CN103145878B - 一种超低分肝素钠工艺研究 - Google Patents

一种超低分肝素钠工艺研究 Download PDF

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刘乃山
迟培升
夏衬来
陆玉梅
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Abstract

本发明公开了一种超低分肝素钠工艺研究，技术方案是采用分子量8000道尔顿以上的肝素钠精品提纯后，对分子量2000-3000道尔顿、效价10-40U/mg的超低分子肝素钠通过再次回收、精制得到符合药用安全的原料药，在欧洲及美国没有此产品上市，因此，在医药领域属一类新药。

Description

一种超低分肝素钠工艺研究
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及从低效价肝素钠中将蛋白去除，得到超低分子肝素钠。
背景技术
肝素钠是从猪小肠粘膜中提取的一种生化药品，是手术中不可替代的、挽救生命的、市场不能断档的首选药物。自二十世纪四十年代用于临床以来，其应用范围不断扩大，尤其是二十世纪九十年代以来，该产品临床主要用于防止血栓形成，治疗心血管病、血液病、尿毒症等。西方国家已开始研究肝素钠对癌症的防治作用，其新用途不断增加，而超低分子肝素钠是治疗血栓的主要药物，目前世界上还未上市，我公司进行了工艺攻关，已成功解决了治疗的目的，并在临床成功治疗了上百例。
发明内容
本发明提供了一种超低分子肝素钠工艺研究的方法，是为了攻克国内外治疗血栓的疑难杂症，通过产品的逐级沉淀分离杂质而得到的。
在发明的技术方案中，包括如下步骤：
一、提取
1、粗品溶解：
开启水阀，加入一定量饮用水，再将肝素钠粗品(效价在10-20usp/mg)加入到反应罐中，边搅边加，按原料与饮用水1∶(6-7)比例溶解，搅拌5-10小时至全部溶解；
2、酶解：
将上一步溶解液，先用盐酸溶液调PH7.0-8.0，升温至50-55℃之间时加入胃蛋白酶5-10g/亿单位，再加入50g/亿单位胰酶，50-55℃保温4小时；
3、急升温：
将上一步酶解液在1小时内升温至85-90℃，静止10-30分钟，开搅拌，通入循环水降温，待温度降至50-55℃时，用2-6mol/L氢氧化钠溶液调PH10.0-12.0，静止分层20-30小时；
4、底部沉淀的杂质离心：
虹吸上清，用40-100目滤袋过滤，过滤后的溶液分为上清液和下层沉淀，留上清液待沉淀，下层沉淀放离心机离心，离心后留上层离心液；
二、精制
1、第一次沉淀：
待上述上清液和离心液温度降至20-30℃，加入20-30g/L氯化钠，搅拌溶解后，用盐酸将滤液调PH10.0-12.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
2、第一次氧化：弃去上层废乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调PH10.0-12.0，然后加入体积10％双氧水，氧化15小时；
3、第二次沉淀：溶液加入20-30g/L氯化钠，搅拌溶解后，用盐酸溶液调将溶液PH6.0-7.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
4、第二次氧化：弃去上层废乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调PH10.0-12.0，然后加入体积10％双氧水，氧化15小时；
5、第三次沉淀：溶液加入20-30g/L氯化钠，用盐酸溶液将溶液调PH10.0-12.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到45～50％，沉淀15小时；
6、第三次氧化：弃去上层废乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调PH10.0-12.0，然后加入体积10％双氧水，氧化15小时；
7、第四次沉淀：溶液加入20-30g/L氯化钠，搅拌溶解后，用盐酸溶液调将溶液PH6.0-7.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
8、第四次氧化：弃去上层乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调PH10.0-12.0，然后加入体积10双氧水，氧化15小时；
9、溶液加入20-30g/L氯化钠，用盐酸溶液将溶液调PH10.0-12.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
10、将沉淀物用纯化水按2-5L/亿单位溶解后，用孔径0.22-0.3微米滤膜板框机微滤，用乙醇沉淀，使乙醇浓度达75-80％，再加入23-26％的氯化钠溶液，每1升溶液加6-10ml氯化钠溶液，静止沉淀10-12小时；
11、将上层乙醇弃去，加入无水乙醇脱水，边搅边加，使乙醇浓度为97-99％，静止24-30小时，弃去上层乙醇，将不锈钢砂芯棒放在产品中，用真空泵通过管道和过滤瓶把剩余乙醇抽干，待干燥；
10、将抽干的产品均匀放置在不锈钢盘中，放在真空干燥箱中抽真空，用循环水加温，温度35-60℃，烘干70-80小时；
11、包装：将产品取出，称重，使每包装袋5kg，用封口机封口，放在铝桶中待验。
根据权利要求2所述的一种超低分肝素钠工艺研究，其特征在于：第四次沉淀后的溶液进行QA取样化验，测吸光度：260nm＜0.2；400nm＜0.03；分子量2000-3000道尔顿，若不合格，继续重复上面过程，若合格移交下一工序。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一、提取
1、粗品溶解：
开启水阀，加入一定量饮用水，再将肝素钠粗品100Kg(效价在10usp/mg)加入到反应罐中，边搅边加入600L饮用水溶解，搅拌10小时；
2、酶解：
将上一步溶解液，用盐酸溶液调PH8.0，升温至53℃时加入胃蛋白酶100g，再加入500g胰酶，50℃保温4小时；
3、急升温：
将上一步酶解液升温至90℃，静止30分钟，开搅拌，通入循环水降温，待温度降至55℃时，用6mol/L氢氧化钠溶液调PH10.0，静止分层30小时；
4、底部沉淀的杂质离心：
虹吸上清，用40-100目滤袋过滤，过滤后的溶液分为上清液和下层沉淀，留上清液待沉淀，下层沉淀放离心机离心，离心后留上层离心液；
二、精制
1、第一次沉淀：
待上述上清液和离心液温度降至30℃，加入18000g氯化钠，搅拌溶解后，用盐酸将滤液调PH12.0，边搅边加浓度为95％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在达到50％，沉淀15小时；
2、第一次氧化：弃去上层废乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液调PH12.0，然后加入30L双氧水，氧化15小时；
3、第二次沉淀：溶液加入9000g氯化钠，搅拌溶解后，用盐酸溶液调将溶液PH6.0-7.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
4、第二次氧化：弃去上层废乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调PH12.0，然后加入30L双氧水，氧化15小时；
5、第三次沉淀：溶液加入9000g氯化钠，用盐酸溶液将溶液调PH10.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
6、第三次氧化：弃去上层废乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调PH12.0，然后加入30L双氧水，氧化15小时；
7、第四次沉淀：溶液加入9000g/L氯化钠，搅拌溶解后，用盐酸溶液调将溶液PH6.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
8、第四次氧化：弃去上层乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调PH10.0，然后加入30L双氧水，氧化15小时；
9、溶液加入9000g/L氯化钠，用盐酸溶液将溶液调PH10.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
10、将沉淀物用纯化水50L溶解后，用孔径0.22-0.3微米滤膜板框机微滤，用乙醇沉淀，使乙醇浓度达80％，再加入26％的氯化钠溶液500ml，静止沉淀12小时；
11、将上层乙醇弃去，加入无水乙醇脱水，边搅边加，使乙醇浓度为97％，静止24小时，弃去上层乙醇，将不锈钢砂芯棒放在产品中，用真空泵通过管道和过滤瓶把剩余乙醇抽干，待干燥；
10、将抽干的产品均匀放置在不锈钢盘中，放在真空干燥箱中抽真空，用循环水加温，温度35-60℃，烘干70小时；
11、包装：将产品取出，称重，使每包装袋5kg，用封口机封口，放在铝桶中待验。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (1)

1.一种超低分子量肝素钠的制备方法，其特征在于：采用多次氧化和沉淀逐级分离，得到分子量在2000-3000道尔顿，效价在10-40u/mg的超低分子量肝素钠，包括如下步骤：
一、提取
(1)、粗品溶解：
开启水阀，加入一定量饮用水，再将回收的效价在10-20uspu/mg的肝素钠粗品加入到反应罐中，边搅边加，按原料与饮用水1Kg∶(6-7)L重量体积比例溶解，搅拌5-10小时至全部溶解；
(2)、酶解：
将上一步溶解液，先用盐酸溶液调pH7.0-8.0，升温至50-55℃之间时加入胃蛋白酶5-10g/亿单位，再加入50g/亿单位胰酶，50-55℃保温4小时；
(3)、急升温：
将上一步酶解液在1小时内升温至85-90℃，静置10-30分钟，开搅拌，通入循环水降温，待温度降至50-55℃时，用2-6mol/L氢氧化钠溶液调pH10.0-12.0，静置分层20-30小时；
(4)、底部沉淀的杂质离心：
虹吸上清，用40-100目滤袋过滤，过滤后的溶液分为上清液和下层沉淀，留上清液待沉淀，下层沉淀放离心机离心，离心后留上层离心液；
二、精制
(1)、第一次沉淀：
待上述上清液和离心液温度降至20-30℃，加入20-30g/L氯化钠，搅拌溶解后，用盐酸将滤液调pH10.0-12.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
(2)、第一次氧化：弃去上层废乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调pH10.0-12.0，然后加入体积10％双氧水，氧化15小时；
(3)、第二次沉淀：溶液加入20-30g/L氯化钠，搅拌溶解后，用盐酸溶液调将溶液pH6.0-7.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
(4)、第二次氧化：弃去上层废乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调pH10.0-12.0，然后加入体积10％双氧水，氧化15小时；
(5)、第三次沉淀：溶液加入20-30g/L氯化钠，用盐酸溶液将溶液调pH10.0-12.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到45～50％，沉淀15小时；
(6)、第三次氧化：弃去上层废乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调pH10.0-12.0，然后加入体积10％双氧水，氧化15小时；
(7)、第四次沉淀：溶液加入20-30g/L氯化钠，搅拌溶解后，用盐酸溶液调将溶液pH6.0-7.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
(8)、第四次氧化：弃去上层乙醇，下层沉淀物用纯化水溶解，用氢氧化钠溶液将溶液调pH10.0-12.0，然后加入体积10％双氧水，氧化15小时；
(9)、溶液加入20-30g/L氯化钠，用盐酸溶液将溶液调pH10.0-12.0，边搅边加浓度为95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的浓度在20℃时达到50％，沉淀15小时；
(10)、将沉淀物用纯化水按2-5L/亿单位溶解后，用孔径0.22-0.3微米滤膜板框机微滤，用乙醇沉淀，使乙醇浓度达75-80％，再加入23-26％的氯化钠溶液，每1升溶液加6-10ml氯化钠溶液，静置沉淀10-12小时；
(11)、将上层乙醇弃去，加入无水乙醇脱水，边搅边加，使乙醇浓度为97-99％，静置24-30小时，弃去上层乙醇，将不锈钢砂芯棒放在产品中，用真空泵通过管道和过滤瓶把剩余乙醇抽干，待干燥；
(12)、将抽干的产品均匀放置在不锈钢盘中，放在真空干燥箱中抽真空，用循环水加温，温度35-60℃，烘干70-80小时；
(13)、包装：将产品取出，称重，使每包装袋5kg，用封口机封口，放在铝桶中待验；
三、化验
第四次沉淀后的溶液进行QA取样化验，测吸光度：260nm＜0.2；400nm＜0.03；分子量2000-3000道尔顿，若不合格，继续重复上面过程，若合格移交下一工序。
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