CN115990213A

CN115990213A - 一种具有降尿酸作用的黑莓叶提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115990213A
Application number: CN202310141078.4A
Authority: CN
Inventors: 王鹏; 郭耿成; 万国韶
Original assignee: Qingdao Haiji Runsheng Biotechnology Co ltd; Ocean University of China
Current assignee: Qingdao Haiji Runsheng Biotechnology Co ltd; Ocean University of China
Priority date: 2023-02-21
Filing date: 2023-02-21
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2043-02-21
Also published as: CN115990213B

Abstract

本发明公开了一种具有降尿酸作用的黑莓叶提取物及其制备方法和应用。所述制备方法包括以下步骤：将干黑莓叶粉碎过筛，用pH 3‑5的酸性乙醇溶液提取；过滤收集提取液，减压浓缩，再次过滤收集滤液，滤液经超滤膜超滤，收集透过液；将透过液减压浓缩，用吸附树脂纯化，收集乙醇洗脱液；将乙醇洗脱液减压浓缩，干燥得黑莓叶提取物。本发明制得的黑莓叶提取物中槲皮素‑3‑芸香糖苷和紫云英苷含量大于160μg/g，其具有良好的降尿酸活性，尿酸生成抑制率最高可达80.28％，因此可作为尿酸抑制剂的新来源，应用于特殊医学用途配方食品或药品的制备中。

Description

一种具有降尿酸作用的黑莓叶提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种具有降尿酸作用的黑莓叶提取物及其制备方法和应用。

背景技术

高尿酸血症是因人体内嘌呤代谢紊乱，致使血液中尿酸增多而引起的一种代谢性疾病，尿酸生成过多是主要原因之一。目前可通过抑制黄嘌呤氧化酶(XO)活性减少尿酸生成，从而缓解高尿酸血症。

研究表明，天然产物经初步提取得到的粗提物往往能表现抑制XO、抗氧化等生物活性。黑树莓含有丰富的营养成分，如具有高效抗氧化的类黄酮物质和天然抗癌作用的鞣花酸等活性成分。CN108619270A公开了一种从树莓中制备黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，采用pH2的盐酸乙醇溶液超声提取，通过AB-8大孔吸附树脂在70％乙醇浓度下分离纯化，这种方法得到的树莓提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制活性较差，其IC₅₀为276.13μg/mL。CN111743940A公开了一种采用闪式提取和酶解来提取树莓干果黄酮的方法，这种方法不涉及纯化过程，得到的黄酮类化合物较杂。

黑莓叶富含多种营养成分，如具有强抗氧化活性的类黄酮多酚物质和人体必需锌、铁等微量元素。研究证明黑莓叶具有抗炎、抗氧化、抗癌的一系列功效。目前，关于黑莓叶的研究主要集中于黄酮、多酚等活性成分的提取、抗炎、抗氧化以及加工工艺的优化等方面。另外，关于树莓叶提取物多仅限于提取，而对其活性方面的研究还比较少，并且目前关于黑莓叶在降尿酸方面的应用未见公开报道。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种具有降尿酸作用的黑莓叶提取物及其制备方法和应用。本发明通过酸性乙醇溶液联合超滤、吸附树脂制备得到一种黑莓叶提取物，其具有良好的降尿酸功效；并且制备工艺简单温和、能耗低，通过超滤联合树脂双重纯化，能有效去除溶液中的悬浮物、微粒等大分子物质，显著提高黑莓叶提取物中活性物质的纯度。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种具有降尿酸作用的黑莓叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将干黑莓叶粉碎过筛，用酸性乙醇溶液提取，过滤得提取液；

(2)将所述提取液减压浓缩得浓缩液I；

(3)将所述浓缩液I过滤，收集的滤液进行超滤，收集得透过液；

(4)将所述透过液减压浓缩得浓缩液II；

(5)将所述浓缩液II纯化洗脱，得洗脱液；

(6)将所述洗脱液减压浓缩得浓缩液III，将浓缩液III干燥得黑莓叶提取物。

进一步的，所述步骤(1)中酸性乙醇溶液是利用食品级柠檬酸、苹果酸或水杨酸调节乙醇溶液pH至3-5获得的；所述乙醇溶液浓度为75％-85％。

进一步的，所述步骤(1)中过筛的目数为40-60目；所述提取的条件为：料液比1:20-1:40，提取温度30℃-40℃，提取时间2h-3h。

进一步的，所述步骤(2)中浓缩液I的固形物含量为20wt％-30wt％；所述步骤(4)中浓缩液II的固形物含量为30wt％-40wt％；所述步骤(6)中浓缩液III的固形物含量为20wt％-30wt％；所述减压浓缩的温度为45℃-55℃。

进一步的，所述步骤(1)中过滤的孔径为30-50μm；所述步骤(3)中过滤的孔径为0.22μm，超滤所用的超滤膜的截留分子量为1kDa。

进一步的，所述步骤(5)中纯化采用的是吸附树脂分离纯化，洗脱采用的是水和70％-80％乙醇溶液分别洗脱；所述吸附树脂为NKA-II、AB-8或LSA-21。

进一步的，所述步骤(6)中干燥的方式为喷雾干燥或冷冻干燥。

综上所述，一种具有降尿酸作用的黑莓叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将干黑莓叶粉碎，过40-60目筛，得到黑莓叶粉，向黑莓叶粉中加入20-40倍体积为75％-85％的乙醇溶液，用食品级柠檬酸、苹果酸或水杨酸调节溶液pH至3-5，提取温度控制在30-40℃，提取2-3h后过30-50μm滤膜，收集提取液；

(2)将步骤(1)的提取液在45-55℃减压浓缩至20-30wt％固形物含量，得到浓缩液I；

(3)将步骤(2)的浓缩液I过0.22μm滤膜，收集的滤液用截留分子量1kDa的超滤膜超滤，收集得透过液；

(4)将步骤(3)的透过液在45-55℃减压浓缩至30-40wt％固形物含量，得到浓缩液II；

(5)将步骤(4)的浓缩液II用吸附树脂分离纯化，依次用水、70％-80％乙醇进行洗脱收集，收集乙醇洗脱液；

(6)将步骤(5)的乙醇洗脱液在45-55℃减压浓缩至20-30wt％固形物含量，得到浓缩液III，将浓缩液III喷雾干燥或冷冻干燥得黑莓叶提取物。

本发明还提供了一种黑莓叶提取物，是由所述的制备方法制得的，其中槲皮素-3-芸香糖苷和紫云英苷含量大于160μg/g。

本发明还提供了所述的黑莓叶提取物在制备具有降尿酸作用的特殊医学用途配方食品、保健品或药品中的应用。

本发明还提供了所述的黑莓叶提取物在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。

进一步的，所述黑莓叶提取物抑制黄嘌呤氧化酶的IC₅₀为165.10μg/mL。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明通过酸性乙醇溶液联合超滤、吸附树脂提供的制备工艺简单，通过食品级柠檬酸、苹果酸或水杨酸调节提取溶液pH，能显著提高黄酮、鞣花酸等活性物质的提取。

(2)本发明提供的黑莓叶提取物具有良好的降尿酸活性，尿酸生成抑制率最高可达80.28％，黑莓叶提取物中槲皮素-3-芸香糖苷和紫云英苷含量＞

160.25μg/g，因此可作为尿酸抑制剂的新来源，应用前景广泛。

(3)本发明中采用的超滤联合树脂双重纯化，能有效去除是一种物理方法分离技术，工艺简单；相较于萃取，无毒无害，能有效去除溶液中的分子量大于1kDa的悬浮物、微粒等大分子物质，显著提高黑莓叶提取物中活性物质的纯度。

附图说明

图1为黑莓叶提取物的液质图谱。

图2为不同实施例组黑莓叶提取物对尿酸抑制率。

图3为实施例2下不同浓度黑莓叶提取物的尿酸生成抑制的IC₅₀，其中横坐标为黑莓叶提取物的浓度，纵坐标为尿酸生成抑制率。

图4为实施例2下不同浓度黑莓叶提取物的XO抑制的IC₅₀，其中横坐标为黑莓叶提取物的浓度，纵坐标为XO抑制率。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但是实施例仅是范例，并不对本发明的范围构成任何限制。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

采用LC-MS法鉴定黑莓叶提取物主要化学成分分析，具体方法如下：

利用液质连用色谱(LC-MS)对黑莓叶提取物样品进行化学成分鉴定，其色谱条件为：色谱柱PLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；检测器PDA，流动相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，采用线性梯度洗脱：0-1min，5％ B；1-10min，5％-60％ B；10-11min，60％-5％ B，流速0.3mL/min；柱温35℃，进样量5μL。质仪谱在负离子模式下运行，参数如下：离子源温度为320℃，源电压为5kV，毛细管电压为-32V，毛细管温度为300℃，鞘内气体和辅助气体(N₂)压力分别为35arb和10arb。谱图如图1所示。

在已鉴定的化合物中，槲皮素-3-O-芸香糖苷出峰时间为6.88min，紫云英苷出峰时间为9.64min。选取槲皮素-3-O-芸香糖苷和紫云英苷标准品采用外标法依据峰面积计算含量。以对照品质量浓度为横坐标(X)，化合物峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得到槲皮素-3-O-芸香糖苷标准曲线：Y＝644.2X+878.5和紫云英苷标准曲线：Y＝908.4X-95.45。

实施例1

将干黑莓叶粉碎，过40目筛，得黑莓叶粉。取黑莓叶粉10g，加入20倍体积75％乙醇溶液，用食品级柠檬酸调节溶液pH至3，提取温度控制在30℃，提取2h后过30μm滤膜，收集提取液，提取液45℃减压浓缩至30wt％固形物含量，得浓缩液I，将浓缩液I过0.22μm滤膜，收集滤液，将滤液用截留分子量1kDa的超滤膜超滤，收集透过液，透过液45℃减压浓缩至40wt％固形物含量，得到浓缩液II，将浓缩液II用NKA-II型大孔树脂分离，分别用水、70％乙醇溶液洗脱，收集70％乙醇洗脱液，洗脱液45℃减压浓缩至30wt％固形物含量，得到浓缩液III，浓缩液III经冷冻干燥得黑莓叶提取物610mg，黑莓叶提取物得率为6.10％，其中槲皮素-3-O-芸香糖苷和紫云英苷含量为160.25μg/g。

实施例2

将干黑莓叶粉碎，过50目筛，得黑莓叶粉。取黑莓叶粉10g，加入30倍体积80％乙醇溶液，用食品级苹果酸调节溶液pH至4，提取温度控制在35℃，提取2.5h后过40μm滤膜，收集提取液，提取液50℃减压浓缩至25wt％固形物含量，得到浓缩液I，将浓缩液I过0.22μm滤膜，收集滤液，将滤液用截留分子量1kDa的超滤膜超滤，收集透过液，透过液50℃减压浓缩至35wt％固形物含量，得到浓缩液II，将浓缩液II用AB-8型大孔树脂分离，分别用水、75％乙醇溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，洗脱液50℃减压浓缩至25wt％固形物含量，得到浓缩液III，浓缩液III经冷冻干燥得黑莓叶提取物645mg，黑莓叶提取物得率为6.45％，其中槲皮素-3-O-芸香糖苷和紫云英苷含量为170.38μg/g。

实施例3

将干黑莓叶粉碎，过60目筛，得黑莓叶粉。取黑莓叶粉10g，加入40倍体积85％乙醇溶液，用食品级水杨酸调节溶液pH至5，提取温度控制在40℃，提取3h后过50μm滤膜，收集提取液，提取液55℃减压浓缩至20wt％固形物含量，得到浓缩液I，将浓缩液1过0.22μm滤膜，收集滤液，将滤液用截留分子量1kDa的超滤膜超滤，收集透过液，透过液55℃减压浓缩至20wt％固形物含量，得到浓缩液II，将浓缩液II用LSA-21型大孔树脂分离，分别用水、80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，洗脱液55℃减压浓缩至20wt％固形物含量，得到浓缩液III，浓缩液III经真空干燥得黑莓叶提取物628mg，黑莓叶提取物得率为6.28％，其中槲皮素-3-O-芸香糖苷和紫云英苷含量为166.79μg/g。

实施例4：黑莓叶提取物的降尿酸活性

针对实施例1-3得到的黑莓叶提取物的活性应用，进行了细胞实验、体外酶活抑制实验，具体如下：

1、细胞实验：

生长对数期的AML12细胞铺24孔板，500μL每孔，1×10⁵个细胞/孔，培养72h，让AML12细胞在无血清DMEM中培养24h后，用PBS洗涤一次，并置于200μL的BSS中孵育(含有200μM黄嘌呤作为UA前体物质)。在有、无样品的情况下，孵育2h后，取200μL BSS用于UA的测定。提取细胞中蛋白并用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量。用尿酸酶法测定BSS中尿酸水平。UA产量以nmol/2h/mg蛋白表达。

分别测定实施例1-3制备的黑莓叶提取物对尿酸生成量的抑制活性，结果见图2，由图可知，实施例1-3制备的黑莓叶提取物能显著地抑制尿酸生成，抑制率最高为80.28％(实施例2制得)，最低为72.79％(实施例1制得)。结果表明本发明制备的黑莓叶提取物具有良好的抑制尿酸生成的活性。

选取实施例2制备的黑莓叶提取物，研究不同浓度的黑莓叶提取物对尿酸生成量的抑制活性，结果见图3。结果表明，在0-500μg/mL浓度范围内，随着黑莓叶提取物浓度升高，尿酸生成抑制率逐渐增加。黑莓叶提取物对尿酸生成抑制率的IC₅₀为105.9μg/mL。

2、酶活抑制实验：

在96孔板上加入不同浓度黑莓叶提取物或空白溶液(PBS)100μL，0.08U/mL黄嘌呤氧化酶50μL，于37℃预温育5min，加入底物0.48mmol/L黄嘌呤溶液50μL启动酶促反应，在吸光波长295nm，每隔30s读数，共5min。

XO抑制率按以下公式计算：

抑制率(％)＝[(空白组-实验组)/空白组]×100％

选择实施例2制备的对尿酸生成抑制率活性最高的黑莓叶提取物，分别测定不同浓度黑莓叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制活性。结果见图4，由图可知，黑莓叶提取物对黄嘌呤氧化酶具有良好的体外抑制效果，IC₅₀为165.10μg/ml。由此说明，黑莓叶提取物具有作为原料进一步开发降尿酸活性的特殊医学用途配方食品、药品的潜力。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所表述的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种具有降尿酸作用的黑莓叶提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含以下步骤：

(2)将所述提取液减压浓缩得浓缩液I；

(4)将所述透过液减压浓缩得浓缩液II；

(5)将所述浓缩液II纯化洗脱，得洗脱液；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中酸性乙醇溶液是利用食品级柠檬酸、苹果酸或水杨酸调节乙醇溶液pH至3-5获得的；所述乙醇溶液浓度为75％-85％。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中过筛的目数为40-60目；所述提取的条件为：料液比1:20-1:40，提取温度30℃-40℃，提取时间2h-3h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中浓缩液I的固形物含量为20wt％-30wt％；所述步骤(4)中浓缩液II的固形物含量为30wt％-40wt％；所述步骤(6)中浓缩液III的固形物含量为20wt％-30wt％；所述减压浓缩的温度为45℃-55℃。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中过滤的孔径为30μm-50μm；所述步骤(3)中过滤的孔径为0.22μm，超滤所用的超滤膜的截留分子量为1kDa。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中纯化采用的是吸附树脂分离纯化，洗脱采用的是水和70％-80％乙醇溶液分别洗脱；所述吸附树脂为NKA-II、AB-8或LSA-21。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中干燥的方式为喷雾干燥或冷冻干燥。

8.一种黑莓叶提取物，其特征在于，所述黑莓叶提取物是由权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的，其中槲皮素-3-芸香糖苷和紫云英苷含量大于160μg/g。

9.权利要求8所述的黑莓叶提取物在制备具有降尿酸作用的特殊医学用途配方食品、保健品或药品中的应用。

10.权利要求8所述的黑莓叶提取物在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。