CN111040047A - 一种酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺、应用 - Google Patents

一种酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺、应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种低分子量硫酸皮肤素，所述低分子量硫酸皮肤素的数均分子量为2000～5000Da；所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量为2500～6500Da。本发明得到的精制的低分子量硫酸皮肤素，具有较窄的重均分子量分布和数据分子量分布，更加适合人体吸收，在抗血栓药物中具有广泛的应用前景。本发明提供的低分子量硫酸皮肤素的精制工艺，是一种酶‑超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺，特别以富含硫酸皮肤素的肝素钠副产物为原料，利用可以降解硫酸皮肤素的生物酶‑‑硫酸软骨素B酶，结合超滤法，得到了该综合精制工艺，反应温和、稳定、可控，工艺重复性高，具有一定的经济效益和环境保护作用，适于工业化推广和应用。

Description

一种酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺、应用
技术领域
本发明属于硫酸皮肤素技术领域，涉及一种低分子量硫酸皮肤素及其精制工艺、应用，尤其涉及一种低分子量硫酸皮肤素以及酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺、应用。
背景技术
硫酸皮肤素(dermatansulfate，简称DS)，是动物体内分布最广泛的一种细胞外基质糖胺多糖，为血管壁蛋白多糖的主要成份。硫酸皮肤素作为一种糖胺多糖，广泛分布于动物组织中。DS作为结缔组织的重要组成部分，具有多种药理作用与生理功能，可用作药物和保健食品，主要用于骨关节炎(oa)和冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)，其抗血栓作用与肝素相当甚至更强，而且DS的抗血栓作用不依赖血浆抗凝血酶III，而是通过肝素辅因子II催化抑制凝血酶，出血副作用比肝素小，目前已逐渐成为一种很有前途的新型抗血栓药物。
在硫酸皮肤素的来源上，可以直接使用天然的硫酸皮肤素，主要来源于动物组织提取，由于和动物体内其它糖胺聚糖、蛋白、核酸等组分混合，因此提取纯化难度较高。另外，天然DS相对分子质量一般在15000～45000Da之间，分子量大，不利于人体吸收，若直接用于人体，存在着两个主要的药动学问题:一是半衰期短，二是皮下和肌内注射时，其生物利用度低；且DS相对分子质量越高，其生物利用度就越低。
因而这就需要制备出分子量小、分子量分布窄的低分子硫酸皮肤素(LowMolecular Weight Dermatan Sulfate，简称LMWDS)，以提高DS的生物利用度并改善其药动学特征。LMWDS是一种通过化学、生物等手段将天然硫酸皮肤素降解制备的小分子聚合物，易被人体吸收，抗血栓活性高，人体利用度高。
目前有研究通过化学法和物理法降解DS以制备LMWDS，但制备过程中存在收率低和分子量分布不易控制等问题。如化学法降解DS，就是利用盐酸、过氧化氢等化学试剂将硫酸皮肤素降解。这两种方式都是通过用强酸或强氧化性化学试剂将硫酸皮肤素断链水解。硫酸皮肤素在盐酸溶液中水解，但使用盐酸量大，水解反应进行缓慢，并且水解反应不易控，易造成水解过剧或水解程度不够。使用过氧化氢氧化降解硫酸皮肤素同样存在降解参数不易控制，反应稳定性及重复性差等问题，造成收率低，降解产物分子量分布不均一，疗效不可控等问题。
因此，如何找到一种适宜的硫酸皮肤素的降解方法，即一种低分子量硫酸皮肤素的精制工艺，解决现有的硫酸皮肤素降解工艺中存在的上述问题，已成业内研发型生产厂家和诸多一线研究人员亟待解决的问题之一。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种低分子量硫酸皮肤素及其精制工艺、应用，特别是一种酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺，本发明精制的低分子硫酸皮肤素成品纯度高、分子量分布窄、更加适合人体吸收，而且工艺反应温和、稳定、可控，工艺重复性高，适于工业化推广和应用。
本发明提供了一种低分子量硫酸皮肤素，所述低分子量硫酸皮肤素的数均分子量为2000～5000Da；
所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量为2500～6500Da。
优选的，所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量的分子量分布为：
分子量小于2000Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的10wt％以下；
分子量大于8000Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的12wt％以下；
分子量为2000～8000Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的78wt％～90wt％。
优选的，所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量为3500～6000Da；
所述低分子量硫酸皮肤素的数均分子量为3000～4500Da；
所述低分子量硫酸皮肤素的比旋度小于等于-40°；
所述低分子量硫酸皮肤素的纯度为99％以上。
本发明提供了一种低分子量硫酸皮肤素的精制工艺，包括以下步骤：
1)将硫酸皮肤素溶液和硫酸软骨素B酶混合后，进行酶解后，得到料液；
2)向上述步骤得到的料液，加入强氧化剂进行氧化反应后，再经过过滤，得到滤后料液；
3)将上述步骤得到的滤后料液经过循环超滤后，得到低分子量硫酸皮肤素。
优选的，所述硫酸皮肤素溶液包括硫酸皮肤素水溶液；
所述硫酸皮肤素溶液的pH值为6.5～8.5；
所述硫酸皮肤素溶液的质量浓度为8％～12％；
所述硫酸皮肤素的重均分子量为15000～45000Da；
所述硫酸软骨素B酶与所述硫酸皮肤素溶液的体积比为0.001％～0.003％；
所述硫酸软骨素B酶的浓度为8000～12000IU/mL；
所述酶解的温度为35～37℃；
所述酶解的时间为3～5h。
优选的，所述强氧化剂包括高锰酸钾、高锰酸钠、过氧化氢和次氯酸钠中的一种或多种；
所述强氧化剂占所述料液的质量比为2％～5％；
所述氧化反应的温度为80～90℃；
所述氧化反应的时间为30～45分钟；
所述氧化反应后还包括静置降温步骤和/或除杂步骤；
所述过滤为微滤膜过滤；
所述微滤膜的孔径为0.1～0.45μm。
优选的，所述循环超滤前还包括稀释步骤；
所述稀释的滤后料液的质量浓度为3％～5％；
所述超滤为切向流超滤；
所述循环超滤的具体步骤为：
先采用第一超滤膜进行第一循环超滤后，收集透过液，再采用第二超滤膜进行第二循环超滤后，收集截留液；
所述第一超滤膜的过滤精度为8000～12000Da；
所述第一循环超滤的次数为100～500次；
所述第二超滤膜的过滤精度为800～1200Da；
所述第二循环超滤的次数为100～500次；
所述循环超滤后还包括后处理步骤。
优选的，所述后处理步骤包括溶解、沉淀、再溶解、过滤、冷冻干燥、研磨和混合中的一步或多步；
所述后处理步骤具体为：
将循环超滤后得到的截留液和氯化钠溶解后，再加入乙醇静置后，舍弃上清液，得到沉淀；
将上述步骤得到的沉淀再次溶解、冷冻干燥和磨粉后，得到成品低分子量硫酸皮肤素；
所述氯化钠与所述截留液体积比为2％～4％；
所述乙醇与溶解后的物料体积比值为(2～3)：1；
所述静置的时间为6～8h。
优选的，所述硫酸皮肤素由富含硫酸皮肤素的肝素钠副产物经制备后得到；
所述制备过程为：
A)将富含DS的肝素钠副产物和水进行溶解，得到原液；
B)将上述步骤得到的原液经过树脂吸附后，再用氯化钠溶液洗脱，得到洗脱后的原液；
C)将上述步骤得到的洗脱后的原液和乙醇混合静置后，再经过干燥，得到硫酸皮肤素；
所述原液的质量浓度为8％～12％；
所述树脂吸附的温度为50～70℃；
所述洗脱包括先洗脱杂质和再洗脱树脂。
本发明提供了上述技术方案任意一项所述的低分子量硫酸皮肤素或上述技术方案任意一项所述的精致工艺所精制的低分子量硫酸皮肤素在制备抗血栓药物中的应用。
本发明提供了一种低分子量硫酸皮肤素，所述低分子量硫酸皮肤素的数均分子量为2000～5000Da；所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量为2500～6500Da。与现有技术相比，本发明针对天然硫酸皮肤素，提取纯化难度较高。而且天然DS相对分子质量一般在15000～45000Da之间，分子量大，不利于人体吸收，存在半衰期短以及皮下和肌内注射时，生物利用度低的问题。
本发明创造性的得到了一种低分子量硫酸皮肤素，该精制的低分子量硫酸皮肤素，具有较窄的重均分子量分布和数据分子量分布，更加适合人体吸收，在抗血栓药物中具有广泛的应用前景。
本发明更针对由猪小肠黏膜提取肝素钠的过程中，大量的硫酸皮肤素会和肝素一起被收集，而我国是肝素钠生产大国，在肝素钠在生产过程中，会产生大量富含DS的副产物，这部分副产物一般作为废弃物处理，造成资源浪费、环境污染等问题的现状。本发明提供了一种低分子量硫酸皮肤素的精制工艺，是一种酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺，特别以富含硫酸皮肤素的肝素钠副产物为原料，利用可以降解硫酸皮肤素的生物酶--硫酸软骨素B酶，结合超滤法，得到了一种“酶-超滤法”综合精制工艺，制备出了分子量小、分子量分布均一、纯度高、利于人体吸收的低分子硫酸皮肤素，有效的解决了现有的利用盐酸、过氧化氢等化学试剂降解硫酸皮肤素，存在的盐酸用量大，水解反应进行缓慢，并且水解反应不易控，易造成水解过剧或水解程度不够，以及降解参数不易控制，反应稳定性及重复性差，造成收率低，降解产物分子量分布不均一，疗效不可控等问题。
本发明整体工艺中，结合树脂洗脱和乙醇沉淀工艺可有效去除核酸、蛋白、类肝素等杂质，保证产品纯度；通过硫酸软骨素B酶处理的酶解工艺可有效降低产品分子量；通过超滤工艺可有效控制产品分子量。本发明提供的低分子量硫酸皮肤素精制工艺，反应温和、稳定、可控，工艺重复性高，具有一定的经济效益和环境保护作用，适于工业化推广和应用。
实验结果表明，本发明提供的低分子量硫酸皮肤素精制工艺，可以将产品中反应核酸、蛋白浓度的260nm、280nm光吸收控制在0.06以下，可以将肝素类杂质的杂质含量控制在0.5％以下(可侧面反映纯度高)。产品经过酶解和超滤后，重均分子量控制在4000～4700Da范围内，分子量分布窄，重均分子量大于8000Da的组分占比不超过6.5％，分子量片段小于2000Da的组分占比不超过8.5％。另外，该工艺可有效保留原料中硫酸软骨素组分，酶解条件经摸索验证后能够保证中间产物的分子量与成品较接近，超滤损失少，产品总收率超过40％。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，本发明优选采用分析纯、医药领域或其应用领域常规的纯度。
本发明所有名词表达和简称均属于本领域常规名词表达和简称，每个名词表达和简称在其相关应用领域内均是清楚明确的，本领域技术人员根据名词表达和简称，能够清楚准确唯一的进行理解。
本发明提供了一种低分子量硫酸皮肤素，所述低分子量硫酸皮肤素的数均分子量为2000～5000Da；
所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量为2500～6500Da。
本发明对所述重均分子量的定义没有特别限制，以本领域技术人员熟知的重均分子量的定义即可，即Mw，本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行选择和调整，本发明所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量为2500～6500Da，优选为3000～6000Da，更优选为3500～5500Da，更优选为4000～5000Da，具体可以为3500～6000Da。
本发明对所述数均分子量的定义没有特别限制，以本领域技术人员熟知的数均分子量的定义即可，即Mn，本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行选择和调整，本发明所述低分子量硫酸皮肤素的数均分子量为2000～5000Da，优选为2200～4700Da，更优选为2500～4500Da，更优选为2700～4200Da，更优选为3000～4000Da，更优选为3200～3800Da，具体可以为3000～4500Da。
本发明原则上对所述低分子量硫酸皮肤素具体的分子量分布没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量的具体分子量分布优选为：
分子量小于2000Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的10wt％以下；
其中，分子量界限可以优选为：分子量小于2100Da，更优选为小于2200Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的10wt％以下。其中，百分比界限可以优选为9wt％以下，更优选为8wt％以下，更优选为7wt％以下，更优选为6wt％以下，更优选为5wt％以下。
分子量大于8000Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的12wt％以下；
其中，分子量界限可以优选为：分子量大于7800Da，更优选为大于7600Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的12wt％以上；其中，百分比界限可以优选为11wt％以下，更优选为10wt％以下，更优选为9wt％以下，更优选为8wt％以下，更优选为7wt％以下。
分子量为2000～8000Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的78wt％～90wt％；
其中，分子量界限可以优选为：2200～7600Da，更优选为2100～7800Da，的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的78wt％～90wt％；其中，百分比界限可以优选为80wt％～88wt％，更优选为82wt％～86wt％。
本发明原则上对所述低分子量硫酸皮肤素的其他参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述低分子量硫酸皮肤素的比旋度优选小于等于-35°，更优选小于等于-40°，更优选为小于等于-42°，更优选为小于等于-45°。所述低分子量硫酸皮肤素的纯度为99％以上，更优选为99.3％以上，更优选为99.5％以上。在本发明中，肝素类杂质总含量越低则纯度越高，低分子量硫酸皮肤素的纯度可以通过其数值侧面得到反映。
本发明还提供了一种低分子量硫酸皮肤素的精制工艺，包括以下步骤：
1)将硫酸皮肤素溶液和硫酸软骨素B酶混合后，进行酶解后，得到料液；
2)向上述步骤得到的料液，加入强氧化剂进行氧化反应后，再经过过滤，得到滤后料液；
3)将上述步骤得到的滤后料液经过循环超滤后，得到低分子量硫酸皮肤素。
本发明所述制备方法中所述材料的性质、结构以及比例等优选原则或具体优选方案与前述低分子量硫酸皮肤素的性质、结构以及比例等优选原则或具体优选方案，优选一一对应，在此不再一一赘述。
本发明首先将硫酸皮肤素溶液和硫酸软骨素B酶混合后，进行酶解后，得到料液。
本发明原则上对所述硫酸皮肤素的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，保证精制工艺的稳定性和重复性，所述硫酸皮肤素的重均分子量可以为15000～45000Da，或者为20000～43000Da，或者为25000～40000Da，或者为30000～37000Da。
本发明原则上对所述硫酸皮肤素溶液的具体溶剂没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，保证精制工艺的稳定性和重复性，所述硫酸皮肤素溶液优选包括硫酸皮肤素水溶液。
本发明原则上对所述硫酸皮肤素溶液的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，保证精制工艺的稳定性和重复性，所述硫酸皮肤素溶液的pH值优选为6.5～8.5，更优选为6.7～8.3，更优选为7.0～8.0，更优选为7.2～7.8。所述硫酸皮肤素溶液的质量浓度优选为8％～12％，更优选为8.5％～11.5％，更优选为9％～11％，更优选为9.5％～10.5％。
本发明原则上对所述硫酸皮肤素的来源没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为能够在保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，保证精制工艺的稳定性和重复性的基础上，同时具有更大的环保意义和经济效益，所述硫酸皮肤素特别优选为富含硫酸皮肤素的肝素钠副产物经制备后得到。
更优选的，所述制备过程具体可以为以下步骤：
A)将富含DS的肝素钠副产物和水进行溶解，得到原液；
B)将上述步骤得到的原液经过树脂吸附后，再用氯化钠溶液洗脱，得到洗脱后的原液；
C)将上述步骤得到的洗脱后的原液和乙醇混合静置后，再经过干燥，得到硫酸皮肤素；
本发明首先将富含DS的肝素钠副产物和水进行溶解，得到原液。
本发明原则上对所述原液的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述原液的质量浓度优选为8％～12％，更优选为8.5％～11.5％，更优选为9％～11％，更优选为9.5％～10.5％。
本发明再将上述步骤得到的原液经过树脂吸附后，再用氯化钠溶液洗脱，得到洗脱后的原液。
本发明原则上对所述树脂吸附的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述树脂吸附的温度优选为50～70℃，更优选为52～68℃，更优选为55～65℃，更优选为58～63℃。所述用于树脂吸附的树脂柱优选包括阴离子树脂柱，更优选为大孔径阴离子树脂柱，具体可以为A98树脂柱。
本发明原则上对所述氯化钠溶液的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述氯化钠溶液的质量浓度优选为2％～9％，更优选为3％～8％，更优选为4％～7％。
本发明原则上对所述洗脱的具体过程没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述洗脱包括先洗脱杂质和再洗脱树脂(洗脱树脂上吸附的硫酸皮肤素)。更具体的，所述洗脱的具体过程可以为：
将上述步骤得到的原液经过树脂吸附后，先使用2％～3％(优选为2.2％～2.8％，更优选为2.4％～2.6％)质量浓度的氯化钠溶液进行洗脱树脂(洗脱2～3个树脂体积)，以去除杂质。然后使用7％～9％(优选为7.2％～8.8％，更优选为7.5％～8.5％，更优选为7.8％～8.3％)质量浓度的氯化钠溶液进行洗脱树脂(洗脱3～4个树脂体积)，将吸附的硫酸皮肤素洗脱下来，得到洗脱后的原液。
本发明最后将上述步骤得到的洗脱后的原液和乙醇混合静置后，再经过干燥，得到硫酸皮肤素。
本发明原则上对所述乙醇的具体用量没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述乙醇与所述洗脱后的原液的体积比优选为(1.8～2.4)：1，更优选为(1.9～2.3)：1，更优选为(2.0～2.2)：1。
本发明原则上对所述混合静置的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述混合静置的时间优选为7～9小时，更优选为7.2～8.8小时，更优选为7.4～8.6小时，更优选为7.6～8.4小时，更优选为7.8～8.2小时。
本发明原则上对所述混合静置的具体过程没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述混合静置优选为多次混合静置，更优选为两次混合静置，具体可以为以下步骤：
将上述步骤得到的洗脱后的原液和0.3～0.4体积倍数(更优选为0.32～0.38，更优选为0.34～0.36)的乙醇混合静置2～3小时(更优选为2.2～2.8小时，更优选为2.4～2.6小时)后，抽取该部分的上清至另一物料罐中，将该部分上清液再次加入1.5～2.0体积倍数(更优选为1.6～1.9，更优选为1.7～1.8)的乙醇混合，再次静置沉淀5～6小时(更优选为5.2～5.8小时，更优选为5.4～5.6小时)，收集该部分沉淀物。
本发明原则上对所述干燥的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述干燥的温度优选为50～60℃，更优选为52～58℃，更优选为54～56℃。
本发明原则上对所述干燥的具体过程没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述干燥的具体过程可以为：
将混合静置后收集沉淀物进行烘干，去除乙醇，得到硫酸皮肤素。
本发明对所述硫酸软骨素B酶的来源没有特别限制，以本领域技术人员熟知的硫酸软骨素B酶常规来源即可，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，选择市售或者按照常规的方法生产得到均可。
本发明原则上对所述硫酸软骨素B酶的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述酸软骨素B酶的浓度优选为8000～12000IU/mL，更优选为8500～11500IU/mL，更优选为9000～11000IU/mL，更优选为9500～10500IU/mL。
本发明原则上对所述硫酸软骨素B酶的具体用量没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述硫酸软骨素B酶与所述硫酸皮肤素溶液的体积比优选为0.001％～0.003％，更优选为0.0012％～0.0028％，更优选为0.0015％～0.0025％，更优选为0.0018％～0.0022％。
本发明原则上对所述酶解的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述酶解的pH值(硫酸皮肤素溶液的pH值)优选为6.5～8.5，更优选为6.7～8.3，更优选为7.0～8.0，更优选为7.2～7.8。所述酶解的温度(硫酸皮肤素溶液的控制温度)优选为35～37℃，更优选为35.2～36.8℃，更优选为35.5～36.5℃，更优选为35.7～36.3℃。所述酶解的时间优选为3～5h，更优选为3.2～4.8h，更优选为3.5～4.5h，更优选为3.7～4.3h。
本发明随后向上述步骤得到的料液，加入强氧化剂进行氧化反应后，再经过过滤，得到滤后料液。
本发明原则上对所述强氧化剂的具体选择和用量没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述强氧化剂优选包括高锰酸钾、高锰酸钠、过氧化氢和次氯酸钠中的一种或多种，更优选为高锰酸钾、高锰酸钠、过氧化氢或次氯酸钠。所述强氧化剂占所述料液的质量比优选为2％～5％，更优选为2.5％～4.5％，更优选为3％～4％。
本发明原则上对所述氧化反应的具体条件没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述氧化反应的温度优选为80～90℃，更优选为82～88℃，更优选为84～86℃。所述氧化反应的时间优选为30～45分钟，更优选为32～43分钟，更优选为35～40分钟。
本发明为完整和细化整个精制工艺，更好的保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述氧化反应后还优选包括静置降温步骤和/或除杂步骤，更优选为静置降温步骤和除杂步骤，更具体优选为：将氧化后料液静置降温至50℃以下，过滤去除高锰酸钾氧化后的杂质产物，之后再进行后续用滤膜进行过滤除杂的步骤。
本发明原则上对所述过滤的具体条件没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述过滤优选为微滤膜过滤。进一步的，所述微滤膜的孔径优选为0.1～0.45μm，更优选为0.15～0.4μm，更优选为0.2～0.35μm，更优选为0.25～0.3μm。
本发明最后将上述步骤得到的滤后料液经过循环超滤后，得到低分子量硫酸皮肤素。
本发明为完整和细化整个精制工艺，更好的保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述循环超滤前优选还包括稀释步骤。具体的，所述稀释的滤后料液的质量浓度优选为3％～5％，更优选为3.2％～4.8％，更优选为3.5％～4.5％，更优选为3.7％～4.2％。
本发明原则上对所述超滤的具体方式没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述超滤优选为切向流超滤。
本发明原则上对所述循环超滤的具体步骤没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述循环超滤的具体步骤优选为：
先采用第一超滤膜进行第一循环超滤后，收集透过液，再采用第二超滤膜进行第二循环超滤后，收集截留液。
本发明原则上对上述循环超滤的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述第一超滤膜的过滤精度优选为8000～12000Da，更优选为8500～11500Da，更优选为9000～11000Da，更优选为9500～10500Da。所述第一循环超滤的次数优选为100～500次，更优选为150～450次，更优选为200～400次，更优选为250～350次。所述第二超滤膜的过滤精度优选为800～1200Da，更优选为850～1150Da，更优选为900～1100Da，更优选为950～1050Da。所述第二循环超滤的次数优选为100～500次，更优选为150～450次，更优选为200～400次，更优选为250～350次。
本发明特别选择切向流超滤(TFF)这种膜分离技术，是一种分子量水平的切向流过滤，切向流过滤膜，在过滤的同时能够对膜表面进行冲刷，使膜表面保持干净，保持稳定的过滤速度。本发明采用切向流超滤技术，更关键的采用了特定的参数和组合，能够对分子量分布不均一的硫酸皮肤素进行更加快捷、高效的分离与纯化。
本发明为完整和细化整个精制工艺，更好的保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述循环超滤后优选还包括后处理步骤。
本发明原则上对上述后处理的具体步骤没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述后处理步骤优选包括溶解、沉淀、再溶解、过滤、冷冻干燥、研磨和混合中的一步或多步，更优选为溶解、沉淀、再溶解、过滤、冷冻干燥、研磨和混合中的多步，更具体可以为以下步骤：
将截留液和氯化钠溶解后，再加入乙醇静置后，舍弃上清液，得到沉淀；
将上述步骤得到的沉淀再次溶解、冷冻干燥和磨粉后，得到成品低分子量硫酸皮肤素。
本发明原则上对上述后处理的具体参数没有特别限制，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整，本发明为保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，所述氯化钠与所述截留液体积比优选为2％～4％，更优选为2.2％～3.8％，更优选为2.5％～3.5％，更优选为2.7％～3.2％。所述乙醇与溶解后的物料体积比值优选为(2～3)：1，更优选为(2.2～2.8)：1，更优选为(2.4～2.6)：1。所述静置的时间优选为6～8h，更优选为6.2～7.8h，更优选为6.5～7.5h，更优选为6.8～7.2h。
本发明对上述再次溶解、冷冻干燥和磨粉的具体步骤和参数没有特别限制，以本领域技术人员熟知的此类产品制备过程中的上述过程相应的常规步骤和参数即可，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整。
本发明为完整和细化整个精制工艺，更好的保证低分子量硫酸皮肤素的高质量，缩窄分子量分布宽度，更加利于人体吸收，上述精制过程具体可以为以下步骤：
A.将富含DS的肝素钠副产物加水进行溶解，得到溶解后的料液；
B.将A中所述料液通过大孔径阴离子树脂柱，控制料液温度约50～70℃，进行树脂吸附。首先用第一质量浓度的氯化钠溶液进行洗脱(2～3个树脂体积)，以洗脱去除杂质；再用第二质量浓度的氯化钠溶液洗脱(3～4个树脂体积)，收集该盐度洗脱的料液。
C.将B中所收集的料液加入乙醇进行沉淀放置，将沉淀上清液转移至另一物料罐中，补加乙醇进行沉淀放置，弃取上清，收集沉淀物；
D.将C中收集沉淀物进行烘干，去除乙醇。然后加加水进行溶解，溶解为料液；
E.将D中所得的料液调整pH为6.5～8.5，温度控制至35～37℃，加入硫酸软骨素B酶，进行酶解。
F.将E中所述料液升温，加入高锰酸钾，持续搅拌，进行氧化；将氧化后料液静置降温，过滤去除高锰酸钾氧化后的杂质产物，再用滤膜进行过滤除杂。
G.将F中过滤后料液稀释，使用第一滤膜进行循环超滤，收集透过液。再将收集的透过液使用第二滤膜进行循环超滤，收集截留液，取样中控检测分子量，控制重均分子量在3000～5000Da；
H.将G中收集的截留液，加入氯化钠进行溶解，加入乙醇，搅拌均匀后，放置。
I.弃取H中沉淀的上清，溶解沉淀物，将沉淀物溶解，过滤、冷冻干燥、磨粉、混合、包装。
本发明提供的酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺，采用了大孔径阴离子树脂柱提纯处理硫酸皮肤素、硫酸软骨素B酶对硫酸皮肤素进行降解以及使用切向流超滤技术调整低分子硫酸皮肤素的分子量的特别组合，得到了整体的精制工艺。其中，树脂洗脱进行硫酸皮肤素的提纯，通过使用大孔径阴离子树脂柱(特别是A98树脂)吸附、洗脱，对硫酸皮肤素进行提纯。能够做到在进行酶解处理前，将硫酸皮肤素中的大量杂质进行去除；而采用乙醇沉淀提纯硫酸皮肤素。通过加入一定体积的乙醇，将硫酸皮肤素进一步提纯；再用硫酸软骨素B酶降解处理，通过用硫酸软骨素B酶的降解作用，将提纯后的硫酸软骨素降解成小分子，相比于传统的使用盐酸、过氧化氢等降解方法，本专利方法降解效率高，处理方法稳定可控、重复性好，生产低分子硫酸皮肤素收率高。另外，本专利方法降解条件温和，尽可能保护低分硫酸皮肤素结构的完整；同时再结合使用高锰酸钾氧化进一步提纯低分子硫酸皮肤素，高锰酸钾对加入的硫酸软骨素B酶进行氧化去除，并且对制备的低分子硫酸皮肤素末端结构进行修饰，使制备的低分子硫酸皮肤素结构稳定；以及使用切向流超滤技术控制低分子硫酸皮肤素的分子量，使用本发明特定参数的切向流超滤技术，可以控制、调整低分子硫酸皮肤素的分子量至适合人体吸收的4KD水平。
本发明提供的低分子硫酸皮肤素精制工艺，相比与传统的低分子硫酸皮肤素制备工艺，工艺反应条件温和、稳定、可控，工艺重复性高，制备的低分子硫酸皮肤素成品纯度高、分子量分布窄、更加适合人体吸收。
本发明还提供了上述技术方案任意一项所述的低分子量硫酸皮肤素或上述技术方案任意一项所述的精致工艺所精制的低分子量硫酸皮肤素在制备抗血栓药物中的应用。
本发明对上述低分子量硫酸皮肤素在制备抗血栓药物中的具体应用方式没有特别限制，以本领域技术人员熟知的此类产品常规的应用方式即可，本领域技术人员可以根据生产情况、应用需求或质量要求进行选择和调整。
本发明上述步骤提供了一种低分子量硫酸皮肤素以及酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺、应用。本发明得到的精制的低分子量硫酸皮肤素，具有较窄的重均分子量分布和数据分子量分布，更加适合人体吸收，在抗血栓药物中具有广泛的应用前景。
本发明提供的低分子量硫酸皮肤素的精制工艺，是一种酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺，特别以富含硫酸皮肤素的肝素钠副产物为原料，利用可以降解硫酸皮肤素的生物酶--硫酸软骨素B酶，结合超滤法，得到了该“酶-超滤法”综合精制工艺，制备出了分子量小、分子量分布均一、纯度高、利于人体吸收的低分子硫酸皮肤素，有效的解决了现有的利用盐酸、过氧化氢等化学试剂降解硫酸皮肤素，存在的盐酸用量大，水解反应进行缓慢，并且水解反应不易控，易造成水解过剧或水解程度不够，以及降解参数不易控制，反应稳定性及重复性差，造成收率低，降解产物分子量分布不均一，疗效不可控等问题。
本发明整体工艺中，结合树脂洗脱和乙醇沉淀工艺可有效去除核酸、蛋白、类肝素等杂质，保证产品纯度；通过硫酸软骨素B酶处理的酶解工艺可有效降低产品分子量；通过超滤工艺可有效控制产品分子量。本发明提供的低分子量硫酸皮肤素精制工艺，反应温和、稳定、可控，工艺重复性高，具有一定的经济效益和环境保护作用，适于工业化推广和应用。
实验结果表明，本发明提供的低分子量硫酸皮肤素精制工艺，可以将产品中反应核酸、蛋白浓度的260nm、280nm光吸收控制在0.06以下，可以将肝素类杂质的杂质含量控制在0.5％以下(可侧面反映纯度高)。产品经过酶解和超滤后，重均分子量控制在4000～4700Da范围内，分子量分布窄，重均分子量大于8000Da的组分占比不超过6.5％，分子量片段小于2000Da的组分占比不超过8.5％。另外，该工艺可有效保留原料中硫酸软骨素组分，酶解条件经摸索验证后能够保证中间产物的分子量与成品较接近，超滤损失少，产品总收率超过40％。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种低分子量硫酸皮肤素及其精制工艺、应用进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
实施例1
称取肝素钠副产物1Kg加10L水进行溶解，溶解为约10％浓度的料液，将料液升温至60℃，缓慢加入约10L树脂的树脂柱，进行树脂吸附；待吸附完毕后，用25L浓度为3.5％的氯化钠溶液，调温度至60℃，进行洗脱，弃取洗脱液；再用30L浓度为8％的氯化钠溶液(调温度至60℃)进行洗脱，收集该部分洗脱液至1#罐；洗脱完毕后，准确测量收集洗脱液体积为32L，加入12.8L乙醇，搅拌均匀后，静置3h，将上清悬浊液转移至2#罐中(1#罐底沉淀物为类肝素)，向2#罐中再次加入64L乙醇，搅拌均匀，静置6小时，弃取上清液，收集2#罐底的沉淀物，将该部分沉淀物进行55℃烘干，得到DS纯品，称量重量为712g。
将DS纯品加7.0L水进行溶解，溶解为约10％浓度的料液，调整pH为8.0，温度控制至36℃，加入料液体积0.7mL硫酸软骨素B酶(酶活性为1000IU/mL)，进行酶解4h。将料液升温至80℃，加入21.3g高锰酸钾，持续搅拌，进行氧化45分钟；将氧化后料液静置降温至50℃以下，用加滤纸的板框过滤器去除高锰酸钾氧化后的杂质产物，再用0.22um滤膜进行过滤除杂。收集料液体积约8L，再次补加6L纯化水，使用10KD超滤膜包进行循环超滤，收集透过液(保持0.1Mpa出口压力)。再将收集的透过液使用1KD的滤膜进行循环超滤，收集截留液，取样中控检测分子量，控制重均分子量的分子量分布在3000～5000Da。
检测物料体积为10L，加入300g氯化钠溶解，再加入25L乙醇，搅拌均匀后，放置8h，弃去上清，将沉淀物溶解，过滤、冷冻干燥、磨粉、混合、共收集冻干后的低分子硫酸皮肤素精品427g。
对本发明实施例1制备的低分子硫酸皮肤素精品(LMWDS)进行检测。
参见表1，表1为本发明实施例制备的LMWDS相关检测数据。
表1
Figure BDA0002313191040000201
表1检测结果显示，本发明提供的精制方案实施制备的低分子量类肝素质量可靠，纯度高。
实施例2
称取肝素钠副产物50Kg加500L水进行溶解，溶解为约10％浓度的料液，将料液升温至60℃，缓慢加入约500L树脂的树脂柱，进行树脂吸附；待吸附完毕后，用1250L浓度为3.5％的氯化钠溶液，调温度至60℃，进行洗脱，弃取洗脱液；再用1500L浓度为8％的氯化钠溶液(调温度至60℃)进行洗脱，收集该部分洗脱液至5#罐；洗脱完毕后，准确测量收集洗脱液体积为1600L，加入640L乙醇，搅拌均匀后，静置3h，将上清悬浊液转移至6#罐中(5#罐底沉淀物为类肝素)，向6#罐中再次加入3000L乙醇，搅拌均匀，静置8小时，弃取上清液，收集6#罐底的沉淀物，将该部分沉淀物进行55℃烘干，得到DS纯品，称量重量为37.5Kg。
将DS纯品加370L水进行溶解，溶解为约10％浓度的料液，调整pH为8.0，温度控制至36℃，加入料液37mL硫酸软骨素B酶(酶活性为1000IU/mL)，进行酶解4h。将料液升温至80℃，加入1.125Kg高锰酸钾，持续搅拌，进行氧化45分钟；将氧化后料液静置降温至50℃以下，用加滤纸的板框过滤器去除高锰酸钾氧化后的杂质产物，再用0.22um滤膜进行过滤除杂。收集料液体积约400L，再次补加400L纯化水，使用10KD超滤膜包进行循环超滤，收集透过液(保持0.1Mpa出口压力)。再将收集的透过液使用1KD的滤膜进行循环超滤，收集截留液，取样中控检测分子量，控制分子量分布在3000～5000Da。检测物料体积为700L，加入21Kg氯化钠溶解，再加入1750L乙醇，搅拌均匀后，放置8h，弃去上清，将沉淀物溶解，过滤、冷冻干燥、磨粉、混合、共收集冻干后的低分子硫酸皮肤素精品24.2Kg。
对本发明实施例2制备的低分子硫酸皮肤素精品(LMWDS)进行检测。
参见表1，表1为本发明实施例制备的LMWDS相关检测数据。
表1检测结果显示，本发明提供的精制方案实施制备的低分子量类肝素质量可靠，纯度高。
实施例3
称取肝素钠副产物100Kg加1000L水进行溶解，溶解为约10％浓度的料液，将料液升温至60℃，缓慢加入约1000L树脂的树脂柱，进行树脂吸附；待吸附完毕后，用2500L浓度为3.5％的氯化钠溶液，调温度至60℃，进行洗脱，弃取洗脱液；再用3000L浓度为8％的氯化钠溶液(调温度至60℃)进行洗脱，收集该部分洗脱液至5#罐；洗脱完毕后，准确测量收集洗脱液体积为3200L，加入1280L乙醇，搅拌均匀后，静置3h，将上清悬浊液转移至6#罐中(5#罐底沉淀物为类肝素)，向6#罐中再次加入6000L乙醇，搅拌均匀，静置8小时，弃取上清液，收集6#罐底的沉淀物，将该部分沉淀物进行55℃烘干，得到DS纯品，称量重量为75.3Kg。
将DS纯品加753L水进行溶解，溶解为约10％浓度的料液，调整pH为8.0，温度控制至36℃，加入料液75mL硫酸软骨素B酶(酶活性为1000IU/mL)，进行酶解4h。将料液升温至80℃，加入2.25Kg高锰酸钾，持续搅拌，进行氧化45分钟；将氧化后料液静置降温至50℃以下，用加滤纸的板框过滤器去除高锰酸钾氧化后的杂质产物，再用0.22um滤膜进行过滤除杂。收集料液体积约800L，再次补加600L纯化水，使用10KD超滤膜包进行循环超滤，收集透过液(保持0.1Mpa出口压力)。再将收集的透过液使用1KD的滤膜进行循环超滤，收集截留液，取样中控检测分子量，控制分子量分布在3000～5000Da。检测物料体积为1500L，加入45Kg氯化钠溶解，再加入3500L乙醇，搅拌均匀后，放置8h，弃去上清，将沉淀物溶解，过滤、冷冻干燥、磨粉、混合、共收集冻干后的低分子硫酸皮肤素精品46.4Kg。
对本发明实施例2制备的低分子硫酸皮肤素精品(LMWDS)进行检测。
参见表1，表1为本发明实施例制备的LMWDS相关检测数据。
表1检测结果显示，本发明提供的精制方案实施制备的低分子量类肝素质量可靠，纯度高。
以上对本发明提供的一种低分子量硫酸皮肤素以及酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺、应用进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不是不同于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种低分子量硫酸皮肤素，其特征在于，所述低分子量硫酸皮肤素的数均分子量为2000～5000Da；
所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量为2500～6500Da。
2.根据权利要求1所述的低分子量硫酸皮肤素，其特征在于，所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量的分子量分布为：
分子量小于2000Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的10wt％以下；
分子量大于8000Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的12wt％以下；
分子量为2000～8000Da的硫酸皮肤素占所述低分子量硫酸皮肤素全部的78wt％～90wt％。
3.根据权利要求1所述的低分子量硫酸皮肤素，其特征在于，所述低分子量硫酸皮肤素的重均分子量为3500～6000Da；
所述低分子量硫酸皮肤素的数均分子量为3000～4500Da；
所述低分子量硫酸皮肤素的比旋度小于等于-40°；
所述低分子量硫酸皮肤素的纯度为99％以上。
4.一种低分子量硫酸皮肤素的精制工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)将硫酸皮肤素溶液和硫酸软骨素B酶混合后，进行酶解后，得到料液；
2)向上述步骤得到的料液，加入强氧化剂进行氧化反应后，再经过过滤，得到滤后料液；
3)将上述步骤得到的滤后料液经过循环超滤后，得到低分子量硫酸皮肤素。
5.根据权利要求4所述的精制工艺，其特征在于，所述硫酸皮肤素溶液包括硫酸皮肤素水溶液；
所述硫酸皮肤素溶液的pH值为6.5～8.5；
所述硫酸皮肤素溶液的质量浓度为8％～12％；
所述硫酸皮肤素的重均分子量为15000～45000Da；
所述硫酸软骨素B酶与所述硫酸皮肤素溶液的体积比为0.001％～0.003％；
所述硫酸软骨素B酶的浓度为8000～12000IU/mL；
所述酶解的温度为35～37℃；
所述酶解的时间为3～5h。
6.根据权利要求4所述的精制工艺，其特征在于，所述强氧化剂包括高锰酸钾、高锰酸钠、过氧化氢和次氯酸钠中的一种或多种；
所述强氧化剂占所述料液的质量比为2％～5％；
所述氧化反应的温度为80～90℃；
所述氧化反应的时间为30～45分钟；
所述氧化反应后还包括静置降温步骤和/或除杂步骤；
所述过滤为微滤膜过滤；
所述微滤膜的孔径为0.1～0.45μm。
7.根据权利要求4所述的精制工艺，其特征在于，所述循环超滤前还包括稀释步骤；
所述稀释的滤后料液的质量浓度为3％～5％；
所述超滤为切向流超滤；
所述循环超滤的具体步骤为：
先采用第一超滤膜进行第一循环超滤后，收集透过液，再采用第二超滤膜进行第二循环超滤后，收集截留液；
所述第一超滤膜的过滤精度为8000～12000Da；
所述第一循环超滤的次数为100～500次；
所述第二超滤膜的过滤精度为800～1200Da；
所述第二循环超滤的次数为100～500次；
所述循环超滤后还包括后处理步骤。
8.根据权利要求7所述的精制工艺，其特征在于，所述后处理步骤包括溶解、沉淀、再溶解、过滤、冷冻干燥、研磨和混合中的一步或多步；
所述后处理步骤具体为：
将循环超滤后得到的截留液和氯化钠溶解后，再加入乙醇静置后，舍弃上清液，得到沉淀；
将上述步骤得到的沉淀再次溶解、冷冻干燥和磨粉后，得到成品低分子量硫酸皮肤素；
所述氯化钠与所述截留液体积比为2％～4％；
所述乙醇与溶解后的物料体积比值为(2～3)：1；
所述静置的时间为6～8h。
9.根据权利要求4～8任意一项所述的精制工艺，其特征在于，所述硫酸皮肤素由富含硫酸皮肤素的肝素钠副产物经制备后得到；
所述制备过程为：
A)将富含DS的肝素钠副产物和水进行溶解，得到原液；
B)将上述步骤得到的原液经过树脂吸附后，再用氯化钠溶液洗脱，得到洗脱后的原液；
C)将上述步骤得到的洗脱后的原液和乙醇混合静置后，再经过干燥，得到硫酸皮肤素；
所述原液的质量浓度为8％～12％；
所述树脂吸附的温度为50～70℃；
所述洗脱包括先洗脱杂质和再洗脱树脂。
10.权利要求1～4任意一项所述的低分子量硫酸皮肤素或权利要求4～9任意一项所述的精致工艺所精制的低分子量硫酸皮肤素在制备抗血栓药物中的应用。
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