CN104293866A - 一种使用硫酸软骨素酶生产硫酸乙酰肝素的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用硫酸软骨素酶生产硫酸乙酰肝素的工艺。首先将肝素钠粗品经过酶解、树脂吸附、氯化钠溶液洗脱得到洗脱物。将洗脱物用硫酸软骨素ABC酶或硫酸软骨素B酶进行酶解。利用这两种酶专一切断硫酸皮肤素结构中二糖单元之间1-4糖苷键的特异性，得到降解反应产物不饱和二糖。之后进行超滤、除重金属、氧化等精制步骤得到硫酸乙酰肝素精品。该法既克服了硫酸乙酰肝素与硫酸皮肤素表面所带负电荷密度相近难分离的特点，又避免了传统路线得到硫酸乙酰肝素所带进的重金属离子杂质，提高了产品收率，有显著的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产硫酸乙酰肝素的工艺，特别涉及一种使用硫酸软骨素酶生产硫酸乙酰肝素的工艺。
背景技术
硫酸乙酰肝素是一广泛存在于动物细胞表面的糖胺聚糖, 是药物舒洛地特的主要组成部分。它在细胞的信号传导、增生与分化、免疫调节、细胞黏附以及神经细胞的信息传递等方面具有重要的生物学功能 。硫酸乙酰肝素在组成糖基和糖苷键连接方式上类似肝素，但比肝素具有抗栓活性强 ,抗凝活性弱的优点 。由于其负电荷密度和分子量与硫酸皮肤素相近，故分离纯化硫酸乙酰肝素成为制约药物开发的难点。曾有文献表明，利用硫酸皮肤素与硫酸乙酰肝素结构上的不同，用班氏试剂可以与硫酸皮肤素生产沉淀从而将两者分离开来。但此方法收率低、周期长、成本高且引入较难除去的杂质铜离子而不被选择。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种使用硫酸软骨素酶生产硫酸乙酰肝素的工艺，利用这两种酶能够专一选择切断硫酸皮肤素氨基己糖和艾杜糖醛酸二糖之间的1-4糖苷键，将硫酸皮肤素降解成二糖小分子，从而与硫酸乙酰肝素分离开来，能够得到大批量的精品硫酸乙酰肝素。
一种使用硫酸软骨素酶生产硫酸乙酰肝素的工艺，包括如下制作步骤，浓度按质量百分比：
A将肝素钠粗品溶于浓度为2％的氯化钠溶液中，采用酶解法酶解，对酶解液用阴离子交换树脂充分吸附；
B步骤A中的阴离子交换树脂用浓度为3.0%-6.0%的氯化钠溶液进行洗脱，得到洗脱液经乙醇沉淀烘干得到洗脱物；
C步骤B中得到的洗脱物溶为10.0%浓度，调节pH值为8.0-8.5，添加洗脱物重量2.0%-3.5%的CaCl2，后添加洗脱物重量3.0%-4.5%的Na2CO3充分搅拌反应，将沉淀过滤除去得到上清液；
D将步骤C中的上清料液调节pH值为6.0-7.0，温度20-40℃，加入硫酸软骨素ABC酶量为：酶/洗脱物=1000-2000 IU/Kg，搅拌酶解8-12h；或调节上清料液pH值7.0-8.5，温度20-40℃，加入硫酸软骨素B酶量为：酶/洗脱物=1500-2500 IU/Kg洗脱物，搅拌酶解8-12h；
E将酶解液用C步骤再次除蛋白，调pH值至7.0，用3K超滤膜进行超滤3-4h，取截留液用乙醇1.5-2.0倍沉淀；
F将步骤E所得沉淀物用纯化水溶解，加入乙二胺四乙酸EDTA进行搅拌、吸附、过滤，滤液用1.5-2.0倍药用乙醇沉淀，所得的沉淀物溶解并用双氧水氧化4h；
G将步骤F所得料液加入1.5-2.0倍药用乙醇沉淀，弃上清，所得固体沉淀物再用纯化水溶成10%浓度，经0.22微米滤芯过滤，然后真空冷冻干燥，最终得到硫酸乙酰肝素精品。
优选的，本发明提到的酶解法是指：
调节步骤A的肝素钠溶液pH值8.0-8.5、温度35-38℃，加入肝素钠粗品重量的1.0%-2.0%的胰蛋白酶解3-4h，酶解完毕调料液pH值7.0-7.5，用强碱型阴离子交换树脂对其充分吸附。
本发明与现有工艺相比，其优点和有益效果在于：
1. 本发明中前期获得低盐度洗脱物并不影响肝素钠的收率，并且为肝素钠的前期生产过程除掉大部分杂质；
2. 本发明中所用到的酶制剂是基因重组酶，它是将来源于肝素黄杆菌的硫酸软骨素B酶基因与麦芽糖结合蛋白基因融合于大肠杆菌中可溶性表达获得此酶，与传统酶相该酶具有酶效高、催化能力强，每升料液体积含酶活在5000IU-7700 IU之间；
3. 与传统工艺相比，利用酶制剂得到硫酸乙酰肝素收率高、纯度高、生产周期短且不会引入重金属杂质。
具体实施方式
实施例1：
在搅拌条件下，将100kg粗品肝素钠溶于1000L质量百分比浓度为2%氯化钠溶液中，以下无特殊说明均为质量百分比浓度。将料液温度调至37℃，然后用浓度为6mol/L的氢氧化钠将料液pH值调节至8.5，加入1.5Kg胰蛋白酶酶解3h。酶解完毕将料液调为pH值7.0，料液用强碱型阴离子交换树脂完全吸附至无料液。配置两倍量树脂体积且浓度为5.3%的氯化钠溶液对树脂柱进行洗脱。将得到的洗脱液用1.6倍体积的药用乙醇沉淀4h,弃上清且60℃烘干5h，得到洗脱物为17.7Kg。将此沉淀物溶于177L纯化水中，调节料液pH值8.0，,添加0.4Kg CaCl2，后添加0.57KgNa2CO3进行充分搅拌反应1h，将沉淀过滤取上清液。用6mol/L盐酸调节料液pH值6.5，控制温度30℃，加入20000IU单位硫酸软骨素ABC酶量，搅拌反应9h。酶解结束，将酶解液用C步骤再次除蛋白。之后调料液pH值7.0，用3K超滤膜进行超滤3h，取截留液用乙醇2.0倍沉淀得到沉淀物干品重约12.3Kg。将所得沉淀物用80L纯化水溶解，加入乙二胺四乙酸EDTA0.76Kg进行搅拌4h并过滤，滤液用2.0倍药用乙醇沉淀。所得的沉淀物用纯化水溶为100L，调节pH值为10.0，控制料液温度调至35℃，加入30％双氧水体积1L，氧化4h。氧化完成经0.22微米微孔滤膜过滤，滤过液用6mol/L盐酸将pH值调节为7.0，加入1.5kg的氯化钠，充分溶解后，加入200L药用乙醇，搅拌30min，沉淀4小时。向沉淀物种加入纯化水53L将沉淀物溶解，然后经0.22微米滤膜过滤至洁净区真空冷冻干燥48h制得精品硫酸乙酰肝素10.5Kg。经过HPLC检测其纯度为94.6%，比旋度为+65.3，效价为7.6IU/mg。
实施例2：
在搅拌条件下，将100kg粗品肝素钠溶于1000L浓度为2%氯化钠溶液中。将料液温度调至35℃，然后用浓度为6mol/L的氢氧化钠将料液pH值调节至8.3，加入肝素钠粗品重量的1.3Kg的胰蛋白酶酶解4h。酶解完毕将料液调为pH值7.2，料液用强碱型阴离子交换树脂完全吸附至无料液。配置两倍量树脂体积且浓度为4.6%的氯化钠溶液对树脂柱进行洗脱。将得到的洗脱液用2.0倍体积的药用乙醇沉淀4h,弃上清且60℃烘干5h，得到洗脱物为17.6Kg。将此沉淀物溶于176L纯化水中，调节料液pH值8.3，添加0.52Kg的CaCl2，后添加0.70Kg的Na2CO3进行充分搅拌反应1h，将沉淀过滤取上清液。用6mol/L盐酸调节料液pH值7.5，控制温度36℃，加入硫酸软骨素B酶量35200IU，搅拌反应10h，将酶解液用C步骤再次除蛋白。之后调料液pH值7.0，用3K超滤膜进行超滤3h，取截留液用乙醇2.0倍沉淀得到沉淀物干品重约12.8Kg. 将所得沉淀物用80L纯化水溶解，加入乙二胺四乙酸EDTA1.2Kg进行搅拌4h并过滤，滤液用2.0倍药用乙醇沉淀。所得的沉淀物用纯化水溶为120L，调节pH值为10.0，控制料液温度调至37℃，加入30％双氧水体积12L，氧化4h。氧化完成经0.22微米微孔滤膜过滤，滤过液用6mon/l盐酸将pH值调节为7.0，加入1.5kg的氯化钠，充分溶解后，加入200L药用乙醇，搅拌30min，沉淀4小时。向沉淀物种加入纯化水60L将沉淀物溶解，然后经0.22微米微孔滤膜过滤至洁净区真空冷冻干燥48h制得精品硫酸乙酰肝素11.2Kg。经过HPLC检测其纯度为95.6%，比旋度为+61.5，效价为8.9IU/mg。
实施例3：
在搅拌条件下，将100kg粗品肝素钠溶于1000L浓度为2%氯化钠溶液中。将料液温度调至38℃，然后用浓度为6mol/L的氢氧化钠将料液pH值调节至8.2，加入肝素钠粗品重量的1Kg的胰蛋白酶酶解4h。酶解完毕将料液调为pH值6.9，料液用强碱型阴离子交换树脂完全吸附至无料液。配置两倍量树脂体积且浓度为3.7%的氯化钠溶液对树脂柱进行洗脱。将得到的洗脱液用2.0倍体积的药用乙醇沉淀4h,弃上清且60℃烘干5h，得到洗脱物为16.2Kg。将此沉淀物溶于176L纯化水中，调节料液pH值8.0，添加0.6Kg的CaCl2，后添加0.7Kg的Na2CO3进行充分搅拌反应1.5h，将沉淀过滤取上清液。用6mol/L盐酸调节料液pH值8.0，控制温度38℃，加入硫酸软骨素B酶量40000IU，搅拌反应10h，将酶解液用C步骤再次除蛋白。之后调料液pH值7.0，用3K超滤膜进行超滤4h，取截留液用乙醇1.7倍沉淀得到沉淀物干品重约11.6Kg. 将所得沉淀物用80L纯化水溶解，加入乙二胺四乙酸EDTA0.9Kg进行搅拌4h并过滤，滤液用2.0倍药用乙醇沉淀。所得的沉淀物用纯化水溶为110L，调节pH值为10.0，控制料液温度调至38℃，加入30％双氧水体积1.1L，氧化4h。氧化完成经0.22微米微孔滤膜过滤，滤过液用6mon/l盐酸将pH值调节为7.0，加入1.5kg的氯化钠，充分溶解后，加入200L药用乙醇，搅拌30min，沉淀4小时。向沉淀物种加入纯化水60L将沉淀物溶解，然后经0.22微米微孔滤膜过滤至洁净区真空冷冻干燥48h制得精品硫酸乙酰肝素10.2Kg。经过HPLC检测其纯度为97.2%，比旋度为+67.1，效价为8.2IU/mg。
Claims (2)
1.一种使用硫酸软骨素酶生产硫酸乙酰肝素的工艺，其特征是包括如下制作步骤，浓度按质量百分比：
将肝素钠粗品溶于浓度为2％的氯化钠溶液中，采用酶解法酶解，对酶解液用阴离子交换树脂充分吸附；
步骤A中的阴离子交换树脂用浓度为3.0%-6.0%的氯化钠溶液进行洗脱，得到洗脱液经乙醇沉淀烘干得到洗脱物；
步骤B中得到的洗脱物溶为10.0%浓度，调节pH值为8.0-8.5，添加洗脱物重量2.0%-3.5%的CaCl2，后添加洗脱物重量3.0%-4.5%的Na2CO3充分搅拌反应，将沉淀过滤除去得到上清液；
将步骤C中的上清料液调节pH值为6.0-7.0，温度20-40℃，加入硫酸软骨素ABC酶量为：酶/洗脱物=1000-2000 IU/Kg，搅拌酶解8-12h；或调节上清料液pH值7.0-8.5，温度20-40℃，加入硫酸软骨素B酶量为：酶/洗脱物=1500-2500 IU/Kg洗脱物，搅拌酶解8-12h；
将酶解液用C步骤再次除蛋白，调pH值至7.0，用3K超滤膜进行超滤3-4h，取截留液用乙醇1.5-2.0倍沉淀；
将步骤E所得沉淀物用纯化水溶解，加入乙二胺四乙酸EDTA进行搅拌、吸附、过滤，滤液用1.5-2.0倍药用乙醇沉淀，所得的沉淀物溶解并用双氧水氧化4h；
将步骤F所得料液加入1.5-2.0倍药用乙醇沉淀，弃上清，所得固体沉淀物再用纯化水溶成10%浓度，经0.22微米滤芯过滤，然后真空冷冻干燥，最终得到硫酸乙酰肝素精品。
2.根据权利要求1所述的使用硫酸软骨素酶生产硫酸乙酰肝素的工艺，其特征是：所述的酶解法是指：
调节步骤A的肝素钠溶液pH值8.0-8.5、温度35-38℃，加入肝素钠粗品重量的1.0%-2.0%的胰蛋白酶解3-4h，酶解完毕调料液pH值7.0-7.5，用强碱型阴离子交换树脂对其充分吸附。
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