og helles i 2,5 volumer etanol. Bunnfallet samles på filteret, vaskes med etanol:vann 6:1 og tørkes. Man oppnår 8 g produkt tilsvarende heparinderivatene som er beskrevet i US-pa-1-3 ;tent 5.010.063. C-NMR-spekteret for dette produkt viser karakteristiske signaler ved de følgende6-verdier, (uttrykt som p.p.m.): 177,3; 104,3; 101,9; 99,5; 98,4; 97,2; 96,8; 79,8; 79,2; 78,6; 72,2; 71,9; 71,3; 68,9; 62,6; 60,6; 60,3; 5-4,2; 53,2. ;Produktet viser følgende kjemisk-fysikalske karakteristika: S = 8,25% ;Sulfat:karboksylforhold = 1,68 ;[°] 546 = +68° (c = 1%1H?°) ;on ;[<*]589 = +56°(C = 1% iH20)

fri NH2=0,6 7%

Produktet oppløses i 150 ml destillert vann og oppløsningen termostatreguleres til 75°C i 24 timer. Etter avkjøling til romtemperatur bringes oppløsningen til nøytral tilstand, det tilsettes 3 g natriumacetat og det helles i 2,5 volumer etanol. Det oppnådde bunnfall vaskes med etanol:vann 6:1 og tørkes.

Man oppnår 6,8 g produkt hvis C-NMR-spektrum viser karakteristiske signaler ved de følgende $ -verdier, (uttrykt som p.p.m.): 177,2; 104,8; 101,9; 101,3; 80,8; 80,5; 79,5; 78,9; 74,6; 73,8; 73,0; 71,8; 71,6; 69,0; 63,2; 61,4; 60,8.

S = 6,30%

Sulfat:karboksylforhold = 1,33

20

fa] 546 = +26° (C = 1% i H?0)

20

[a] 589= +21° <c = !-i E20)

fri NH9= 1,5%

APTT = 111,9 ug/ml

Anti Xa = 55,5 ug/ml

Forlengelse av blødningstiden: 16% (lmg/kg, i.v.)

Beskyttelse mot trombose i forhold til utgangsproduktet = 12,5%

(1 mg/kg, i.v.)

Inhibering av transmembranstrømmen til oksalatet = 68,1%

(C = 100 ug/ml)

Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 32%

(C = 10 ug/ral)

EKSEMPEL 6

Det andre halv-volum av oppløsningen fra eksempel 5 nøytra-liseres med iseddik og termostatreguleres ved 75°C i 24 timer. Etter avkjøling til romtemperatur blir oppløsningen langsomt helt i 2,5 volumer etanol. Bunnfallet samles på filteret, vaskes med 6:1 etanol:vann og tørkes. 7,2 g produkt oppnås og "^C-NMR-spekteret viser karakteristiske signaler ved følgende 5 -verdier, (uttrykt som p.p.m.): 177,3; 104,8; 101,8; 101,3; 80,8; 80,5; 79,5; 74,6; 73,8; 73,0; 71,8; 71,6; 68,9; 63,1; 61,4; 60,8.

S = 6,32%

Sulfat:karboksylforhold = 1,36

546<=><+>24° (C = 1%i H-0)

[a] 589 = +20° (C = 1% i H90)

fri NH9= 1,49%

APTT = 101,3 ug/ml

Anti Xa = 53,9 (ag/ml

Forlengelse av blødningstiden: 18% (lmg/kg, i.v.)

Beskyttelse mot trombose i forhold til utgangsproduktet = 20%

(1 mg/kg, i.v.)

Inhibering av transmembranstrømmen til oksalatet = 78,3%

(C = 100 ug/ml)

Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 26%

(C = 10 ug/ml)

EKSEMPEL 7

12 g heparin LMW ALFA 87-198 med lav molekylvekt tilsettes til 300 ml av en vandig oppløsning av natriumhydroksid (12 g, 1,0 N), natriumacetat (15 g, 0,625 N) og natriumborhydrid (60 mg). Oppløsningen termostatreguleres til 60°C i 4 timer, avkjøles til romtemperatur, bringes til nøytral tilstand, dialyseres i 24 timer med rennende vann og i 6 timer med destillert vann. Oppløs-ningen frysetørkes deretter for å oppnå 10 g produkt tilsvarende de heparinderivater som oppnås i US-patentsøknad 5.010.063 hvis C-NMR-spektrum viser karakteristiske topper ved følgende

6-verdier, (uttrykt som p.p.m.): 177,3; 104,8; 101,9; 100,3; 80,5; 80,1; 79,4; 72,7; 71,9; 69,0; 62,7; 60,6; 54,3; 53,2.

S = 8,25%

Sulfat:karboksylforhold = 1,53

[a] 546=+63 (C = 1% i H20)

[a] 589=<+>55 (C = 1% i H20)

fri NH2= 0,3%

5 g av dette heparinderivat oppløses i 100 ml destillert vann og oppløsningen termostatreguleres i 24 timer til 75°C, avkjøles til romtemperatur, bringes til nøytral tilstand og frysetørkes for derved å oppnå 30,2 g produkt hvis "^C-NMR-spektrum viser karakteristiske topper ved de følgende6-verdier, (uttrykt som p.p.m.): 177,6; 104,6; 101,8; 101,3; 80,7; 78,9; 74,4; 73,6; 72,7; 71,3; 69,1; 62,7; 61,3; 60,8.

S = 6,80%

Sulfat:karboksylforhold = 1,52

[a]5<2>4°6 = +19° (C = 1% i H20)

^ 5<2>8°9<=>+16° (C = 1% i H20)

fri NH2=0,4%

Forlengelse av blødningstiden: 19% (lmg/kg, i.v.)

APTT = 71,2 ug/ml

Anti Xa = 71,2 ug/ml

Beskyttelse mot trombose i forhold til utgangsproduktet = 20%

(1 mg/kg, i.v.)

Inhibering av transmembranstrømmen til oksalatet = 68,9%

(C = 100 ug/ml)

Inhibering av fosforyleringen av membranproteinene = 20%

(C = 10 ug/ml)

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive 13 heparinderivater som har et C-NMR-spektrum som skiller seg fra tilsvarende spektrum til de kommersielle hepariner, spesielt i sonen mellom 102 ppm og 92 ppm, ved nærvær av et karakteristisk signal ved 101,3 ppm, en spesifikk dreining ved 546 nm mellom +15° og +40° i vandig oppløsning, et svovelinnhold mellom 6% og 9%, et sulfat:karboksylforhold mellom 1,20 og 1,70 og et innhold av frie aminogrupper mellom 0,4% og 2,1%,karakterisert vedat den omfatter å behandle en vandig opp-løsning inneholdende et kommersielt eller et renset heparin eller et heparin med lav molekylvekt med en base av et alkali- eller jordalkalimetall i en konsentrasjon av 0,01 N til 1 N, eventuelt i nærvær av et salt av et alkali- eller jordalkalimetall i en konsentrasjon av ca. 1 N og av en katalytisk mengde av et reduserende middel, i et tidsrom mellom 0,5 og 24 timer ved en temperatur mellom 75°C og reaksjonsblandingens koketemperatur, eventuelt å underkaste reaksjonsblandingen perkolering gjennom en ionerbytterkolonne eller ved dialyse og isolering av produktene med den således modifiserte struktur enten ved utfelling ved tilsetning av fra 2 til 4 volumer av en alkohol med fra 1 til 3 karbonatomer ved omtrent nøytral pK-verdi, eller ved fryse-tørking .

2. Analogifremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat basen velges blant natrium-, kalium- og bariumhydroksider, at saltet velges blant acetater og klorider av natrium, kalium, barium, kalsium og magnesium og sulfater av natrium, kalium og magnesium, at man som reduksjonsmiddel anvender natriumborhydrid og at de ønskede produkter felles ut ved hjelp av 2,5 volumer etylalkohol.