CN116903688A - 一种具有urat1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用。所述制备方法的步骤包括:将黑莓叶洗净烘干,粉碎过筛,得黑莓叶粉;将黑莓叶粉进行超临界萃取,收集提取液;将提取液减压浓缩,得浓缩液;将浓缩液纯化洗脱,收集洗脱液;将洗脱液减压浓缩、干燥,得密蒙花苷。所述密蒙花苷得率0.84%,HPLC纯度高达99.9%,且制备方法安全环保、成本低廉。本发明还经实验验证,密蒙花苷具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性,为尿酸盐转运蛋白1抑制剂开发提供新资源,同时也为黑莓叶高值化利用提供新用途。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物开发领域,具体涉及一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用。
背景技术
尿酸盐转运蛋白1(URAT1),定位在肾脏近端小管的顶端膜,是控制肾脏尿酸盐重吸收过程的主要转运蛋白,也是用于治疗高尿酸血症的重要靶点之一。靶向URAT1治疗高尿酸血症的药物(如苯溴马隆),通过抑制URAT1对尿酸盐的转运能力,减少尿酸盐的重吸收,从而促进尿酸排泄。然而,苯溴马隆具有较强的肝毒性,且不适用于痛风发作期,进而限制了其应用。而其他作用于URAT1的药物也有不同程度的副作用和使用局限性,因此从天然化合物挖掘筛选URAT1抑制剂逐渐成为研究的热点。
密蒙花苷,分子量为594.52,是一种糖苷类黄酮,具有抗血栓、降血糖、抗炎、抗肿瘤等活性,但目前未见关于密蒙花苷对URAT1抑制活性或降尿酸活性的报道。研究报道的密蒙花苷主要来源有密蒙花、紫椴花、覆盆子等,但部分原料价格偏高,而黑莓叶中密蒙花苷含量较高,且黑莓叶作为黑莓种植产业的副产物,成本较低,因此可以作为制备密蒙花苷的原料。密蒙花苷生产工艺主要有机溶剂浸提、回流提取等方式,存在有机溶剂消耗量大、提取时间长、提取率较低等缺点。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用。本发明利用超临界二氧化碳萃取技术,结合C18反相硅胶柱纯化,从黑莓叶中高效提取纯化密蒙花苷,所得的密蒙花苷得率和纯度高,具有较强的尿酸盐转运蛋白1抑制活性。
为实现上述发明目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明提供了一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷的制备方法,包括以下步骤:
(1)黑莓叶洗净烘干,粉碎过筛,得黑莓叶粉;
(2)将步骤(1)的黑莓叶粉进行超临界萃取,收集提取液;
(3)将步骤(2)的提取液减压浓缩,得浓缩液;
(4)将步骤(3)的浓缩液纯化洗脱,收集洗脱液;
(5)将步骤(4)的洗脱液减压浓缩、干燥,得密蒙花苷。
进一步的,所述步骤(1)中的过筛的目数为40-100目。
进一步的,所述步骤(2)中的超临界萃取采用的是萃取釜,以CO2为萃取剂,40%-80%乙醇为夹带剂;所述超临界萃取的条件为:萃取温度为30℃-50℃,萃取压力为35Mpa-50Mpa,萃取时间为40min-60min,夹带剂流速为2L/h-3L/h,CO2流速为30L/h-50L/h,其中分离釜1的压力为15Mpa-20Mpa,分离釜2的压力为4Mpa-8Mpa。
进一步的,所述步骤(3)中的提取液和步骤(5)中的洗脱液均减压浓缩至原体积的1/10-1/20;所述减压浓缩条件为:温度为40℃-55℃,真空度为-0.055Mpa~-0.098Mpa。
进一步的,所述步骤(4)中的纯化采用的是硅胶柱纯化,具体为粒径10-40μm的C18反相硅胶柱。
进一步的,所述步骤(4)中的洗脱条件为:40%-45%甲醇溶液洗脱2-3BV,50%-60%甲醇溶液洗脱3BV,薄层色谱实时检测,收集50%-60%甲醇洗脱液中含有目标化合物的组分。
进一步的,所述步骤(5)中的干燥方式为真空干燥或冷冻干燥。
综上,一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷的制备方法,包括以下步骤:
(1)黑莓叶洗净烘干,粉碎,过40-100目筛,得黑莓叶粉;
(2)将黑莓叶粉加入萃取釜,以CO2为萃取剂,40%-80%乙醇为夹带剂进行超临界萃取,设置萃取温度30-50℃,压力35-50Mpa,时间40-60min,夹带剂流速为2-3L/h,CO2流速为30-50L/h,分离釜1压力为15-20Mpa,分离釜2压力为4-8Mpa,在分离釜2收集提取液;
(3)将步骤(2)的提取液在温度40-55℃,真空度-0.055~-0.098Mpa的条件下减压浓缩至原体积的1/10-1/20,得浓缩液;
(4)将步骤(3)的浓缩液用粒径10-40μm的C18反相硅胶柱纯化,上样后用40%-45%甲醇溶液洗脱2-3BV,50-60%甲醇溶液洗脱3BV,薄层色谱实时检测,收集50%-60%甲醇洗脱液中含有目标化合物的组分;
(5)将步骤(4)的洗脱液在温度40-55℃,真空度-0.055~-0.098Mpa的条件下减压浓缩至原体积的1/10-1/20,真空干燥或冷冻干燥得密蒙花苷。
本发明还提供了一种密蒙花苷,其是由所述的制备方法制备得到的,其中纯度大于98%。
本发明还提供了所述的密蒙花苷在制备具有降尿酸作用的特殊医学用途配方食品、保健品或药品中的应用。
本发明还提供了所述的密蒙花苷在制备URAT1抑制剂中的应用。
进一步的,所述密蒙花苷抑制URAT1的IC50为7.77μmol/L。
与现有技术相比,本发明的优点和有益效果是:
1、本发明提供了一种从黑莓叶中提取制备密蒙花苷的制备方法,利用超临界二氧化碳萃取技术,结合C18反相硅胶柱纯化,高效制备高纯度具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的密蒙花苷,密蒙花苷得率0.84%,HPLC纯度高达99.9%,而且制备方法具有安全环保、成本低廉等优势。
2、本发明提供的黑莓叶来源的密蒙花苷首次验证具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性,抑制尿酸盐转运蛋白1的IC50为7.77μmol/L,与苯溴马隆活性相当,为尿酸盐转运蛋白1抑制剂开发提供新资源,同时也为黑莓叶高值化利用提供新用途。
3、黑莓叶来源密蒙花苷作为一种天然植物提取物,与已有药物相比具有对人体副作用小、绿色安全的优势,在制备具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的功能制品中具有明显的优势和广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2的密蒙花苷的HPLC色谱图,其中横坐标为时间,纵坐标为电信号强度。
图2为不同实施例的密蒙花苷对URAT1的抑制活性,其中横坐标为不同实施例制备的密蒙花苷,纵坐标为抑制率。
图3为苯溴马隆和实施例1的密蒙花苷对URAT1的抑制作用,其中横坐标为浓度,纵坐标为抑制率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但以下实施例不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明所作的任何变换或替换,均属于本发明的保护范围。如无特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
密蒙花苷纯度测定:采用HPLC检测并用峰面积归一法计算纯度,色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18色谱柱(5μm,4.6mm×250mm);以甲醇(A)和0.1%的甲酸(B)为流动相,比例为45%A和55%B;流速为1.0mL/min,柱温为25℃,检测波长为365nm,进样量为20μL,样品浓度为25μg/mL,检测时间为15min。
密蒙花苷得率计算:
式中,m1为所得密蒙花苷固体粉末的质量,P为密蒙花苷固体粉末的纯度,m2为黑莓叶粉的质量。
实施例1工艺条件对制备密蒙花苷的影响
黑莓叶洗净烘干,粉碎,过筛得40-100目黑莓叶粉。取1kg黑莓叶粉加入萃取釜,以CO2为萃取剂,60%乙醇为夹带剂进行超临界萃取,设置萃取温度40℃,压力40Mpa,时间50min,夹带剂流速为3L/h,CO2流速为35L/h,分离釜1压力为16Mpa,分离釜2压力为6Mpa,收集分离釜2中的提取液。在温度50℃,真空度-0.090Mpa的条件下减压浓缩至原体积的1/10,得浓缩液。将浓缩液用粒径20μm的C18反相硅胶柱纯化,上样后用45%甲醇溶液洗脱2BV,55%甲醇溶液洗脱3BV,薄层色谱实时检测,收集含有目标化合物的洗脱液,然后将所得洗脱液在温度50℃,真空度-0.090Mpa的条件下减压浓缩至原体积的1/10,真空干燥得密蒙花苷。
(1)提取温度对制备密蒙花苷的影响
在上述基本工艺的基础上,分别调节萃取釜的提取温度为20、30、40、50、60、70℃,其他工艺条件不变,研究不同提取温度对于制备密蒙花苷的影响。
表1不同提取温度对制备密蒙花苷的影响
温度/℃ | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
得率/% | 0.62 | 0.72 | 0.82 | 0.80 | 0.71 | 0.66 |
纯度/% | 98.2 | 98.5 | 99.8 | 99.6 | 99.6 | 98.9 |
结果如表1所示,当温度为40℃时,密蒙花苷的得率和纯度最高,不同提取温度对于密蒙花苷纯度影响不大。
(2)提取压力对制备密蒙花苷的影响
在上述基本工艺的基础上,分别设置提取压力为20、25、30、35、40、45、50Mpa,其他工艺条件不变,研究不同提取压力对于制备密蒙花苷的影响。
表2不同压力对制备密蒙花苷的影响
压力/MPa | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 |
得率/% | 0.60 | 0.69 | 0.74 | 0.83 | 0.82 | 0.83 | 0.83 |
纯度/% | 95.1 | 94.2 | 95.5 | 99.6 | 99.6 | 99.6 | 98.9 |
结果如表2所示,当提取压力为35MPa时,再增加压力,密蒙花苷的得率没有明显增加,且提取压力为35-45MPa时,密蒙花苷纯度均大于99.5%。
(3)提取时间对制备密蒙花苷的影响
在上述基本工艺的基础上,分别设置提取时间为10、20、30、40、50、60min,其他工艺条件不变,研究不同提取时间对制备密蒙花苷的影响。
表3提取时间对制备密蒙花苷的影响
萃取时间/min | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
得率/% | 0.60 | 0.72 | 0.75 | 0.84 | 0.83 | 0.81 |
纯度/% | 95.4 | 97.2 | 98.1 | 99.4 | 98.9 | 98.8 |
结果如表3所示,提取时间为40min时,密蒙花苷的纯度和得率都最高。
(4)夹带剂浓度对制备密蒙花苷的影响
在上述基本工艺的基础上,分别设置夹带剂浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇,其他工艺条件不变,研究不同夹带剂浓度对制备密蒙花苷的影响。
表4夹带剂浓度对制备密蒙花苷的影响
乙醇浓度/% | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 |
得率/% | 0.58 | 0.65 | 0.71 | 0.80 | 0.84 | 0.82 | 0.82 | 0.79 | 0.62 | 0.55 |
纯度/% | 96.5 | 97.1 | 98.5 | 98.8 | 99.4 | 99.3 | 99.0 | 98.9 | 98.6 | 96.8 |
结果如表4所示,夹带剂乙醇浓度为50%时,密蒙花苷的得率和纯度最高。
(5)洗脱液甲醇浓度对制备密蒙花苷的影响
在上述基本工艺的基础上,分别设置洗脱液甲醇浓度为40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%,其他工艺条件不变,研究不同浓度洗脱液浓度对制备密蒙花苷的影响。
表5不同甲醇洗脱液浓度对制备密蒙花苷的影响
甲醇浓度/% | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 | 65 | 70 | 75 |
得率/% | 0.32 | 0.54 | 0.61 | 0.84 | 0.83 | 0.84 | 0.82 | 0.79 |
纯度/% | 98.5 | 97.1 | 97.5 | 99.8 | 95.4 | 90.3 | 83.6 | 78.5 |
结果如表5所示,洗脱剂甲醇浓度为55%时,密蒙花苷的得率和纯度最高。
实施例2从黑莓叶中提取纯化密蒙花苷
黑莓叶洗净烘干,粉碎机粉碎后,过60目筛。取黑莓叶粉1kg加入萃取釜,夹带剂为50%乙醇,设置夹带剂流速为3L/h,CO2流速为40L/h,调节萃取釜的温度为40℃,压力35Mpa,萃取时间40min,设置分离釜1压力为18Mpa,分离釜2压力为6Mpa。收集分离釜2的提取液,减压浓缩至原体积的1/10后,将浓缩液用粒径10μm的C18反相硅胶柱,45%甲醇溶液洗脱2BV,然后用55%甲醇溶液洗脱,每15mL收集一份,薄层色谱检测并合并含有密蒙花苷单一点的组分,共洗脱3BV,将收集到的密蒙花苷溶液减压浓缩后,用冷冻干燥器干燥,获得密蒙花苷固体粉末,将粉末溶解后用HPLC检测,计算所得密蒙花苷纯度为99.9%(HPLC图谱见图1),得率为0.84%。
实施例3从黑莓叶中提取纯化密蒙花苷
黑莓叶洗净烘干,粉碎机粉碎后,过80目筛。取黑莓叶粉800g加入萃取釜,夹带剂为75%乙醇,设置夹带剂流速为2L/h,CO2流速为30L/h,调节萃取釜的温度为35℃,压力30Mpa,萃取时间45min,设置分离釜1压力为15Mpa,分离釜2压力为5Mpa。收集分离釜2的提取液,55℃下减压浓缩后,将浓缩液上样到粒径20μm的C18反相硅胶柱,45%甲醇溶液洗脱3BV,然后更换55%甲醇溶液洗脱,薄层色谱实时检测并收集含有密蒙花苷单一点的组分,共洗脱3BV,之后更换100%甲醇洗脱2BV,将收集到的密蒙花苷溶液50℃下减压浓缩后,用真空干燥器干燥,获得密蒙花苷固体粉末。将粉末溶解后用HPLC检测,计算所得密蒙花苷纯度为98.2%,得率为0.80%。
实施例4从黑莓叶中提取纯化密蒙花苷
取80目的黑莓叶粉1kg加入萃取釜,夹带剂为60%乙醇,设置夹带剂流速为3L/h,CO2流速为35L/h,调节萃取釜的温度为40℃,压力35Mpa,萃取时间40min,设置分离釜1压力为20Mpa,分离釜2压力为6Mpa。收集分离釜2的萃取液,50℃下减压浓缩后,将浓缩液上样到C18反相硅胶柱,45%甲醇溶液洗脱3BV,然后更换55%甲醇溶液洗脱,每20mL收集一管,薄层色谱检测并合并含有密蒙花苷单一点的组分,共洗脱3BV,之后更换100%甲醇洗脱2BV,将收集到的密蒙花苷溶液在50℃下减压浓缩,用真空干燥器干燥,获得密蒙花苷固体粉末。将密蒙花苷固体粉末溶解后用HPLC检测,计算所得密蒙花苷纯度为99.0%,得率为0.79%。
实施例5从黑莓叶中提取纯化密蒙花苷
黑莓叶洗净烘干,粉碎机粉碎后,过60目筛。取黑莓叶粉600g加入萃取釜,夹带剂为80%乙醇,设置夹带剂流速为1.5L/h,CO2流速为35L/h,调节萃取釜的温度为50℃,压力30Mpa,萃取时间45min,设置分离釜1压力为16Mpa,分离釜2压力为5Mpa。收集分离釜2的提取物,将获得的提取物在55℃下减压浓缩,将浓缩液用C18反相硅胶柱纯化,45%甲醇溶液洗脱3BV除杂,然后更换55%甲醇溶液洗脱,薄层色谱实时检测并收集含有密蒙花苷单一点的组分,共洗脱3BV,将收集到的密蒙花苷溶液减压浓缩后,用真空干燥器干燥,获得密蒙花苷固体。将粉末溶解后用HPLC检测,计算所得密蒙花苷纯度为99.5%,得率为0.76%。
实施例6从黑莓叶中提取纯化密蒙花苷
黑莓叶洗净烘干,粉碎机粉碎后,过60目筛。取黑莓叶粉600g加入萃取釜,夹带剂为70%乙醇,设置夹带剂流速为1.5L/h,CO2流速为35L/h,调节萃取釜的温度为50℃,压力30Mpa,萃取时间45min,设置分离釜1压力为16Mpa,分离釜2压力为5Mpa。收集分离釜2的提取物,将获得的提取物溶液在55℃下减压浓缩,将浓缩液用C18反相硅胶柱纯化,45%甲醇溶液洗脱3BV,然后更换55%甲醇溶液洗脱3BV,薄层色谱实时检测并收集含有密蒙花苷单一点的组分,将收集到的密蒙花苷溶液减压浓缩后,用冷冻干燥器干燥,获得密蒙花苷固体。将粉末溶解后用HPLC检测,计算所得密蒙花苷纯度为99.5%,得率为0.76%。
实施例7密蒙花苷对URAT1的抑制活性
在本实施例中,采用如下方法测定密蒙花苷对过表达URAT1的HEK-293T细胞吸收6-羧基荧光素(6-CFL)的抑制活性:
(1)HEK-293T细胞使用DMEM培养基培养,培养基中包含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100IU/mL)、链霉素(100μg/mL),置于37℃、5%CO2的培养箱中。
(2)利用慢病毒载体构建过表达URAT1的HEK-293T-URAT1细胞和对照组HEK-293T-EGFP细胞。用胰酶将细胞消化下来,制备成约40×104cells/mL的细胞悬液,每孔100μL加入到96孔白色细胞培养板中,设置实验组,对照组和空白组,每组分别设6个复孔。铺板48h后,吸走培养基,用HBSS溶液清洗一次,然后每孔加入100μL的HBSS溶液,放入培养箱孵育10min,然后加入对应溶液。实验组:用HBSS溶液配制239.5μmol/L的6-CFL,再用该溶液配制相应浓度的待测样品和阳性药物;对照组:含6-CFL但不含待测样品;空白组:HBSS溶液,每孔体系均为100μL。
(3)培养箱内孵育1h后,吸走孵育溶液,用37℃PBS缓冲液洗涤3-5次。吸干残留的PBS缓冲液,每孔加入100μL 1mM的NaOH溶液,避光室温裂解30min,震荡2min混匀后,在激发和发射光分别为490和525nm的条件下进行读数。按照如下公式计算抑制率:
抑制率/%=(对照组-实验组)/(对照组-空白组)×100%
(4)2倍梯度稀释密蒙花苷和阳性药,以HBSS作为空白对照,按上述方法测定不同浓度样品对细胞中URAT1吸收6-CFL的抑制率,计算IC50值。
对实施例2,实施例3,实施例4,实施例5,实施例6中制备的密蒙花苷的URAT1抑制活性进行测定。结果见图2,浓度为50μmol/L下的密蒙花苷对细胞中URAT1吸收6-CFL的抑制率分别为83.93%、79.87%、82.47%、81.40%、78.47%,表明密蒙花苷能够显著地抑制URAT1对6-CFL的吸收。
选择实施例1制备的密蒙花苷,研究不同浓度的密蒙花苷对URAT1抑制活性。结果见图3,结果表明在0~100μmol/L浓度范围内,随着密蒙花苷浓度升高对URAT1抑制活性逐渐增加。当密蒙花苷的浓度为25μmol/L时,其抑制率可达76.50%,浓度继续升高,抑制率增长趋势趋于平缓,密蒙花苷对URAT1抑制的IC50为7.77μmol/L,与苯溴马隆活性相当。由此说明,密蒙花苷具有作为先导化合物或原料进一步开发降尿酸药品、特殊医学用途配方食品、保健食品的潜力。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例所表述的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
(1)黑莓叶洗净烘干,粉碎过筛,得黑莓叶粉;
(2)将所述步骤(1)的黑莓叶粉进行超临界萃取,收集提取液;
(3)将所述步骤(2)的提取液减压浓缩,得浓缩液;
(4)将所述步骤(3)的浓缩液纯化洗脱,收集洗脱液;
(5)将所述步骤(4)的洗脱液减压浓缩、干燥,得密蒙花苷。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中的过筛的目数为40-100目。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中的超临界萃取采用的是萃取釜,以CO2为萃取剂,40%-80%乙醇为夹带剂;所述超临界萃取的条件为:萃取温度为30℃-50℃,萃取压力为35Mpa-50Mpa,萃取时间为40min-60min,夹带剂流速为2L/h-3L/h,CO2流速为30L/h-50L/h,其中分离釜1的压力为15Mpa-20Mpa,分离釜2的压力为4Mpa-8Mpa。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中的提取液和步骤(5)中的洗脱液均减压浓缩至原体积的1/10-1/20;所述减压浓缩条件为:温度为40℃-55℃,真空度为-0.055Mpa~-0.098Mpa。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中的纯化采用的是硅胶柱纯化,具体为粒径10-40μm的C18反相硅胶柱。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中的洗脱条件为:40%-45%甲醇溶液洗脱2-3BV,50%-60%甲醇溶液洗脱3BV,薄层色谱实时检测,收集50%-60%甲醇洗脱液中含有目标化合物的组分。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)中的干燥方式为真空干燥或冷冻干燥。
8.一种密蒙花苷,其特征在于,所述密蒙花苷是由权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的,其中纯度大于98%。
9.权利要求8所述的密蒙花苷在制备具有降尿酸作用的特殊医学用途配方食品、保健品或药品中的应用。
10.权利要求8所述的密蒙花苷在制备URAT1抑制剂中的应用。
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CN202310141077.XA CN116903688A (zh) | 2023-02-21 | 2023-02-21 | 一种具有urat1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用 |
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CN117717172A (zh) * | 2023-12-19 | 2024-03-19 | 武汉森澜生物科技有限公司 | 一种具有降尿酸功效的含银锻苷的组合物及其制备方法 |
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2023
- 2023-02-21 CN CN202310141077.XA patent/CN116903688A/zh active Pending
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