CN106242959B - 一种虎杖生物活性成分的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虎杖生物活性成分的提取方法，该方法包括如下步骤：称取虎杖，粉碎，过18‑22目筛，投入到回流罐中；加入虎杖重量6‑10倍的75‑85％的酒精，在55‑65℃温度下回流2.5‑3.5小时；在回流液体中加入饱和硫酸铵至产生沉淀，过滤除去沉淀；回收酒精，得到醇提液；浓缩得到浓缩浸膏；水沉取上清液；再浓缩得到浓缩浸膏；再醇溶取上清液；将上清液用磺化聚醚砜(SPES)平板超滤，收集沉淀和上清液；分离纯化大黄素，其纯度为99.8％；对上清液用大孔树脂吸附；分离纯化虎杖甙，其纯为99.5％以上；分离纯化白藜芦醇，其纯度为99.2以上％。本发明方法所采用设备简单，工艺简单可行，便于工业化生产，所用溶剂无毒无残留，不产生环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及中医药技术领域，更具体涉及一种虎杖生物活性成分的提取方法。
背景技术
虎杖是一种传统中药，味微苦、涩、性微寒，归肝、胆、肺经，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰的功效，主治关节痹痛、湿热黄疸经闭等多种疾病；经现代药化、药理学研究虎杖含有大量的生物活性成分，主要有芪三酚类(虎杖甙及白藜芦醇)、蒽醌类(大黄素等)。
白藜芦醇是一种活性多酚类化合物，具有很强的抗氧化、延缓衰老、清除自由基的作用，对癌变及细胞组织变异具有很强的抑制作用，是紫杉醇后又一绿色抗癌防癌活性物质。而且白藜芦醇具有预防动脉硬化、冠心病及清除血液、肝脏脂肪的作用；虎杖甙是白藜芦醇的配糖化合物，虎杖甙可以在生物酶的作用下水解为白藜芦醇和葡萄糖分子，在虎杖植物内主要以更加稳定的虎杖甙形式存在于虎杖细胞内，一般虎杖甙含量是游离虎杖甙元的两倍多，虎杖甙具有强心作用、改善微循环、抑制过氧化物在血管和肝脏堆积而起到护肝和保护血管作用等等；大黄素是虎杖的代表性鉴别物质，具有显著的抗菌活性、有强力泻下作用而改善便秘症状、还有降血压、护肝、改善微循环的作用等等；所以虎杖是一种利用价值很高的中药材，很值得大力开发利用。
我国地区海拔2500米以下的阴暗潮湿之地都是虎杖的分布区域，从南到北广泛分布，以湖南湖北为主产区，而且质量最优，而且大量野生虎杖资源自生自灭从未加以利用，而且虎杖采集方便成片生长，在我国有开发的广阔前景。
虎杖作为传统中药，我国很早就有比较充分的认识，经过几十年现代药化药理研究，特别是虎杖提取物研究开发以来，首先从虎杖提取物以大黄素为标志性成分到目前经发酵提取白藜芦醇到现在分离提纯虎杖甙再发酵制备白藜芦醇等，但是到目前为止还没有综合利用纯化的工艺。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题就是如何综合利用虎杖，而提供一种虎杖生物活性成分的提取方法。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种虎杖生物活性成分的提取方法(所用原料均市购得到)，该方法包括如下步骤：
步骤一：准备：称取虎杖，粉碎，过18-22目筛，投入到回流罐中；
步骤二：回流：加入虎杖重量6-10倍的75-85％的酒精，用1％KOH溶液调节pH值为8.5-9.5，在55-65℃温度下回流2.5-3.5小时；
步骤三：二次回流：加入虎杖重量5-7倍的75-85％的酒精，用1％KOH溶液调节pH值为8.5-9.5，在55-65℃温度下回流1.5-2.5小时；
步骤四：过滤：合并两次回流液体，用HCl中和至pH值为6.5-7.0，加入饱和硫酸铵至产生沉淀，过滤除去沉淀；
步骤五：回收酒精：从滤液中回收酒精至酒精含量为15％以下，得到醇提液；
步骤六：浓缩：将酒精含量为15％以下的醇提液浓缩至比重为1.0-1.5，得到浓缩浸膏；
步骤七：水沉：将浓缩浸膏用4-6倍重量的80-90℃的热水充分搅拌溶解，保温0.5-1.5小时后迅速高速离心过滤，除去水不溶性成分取上清液；
步骤八：再浓缩：将步骤七得到的上清液浓缩至比重为1.0-1.5，得到浓缩浸膏；
步骤九：再醇溶：将步骤八得到的浓缩浸膏用4-6倍重量的浓度75-85％的酒精溶解过夜，高速离心分离醇不溶沉淀，取上清液；
步骤十：超滤：将从骤九得到的上清液中回收酒精至酒精含量小于15％，将上清液用磺化聚醚砜(SPES)平板超滤，收集超滤液，用水稀释超滤液至酒精浓度为50％，看到絮状物，冷冻过夜，收集沉淀和上清液；
步骤十一：分离纯化大黄素：将步骤十得到的沉淀加到5％碳酸钠溶液中，再加入乙醚均匀混合，静置后分为乙醚层和碱液层，取碱液层酸化沉淀，将酸化沉淀物用丙酮重结晶，得到橙色针状结晶大黄素，其纯度为99.8％；
步骤十二：分离上清液：对步骤十得到的上清液用大孔树脂吸附，分别洗脱收集40％酒精溶液的洗脱液和80％酒精溶液的洗脱液；
步骤十三：分离纯化虎杖甙：将步骤十二得到的40％酒精洗脱液蒸发至无酒精味，用5倍纯水稀释，用重量浓度为5％的Na2CO3水溶液调节pH值至8.5-9.5，充分搅拌至完全溶解，然后高速离心过滤得上清液，将该上清液用盐酸酸化至pH 4.5-5.5，过夜冷藏，然后离心分离收集沉淀，对得到的沉淀用冷纯水洗涤4-6次，再用乙醚充分洗涤1-3次，然后将沉淀用该沉淀10倍重量80％的酒精一起加热溶解，冷却后高速离心沉淀得到上清液，将上清液稀释至酒精浓度15％以下，酸化高速离心收集沉淀，对沉淀水洗4-6次，乙醚洗涤1-3次，真空干燥，得到无色针状结晶的虎杖甙，其纯为99.5％以上；
步骤十四：分离纯化白藜芦醇：将步骤十二得到的80％酒精洗脱液蒸发至酒精含量15％以下，5倍重量纯水稀释，用1％的KOH水溶液调节pH至10.5-11.5，完全溶解，然后离心过滤得上清液，将该上清液用盐酸酸化至pH5.0-6.0，冷藏过夜，收集沉淀，对沉淀用纯水洗涤4-6次，乙醚洗涤1-3次，再用1％的KOH水溶液调节pH至10.5-11.5，搅拌至完全溶解，再用盐酸酸化至pH 5.0-6.0，冷藏过夜沉淀，将所得沉淀用纯水洗涤2次，乙醚洗涤2次，真空干燥，得到白色针状结晶的白藜芦醇，其纯度为99.2％。
优选地，在步骤一中，所述的筛为20目。
优选地，在步骤二和步骤三中，所述的回流温度为60℃。
优选地，在步骤六和步骤八中所述的比重为1.15-1.20。
优选地，在步骤七中：所述的水沉温度为85℃。
优选地，在步骤十二中：所采用的大孔树脂为弱极性D101大孔树脂。
优选地，上述方法包括如下步骤：
步骤一：准备：称取虎杖，粉碎，过20目筛，投入到回流罐中；
步骤二：回流：加入虎杖重量8倍的浓度80％的酒精，用1％KOH溶液调节pH值为9.0，在60℃温度下回流3小时；
步骤三：二次回流：加入虎杖重量6倍的浓度80％的酒精，用1％KOH溶液调节pH值为9.0，在60℃温度下回流2小时；
步骤四：过滤：合并两次回流液体，用HCl中和至pH值为6.5-7.0，加入饱和硫酸铵至产生沉淀，过滤除去沉淀；
步骤五：回收酒精：从滤液中回收酒精至酒精含量为15％以下，得到醇提液；
步骤六：浓缩：将酒精含量为15％以下的醇提液浓缩至比重为1.2，得到浓缩浸膏；
步骤七：水沉：将浓缩浸膏用5倍重量的90℃的热水充分搅拌溶解，保温1.0小时后迅速高速离心过滤，除去水不溶性成分取上清液；
步骤八：再浓缩：将步骤七得到的上清液浓缩至比重为1.2，得到浓缩浸膏；
步骤九：再醇溶：将步骤八得到的浓缩浸膏用5倍重量的重量浓度80％的酒精溶解过夜，高速离心分离醇不溶沉淀，取上清液；
步骤十：超滤：将从步骤九得到的上清液中回收酒精至酒精含量小于15％，将上清液用磺化聚醚砜平板超滤，收集超滤液，用水稀释超滤液至酒精浓度为50％，看到絮状物，冷冻过夜，收集沉淀和上清液；
步骤十一：分离纯化大黄素：将步骤十得到的沉淀加到5％碳酸钠溶液中，再加入乙醚均匀混合，静置后分为乙醚层和碱液层，取碱液层酸化沉淀，将酸化沉淀物用丙酮重结晶，得到橙色针状结晶大黄素，其纯度为99.8％；
步骤十二：分离上清液：对步骤十得到的上清液用弱极性D101大孔树脂吸附，分别洗脱收集40％酒精溶液的洗脱液和80％酒精溶液的洗脱液；
步骤十三：分离纯化虎杖甙：将步骤十二得到的40％酒精洗脱液蒸发至酒精含量15％以下，用5倍纯水稀释，用5％的Na2CO3水溶液调节pH值至9.0，充分搅拌至完全溶解，然后高速离心过滤得上清液，将该上清液用盐酸酸化至pH5.0，过夜冷藏，然后离心分离收集沉淀，对得到的沉淀用冷纯水洗涤5次，再用乙醚充分洗涤2次，然后将沉淀用10倍重量80％的酒精加热溶解，冷却后高速离心沉淀得到上清液，将上清液稀释至酒精浓度为15％以下，酸化高速离心收集沉淀，对沉淀水洗5次，乙醚洗涤2次，真空干燥，得到无色针状结晶的虎杖甙，其纯为99.5％以上；
步骤十四：分离纯化白藜芦醇：将步骤十二得到的80％酒精洗脱液蒸发至酒精含量15％以下，5倍纯水稀释，用1％的KOH水溶液调节pH至11.0，完全溶解，然后离心过滤得上清液，将该上清液用盐酸酸化至pH5.5，冷藏过夜，收集沉淀，对沉淀用纯水洗涤5次，乙醚洗涤2次，再用1％的KOH水溶液调节pH至11.0，搅拌至完全溶解，再用盐酸酸化至pH5.5，冷藏过夜沉淀，将所得沉淀用纯水洗涤2次，乙醚洗涤2次，真空干燥，得到白色针状结晶的白藜芦醇，其纯度为99.2％。
(三)有益效果
本发明方法所采用设备简单，工艺简单可行，便于工业化生产；所用溶剂无毒无残留，不产生环境污染，后期洗涤结晶用的有机溶剂使用量小；本发明虎杖综合利用高，所得回收率都在95％以上，所得大黄素、虎杖甙、白藜芦醇纯度很高，可直接用于药品工业。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
本发明所使用的溶剂、KOH、HCl、Na2SO4、乙醚、丙酮均为食用级或者分析纯，不得使用工业级。
实施例1：
本实施例提取虎杖生物活性成分方法的步骤如下：
1，取虎杖(干)500KG，(HPLC检测含有大黄素0.61％、虎杖甙2.47％、白藜芦醇0.72％)，粉碎过20目筛，投入回流提取罐；
2)第一次回流提取：4000公斤80％酒精，1％KOH调节PH至9.0，温度控制在60度，回流3小时；
3)第二次回流：3000公斤80％酒精，1％KOH调节PH至9.0，温度控制在60度，回流2小时；
4)合并回流液并中和：合并两次回流液体，用HCl中和至pH6.5-7.0，加入饱和硫酸铵，过滤除去沉淀；
5)酒精回收：过滤后的提取液回收酒精至酒精含量15％以下得回收液2700公斤；
6)浓缩：对回收酒精含量15％以下的醇提液浓缩至比重1.2得浓缩浸膏126公斤；
7)水沉：浓缩的浸膏用620公斤的90度热水充分搅拌溶解，保温一小时后迅速高速离心过滤，除去水不溶性成分取上清液596公斤；
8)再浓缩：步骤7)之上清液浓缩至比重1.2得浸膏74公斤；
9)再醇溶：步骤8)的浓缩浸膏用370公斤80％酒精溶解过夜，高速离心分离醇不溶沉淀，取上清液421公斤；
10)超滤：步骤9)之上清液回收酒精至酒精含量小于15％，该上清液用SPES平板超滤，收集超滤液，用水稀释超滤液至酒精浓度为50％，看到絮状物，冷库冷冻过夜，收集沉淀(1)3.6公斤和上清液(11)97公斤；
11)沉淀(1)的分离纯化：沉淀(1)进行分离纯化，大黄素和别的醌类化合物不一样，大黄素可以溶于5％碳酸钠溶液，加入乙醚混合，除去杂质游离杂质醌，静置后乙醚层和碱液层分开，取碱液层酸化沉淀(沉淀2)，取酸化沉淀物用丙酮重结晶，可得橙色针状结晶大黄素纯品2.61公斤，经分析可达99.8％。
12)上清液(11)的分离：对上清液(11)用大孔树脂吸附虎杖甙及甙元后，收集40％酒精溶液的洗脱液(22)和80％酒精溶液洗脱液(33)，甙元极性较小都收集在80％洗脱液(33)中，虎杖甙极性较大洗脱较慢都收集在40％酒精洗脱液(22)中。
13)步骤12)所得40％洗脱液(22)的分离纯化：40％洗脱液(22)蒸发酒精至含酒精15％以下，用5倍纯水稀释，用5％Na2CO3调节pH至9.0完全溶解充分搅拌后高速离心过滤得上清液(221)，上清液用盐酸酸化至pH5.0过夜冷藏后离心分离收集沉淀(222)，对沉淀(222)用冷纯水洗涤5次，用乙醚充分洗涤2次得沉淀(223)，对沉淀(223)用10倍80％加热溶解，冷却高速离心沉淀得上清液，稀释上清液酒精至酒精浓度15％以下酸化高速离心收集沉淀得沉淀(224),对沉淀水洗5次，乙醚洗涤2次真空干燥得到无色针状结晶的10.70公斤虎杖甙纯品(99.5％)；
14)步骤12)所得80％洗脱液(33)分离纯化：80％酒精洗脱液(33)蒸发酒精至酒精含量15％以下，5倍纯水稀释，用1％KOH调节pH至11.0完全溶解离心过滤得上清液(331)，对上清液(331)用盐酸酸化至pH5.5，沉淀冷藏过夜收集沉淀(332)用纯水洗涤5次乙醚充分洗涤2次得沉淀(333)，沉淀(333)再用5倍纯水及1％KOH调节pH至11.0，搅拌溶解至完全溶解，再用盐酸酸化pH5.5冷藏过夜沉淀所得沉淀用纯水洗涤2次，乙醚洗涤两次，真空干燥得白色针状结晶为3.36公斤白藜芦醇纯品(99.2％)。
实施例2：
本实施例提取虎杖生物活性成分方法的步骤如下：
1，取虎杖(干)500KG，(HPLC检测含有大黄素0.63％、虎杖甙2.41％、白藜芦醇0.75％)，粉碎过20目筛，投入回流提取罐；
2)第一次回流提取：4000公斤80％酒精1％KOH调节pH9.0，温度控制在60度回流3小时；
3)第二次回流：3000公斤80％酒精，1％KOH调节pH9.0，温度控制在60度，回流2小时；
4)合并回流液并中和：合并两次回流液体，用HCl中和至pH6.5-7.0，加入饱和硫酸铵，过滤除去沉淀；
5)酒精回收：过滤后的提取液回收酒精至酒精含量15％以下得回收液2810公斤；
6)浓缩：对回收酒精含量15％以下至醇提液浓缩至比重1.2得浓缩浸膏131公斤；
7)水沉：浓缩的浸膏用650公斤的90度热水充分搅拌溶解，保温一小时后迅速高速离心过滤，除去水不溶性成分取上清液670公斤；
8)再浓缩：步骤7)之上清液浓缩至比重1.2得浸膏82公斤；
9)再醇溶：步骤8)的浓缩浸膏用410公斤80％酒精溶解过夜，高速离心分离醇不溶沉淀，取上清液430公斤；
10)超滤：步骤9)之上清液回收酒精至酒精含量小于15％，该上清液用SPES平板超滤，收集超滤液，用水稀释超滤液至酒精度为50％，看到絮状物，冷库冷冻过夜，收集沉淀(1)4.1公斤和上清液(11)101公斤；
11)沉淀(1)的分离纯化：沉淀(1)进行分离纯化，大黄素和别的醌类化合物不一样，大黄素可以溶于5％碳酸钠溶液，加入乙醚混合，除去杂质游离杂质醌，静置后乙醚层和碱液层分开，取碱液层酸化沉淀(沉淀2)，取酸化沉淀物用丙酮重结晶，可得橙色针状结晶大黄素纯品2.78公斤，经分析可达99.6％。
12)上清液(11)的分离：对上清液(11)用大孔树脂吸附虎杖甙及甙元后，收集40％酒精溶液的洗脱液(22)和80％酒精溶液洗脱液(33)，甙元极性较小都收集在80％洗脱液(33)中，虎杖甙极性较大洗脱较慢都收集在40％酒精洗脱液(22)中。
13)步骤12)所得40％洗脱液(22)的分离纯化：40％洗脱液(22)蒸发酒精至含酒精含量15％以下，用5倍纯水稀释，用5％Na2CO3调节pH至9.0完全溶解充分搅拌后高速离心过滤得上清液(221)，上清液用盐酸酸化至pH5.0过夜冷藏后离心分离收集沉淀(222)，对沉淀(222)用冷纯水洗涤5次，用乙醚充分洗涤2次得沉淀(223)，对沉淀(223)用10倍80％加热溶解，冷却高速离心沉淀得上清液，上清液酒精稀释至酒精浓度15％以下酸化高速离心收集沉淀得沉淀(224),对沉淀水洗5次，乙醚洗涤2次真空干燥得到无色针状结晶的9.96公斤虎杖甙纯品(99.6％)；
14)步骤12)所得80％洗脱液(33)分离纯化：80％酒精洗脱液(33)蒸发酒精至酒精含量15％以下，5倍纯水稀释，用KOH调节pH至11.0完全溶解离心过滤得上清液(331)，对上清液(331)用盐酸酸化至pH5.5，沉淀冷藏过夜收集沉淀(332)用纯水洗涤5次乙醚充分洗涤2次得沉淀(333)，沉淀(333)再用5倍纯水，1％KOH调节pH至11.0，搅拌溶解至完全溶解，再用盐酸酸化pH5.5冷藏过夜沉淀所得沉淀用纯水洗涤2次，乙醚洗涤两次，真空干燥得白色针状结晶为3.44公斤白藜芦醇纯品(99.5％)。
实施例3:
本实施例提取虎杖生物活性成分方法的步骤如下：
1，取虎杖(干)500KG，(HPLC检测含有大黄素0.60％、虎杖甙2.44％、白藜芦醇0.69％)，粉碎过20目筛，投入回流提取罐；
2)第一次回流提取：4000公斤80％酒精1％KOH调节PH9.0，温度控制在60度回流3小时；
3)第二次回流：3000公斤80％酒精，1％KOH调节PH至9.0，温度控制在60度，回流2小时；
4)合并回流液并中和：合并两次回流液体，用HCl中和至pH6.5-7.0，加入饱和硫酸铵，过滤除去沉淀；
5)酒精回收：过滤后的提取液回收酒精至酒精含量15％以下得回收液2600公斤；
6)浓缩：对回收酒精含量15％以下至醇提液浓缩至比重1.2得浓缩浸膏120公斤；
7)水沉：浓缩的浸膏用600公斤的90度热水充分搅拌溶解，保温一小时后迅速高速离心过滤，除去水不溶性成分取上清液550公斤；
8)再浓缩：步骤7)之上清液浓缩至比重1.2得浸膏69公斤；
9)再醇溶：步骤8)的浓缩浸膏用370公斤80％酒精溶解过夜，高速离心分离醇不溶沉淀，取上清液408公斤；
10)超滤：步骤9)之上清液回收酒精至酒精含量小于15％，该上清液用SPES平板超滤，收集超滤液，用水稀释超滤液至酒精度为50％，看到絮状物，冷库冷冻过夜，收集沉淀(1)3.5公斤和上清液(11)96公斤；
11)沉淀(1)的分离纯化：沉淀(1)进行分离纯化，大黄素和别的醌类化合物不一样，大黄素可以溶于5％碳酸钠溶液，加入乙醚混合，除去杂质游离杂质醌，静置后乙醚层和碱液层分开，取碱液层酸化沉淀(沉淀2)，取酸化沉淀物用丙酮重结晶，可得橙色针状结晶大黄素纯品2.59公斤，经分析可达99.8％。
12)上清液(11)的分离：对上清液(11)用大孔树脂吸附虎杖甙及甙元后，收集40％酒精溶液的洗脱液(22)和80％酒精溶液洗脱液(33)，甙元极性较小都收集在80％洗脱液(33)中，虎杖甙极性较大洗脱较慢都收集在40％酒精洗脱液(22)中。
13)步骤12)所得40％洗脱液(22)的分离纯化：40％洗脱液(22)蒸发酒精至含酒精含量15％以下，用5倍纯水稀释，用5％Na2CO3调节pH至9.0完全溶解充分搅拌后高速离心过滤得上清液(221)，上清液用盐酸酸化至p5.0过夜冷藏后离心分离收集沉淀(222)，对沉淀(222)用冷纯水洗涤5次，用乙醚充分洗涤2次得沉淀(223)，对沉淀(223)用10倍80％加热溶解，冷却高速离心沉淀得上清液，上清液酒精稀释至酒精浓度15％以下酸化高速离心收集沉淀得沉淀(224),对沉淀水洗5次，乙醚洗涤2次真空干燥得到无色针状结晶的9.77公斤虎杖甙纯品(99.6％)；
14)步骤12)所得80％洗脱液(33)分离纯化：80％酒精洗脱液(33)蒸发酒精至酒精含量15％以下，5倍纯水稀释，用KOH调节PH至11.0完全溶解离心过滤得上清液(331)，对上清液(331)用盐酸酸化至pH5.5，沉淀冷藏过夜收集沉淀(332)用纯水洗涤5次乙醚充分洗涤2次得沉淀(333)，沉淀(333)再用5倍纯水，1％KOH调节pH至11.0，搅拌溶解至完全溶解，再用盐酸酸化pH5.5冷藏过夜沉淀所得沉淀用纯水洗涤2次，乙醚洗涤两次，真空干燥得白色针状结晶为3.18公斤白藜芦醇纯品(99.5％)。
对比例1:
采用的虎杖甙的提取纯化工艺为：虎杖打细粉，80％酒精40度回流提取2次，每次3小时，得初提物，对初提物用聚酰胺富集、氧化铝除杂、活性炭脱色、结晶得98％虎杖甙1.26％。
具体工艺为：500公斤虎杖粗粉，用10倍80％酒精在40度温度下回流2次，每次3小时，合并两次回流酒精液体1650公斤，真空浓缩至无酒精味道得浓缩液170公斤，加入750公斤纯水充分搅拌，然后高速离心分离沉淀得上清液640公斤，过大孔树脂后，先用纯水将杂质洗至树脂无色，再用70％酒精洗脱，收集洗脱液，浓缩至比重1.2得到虎杖甙粗提物浸膏20.11公斤，浸膏用3倍90％酒精充分搅拌溶解过中性氧化铝柱层析，收集90％酒精洗脱液得洗脱液得洗脱液66.8公斤，66.8公斤洗脱液用活性炭脱色得清亮液体49.6公斤，回收酒精浓缩至无酒精味道浸膏22.36公斤，加入50％乙醇加热充分溶解，冷却，冷库过夜，高速离心分离结晶得沉淀6.29公斤虎杖甙。该方法过程多，过程中吸附材料使用也多，得率较低。
对比例2：
采用的分离提纯工艺为传统发酵法：对虎杖粗粉加入4倍水和40/1000的纤维素酶35-40度PH7.5左右发酵48小时然后溶剂法提取白藜芦醇、大黄素及虎杖甙，然后分离纯化。
具体工艺为：500公斤虎杖粗粉加入2000公斤纯水用碳酸钠调节PH至7.2加入20公斤纤维素酶(酶先与水充分搅拌再加入虎杖粗粉混合均匀，35-40度发酵48小时，加如90％酒精大约6000公斤，让酒精度达到至少75％以上不要高于80％，60度回流3小时提取2次，合并滤液并浓缩至无酒精味道加入调节好PH9.0的纯水充分溶解高速离心沉淀，除去沉淀得上清液，过大孔树脂，收集洗脱液30％酒精洗脱液为大黄素、50％酒精洗脱液为虎杖甙、80％洗脱液为白藜芦醇，三个洗脱液用酒精结晶，分别得到大黄素3.26公斤，白藜芦醇12.7公斤、虎杖甙1.1公斤。结果显示该方法与本申请方法比较收得率明显偏低，经分析产品纯度与本申请方法相差明显，所使用大孔树脂投资较大，不利于推广。
实验例1：大黄素、虎杖甙、白藜芦醇含量测定(范玲、严冬等南京中医药科大学，中国实验方剂学杂志2013年4月)
1，仪器试剂
Waters 2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站(Waters公司)，Agilent1100高效液相色谱系统，Agilent 1260高效液相色谱系统，AgilentChemStation工作站；Agilent Eclipse C 18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，Agilent Extend C 18(4.6mm×250mm，5μm)，Hedera C 18(4.6mm×250mm，5μm)，Sunfire C 18(4.6mm×250mm，5μm)，Hypersil C 18
(4.6mm×250mm，5μm)、Discovery C 18(4.6mm×250mm，5μm)，BP-211D型电子分析天平(德国赛多利斯公司)，KQ-1000型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。虎杖苷(批号110509，含量＞98％)，白藜芦醇(批号110609，含量＞98％)两者均购自四川维克奇生物科技有限公司。大黄素(批号100756-200211，含量＞98％)购自中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
2，原理：
某一典型组分(有对照品供应者)为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子，通过校正因子计算其他组分的含量fkm＝fk/fm＝W k×A m/W m×A k(1)A k为内标物峰面积，W k为内标物浓度；A m为其他组分m峰面积，W m为其他组分m浓度。
3，色谱条件
色谱条件Hypercil-C 18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)(洗脱程序见表1)，柱温30℃，流速1.0mL·min－1，检测波长采用306nm，280nm程序控制改变波长；理论塔板数以大黄素计不低于3 000，上述色谱条件下，各组分分离度良好。
4，对照样品制备
对照品溶液制备取虎杖苷、白藜芦醇、大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度分别为64.50，11.34，26.75，7.74mg·L－1的混合对照品溶液。
5，供试样品制备
供试品溶液的制备取虎杖饮片粉末(过80目筛)0.1g，精密称定，置于100mL锥形瓶，精密加入25mL甲醇，称重，超声40min，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液。
6，线性关系
线性关系精密吸取上述混合对照品溶液2，3，5，8，10，15，20μL进样分析，以进样量对峰面积积分值进行回归处理，分别得虎杖苷、白藜芦醇、大黄素的回归方程见表2，各标准曲线在线性范围内线性良好。3种有效成分的标准曲线
在线性范围内确定大黄素、虎杖甙、白藜芦醇得含量。
表1：检测结果
| 样品 | 大黄素 | 虎杖甙 | 白藜芦醇 |
| 实施例1 | 99.8％ | 99.5％ | 99.2％ |
| 实施例2 | 99.6％ | 99.6％ | 99.5％ |
| 实施例3 | 99.8％ | 99.6％ | 99.5％ |
| 对比例1 | 98.7％ | ||
| 对比例2 | 93.2％ | 93.7％ | 94.3％ |
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种虎杖生物活性成分的提取方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤一：准备：称取虎杖，粉碎，过18-22目筛，投入到回流罐中；
步骤二：回流：加入虎杖重量6-10倍的75-85％的酒精，用1％的KOH溶液调节pH值为8.5-9.5，在55-65℃温度下回流2.5-3.5小时；
步骤三：二次回流：加入虎杖重量5-7倍的75-85％的酒精，用1％的KOH溶液调节pH值为8.5-9.5，在55-65℃温度下回流1.5-2.5小时；
步骤四：过滤：合并两次回流液体，用HCl中和至pH值为6.5-7.0，加入饱和硫酸铵至产生沉淀，过滤除去沉淀；
步骤五：回收酒精：从滤液中回收酒精至酒精含量为15％以下，得到醇提液；
步骤六：浓缩：将酒精含量为15％以下的醇提液浓缩至比重为1.0-1.5，得到浓缩浸膏；
步骤七：水沉：将浓缩浸膏用4-6倍重量的80-90℃的热水充分搅拌溶解，保温0.5-1.5小时后迅速高速离心过滤，除去水不溶性成分取上清液；
步骤八：再浓缩：将步骤七得到的上清液浓缩至比重为1.0-1.5，得到浓缩浸膏；
步骤九：再醇溶：将步骤八得到的浓缩浸膏用4-6倍重量的75-85％的酒精溶解过夜，高速离心分离醇不溶沉淀，取上清液；
步骤十：超滤：将从骤九得到的上清液中回收酒精至酒精含量小于15％，将上清液用磺化聚醚砜平板超滤，收集超滤液，用水稀释超滤液至酒精浓度为50％，看到絮状物，冷冻过夜，收集沉淀和上清液；
步骤十一：分离纯化大黄素：将步骤十得到的沉淀加到5％碳酸钠溶液中，再加入乙醚均匀混合，静置后分为乙醚层和碱液层，取碱液层酸化沉淀，将酸化沉淀物用丙酮重结晶，得到橙色针状结晶大黄素，其纯度为99.8％；
步骤十二：分离上清液：对步骤十得到的上清液用大孔树脂吸附，分别洗脱收集40％酒精溶液的洗脱液和80％酒精溶液的洗脱液；
步骤十三：分离纯化虎杖甙：将步骤十二得到的40％酒精洗脱液蒸发至无酒精味，用5倍纯水稀释，用5％的Na2CO3水溶液调节pH值至8.5-9.5，充分搅拌至完全溶解，然后高速离心过滤得上清液，将该上清液用盐酸酸化至pH 4.5-5.5，过夜冷藏，然后离心分离收集沉淀，对得到的沉淀用冷纯水洗涤4-6次，再用乙醚充分洗涤1-3次，然后将沉淀用该沉淀10倍重量80％的酒精一起加热溶解，冷却后高速离心沉淀得到上清液，将上清液稀释至酒精含量15％以下，酸化高速离心收集沉淀，对沉淀水洗4-6次，乙醚洗涤1-3次，真空干燥，得到无色针状结晶的虎杖甙，其纯为99.5％以上；
步骤十四：分离纯化白藜芦醇：将步骤十二得到的80％酒精洗脱液蒸发至酒精含量15％以下，5倍重量纯水稀释，用1％的KOH水溶液调节pH至10.5-11.5，完全溶解，然后离心过滤得上清液，将该上清液用盐酸酸化至pH5.0-6.0，冷藏过夜，收集沉淀，对沉淀用纯水洗涤4-6次，乙醚洗涤1-3次，再用1％的KOH水溶液调节pH至10.5-11.5，搅拌至完全溶解，再用盐酸酸化至pH 5.0-6.0，冷藏过夜沉淀，将所得沉淀用纯水洗涤2次，乙醚洗涤2次，真空干燥，得到白色针状结晶的白藜芦醇，其纯度为99.2％。
2.根据权利要求1所述的虎杖生物活性成分的提取方法，其特征在于，在步骤一中，所述的筛为20目。
3.根据权利要求1所述的虎杖生物活性成分的提取方法，其特征在于，在步骤二和步骤三中，所述的回流温度为60℃。
4.根据权利要求1所述的虎杖生物活性成分的提取方法，其特征在于，在步骤六和步骤八中所述的比重为1.15-1.20。
5.根据权利要求1所述的虎杖生物活性成分的提取方法，其特征在于，在步骤七中：所述的水沉温度为85℃。
6.根据权利要求1所述的虎杖生物活性成分的提取方法，其特征在于，在步骤十二中：所采用的大孔树脂为弱极性D101大孔树脂。
7.根据权利要求1-6任一项所述的虎杖生物活性成分的提取方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤一：准备：称取虎杖，粉碎，过20目筛，投入到回流罐中；
步骤二：回流：加入虎杖重量8倍的80％的酒精，用1％的KOH溶液调节pH值为9.0，在60℃温度下回流3小时；
步骤三：二次回流：加入虎杖重量6倍的80％的酒精，用1％的KOH溶液调节pH值为9.0，在60℃温度下回流2小时；
步骤四：过滤：合并两次回流液体，用HCl中和至pH值为6.5-7.0，加入饱和硫酸铵至产生沉淀，过滤除去沉淀；
步骤五：回收酒精：从滤液中回收酒精至酒精含量为15％以下，得到醇提液；
步骤六：浓缩：将酒精含量为15％以下的醇提液浓缩至比重为1.2，得到浓缩浸膏；
步骤七：水沉：将浓缩浸膏用5倍重量的90℃的热水充分搅拌溶解，保温1.0小时后迅速高速离心过滤，除去水不溶性成分取上清液；
步骤八：再浓缩：将步骤七得到的上清液浓缩至比重为1.2，得到浓缩浸膏；
步骤九：再醇溶：将步骤八得到的浓缩浸膏用5倍重量的重量浓度80％的酒精溶解过夜，高速离心分离醇不溶沉淀，取上清液；
步骤十：超滤：将从骤九得到的上清液中回收酒精至酒精含量小于15％，将上清液用磺化聚醚砜平板超滤，收集超滤液，用水稀释超滤液至酒精浓度为50％，看到絮状物，冷冻过夜，收集沉淀和上清液；
步骤十一：分离纯化大黄素：将步骤十得到的沉淀加到浓度5％碳酸钠溶液中，再加入乙醚均匀混合，静置后分为乙醚层和碱液层，取碱液层酸化沉淀，将酸化沉淀物用丙酮重结晶，得到橙色针状结晶大黄素，其纯度为99.8％；
步骤十二：分离上清液：对步骤十得到的上清液用弱极性D101大孔树脂吸附，分别洗脱收集40％酒精溶液的洗脱液和80％酒精溶液的洗脱液；
步骤十三：分离纯化虎杖甙：将步骤十二得到的40％酒精洗脱液蒸发至酒精含量15％以下，用5倍纯水稀释，用5％的Na2CO3水溶液调节pH值至9.0，充分搅拌至完全溶解，然后高速离心过滤得上清液，将该上清液用盐酸酸化至pH5.0，过夜冷藏，然后离心分离收集沉淀，对得到的沉淀用冷纯水洗涤5次，再用乙醚充分洗涤2次，然后将沉淀用10倍重量80％的酒精加热溶解，冷却后高速离心沉淀得到上清液，将上清液稀释至酒精浓度为15％以下，酸化高速离心收集沉淀，对沉淀水洗5次，乙醚洗涤2次，真空干燥，得到无色针状结晶的虎杖甙，其纯为99.5％以上；
步骤十四：分离纯化白藜芦醇：将步骤十二得到的80％酒精洗脱液蒸发至酒精含量15％以下，5倍纯水稀释，用1％的KOH水溶液调节pH至11.0，完全溶解，然后离心过滤得上清液，将该上清液用盐酸酸化至pH5.5，冷藏过夜，收集沉淀，对沉淀用纯水洗涤5次，乙醚洗涤2次，再用1％的KOH水溶液调节pH至11.0，搅拌至完全溶解，再用盐酸酸化至pH5.5，冷藏过夜沉淀，将所得沉淀用纯水洗涤2次，乙醚洗涤2次，真空干燥，得到白色针状结晶的白藜芦醇，其纯度为99.2％。
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