CN116903688A - 一种具有urat1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有urat1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116903688A CN116903688A CN202310141077.XA CN202310141077A CN116903688A CN 116903688 A CN116903688 A CN 116903688A CN 202310141077 A CN202310141077 A CN 202310141077A CN 116903688 A CN116903688 A CN 116903688A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buddleoside
- extraction
- preparation
- reduced pressure
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 101000821903 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 12 Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 102100021495 Solute carrier family 22 member 12 Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 241000123846 Buddleja officinalis Species 0.000 title claims abstract description 11
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 title claims abstract description 11
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 title claims abstract description 10
- YFVGIJBUXMQFOF-PJOVQGMDSA-N 5-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-7-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2r,3r,4r,5r,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxychromen-4-one Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(OC1=C2)=CC(=O)C1=C(O)C=C2O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O2)O)O1 YFVGIJBUXMQFOF-PJOVQGMDSA-N 0.000 claims abstract description 66
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000194 supercritical-fluid extraction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 5
- 244000078534 Vaccinium myrtillus Species 0.000 claims abstract 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 87
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 48
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 22
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 13
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims description 9
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 4
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 claims description 4
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 4
- 229940083914 URAT1 inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- ASUMVAPLXCRBMA-UHFFFAOYSA-N (3,5-dichloro-4-hydroxyphenyl)-(2,3-dihydro-1,4-benzoxazin-4-yl)methanone Chemical compound C1=C(Cl)C(O)=C(Cl)C=C1C(=O)N1C2=CC=CC=C2OCC1 ASUMVAPLXCRBMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 10
- 102100030935 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 9 Human genes 0.000 abstract description 6
- 108010078530 urate transporter Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 49
- 241001092459 Rubus Species 0.000 description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 229930187794 buddledin Natural products 0.000 description 7
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- WHQCHUCQKNIQEC-UHFFFAOYSA-N benzbromarone Chemical compound CCC=1OC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C1=CC(Br)=C(O)C(Br)=C1 WHQCHUCQKNIQEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002529 benzbromarone Drugs 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 201000001431 Hyperuricemia Diseases 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003815 supercritical carbon dioxide extraction Methods 0.000 description 2
- 150000007968 uric acids Chemical class 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- SPJOZZSIXXJYBT-UHFFFAOYSA-N Fenson Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SPJOZZSIXXJYBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 244000172730 Rubus fruticosus Species 0.000 description 1
- 240000007651 Rubus glaucus Species 0.000 description 1
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 1
- 241000793823 Tilia amurensis Species 0.000 description 1
- 229940127358 Urate Transporter 1 Inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- -1 glycoside flavonoid Chemical class 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
- C07H17/06—Benzopyran radicals
- C07H17/065—Benzo[b]pyrans
- C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
- C07H1/08—Separation; Purification from natural products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用。所述制备方法的步骤包括：将黑莓叶洗净烘干，粉碎过筛，得黑莓叶粉；将黑莓叶粉进行超临界萃取，收集提取液；将提取液减压浓缩，得浓缩液；将浓缩液纯化洗脱，收集洗脱液；将洗脱液减压浓缩、干燥，得密蒙花苷。所述密蒙花苷得率0.84％，HPLC纯度高达99.9％，且制备方法安全环保、成本低廉。本发明还经实验验证，密蒙花苷具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性，为尿酸盐转运蛋白1抑制剂开发提供新资源，同时也为黑莓叶高值化利用提供新用途。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物开发领域，具体涉及一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用。
背景技术
尿酸盐转运蛋白1(URAT1)，定位在肾脏近端小管的顶端膜，是控制肾脏尿酸盐重吸收过程的主要转运蛋白，也是用于治疗高尿酸血症的重要靶点之一。靶向URAT1治疗高尿酸血症的药物(如苯溴马隆)，通过抑制URAT1对尿酸盐的转运能力，减少尿酸盐的重吸收，从而促进尿酸排泄。然而，苯溴马隆具有较强的肝毒性，且不适用于痛风发作期，进而限制了其应用。而其他作用于URAT1的药物也有不同程度的副作用和使用局限性，因此从天然化合物挖掘筛选URAT1抑制剂逐渐成为研究的热点。
密蒙花苷，分子量为594.52，是一种糖苷类黄酮，具有抗血栓、降血糖、抗炎、抗肿瘤等活性，但目前未见关于密蒙花苷对URAT1抑制活性或降尿酸活性的报道。研究报道的密蒙花苷主要来源有密蒙花、紫椴花、覆盆子等，但部分原料价格偏高，而黑莓叶中密蒙花苷含量较高，且黑莓叶作为黑莓种植产业的副产物，成本较低，因此可以作为制备密蒙花苷的原料。密蒙花苷生产工艺主要有机溶剂浸提、回流提取等方式，存在有机溶剂消耗量大、提取时间长、提取率较低等缺点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用。本发明利用超临界二氧化碳萃取技术，结合C18反相硅胶柱纯化，从黑莓叶中高效提取纯化密蒙花苷，所得的密蒙花苷得率和纯度高，具有较强的尿酸盐转运蛋白1抑制活性。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷的制备方法，包括以下步骤：
(1)黑莓叶洗净烘干，粉碎过筛，得黑莓叶粉；
(2)将步骤(1)的黑莓叶粉进行超临界萃取，收集提取液；
(3)将步骤(2)的提取液减压浓缩，得浓缩液；
(4)将步骤(3)的浓缩液纯化洗脱，收集洗脱液；
(5)将步骤(4)的洗脱液减压浓缩、干燥，得密蒙花苷。
进一步的，所述步骤(1)中的过筛的目数为40-100目。
进一步的，所述步骤(2)中的超临界萃取采用的是萃取釜，以CO2为萃取剂，40％-80％乙醇为夹带剂；所述超临界萃取的条件为：萃取温度为30℃-50℃，萃取压力为35Mpa-50Mpa，萃取时间为40min-60min，夹带剂流速为2L/h-3L/h，CO2流速为30L/h-50L/h，其中分离釜1的压力为15Mpa-20Mpa，分离釜2的压力为4Mpa-8Mpa。
进一步的，所述步骤(3)中的提取液和步骤(5)中的洗脱液均减压浓缩至原体积的1/10-1/20；所述减压浓缩条件为：温度为40℃-55℃，真空度为-0.055Mpa～-0.098Mpa。
进一步的，所述步骤(4)中的纯化采用的是硅胶柱纯化，具体为粒径10-40μm的C18反相硅胶柱。
进一步的，所述步骤(4)中的洗脱条件为：40％-45％甲醇溶液洗脱2-3BV，50％-60％甲醇溶液洗脱3BV，薄层色谱实时检测，收集50％-60％甲醇洗脱液中含有目标化合物的组分。
进一步的，所述步骤(5)中的干燥方式为真空干燥或冷冻干燥。
综上，一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷的制备方法，包括以下步骤：
(1)黑莓叶洗净烘干，粉碎，过40-100目筛，得黑莓叶粉；
(2)将黑莓叶粉加入萃取釜，以CO2为萃取剂，40％-80％乙醇为夹带剂进行超临界萃取，设置萃取温度30-50℃，压力35-50Mpa，时间40-60min，夹带剂流速为2-3L/h，CO2流速为30-50L/h，分离釜1压力为15-20Mpa，分离釜2压力为4-8Mpa，在分离釜2收集提取液；
(3)将步骤(2)的提取液在温度40-55℃，真空度-0.055～-0.098Mpa的条件下减压浓缩至原体积的1/10-1/20，得浓缩液；
(4)将步骤(3)的浓缩液用粒径10-40μm的C18反相硅胶柱纯化，上样后用40％-45％甲醇溶液洗脱2-3BV，50-60％甲醇溶液洗脱3BV，薄层色谱实时检测，收集50％-60％甲醇洗脱液中含有目标化合物的组分；
(5)将步骤(4)的洗脱液在温度40-55℃，真空度-0.055～-0.098Mpa的条件下减压浓缩至原体积的1/10-1/20，真空干燥或冷冻干燥得密蒙花苷。
本发明还提供了一种密蒙花苷，其是由所述的制备方法制备得到的，其中纯度大于98％。
本发明还提供了所述的密蒙花苷在制备具有降尿酸作用的特殊医学用途配方食品、保健品或药品中的应用。
本发明还提供了所述的密蒙花苷在制备URAT1抑制剂中的应用。
进一步的，所述密蒙花苷抑制URAT1的IC50为7.77μmol/L。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
1、本发明提供了一种从黑莓叶中提取制备密蒙花苷的制备方法，利用超临界二氧化碳萃取技术，结合C18反相硅胶柱纯化，高效制备高纯度具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的密蒙花苷，密蒙花苷得率0.84％，HPLC纯度高达99.9％，而且制备方法具有安全环保、成本低廉等优势。
2、本发明提供的黑莓叶来源的密蒙花苷首次验证具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性，抑制尿酸盐转运蛋白1的IC50为7.77μmol/L，与苯溴马隆活性相当，为尿酸盐转运蛋白1抑制剂开发提供新资源，同时也为黑莓叶高值化利用提供新用途。
3、黑莓叶来源密蒙花苷作为一种天然植物提取物，与已有药物相比具有对人体副作用小、绿色安全的优势，在制备具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的功能制品中具有明显的优势和广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2的密蒙花苷的HPLC色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为电信号强度。
图2为不同实施例的密蒙花苷对URAT1的抑制活性，其中横坐标为不同实施例制备的密蒙花苷，纵坐标为抑制率。
图3为苯溴马隆和实施例1的密蒙花苷对URAT1的抑制作用，其中横坐标为浓度，纵坐标为抑制率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但以下实施例不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。如无特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
密蒙花苷纯度测定：采用HPLC检测并用峰面积归一法计算纯度，色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；以甲醇(A)和0.1％的甲酸(B)为流动相，比例为45％A和55％B；流速为1.0mL/min，柱温为25℃，检测波长为365nm，进样量为20μL，样品浓度为25μg/mL，检测时间为15min。
密蒙花苷得率计算：
式中，m1为所得密蒙花苷固体粉末的质量，P为密蒙花苷固体粉末的纯度，m2为黑莓叶粉的质量。
实施例1工艺条件对制备密蒙花苷的影响
黑莓叶洗净烘干，粉碎，过筛得40-100目黑莓叶粉。取1kg黑莓叶粉加入萃取釜，以CO2为萃取剂，60％乙醇为夹带剂进行超临界萃取，设置萃取温度40℃，压力40Mpa，时间50min，夹带剂流速为3L/h，CO2流速为35L/h，分离釜1压力为16Mpa，分离釜2压力为6Mpa，收集分离釜2中的提取液。在温度50℃，真空度-0.090Mpa的条件下减压浓缩至原体积的1/10，得浓缩液。将浓缩液用粒径20μm的C18反相硅胶柱纯化，上样后用45％甲醇溶液洗脱2BV，55％甲醇溶液洗脱3BV，薄层色谱实时检测，收集含有目标化合物的洗脱液，然后将所得洗脱液在温度50℃，真空度-0.090Mpa的条件下减压浓缩至原体积的1/10，真空干燥得密蒙花苷。
(1)提取温度对制备密蒙花苷的影响
在上述基本工艺的基础上，分别调节萃取釜的提取温度为20、30、40、50、60、70℃，其他工艺条件不变，研究不同提取温度对于制备密蒙花苷的影响。
表1不同提取温度对制备密蒙花苷的影响
| 温度/℃ | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
| 得率/％ | 0.62 | 0.72 | 0.82 | 0.80 | 0.71 | 0.66 |
| 纯度/％ | 98.2 | 98.5 | 99.8 | 99.6 | 99.6 | 98.9 |
结果如表1所示，当温度为40℃时，密蒙花苷的得率和纯度最高，不同提取温度对于密蒙花苷纯度影响不大。
(2)提取压力对制备密蒙花苷的影响
在上述基本工艺的基础上，分别设置提取压力为20、25、30、35、40、45、50Mpa，其他工艺条件不变，研究不同提取压力对于制备密蒙花苷的影响。
表2不同压力对制备密蒙花苷的影响
| 压力/MPa | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 |
| 得率/％ | 0.60 | 0.69 | 0.74 | 0.83 | 0.82 | 0.83 | 0.83 |
| 纯度/％ | 95.1 | 94.2 | 95.5 | 99.6 | 99.6 | 99.6 | 98.9 |
结果如表2所示，当提取压力为35MPa时，再增加压力，密蒙花苷的得率没有明显增加，且提取压力为35-45MPa时，密蒙花苷纯度均大于99.5％。
(3)提取时间对制备密蒙花苷的影响
在上述基本工艺的基础上，分别设置提取时间为10、20、30、40、50、60min，其他工艺条件不变，研究不同提取时间对制备密蒙花苷的影响。
表3提取时间对制备密蒙花苷的影响
| 萃取时间/min | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 得率/％ | 0.60 | 0.72 | 0.75 | 0.84 | 0.83 | 0.81 |
| 纯度/％ | 95.4 | 97.2 | 98.1 | 99.4 | 98.9 | 98.8 |
结果如表3所示，提取时间为40min时，密蒙花苷的纯度和得率都最高。
(4)夹带剂浓度对制备密蒙花苷的影响
在上述基本工艺的基础上，分别设置夹带剂浓度为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的乙醇，其他工艺条件不变，研究不同夹带剂浓度对制备密蒙花苷的影响。
表4夹带剂浓度对制备密蒙花苷的影响
| 乙醇浓度/％ | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 |
| 得率/％ | 0.58 | 0.65 | 0.71 | 0.80 | 0.84 | 0.82 | 0.82 | 0.79 | 0.62 | 0.55 |
| 纯度/％ | 96.5 | 97.1 | 98.5 | 98.8 | 99.4 | 99.3 | 99.0 | 98.9 | 98.6 | 96.8 |
结果如表4所示，夹带剂乙醇浓度为50％时，密蒙花苷的得率和纯度最高。
(5)洗脱液甲醇浓度对制备密蒙花苷的影响
在上述基本工艺的基础上，分别设置洗脱液甲醇浓度为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％，其他工艺条件不变，研究不同浓度洗脱液浓度对制备密蒙花苷的影响。
表5不同甲醇洗脱液浓度对制备密蒙花苷的影响
| 甲醇浓度/％ | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 | 65 | 70 | 75 |
| 得率/％ | 0.32 | 0.54 | 0.61 | 0.84 | 0.83 | 0.84 | 0.82 | 0.79 |
| 纯度/％ | 98.5 | 97.1 | 97.5 | 99.8 | 95.4 | 90.3 | 83.6 | 78.5 |
结果如表5所示，洗脱剂甲醇浓度为55％时，密蒙花苷的得率和纯度最高。
实施例2从黑莓叶中提取纯化密蒙花苷
黑莓叶洗净烘干，粉碎机粉碎后，过60目筛。取黑莓叶粉1kg加入萃取釜，夹带剂为50％乙醇，设置夹带剂流速为3L/h，CO2流速为40L/h，调节萃取釜的温度为40℃，压力35Mpa，萃取时间40min，设置分离釜1压力为18Mpa，分离釜2压力为6Mpa。收集分离釜2的提取液，减压浓缩至原体积的1/10后，将浓缩液用粒径10μm的C18反相硅胶柱，45％甲醇溶液洗脱2BV，然后用55％甲醇溶液洗脱，每15mL收集一份，薄层色谱检测并合并含有密蒙花苷单一点的组分，共洗脱3BV，将收集到的密蒙花苷溶液减压浓缩后，用冷冻干燥器干燥，获得密蒙花苷固体粉末，将粉末溶解后用HPLC检测，计算所得密蒙花苷纯度为99.9％(HPLC图谱见图1)，得率为0.84％。
实施例3从黑莓叶中提取纯化密蒙花苷
黑莓叶洗净烘干，粉碎机粉碎后，过80目筛。取黑莓叶粉800g加入萃取釜，夹带剂为75％乙醇，设置夹带剂流速为2L/h，CO2流速为30L/h，调节萃取釜的温度为35℃，压力30Mpa，萃取时间45min，设置分离釜1压力为15Mpa，分离釜2压力为5Mpa。收集分离釜2的提取液，55℃下减压浓缩后，将浓缩液上样到粒径20μm的C18反相硅胶柱，45％甲醇溶液洗脱3BV，然后更换55％甲醇溶液洗脱，薄层色谱实时检测并收集含有密蒙花苷单一点的组分，共洗脱3BV，之后更换100％甲醇洗脱2BV，将收集到的密蒙花苷溶液50℃下减压浓缩后，用真空干燥器干燥，获得密蒙花苷固体粉末。将粉末溶解后用HPLC检测，计算所得密蒙花苷纯度为98.2％，得率为0.80％。
实施例4从黑莓叶中提取纯化密蒙花苷
取80目的黑莓叶粉1kg加入萃取釜，夹带剂为60％乙醇，设置夹带剂流速为3L/h，CO2流速为35L/h，调节萃取釜的温度为40℃，压力35Mpa，萃取时间40min，设置分离釜1压力为20Mpa，分离釜2压力为6Mpa。收集分离釜2的萃取液，50℃下减压浓缩后，将浓缩液上样到C18反相硅胶柱，45％甲醇溶液洗脱3BV，然后更换55％甲醇溶液洗脱，每20mL收集一管，薄层色谱检测并合并含有密蒙花苷单一点的组分，共洗脱3BV，之后更换100％甲醇洗脱2BV，将收集到的密蒙花苷溶液在50℃下减压浓缩，用真空干燥器干燥，获得密蒙花苷固体粉末。将密蒙花苷固体粉末溶解后用HPLC检测，计算所得密蒙花苷纯度为99.0％，得率为0.79％。
实施例5从黑莓叶中提取纯化密蒙花苷
黑莓叶洗净烘干，粉碎机粉碎后，过60目筛。取黑莓叶粉600g加入萃取釜，夹带剂为80％乙醇，设置夹带剂流速为1.5L/h，CO2流速为35L/h，调节萃取釜的温度为50℃，压力30Mpa，萃取时间45min，设置分离釜1压力为16Mpa，分离釜2压力为5Mpa。收集分离釜2的提取物，将获得的提取物在55℃下减压浓缩，将浓缩液用C18反相硅胶柱纯化，45％甲醇溶液洗脱3BV除杂，然后更换55％甲醇溶液洗脱，薄层色谱实时检测并收集含有密蒙花苷单一点的组分，共洗脱3BV，将收集到的密蒙花苷溶液减压浓缩后，用真空干燥器干燥，获得密蒙花苷固体。将粉末溶解后用HPLC检测，计算所得密蒙花苷纯度为99.5％，得率为0.76％。
实施例6从黑莓叶中提取纯化密蒙花苷
黑莓叶洗净烘干，粉碎机粉碎后，过60目筛。取黑莓叶粉600g加入萃取釜，夹带剂为70％乙醇，设置夹带剂流速为1.5L/h，CO2流速为35L/h，调节萃取釜的温度为50℃，压力30Mpa，萃取时间45min，设置分离釜1压力为16Mpa，分离釜2压力为5Mpa。收集分离釜2的提取物，将获得的提取物溶液在55℃下减压浓缩，将浓缩液用C18反相硅胶柱纯化，45％甲醇溶液洗脱3BV，然后更换55％甲醇溶液洗脱3BV，薄层色谱实时检测并收集含有密蒙花苷单一点的组分，将收集到的密蒙花苷溶液减压浓缩后，用冷冻干燥器干燥，获得密蒙花苷固体。将粉末溶解后用HPLC检测，计算所得密蒙花苷纯度为99.5％，得率为0.76％。
实施例7密蒙花苷对URAT1的抑制活性
在本实施例中，采用如下方法测定密蒙花苷对过表达URAT1的HEK-293T细胞吸收6-羧基荧光素(6-CFL)的抑制活性：
(1)HEK-293T细胞使用DMEM培养基培养，培养基中包含10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100IU/mL)、链霉素(100μg/mL)，置于37℃、5％CO2的培养箱中。
(2)利用慢病毒载体构建过表达URAT1的HEK-293T-URAT1细胞和对照组HEK-293T-EGFP细胞。用胰酶将细胞消化下来，制备成约40×104cells/mL的细胞悬液，每孔100μL加入到96孔白色细胞培养板中，设置实验组，对照组和空白组，每组分别设6个复孔。铺板48h后，吸走培养基，用HBSS溶液清洗一次，然后每孔加入100μL的HBSS溶液，放入培养箱孵育10min，然后加入对应溶液。实验组：用HBSS溶液配制239.5μmol/L的6-CFL，再用该溶液配制相应浓度的待测样品和阳性药物；对照组：含6-CFL但不含待测样品；空白组：HBSS溶液，每孔体系均为100μL。
(3)培养箱内孵育1h后，吸走孵育溶液，用37℃PBS缓冲液洗涤3-5次。吸干残留的PBS缓冲液，每孔加入100μL 1mM的NaOH溶液，避光室温裂解30min，震荡2min混匀后，在激发和发射光分别为490和525nm的条件下进行读数。按照如下公式计算抑制率：
抑制率/％＝(对照组-实验组)/(对照组-空白组)×100％
(4)2倍梯度稀释密蒙花苷和阳性药，以HBSS作为空白对照，按上述方法测定不同浓度样品对细胞中URAT1吸收6-CFL的抑制率，计算IC50值。
对实施例2，实施例3，实施例4，实施例5，实施例6中制备的密蒙花苷的URAT1抑制活性进行测定。结果见图2，浓度为50μmol/L下的密蒙花苷对细胞中URAT1吸收6-CFL的抑制率分别为83.93％、79.87％、82.47％、81.40％、78.47％，表明密蒙花苷能够显著地抑制URAT1对6-CFL的吸收。
选择实施例1制备的密蒙花苷，研究不同浓度的密蒙花苷对URAT1抑制活性。结果见图3，结果表明在0～100μmol/L浓度范围内，随着密蒙花苷浓度升高对URAT1抑制活性逐渐增加。当密蒙花苷的浓度为25μmol/L时，其抑制率可达76.50％，浓度继续升高，抑制率增长趋势趋于平缓，密蒙花苷对URAT1抑制的IC50为7.77μmol/L，与苯溴马隆活性相当。由此说明，密蒙花苷具有作为先导化合物或原料进一步开发降尿酸药品、特殊医学用途配方食品、保健食品的潜力。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所表述的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种具有URAT1抑制活性的密蒙花苷的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)黑莓叶洗净烘干，粉碎过筛，得黑莓叶粉；
(2)将所述步骤(1)的黑莓叶粉进行超临界萃取，收集提取液；
(3)将所述步骤(2)的提取液减压浓缩，得浓缩液；
(4)将所述步骤(3)的浓缩液纯化洗脱，收集洗脱液；
(5)将所述步骤(4)的洗脱液减压浓缩、干燥，得密蒙花苷。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的过筛的目数为40-100目。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的超临界萃取采用的是萃取釜，以CO2为萃取剂，40％-80％乙醇为夹带剂；所述超临界萃取的条件为：萃取温度为30℃-50℃，萃取压力为35Mpa-50Mpa，萃取时间为40min-60min，夹带剂流速为2L/h-3L/h，CO2流速为30L/h-50L/h，其中分离釜1的压力为15Mpa-20Mpa，分离釜2的压力为4Mpa-8Mpa。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的提取液和步骤(5)中的洗脱液均减压浓缩至原体积的1/10-1/20；所述减压浓缩条件为：温度为40℃-55℃，真空度为-0.055Mpa～-0.098Mpa。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的纯化采用的是硅胶柱纯化，具体为粒径10-40μm的C18反相硅胶柱。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的洗脱条件为：40％-45％甲醇溶液洗脱2-3BV，50％-60％甲醇溶液洗脱3BV，薄层色谱实时检测，收集50％-60％甲醇洗脱液中含有目标化合物的组分。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中的干燥方式为真空干燥或冷冻干燥。
8.一种密蒙花苷，其特征在于，所述密蒙花苷是由权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的，其中纯度大于98％。
9.权利要求8所述的密蒙花苷在制备具有降尿酸作用的特殊医学用途配方食品、保健品或药品中的应用。
10.权利要求8所述的密蒙花苷在制备URAT1抑制剂中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310141077.XA CN116903688A (zh) | 2023-02-21 | 2023-02-21 | 一种具有urat1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310141077.XA CN116903688A (zh) | 2023-02-21 | 2023-02-21 | 一种具有urat1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116903688A true CN116903688A (zh) | 2023-10-20 |
Family
ID=88353741
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310141077.XA Pending CN116903688A (zh) | 2023-02-21 | 2023-02-21 | 一种具有urat1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116903688A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117717172A (zh) * | 2023-12-19 | 2024-03-19 | 武汉森澜生物科技有限公司 | 一种具有降尿酸功效的含银锻苷的组合物及其制备方法 |
-
2023
- 2023-02-21 CN CN202310141077.XA patent/CN116903688A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117717172A (zh) * | 2023-12-19 | 2024-03-19 | 武汉森澜生物科技有限公司 | 一种具有降尿酸功效的含银锻苷的组合物及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107337586B (zh) | 一种从汉麻中提取纯化大麻二酚的方法 | |
| CN103319328B (zh) | 一种阿魏酸的制备方法 | |
| CN102382177B (zh) | 恩拉霉素的提取分离和纯化方法 | |
| CN110272932B (zh) | 一种灵芝孢子粉多糖肽的制备方法 | |
| CN103254064B (zh) | 一种阿魏酸的制备方法 | |
| WO2021232543A1 (zh) | 一种利用超临界流体色谱系统分离辅酶q10的方法 | |
| CN116903688A (zh) | 一种具有urat1抑制活性的密蒙花苷及其制备方法和应用 | |
| US7649120B2 (en) | Microwave-assisted extraction of solanesol from potato stems and/or leaves | |
| CN114105747A (zh) | 一种提高姜黄素提取率和纯化效果的方法 | |
| CN109369733B (zh) | 一种从苦荞叶中同时提取多种黄酮类化合物的方法 | |
| CN114645069A (zh) | 一种多甲氧基黄酮及其全水相制备方法与应用 | |
| CN113897406A (zh) | 一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法 | |
| WO2019205026A1 (zh) | β-葡萄糖苷酶的用途及用其制备宝藿苷Ⅰ的方法 | |
| AU2017416080B2 (en) | Method for preparing betanin | |
| WO2019205025A1 (zh) | 一种利用β-葡萄糖苷酶制备宝藿苷I的方法 | |
| CN103356740A (zh) | 黄芩素和黄芩黄酮总苷元提取物的制备方法 | |
| CN114644608A (zh) | 一种具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的漆黄素及其制备方法与应用 | |
| CN108997359B (zh) | 一种从甜菊糖生产废渣中提取叶绿素的方法 | |
| CN108992450B (zh) | 环黄芪醇衍生物在制备抗肝纤维化作用药物中的应用 | |
| CN101387586B (zh) | 荭草苷标准品的制备方法 | |
| CN115990213A (zh) | 一种具有降尿酸作用的黑莓叶提取物及其制备方法和应用 | |
| CN107043402B (zh) | 一种高活性甘蔗花色苷的制备方法 | |
| CN110386861A (zh) | 从工业大麻里提取大麻二酚的新型工艺方法 | |
| CN114656437B (zh) | 一种具有urat1抑制活性的芫花素及其制备方法和应用 | |
| CN107417750B (zh) | 一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |