CN103275246A - 一种那曲肝素钙生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种那曲肝素钙生产方法，属于生物医药领域。该方法采用粗品肝素钠为原料，以酶解和改良的亚硝酸盐降解法为基础，经酶解、氧化脱色、超滤除杂、醇沉除杂、降解、还原、紫外照射、氧化、钙置换、纳滤、超滤精制、冻干等步骤制得具有特定平均分子量(3800～5000Da)的那曲肝素钙精品，具有制备工艺简单、产品的生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小等特点。

Description

一种那曲肝素钙生产方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说是一种那曲肝素钙(Nadroparin)生产方法。

背景技术

肝素(普通肝素即未分级肝素)是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，在体内和体外都有抗凝血作用。但普通肝素存在生物利用度低、副作用大和给药次数过频等缺陷，而其换代产品低分子肝素如那曲肝素钙不仅抗血栓作用优于普通肝素，而且具有生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小等优点。肝素的抗凝血活性分为抗栓活性(FXa)和抗凝(FIIa)活性两大类，在抗血栓形成的过程中，抗FXa活性与抗FIIa活性的作用都是必需的，抗血栓作用的衡量标准用抗FXa/FIIa值表示，其值越大，表示抗血栓作用越强，出血倾向越小。

那曲肝素钙是通过酸性亚硝酸钙的解聚，硼氢化钠还原和紫外修饰，经氧化、钙置换后的一种抗凝和抗血栓药物，是低分子肝素的一种。国际和国内上制备方法比较单一，均为亚硝酸盐降解，但以此为条件，产品降解不稳定，内部结构破坏较大，结构确认合格率低。目前通常的生产方法是：将外购的精品肝素钠原料溶于纯化水中，直接加入一定量的亚硝酸钠，控制pH值在2.7～2.9范围内，一定温度下搅拌反应25～35min。再经还原、转钙、过滤、浓缩等制的成品。传统方法是以外购的精品肝素为原料，难以从原料源头控制最终成品质量，降解时只选择了肝素可被亚硝酸盐降解而生产低分子，而其降解过程难以控制pH值的剧烈变化而带来对产品分子量和结构的不可控性，且产品稳定性差。转钙时只是以传统的沉淀方法进行产品中游离钙离子的去除，难以达到可控的效果，从而导致制备出来的产品纯度不够，结构不稳定等缺点，这些都是目前工艺中不能解决的问题。而且在制成的注射剂药物的过程中存在一定的风险。

发明内容

本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种那曲肝素钙生产方法。该方法克服了传统工艺中的原料不可控性及产品产率低，产品稳定性差的缺陷。以该方法生产的那曲肝素钙的质量高于国有标准和欧洲质量标准，且稳定性好，产品收率高。

本发明的技术任务是按以下方式实现的：该方法采用粗品肝素钠为原料，选用木瓜蛋白酶、核糖核酸酶II等蛋白和核酸酶优化组合，对粗品肝素中蛋白和核酸进行高效降解，并结合膜技术一次性去除蛋白和核酸杂质。将经过处理的肝素钠加入具有缓冲作用的冰醋酸中完全溶解，在特定温度和酸性条件下，与亚硝酸钙反应，引起N-硫酸基氨基葡糖残基上的脱氨作用，进而发生重排反应引起氨基葡糖和糖醛酸之间的糖苷键断裂，形成2，5-脱水甘露糖末端残基，然后还原处理获得稳定的2，5-脱水甘露醇，紫外照射后再经过钙盐置换取代结构上的钠离子，后经纳滤技术和低分子膜分离技术，得到分子量3800～5000道尔顿的那曲肝素钙粗品，将上述那曲肝素钙粗品经过氧化氢氧化脱色，乙醇沉淀、真空冷冻干燥，得到抗Xa因子活性为100IU/mg～130IU/mg、pH值为6.5～7.2、抗Xa/IIa比值为2.7～4.0、平均分子量为3800～5000D的那曲肝素钙成品。

一种那曲肝素钙生产方法，包括以下步骤：

包括以下步骤：

a)酶解：向粗品肝素钠中加入10～12倍量(质量比)水溶解，调节料液pH值至8.0～8.5，温度至35～40℃，加入适量木瓜蛋白酶及核糖核酸酶II，酶解反应8～10小时，离心去沉淀，上清液过滤，收集滤液；

b)氧化脱色：控制步骤a)所得滤液温度至30～40℃，调整滤液pH值至9～11，加入0.3％～0.5％滤液体积的过氧化氢，搅拌反应6～8小时，得纯化液；

c)超滤除杂：调节步骤b)纯化液的pH值至6～8，采用截留分子量为3,000～8,000Da的超滤膜对步骤b)所得纯化液进行切向流循环超滤，循环超滤5～8小时，收集截留液；

d)醇沉除杂：截留液醇沉除杂，所得沉淀物干燥称重；

e)降解：向步骤d)中所得的沉淀物中加入7～8倍量(质量比)的冰醋酸溶解，调节料液pH值至3.0～3.2，调整料液温度至18～22℃，加入适量亚硝酸盐，搅拌反应20～30分钟；所述冰醋酸的体积浓度为1.8％～2.0％；所述亚硝酸盐的用量为步骤d)中所得沉淀物重量的1.5％～2.1％；

f)还原：降解反应完成后，迅速调节料液的pH值至9.0～10.0，加入步骤d)所述沉淀物重量0.9％～1.1％的硼氢化钠，搅拌反应10～15h，反应完成后调节pH值至3.0～4.0，搅拌反应15-30分钟后，再调节料液的pH值至6～8，然后加入适量氯化钠，搅拌溶解，微孔过滤器过滤，并向其中加入2～3倍体积的95％乙醇，搅拌20～30min后，静置8～12小时；氯化钠与料液的质量体积比为0.9％～1.1％；

g)紫外照射：将步骤f)中的沉淀物去上清，向沉淀物中加入8～10倍量(质量比)的水搅拌使其溶解，在室温下用254nm的波长的紫外线照射20～30分钟；

h)氧化：调节料液pH值至9～10，加入0.8％～1.0％料液体积的过氧化氢，20～30℃料液温度下搅拌反应6～8小时；氧化完毕，醇沉，静止沉淀8～10小时后，去上清，向沉淀物中加入9～10倍量(质量比)的水溶解；

i)钙置换：在搅拌状态下持续加入适量氯化钙，20～25℃下搅拌反应10～12小时；所述氯化钙的用量为步骤h所得沉淀物重量的8～12％；

j)纳滤：反应完成，料液经过滤后加入纳滤机开始循环纳滤，纳滤截留液的体积浓度达到20％～25％时，放出截留液，加入截留液体积2～3倍量的95％乙醇，静置沉淀12～15小时制得钙盐沉淀物；循环纳滤过程中可补加适量纯化水；

k)超滤精制：向步骤j)所得的钙盐沉淀物加入10～12倍量的水进行溶解，完全溶解后先用0.22um的滤膜过滤，然后用1000～3000Da的膜循环超滤控制分子量，收集截留液；截留液经0.1μm的除菌膜过滤，收集滤液，并调节滤液pH值至6.5～7.2；

l)将滤液进行冻干处理，得那曲肝素钙成品。步骤a中木瓜蛋白酶的用量为粗品肝素钠重量的0.5％～0.7％，核糖核酸酶II的用量为粗品肝素钠重量的0.3％～0.5％。

步骤d、步骤h中，可以利用现有技术中公知的醇沉方法完成醇沉操作，但是，为了得到更好的提纯效果，优选以下具体方法实现：

步骤d中醇沉除杂时，向c)所得的截留液中加入适量氯化钠，搅拌溶解后再加入0.8～1.0倍体积的95％乙醇，沉淀10～12小时，分离得沉淀物；再将沉淀物加水溶解，向溶液中加入l～1.2倍体积的95％乙醇，沉淀6～8小时，分离得沉淀物，沉淀物真空干燥并称重；氯化钠与截留液的质量体积比为1.0％～1.2％。

步骤h中醇沉的具体过程为：调节料液pH值至6～8，向料液中加入适量氯化钠及2～3倍体积的95％乙醇；氯化钠与料液的质量体积比为0.8％～1.0％。

步骤e中所述亚硝酸盐为亚硝酸钙。

与现有技术相比，本发明的那曲肝素钙生产方法具有以下突出的有益效果：

(一)以粗品肝素钠为原料，选用木瓜蛋白酶、核糖核酸酶II等蛋白和核酸酶优化组合，对粗品肝素钠中蛋白和核酸进行高效降解，并结合膜技术一次性去除蛋白和核酸杂质，避免了传统工艺中从粗品到精品制备反复除杂的繁琐过程；

(二)进行亚硝酸盐降解前，将经过处理的肝素钠加入具有缓冲作用的冰醋酸，克服了传统工艺与亚硝酸盐反应时的pH变化剧烈而引起的产品分子量剧烈变化，生产产品结构不合格，产品稳定性差等缺陷，增加产品的稳定性；

(三)在一定温度和酸性条件下，与亚硝酸钙发生降解反应。采用亚硝酸钙降解，会有部分钙离子置换出产品中的钠离子，这样可以适当减少后期钙置换时氯化钙的投入，及其钙置换的反应时间，降低了成本投入和缩短了制备周期；

(四)将先进的纳滤技术应用于产品中游离钙离子的去除，改变了落后的溶媒分级沉淀去除法，产品收率大幅提高；

(五)通过本发明方法制备得到的那曲肝素钙成品的平均分子量为3800～5000道尔顿，分子量分布为：分子量小于2000的比率为≤15.0％；分子量于2000～8000的比率为75.0％～95.0％；分子量在2000～4000的比率为35.0％～55.0％，抗Xa因子活性为100IU/mg～130IU/mg，抗Xa/IIa比值为2.7～4.0，pH值为6.5～7.2；5％的产品水溶液澄清透明；乙醇含量≤0.8％；钙含量(干品)9.7％～11.3％，产品质量超越国内标准和欧洲药典标准，生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小；

(六)操作简单，易于实现工业化生产。

附图说明

附图1是本发明方法的工艺流程图。

具体实施方式

参照说明书附图以具体实施例对本发明的那曲肝素钙生产方法作以下详细地说明。

制备实施例一：

具体步骤：

a)酶解：取粗品肝素钠1000g，并向其中加入10kg水溶解，用20％(w/v)氢氧化钙溶液调节料液pH值至8.2，调节料液温度至37℃，分别加入木瓜蛋白酶7g、核糖核酸酶II4g，搅拌反应10小时，离心去沉淀，将上清液用板框过滤器过滤，收集得滤液10L。；

b)氧化：控制步骤a)所得滤液温度至37℃，用20％(w/v)氢氧化钙溶液调整滤液pH值至10.1，加入30ml过氧化氢，室温搅拌反应8小时，得纯化液；

c)超滤除杂：将步骤b中所获得的纯化液用4mol/L的盐酸调节为pH7.2后进行切向流超滤，选择截留分子量为8,000Da的超滤膜进行循环超滤6小时，收集得截留液6L；

d)醇沉除杂：向步骤c)所得的截留液中加入60g氯化钠，搅拌溶解后再加入6L95％(v/v)乙醇，沉淀12小时，分离得沉淀物；沉淀物加8L水溶解，并向溶液中加入9.6L95％(v/v)乙醇，沉淀8小时，分离得沉淀物，沉淀物真空干燥，重900g；

e)降解：向步骤d)中所得的沉淀物中加入6.3kg2％(v/v)的冰醋酸溶解，用4mol/L的盐酸调节料液pH值至3.1，调整温度至20℃时，加入16.2g亚硝酸钙，搅拌反应25分钟；

f)还原：反应完成后，迅速用20％(w/v)氢氧化钙溶液调节料液的pH值至9.4，加入9.9g硼氢化钠，搅拌反应12h，反应完成后用4mol/L的盐酸调节pH值至3.6，搅拌反应20分钟后，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节料液的pH值至6.8，然后加入63g氯化钠，搅拌溶解，然后将料液用微孔过滤器过滤，并向其中加入13L95％(v/v)乙醇，搅拌25min后，静置10小时；

g)紫外照射：将步骤f)中的沉淀物去上清，加入7kg水搅拌使其溶解，在室温下用254nm的波长的紫外线照射25分钟；

h)氧化：用20％(w/v)氢氧化钙溶液调节料液pH值至9.4，加入56ml的过氧化氢，25℃料液温度下搅拌反应6小时；氧化完毕后，用4mol/L的盐酸调节料液pH值至7.2，向其中加入56g氯化钠及18L95％(v/v)乙醇，搅拌20分钟以后，静止沉淀10小时，去上清，加入8kg水进行溶解；

i)钙置换：在搅拌状态下持续加入64g氯化钙，20℃下搅拌反应12小时；

j)纳滤：反应完成，滤板过滤，将料液加入纳滤机开始循环纳滤，中间补加适量的水，直到纳滤截留液的体积浓度达到25％时，放出料液，加入16L95％(v/v)乙醇，然后静置沉淀13小时制得钙盐沉淀物；

k)超滤精制：向步骤j)中所得的沉淀物加入7.8kg水进行溶解，完全溶解后先用0.22um的滤膜过滤，然后用1000Da的膜循环超滤控制分子量，收集截留液；将截留液经0.1μm的除菌膜过滤后，得滤液，再用1mol/L的盐酸溶液调节滤液pH值至6.8；

L)将滤液转移至真空冷冻干燥箱中进行冻干处理，得那曲肝素钙成品770g。

制备实施例二：

具体步骤：

a)酶解：取粗品肝素钠1000g，并向其中加入11kg水溶解，用20％(w/v)氢氧化钙溶液调节料液pH值至8.3，调节料液温度至38℃，分别加入木瓜蛋白酶6g、核糖核酸酶II5g，搅拌反应10小时，离心去沉淀，将上清液用板框过滤器过滤，收集得滤液11L。；

b)氧化：控制步骤a)所得滤液温度至39℃，用20％(w/v)氢氧化钙溶液调整滤液pH值至9.5，加入35ml过氧化氢，室温搅拌反应7小时，得纯化液；

c)超滤除杂：将步骤b中所获得的纯化液用4mol/L的盐酸调节pH为6.8后进行切向流超滤，选择截留分子量为5,000Da的超滤膜进行循环超滤6小时，收集得截留液7L；

d)醇沉除杂：向步骤c)所得的截留液中加入70g氯化钠，搅拌溶解后再加入7L95％(v/v)乙醇，沉淀11小时，分离得沉淀物；沉淀物加7.5L水溶解，并向溶液中加入9.0L95％(v/v)乙醇，沉淀8小时，分离得沉淀物，沉淀物真空干燥，重895g；

e)降解：向步骤d)中所得的沉淀物中加入7.1kg2％(v/v)的冰醋酸溶解，用4mol/L的盐酸调节料液pH值至3.1，调整温度至21℃时，加入16.7g亚硝酸钙，搅拌反应25分钟；

f)还原：反应完成后，迅速用20％(w/v)氢氧化钙溶液调节料液的pH值至9.5，加入8.9g硼氢化钠，搅拌反应12h，反应完成后用4mol/L的盐酸调节pH值至3.4，搅拌反应25分钟后，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节料液的pH值至7.2，然后加入70g氯化钠，搅拌溶解，然后将料液用微孔过滤器过滤，并向其中加入17L95％(v/v)乙醇，搅拌20min后，静置10小时；

g)紫外照射：将步骤f)中的沉淀物去上清，加入7.6kg水搅拌使其溶解，在室温下用254nm的波长的紫外线照射25分钟；

h)氧化：用20％(w/v)氢氧化钙溶液调节料液pH值至9.6，加入60ml的过氧化氢，26℃料液温度下搅拌反应6小时；氧化完毕后，用4mol/L的盐酸调节料液pH值至7.0，向其中加入60g氯化钠及20L95％(v/v)乙醇，搅拌20分钟以后，静止沉淀10小时，去上清，加入8kg水进行溶解；

i)钙置换：在搅拌状态下持续加入64g氯化钙，21℃下搅拌反应12小时；

j)纳滤：反应完成，滤板过滤，将料液加入纳滤机开始循环纳滤，中间补加适量的水，直到纳滤截留液的体积浓度达到25％时，放出料液，加入20L95％(v/v)乙醇，然后静置沉淀12小时制得钙盐沉淀物；

k)超滤精制：向步骤j)中所得的沉淀物加入80kg水进行溶解，完全溶解后先用0.22um的滤膜过滤，然后用1000Da的膜循环超滤控制分子量，收集截留液；将截留液经0.1μm的除菌膜过滤后，得滤液，再用1mol/L的盐酸溶液调节滤液pH值至6.7；

L)将滤液转移至真空冷冻干燥箱中进行冻干处理，得那曲肝素钙成品765g。

试验例：

分别以制备实施例一、制备实施例二所得那曲肝素钙成品为样品一、样品二进行实验分析，与国家和进口标准有关数据的对比情况如表一所示。

表一：

Claims (6)

1.一种那曲肝素钙生产方法，其特征在于：

以粗品肝素钠为原料，经木瓜蛋白酶、核糖核酸酶II酶解，提纯得到精品肝素钠；

精品肝素钠加入冰醋酸缓冲液中，并在一定温度和酸性条件下与亚硝酸盐反应，再经还原、紫外照射、氧化、钙置换得到那曲钙粗品；

那曲钙粗品经纳滤、超滤精制后，进行冻干处理，得那曲肝素钙成品。

2.一种那曲肝素钙生产方法，其特征在于：

包括以下步骤：

a)酶解：向粗品肝素钠中加入10～12倍量水溶解，调节料液pH值至8.0～8.5，温度至35～40℃，加入适量木瓜蛋白酶及核糖核酸酶II，酶解反应8～10小时，离心去沉淀，上清液过滤，收集滤液；

b)氧化脱色：控制步骤a)所得滤液温度至30～40℃，调整滤液pH值至9～11，加入0.3％～0.5％滤液体积的过氧化氢，搅拌反应6～8小时，得纯化液；

c)超滤除杂：调节步骤b)的纯化液pH值至6～8，采用截留分子量为3,000～8,000Da的超滤膜对步骤b)所得纯化液进行切向流循环超滤，循环超滤5～8小时，收集截留液；

d)醇沉除杂：截留液醇沉除杂，所得沉淀物干燥称重；

e)降解：向步骤d)中所得的沉淀物中加入7～8倍量的冰醋酸溶解，调节料液pH值至3.0～3.2，调整料液温度至18～22℃，加入适量亚硝酸盐，搅拌反应20～30分钟；所述冰醋酸的体积浓度为1.8～2.0％；所述亚硝酸盐的用量为步骤d)中所得沉淀物重量的1.5％～2.1％；

f)还原：降解反应完成后，迅速调节料液的pH值至9.0～10.0，加入步骤d)所述沉淀物重量0.9％～1.1％的硼氢化钠，搅拌反应10～15h，反应完成后调节pH值至3.0～4.0，搅拌反应15～30分钟后，再调节料液的pH值至6～8，然后加入适量氯化钠，搅拌溶解，微孔过滤器过滤，并向其中加入2～3倍体积的95％乙醇，搅拌20～30min后，静置8～12小时；氯化钠与料液的质量体积比为0.9％～1.1％；

g)紫外照射：将步骤f)中的沉淀物去上清，向沉淀物中加入8～10倍量的水搅拌使其溶解，在室温下用254nm的波长的紫外线照射20～30分钟；

h)氧化：调节料液pH值至9～10，加入0.8％～1.0％料液体积的过氧化氢，20～30℃料液温度下搅拌反应6～8小时；氧化完毕，醇沉，静止沉淀8～10小时后，去上清，向沉淀物中加入9～10倍量的水溶解；

i)钙置换：在搅拌状态下持续加入适量氯化钙，20～25℃下搅拌反应10～12小时；所述氯化钙的用量为步骤h所得沉淀物重量的8～12％；

j)纳滤：反应完成，料液经过滤后加入纳滤机开始循环纳滤，纳滤截留液的体积浓度达到20％～25％时，放出截留液，加入截留液体积2～3倍量的95％乙醇，静置沉淀12～15小时制得钙盐沉淀物；

k)超滤精制：向步骤j)所得的钙盐沉淀物加入10～12倍量的水进行溶解，完全溶解后先用0.22um的滤膜过滤，然后用1000～3000Da的膜循环超滤控制分子量，收集截留液；截留液经0.1μm的除菌膜过滤，收集滤液，并调节滤液pH值至6.5～7.2；

l)将滤液进行冻干处理，得那曲肝素钙成品。

3.根据权利要求2所述的那曲肝素钙生产方法，其特征在于，步骤a中木瓜蛋白酶的用量为粗品肝素钠重量的0.5％～0.7％，核糖核酸酶II的用量为粗品肝素钠重量的0.3％～0.5％。

4.根据权利要求2所述的那曲肝素钙生产方法，其特征在于，步骤d中醇沉除杂时，向c)所得的截留液中加入适量氯化钠，搅拌溶解后再加入0.8～1.0倍体积的95％乙醇，沉淀10～12小时，分离得沉淀物；再将沉淀物加水溶解，向溶液中加入1～1.2倍体积的95％乙醇，沉淀6～8小时，分离得沉淀物，沉淀物真空干燥并称重；氯化钠与截留液的质量体积比为1.0％～1.2％。

5.根据权利要求2所述的那曲肝素钙生产方法，其特征在于，步骤e中所述亚硝酸盐为亚硝酸钙。

6.根据权利要求2所述的那曲肝素钙生产方法，其特征在于，步骤h中醇沉的具体过程为：调节料液pH值至6～8，向料液中加入适量氯化钠及2～3倍体积的95％乙醇；氯化钠与料液的质量体积比为0.8％～1.0％。

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