CN114644608A - 一种具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的漆黄素及其制备方法与应用 - Google Patents
一种具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的漆黄素及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的漆黄素及其制备方法与应用。所述制备方法包括步骤为：将洋甘草进行超微粉碎，过筛，得到超细粉末；将超细粉末浸泡于乙醇中，超声辅助提取，过滤收集滤液，重复提取过滤，合并滤液得到粗提物；将粗提物减压浓缩得到浸膏，所述浸膏用水复溶后，用有机溶剂萃取，分离得到萃取液，重复萃取并合并萃取液；将步骤萃取液经由大孔树脂粗分、层析柱细分级、高效液相色谱纯化后，干燥得到漆黄素。本发明的制备方法简单，特异性强，得到的漆黄素具有体外尿酸盐转运蛋白1抑制活性，开辟了洋甘草漆黄素的新用途。
Description
技术领域
本发明属于天然提取物领域，特别涉及一种具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的漆黄素及其制备方法与应用。
背景技术
随着生活水平的提高，高嘌呤、高蛋白饮食增加，人们的尿酸水平呈增高趋势，而高尿酸血症的患病率也逐年增高。高尿酸血症不仅是急性关节炎、痛风石、肾结石和尿酸性肾病等疾病的重要生化基础，而且与冠心病、高血压、糖尿病、心功能衰竭、慢性肾脏疾病等疾病密切相关。高尿酸血症的发病机制主要为嘌呤代谢异常和尿酸排泄受阻。
目前临床上近90%的高尿酸血症是由于尿酸排泄减少引起的，尿酸约有2/3通过肾脏排泄，1/3经消化道排泄，约90%尿酸在肾脏近曲小管重新吸收回血液，尿酸盐转运蛋白1是参与尿酸重吸收的主要蛋白质，其参与尿酸盐的重吸收，而高水平的尿酸盐转运蛋白1可能会引起高尿酸血症或痛风。目前市场上促进尿酸排泄的药物均表现出不同的毒副作用，难以满足患者长期服用的需求，因此，寻找有效且低毒副作用的新型尿酸盐转运蛋白1抑制剂非常必要。
洋甘草（Glycyrrhiza glabra L.）是甘草的一种，主要有效成分包括皂苷类化合物、黄酮类化合物及甘草多糖等。漆黄素，又名非瑟酮（Fisetin），是一种存在于漆树科植物、多种水果和蔬菜中的天然黄酮类化合物，研究已报道其具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎、神经保护等多种药理活性。制备漆黄素的相关研究主要集中在以漆树科植物作为来源进行制备，且制备工艺复杂多样，例如从黄栌干燥枝叶、茎枝中，从黄杨木中，从余甘子中等制备漆黄素。但目前，从洋甘草中制备漆黄素的方法未见公开报道。因此，需要一种对洋甘草的有效部位和有效活性成分进行针对性提取，提高漆黄素纯度，提供具有良好活性的漆黄素的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的漆黄素及其制备方法与应用。本发明从洋甘草中高效且特异性制备具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的漆黄素，产品纯度高，且抑制活性高。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的漆黄素的制备方法，包括如下步骤：
（1）将洋甘草进行超微粉碎，过筛，得到超细粉末；
（2）将步骤（1）的超细粉末浸泡于乙醇中，超声辅助提取，过滤收集滤液，重复提取过滤，合并滤液得到粗提物；
（3）将步骤（2）中的粗提物减压浓缩得到浸膏，所述浸膏用水复溶后，用有机溶剂萃取，分离得到萃取液，重复萃取并合并萃取液；
（4）将步骤（3）中的萃取液经由大孔树脂粗分、层析柱细分级、高效液相色谱纯化后，干燥得到漆黄素。
进一步的，所述步骤（1）中超细粉末的粒径为500目~1000目。
进一步的，所述步骤（2）中超细粉末与乙醇的料液比为1：10~1：20；所述乙醇的浓度为70%~85%；所述超细粉末浸泡于乙醇中，常温静置1~2小时。
进一步的，所述步骤（2）中超声辅助提取条件为：超声功率：50W~150W，温度30℃~50℃，时间40~60分钟。
优选的，所述步骤（2）中超声辅助提取条件为：超声功率：150W，温度40℃，时间50分钟。
进一步的，所述步骤（3）中减压浓缩的温度为50℃～60℃；在浸膏复溶时，水的体积是浸膏体积的1~2倍，复溶后得到复溶液；在有机溶剂萃取时，有机溶剂的体积是复溶液的2～3倍。
进一步的，所述有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯中的至少一种。
进一步的，所述大孔树脂柱的洗脱剂为70%~90%的乙醇溶液；所述层析柱为葡聚糖凝胶柱，其洗脱剂为60~80%甲醇溶液。
优选的，所述大孔树脂柱的洗脱剂为70%的乙醇溶液。
进一步的，所述大孔树脂包括AB-8、SPD100、HPD100、XAD-4、XAD-7大孔树脂；所述葡聚糖凝胶柱为SephadexLH-20。
进一步的，所述高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为C18反相柱，柱温为30℃，流动相为1%甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；梯度洗脱条件为：0～5min，30%甲醇；5～10min，30%~40%甲醇；10～20min，40%~60%甲醇，进样量为10μL；检测器为紫外检测器。
进一步的，所述洋甘草的超微粉碎部位是洋甘草的干燥根和根茎。
结合上述条件，一种具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的漆黄素的制备方法，包括如下步骤：
（1）将洋甘草的干燥根和根茎进行超微粉碎，过筛，得到粒径为500~1000目的粉末；
（2）将步骤（1）得到的粉末按料液比1：10~1：20浸泡于浓度为70~85%的乙醇中，常温静置1~2小时，然后超声辅助提取，过滤收集滤液，重复提取2~3次，合并滤液得到粗提物；
（3）将步骤（2）中得到的粗提物在50～60℃减压浓缩得浸膏，用1~2倍体积水复溶，采用2～3倍体积有机溶剂萃取，分离得萃取液，重复萃取2~3次，合并得萃取液；
（4）将步骤（3）中得到的萃取液先用大孔树脂粗分，再通过葡聚糖凝胶柱细分级，最后经高效液相色谱纯化，干燥得到单体漆黄素。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的漆黄素，所述漆黄素具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性。
进一步的，所述漆黄素的纯度为95%以上，其抑制尿酸盐转运蛋白1的IC50为12.77µmol/L。
本发明还提供了所述的漆黄素在用于制备尿酸盐转运蛋白1抑制剂中的应用。
进一步的，所述漆黄素的使用浓度为10μM~150μM。
进一步的，所述漆黄素能够竞争性结合尿酸盐转运蛋白1的活性位点抑制尿酸盐转运蛋白1活性。
本发明还提供了所述的漆黄素在用于制备防治高尿酸血症中的药物和/或保健品中的应用。
进一步的，所述高尿酸血症是由尿酸盐转运蛋白1高表达引起的高尿酸血症。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、本发明以洋甘草为原料，并采用超声辅助提取、大孔树脂柱层析、凝胶柱细分级、高效液相色谱纯化的方法，有针对性且高效的制备了漆黄素，制备方法简单。本发明制备得到的漆黄素纯度高，最高可达98.48%。
2、本发明制备得到的漆黄素具有体外尿酸盐转运蛋白1抑制作用，且活性高，开辟了漆黄素的新用途，使其具有良好的推广和应用价值。
附图说明
图1是漆黄素HPLC图，其中横坐标为保留时间，纵坐标为电信号。
图2 是实施例1~5制备的漆黄素对尿酸盐转运蛋白1的抑制作用，其中横坐标为不同实施例制备的漆黄素，纵坐标为抑制率。
图3 是实施例5制备的漆黄素及苯溴马隆对尿酸盐转运蛋白1的抑制作用，其中横坐标为浓度，纵坐标为抑制率；A为漆黄素，B为苯溴马隆。
图4 是漆黄素与尿酸盐转运蛋白1相互作用模式图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
漆黄素纯度测定：采用液相色谱法测定漆黄素纯度，具体方法如下：色谱条件为：色谱柱为C18反相柱，柱温为30℃；流动相为1%甲酸水溶液-甲醇，流速为1mL/min；梯度洗脱条件为：0～5min，30%甲醇，5～10min，30%~40%甲醇，10～20min，40%~60%甲醇；进样量为10μL；检测器为紫外检测器，检测波长：365nm。将分离纯化的漆黄素按上述色谱条件进行高效液相色谱仪分析，以峰面积归一化法计算漆黄素纯度。
实施例1、从洋甘草中制备漆黄素
取洋甘草的干燥根和根茎5kg进行超微粉碎，过筛，得到粒径为1000目的粉末，将料液比为1：10的70%乙醇加入到粉末中，静置浸泡1 h，预处理完成后以超声功率：100W，温度40℃，时间50分钟为条件进行超声辅助提取，过滤，重复提取2次，合并滤液得到粗提物。将粗提物经旋转蒸发浓缩仪在50℃下减压浓缩制成浸膏，浸膏以2倍体积蒸馏水搅拌溶解，加入3倍体积的乙酸乙酯萃取，分离得萃取液，重复萃取2次，合并得萃取液，在50℃下减压浓缩制成浸膏。进一步采用AB-8型大孔树脂粗分，以8倍柱体积（BV）80%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩制成浸膏，以70%甲醇复溶后再通过葡聚糖凝胶柱（SephadexLH-20）进行细分级，以70%甲醇洗脱，得到洗脱液，再经高效液相色谱化，色谱条件为：色谱柱为C18反相柱，柱温为30℃，流动相为1%甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；梯度洗脱条件为：0～5min，30%甲醇；5～10min，30%~40%甲醇；10～20min，40%~60%甲醇，进样量为10μL；检测器为紫外检测器。收集洗脱液干燥得到漆黄素。
所得漆黄素单体纯度为96.38%，得率为0.45%。
实施例2、从洋甘草中制备漆黄素
取洋甘草的干燥根和根茎5kg进行超微粉碎，过筛，得到粒径为800目的粉末，将料液比为1：12的75%乙醇加入到粉末中，静置浸泡1.5h，预处理完成后以超声功率：120W，温度30℃，时间60分钟为条件进行超声辅助提取，过滤，重复提取3次，合并滤液得到粗提物。将粗提物经旋转蒸发浓缩仪在55℃下减压浓缩制成浸膏，浸膏以1倍体积蒸馏水搅拌溶解，加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，分离得萃取液，重复萃取3次，合并得萃取液，在55℃下减压浓缩制成浸膏。进一步采用SPD100型大孔树脂粗分，以10BV 85%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩制成浸膏，以80%甲醇复溶后再通过葡聚糖凝胶柱进行细分级，以80%甲醇洗脱，得到洗脱液，再经制备型高效液相色谱纯化得到漆黄素，色谱条件为：色谱柱为C18反相柱，柱温为30℃，流动相为1%甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；梯度洗脱条件为：0～5min，30%甲醇；5～10min，30%~40%甲醇；10～20min，40%~60%甲醇，进样量为10μL；检测器为紫外检测器。收集洗脱液干燥得到漆黄素。
所得漆黄素单体纯度为97.34%，得率为0.38%。
实施例3、从洋甘草中制备漆黄素
取洋甘草的干燥根和根茎5kg进行超微粉碎，过筛，得到粒径为500目的粉末，将料液比为1：15的80%乙醇加入到粉末中，静置浸泡1.8h，预处理完成后以超声功率：150W，温度45℃，时间40分钟为条件进行超声辅助提取，过滤，重复提取3次，合并滤液得到粗提物。将粗提物经旋转蒸发浓缩仪在55℃下减压浓缩制成浸膏，浸膏以1.5倍体积蒸馏水搅拌溶解，加入2倍体积的石油醚萃取，取水相再加2倍体积的乙酸乙酯萃取，分离得萃取液，重复萃取2次，合并得萃取液，在55℃下减压浓缩制成浸膏。进一步采用XAD-4型大孔树脂粗分，以10BV 90%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩制成浸膏，以70%甲醇复溶后再通过葡聚糖凝胶柱进行细分级，以70%甲醇洗脱，得到洗脱液，再经制备型高效液相色谱纯化得到漆黄素，色谱条件为：色谱柱为C18反相柱，柱温为30℃，流动相为1%甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；梯度洗脱条件为：0～5min，30%甲醇；5～10min，30%~40%甲醇；10～20min，40%~60%甲醇，进样量为10μL；检测器为紫外检测器。收集洗脱液干燥得到漆黄素。
所得漆黄素单体纯度为98.13%，得率为0.41%。
实施例4、从洋甘草中制备漆黄素
取洋甘草的干燥根和根茎5kg进行超微粉碎，过筛，得到粒径为600目的粉末，将料液比为1：15的85%乙醇加入到粉末中，静置浸泡1.2h，预处理完成后以超声功率：50W，温度50℃，时间45分钟为条件进行超声辅助提取，过滤，重复提取2次，合并滤液得到粗提物。将粗提物经旋转蒸发浓缩仪在60℃下减压浓缩制成浸膏，浸膏以1.2倍体积蒸馏水搅拌溶解，加入2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离得萃取液，重复萃取2次，合并得萃取液，在60℃下减压浓缩制成浸膏。进一步采用XAD-7型大孔树脂粗分，以12BV 70%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩制成浸膏，以60%甲醇复溶后再通过葡聚糖凝胶柱进行细分级，以60%甲醇洗脱，得到洗脱液，再经制备型高效液相色谱纯化得到漆黄素，色谱条件为：色谱柱为C18反相柱，柱温为30℃，流动相为1%甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；梯度洗脱条件为：0～5min，30%甲醇；5～10min，30%~40%甲醇；10～20min，40%~60%甲醇，进样量为10μL；检测器为紫外检测器。收集洗脱液干燥得到漆黄素。
所得漆黄素单体纯度为97.47%，得率为0.36%。
实施例5、从洋甘草中制备漆黄素
取洋甘草的干燥根和根茎5kg进行超微粉碎，过筛，得到粒径为700目的粉末，将料液比为1：20的85%乙醇加入到粉末中，静置浸泡2h，预处理完成后以超声功率：80W，温度35℃，时间55分钟为条件进行超声辅助提取，过滤，重复提取3次，合并滤液得到粗提物。将粗提物经旋转蒸发浓缩仪在60℃下减压浓缩制成浸膏，浸膏以1.8倍体积蒸馏水搅拌溶解，加入3倍体积的石油醚萃取，取水相再加3倍体积的乙酸乙酯萃取，分离得萃取液，重复萃取3次，合并得萃取液，在60℃下减压浓缩制成浸膏。进一步采用HPD100型大孔树脂粗分，以10BV 90%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩制成浸膏，以70%甲醇复溶后再通过葡聚糖凝胶柱进行细分级，以70%甲醇洗脱，得到洗脱液，再经制备型高效液相色谱纯化得到漆黄素，色谱条件为：色谱柱为C18反相柱，柱温为30℃，流动相为1%甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；梯度洗脱条件为：0～5min，30%甲醇；5～10min，30%~40%甲醇；10～20min，40%~60%甲醇，进样量为10μL；检测器为紫外检测器。收集洗脱液干燥得到漆黄素。
所得漆黄素单体纯度为98.48%，得率为0.48%。漆黄素HPLC图见图1。
实施例6、不同提取纯化条件对制备漆黄素的影响
取洋甘草的干燥根和根茎2 kg进行超微粉碎，过筛，得到粒径为800目的粉末，将料液比为1：15的75%乙醇加入到粉末中，静置浸泡1.5 h，预处理完成后以超声功率：100W，40℃，时间50分钟为条件进行超声辅助提取，过滤，重复提取2次，合并滤液得到粗提物。将粗提物经旋转蒸发浓缩仪在50~60℃下减压浓缩制成浸膏，浸膏以2倍体积蒸馏水搅拌溶解，加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，分离得萃取液，重复萃取2次，合并得萃取液，在55℃下减压浓缩制成浸膏。采用HPD型大孔树脂粗分，以8倍柱体积（BV）的90%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩制成浸膏，以70%甲醇复溶后，再通过葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20进行细分级，以70%甲醇洗脱，得到洗脱液，洗脱液浓缩后再经制备型高效液相色谱纯化，色谱条件为：色谱柱为C18反相柱，柱温为30℃，流动相为1%甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；梯度洗脱条件为：0～5min，30%甲醇；5～10min，30%~40%甲醇；10～20min，40%~60%甲醇，进样量为10μL；检测器为紫外检测器。收集洗脱液干燥得到漆黄素。计算漆黄素提取率，检测漆黄素纯度。
（1）超声功率对制备漆黄素的影响
在上述基本工艺的基础上，分别采用超声功率0W，50W，100W，150W，200W，250W，300W，其它工艺条件不变，研究不同超声功率对制备漆黄素的影响。
结果如表1，当采用超声功率150W时，漆黄素的提取率和纯度最高。
表1：不同超声功率对制备漆黄素的影响
| 超声功率/W | 0 | 50 | 100 | 150 | 200 | 250 | 300 |
| 提取率/% | 0.26 | 0.35 | 0.44 | 0.45 | 0.44 | 0.36 | 0.33 |
| 漆黄素纯度/% | 73.1 | 95.1 | 96.3 | 97.8 | 91.3 | 85.3 | 72.4 |
（2）超声提取温度对制备漆黄素的影响
在上述基本工艺的基础上，分别采用超声提取温度20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，其它工艺条件不变，研究不同超声温度对制备漆黄素的影响。
结果如表2，当采用超声提取温度为40℃时，漆黄素的提取率和纯度最高。
表2：不同温度对制备漆黄素的影响
| 温度/℃ | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 |
| 提取率/% | 0.17 | 0.28 | 0.41 | 0.45 | 0.42 | 0.39 | 0.31 |
| 漆黄素纯度/% | 65.0 | 76.3 | 95.7 | 98.1 | 97.2 | 90.3 | 77.5 |
（3）大孔树脂乙醇洗脱浓度对制备漆黄素的影响
在上述基本工艺的基础上，分别采用8倍柱体积，浓度为50%，60%，70%，80%，90%，99.8%的乙醇溶液洗脱HPD型大孔树脂，其它工艺条件不变，研究不同乙醇洗脱浓度对制备漆黄素的影响。
结果如表3：当采用大孔树脂乙醇洗脱浓度为90%时，漆黄素的提取率和纯度最高。
表3：不同乙醇洗脱浓度对制备漆黄素的影响
| 乙醇浓度/% | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 99.8 |
| 提取率/% | 0.35 | 0.38 | 0.40 | 0.42 | 0.44 | 0.24 |
| 漆黄素纯度/% | 76.3 | 84..5 | 95.1 | 96.2 | 98.1 | 60.2 |
（4）凝胶柱甲醇洗脱浓度对制备漆黄素的影响
在上述基本工艺的基础上，分别采用浓度为50%，60%，70%，80%，90%的甲醇溶液洗脱葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20，其它工艺条件不变，研究不同甲醇洗脱浓度对制备漆黄素的影响。
结果如表3：当采用凝胶柱甲醇洗脱浓度为70%时，漆黄素的提取率和纯度最高。
表4：不同甲醇洗脱浓度对制备漆黄素的影响
| 乙醇浓度/% | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 |
| 提取率/% | 0.32 | 0.38 | 0.43 | 0.41 | 0.35 |
| 漆黄素纯度/% | 72.8 | 95.3 | 97.1 | 96.7 | 86.3 |
实施例7、漆黄素对尿酸盐转运蛋白1抑制活性
在本实施例中，采用以下步骤测定漆黄素对尿酸盐转运蛋白1吸收6-羧基荧光素（6-CFL）的抑制活性：
（1）HEK-293T细胞以DMEM为培养基，培养基中包含10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100IU/mL）和链霉素（100μg/mL）。细胞转染采用胰酶常规消化收集细胞，用DMEM培养基将293T细胞种于10cm培养皿中，待细胞贴壁且密度达到60-70%左右时，通过Lipofectamine3000试剂盒进行转染，10cm皿中转染10µg质粒。
（2）用0.25%胰酶将转染pcDNA3.1-EGFP-SLC22A12质粒和未转染的293T细胞从10cm皿中消化下来，制备成约4×104 cells/well的细胞悬液，每孔100μL加入到96孔白色荧光板中，设置实验组，对照组和空白组，每组分别设6个复孔。
（3）48h后，吸走孔内旧的培养基，用HBSS（无Cl-）溶液每孔100μL清洗一次，洗完之后再加入每孔100μL的HBSS溶液，放入培养箱孵育10min。
（4）孵育期间，进行溶液配制。实验组：用HBSS溶液配制239.5μmol/L的6-CFL，用6-CFL溶液配制相应浓度的待测化合物或苯溴马隆，每孔体系为100μL，超声10min保证化合物溶解均一；对照组：加入6-CFL且不含待测化合物，每孔加入100μL。
（5）培养箱孵育10min后，吸走HBSS溶液，分别加入各组配制好的相应溶液，然后放置培养箱内孵育1h。
（6）1h后，吸走孵育溶液，每孔加入37℃水浴锅恒温处理的100μL PBS溶液洗涤，共3次。每孔加入100μL 0.1mol/L的NaOH溶液，室温裂解30min，在酶标仪中震荡5min后，在激发和发射光分别为490nm和525nm的条件下进行读数。按照如下公式计算抑制率。
抑制率=（对照组-实验组）/（对照组-空白组）× 100%
（7）梯度稀释漆黄素及苯溴马隆溶液，以HBSS作为空白对照，按上述方法测定样品对细胞中尿酸盐转运蛋白1吸收6-CFL的抑制率，计算IC50值。
分别对实施例1~5中制备得到的漆黄素的尿酸盐转运蛋白1抑制活性进行测定。结果如图2所示，实施例1~5制备得到的漆黄素均能够显著地抑制6-CFL的吸收，且实施例5中制备的漆黄素具有最高的抑制率、纯度和最强的活性。
进而对苯溴马隆、实施例5制备的漆黄素进行IC50测定。结果如图3所示，苯溴马隆、实施例5制备的漆黄素的IC50分别为3.33和12.77 µM。由此说明，漆黄素具有作为先导化合物或原料进一步开发具有抑制尿酸盐转运蛋白1抑制活性的药品、特殊医学用途配方食品、保健食品的潜力。
实施例8、漆黄素与尿酸盐转运蛋白1的作用机制研究
采用分子对接方法研究本发明制备的漆黄素与尿酸盐转运蛋白1的相互作用关系与作用机制，漆黄素与尿酸盐转运蛋白的相互关系图见图4，分子对接结果表明，漆黄素与尿酸盐转运蛋白1的对接打分为-9.19 kcal/mol，表明漆黄素与尿酸盐转运蛋白1具有高度结合亲和力；相互作用关系分析表明漆黄素能够与尿酸盐转运蛋白1的关键活性位点产生相互作用，包括与Phe364、Phe365形成的π-π堆积相互作用，与Arg477形成的氢键相互作用，与Tyr152、Phe360形成的疏水相互作用，上述相互作用表明漆黄素可以与底物竞争性结合尿酸盐转运蛋白1的活性位点，抑制尿酸盐转运蛋白1活性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所表述的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性的漆黄素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将洋甘草进行超微粉碎，过筛，得到超细粉末；
（2）将步骤（1）的超细粉末浸泡于乙醇中，超声辅助提取，过滤收集滤液，重复提取过滤，合并滤液得到粗提物；
（3）将步骤（2）中的粗提物减压浓缩得到浸膏，所述浸膏用水复溶后，用有机溶剂萃取，分离得到萃取液，重复萃取并合并萃取液；
（4）将步骤（3）中的萃取液经由大孔树脂粗分、层析柱细分级、高效液相色谱纯化后，干燥得到漆黄素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中超细粉末的粒径为500目~1000目。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中超细粉末与乙醇的料液比为1：10~1：20；所述乙醇的浓度为70%~85%；所述超细粉末浸泡于乙醇中，常温静置1~2小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中超声辅助提取条件为：超声功率：50W~150W，温度30℃~50℃，时间40~60分钟。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中减压浓缩的温度为50℃～60℃；在浸膏复溶时，水的体积是浸膏体积的1~2倍，复溶后得到复溶液；在有机溶剂萃取时，有机溶剂的体积是复溶液的2～3倍；所述有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂包括AB-8、SPD100、HPD100、XAD-4、XAD-7大孔树脂，其洗脱剂为70%~90%的乙醇溶液；所述层析柱为葡聚糖凝胶柱，其洗脱剂为60~80%甲醇溶液；所述高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为C18反相柱，柱温为30℃，流动相为1%甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；梯度洗脱条件为：0～5min，30%甲醇；5～10min，30%~40%甲醇；10～20min，40%~60%甲醇，进样量为10μL；检测器为紫外检测器。
7.权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的漆黄素，其特征在于，所述漆黄素具有尿酸盐转运蛋白1抑制活性。
8.权利要求7所述的漆黄素在用于制备尿酸盐转运蛋白1抑制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述漆黄素的使用浓度为10μM~150μM。
10.权利要求7所述的漆黄素在用于制备防治高尿酸血症中的药物和/或保健品中的应用。
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