CN1283636A

CN1283636A - 一种肝素及其制备方法

Info

Publication number: CN1283636A
Application number: CN 00125093
Authority: CN
Inventors: 沙龙华; 金武
Original assignee: HUIHAI BIO-CHEMICAL PRODUCTS FACTORY SHANGHAI
Current assignee: HUIHAI BIO-CHEMICAL PRODUCTS FACTORY SHANGHAI
Priority date: 2000-09-07
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2001-02-14
Anticipated expiration: 2020-09-07
Also published as: CN1111171C

Abstract

本发明为一种肝素及其制各方法,肝素的提取起始原料为肠粘膜,通过酶水解或者盐水解得到含有肝素的溶液,再通过聚苯乙烯二乙烯苯三甲胺季胺型强碱性阴离子交换树脂吸附,洗涤,洗脱出肝素类粘多糖物质,本发明特征是此物质经过精制、纯化操作最终得到精品肝素,采用有机溶媒的分级沉淀,从中分离出类肝素类其他粘多糖,如硫酸皮肤素等物质,再经过二次过氧化氢氧化的精制操作。使最终精品肝素质量达到单位效价高,无菌、无热原、无杂质,透光率、收得率均达到国际国内领先水平,且操作简便,适合于规模生产。

Description

一种肝素及其制备方法

本发明公开了一种肝素及其制备方法，属一种生物药品的制备方法。

肝素是天然抗凝药，它的商品有肝素的钠盐称肝素钠，和肝素的钙盐，称肝素钙。10mg肝素在4小时内能抑制500ml血浆凝固，临床上广泛用于各种外科手术前后防止血栓形成和栓塞，输血时预防血液凝固和保存鲜血时的抗凝剂，小剂量时用于防治高血脂症和动脉粥样硬化。众所周知，肝素广泛分布于哺乳动物组织中，如肠粘膜，十二脂肠，肺、肝、胰脏、胎盘及血液中。肝素和大多数粘多糖一样在体内作为蛋白质结合的复合物存在。这种复合物抗凝活性，而随着蛋白去除其活性增加。传统肝素钠生产工艺，有从牛肺提取，产率低、工艺繁锁，且最终产品达不到质量要求。另外，从肠粘膜提取有从十六烷三甲基合溴化氨(CTAB)洛合工艺及乙醚用分液漏斗淬取方法，工艺繁锁，收率少，不宜工业化生产。

本发明的目的是公开一种肝素及其制备方法，它具有简化生产工序，产品质量高并提高工业化生产能力。

本发明是这样实现的，在提取工段中，注意到肝素在碱性介质内较为稳定，且碱能打断肝素与蛋白质的结合，故组织内肝素的提取都采用钠盐的碱性热水或沸水浸提。这样的提取物内，仍存在可溶性肝素－蛋白质复合物。本发明在将粗品肝素内肝素－蛋白质分解有两类方法(1)酶解技术目前一般在提取时就加入蛋白质水解酶，所使用的酶有细菌蛋白酶，胰蛋白质酶、胰酶、胃蛋白酶和本瓜蛋白水解酶，(2)盐解技术，盐解一般是用碱性食盐水提取与热变性和凝结剂(明矾、硫酸铝)等变性措施相结合，以除去蛋白质。上述方法得到的产物仍含有其它粘多糖、核酸及未除尽的蛋白质。本发明采用阴离子交换剂或长链季铵盐进行分级分离，再经过有机溶剂分级沉淀和H₂O₂二次氧化，制得精品肝素。

一、酶解树脂法

1、工艺路线

2、工艺过程(按以下次序进行)

(1)酶解新鲜肠粘膜(总固体5-7％)，搅拌中加入绞碎的胰脏5-10kg(可用胰酶粉约0．5-1kg)用30-40％氢氧化钠调pH8．5-9．0左右，升温至40℃-50℃，保温2-3小时，pH值应保持在8．5-9．0。

加入50公斤粗盐，升温至90℃左右，用6N盐酸调pH6．5左右，停止搅拌，保温20分钟，以布袋过滤。

(2)离子交换吸附，滤液冷至50℃以下，用6N氢氧化钠调pH7．0加入50公斤D-254强碱性阴离子交换树脂，搅拌5小时左右，交换完毕，弃除液体。

(3)洗涤与洗脱，用自来水漂洗树脂至水清。树脂用2M氯化钠(约树脂体积的等量)搅拌洗涤15分钟，弃去洗涤液，再用1．2M氯化钠(约树脂体积的两倍)同法洗涤2次。

用3-5M氯化钠(约树脂体积的一半量)洗脱1小时，收集洗脱液，然后用3M氯化钠(约树脂体积的三分之一量)同法洗脱2次。合并洗脱液。

(4)乙醇沉淀：用纸浆助滤，将洗脱液过滤一次，使达澄清。加入体积的0．9倍量95％乙醇，冷处沉淀8-12小时。虹吸上清液弃除，抽滤干或布袋吊滤干后加入95％乙醇洗2-3次抽干，60-80℃真空干燥，得肝素粗品。

(5)酸化：按粗品∶水∶氯化钠为7∶100∶1，加入纯水和氯化物，将粗品投入反应锅内后开动搅拌，使粗品完全溶解，同时使反应锅降温到10℃，用6NHCL，调液体pH1．9，板框压滤(硅藻土助滤)滤液调pH9．0-11．0。

(6)第一次氧化：清液恒温在25℃容器中，缓缓加入2％过氧化氢pH在9-11中保温24小时，0．2μ微孔滤膜过滤后，0．8倍量95％乙醇沉淀过夜(5-10℃)。

(7)第二次氧化：虹吸上清废乙醇，沉淀物加入粗品重量10倍量的1％氯化钠溶液中充分溶解后，冷却10℃以下，用0．2μ微孔滤膜过滤后升温至25℃，用5N氢氯化钠调pH9-11，加入0．5-1．5％H₂O₂保温24小时后再用0．2μ微孔滤膜过滤后，调pH4．0-7．00清液加入0．7倍量95％乙醇沉淀，静置过夜。

(8)6小时后吸去肝素上层酒精清液，粗品重量6-10倍1％无热原氯化钠溶液中，溶解后，冷至10℃以下，用0．2μ微孔滤膜再过滤清：清液加入0．7倍量95％乙醇沉淀，静置过夜。

(9)次日虹吸废乙醇后，沉淀物滤干，或吊滤干后用95％乙醇洗涤2-3次。

(10)成品进入60-80℃，真空干燥箱，干燥24小时-36小时后进行球磨，粉碎后得精品肝素170-180iu／mg，透光率达英国药典PB98版标准。

二、盐解树脂法

1、工艺路线

2、工艺过程(按以下次序进行)：

1)提取：取新鲜肠粘膜1000公斤，按3．3％加入食用盐，用氢氧化钠调节pH8．8-9．0逐步升温至50-55℃，保温2小时，继续升温至95℃维持10分钟，冷却至60℃以下，用30目双层布过滤，收集滤液。

2)吸附：将备用的D-254树脂按3-5％比例加入搅拌，吸附6小时，停止搅拌，弃除废液，收集树脂。用自来水漂洗树脂洗清为止。

3)洗涤与洗脱，将漂洗清的树脂，倒入缸内，用1．3N氯化钠溶液为树脂量的1．5倍体积搅拌洗涤1小时，滤干后再用1．4N氯化钠溶液洗涤一次，最后树脂用3N氯化钠搅拌洗涤2次，第一次为5小时，第二次2小时，第一次的量为树脂1．5倍，第二次为树脂的1倍，然后收集洗脱液。

4)乙醇沉淀，合并二次滤液，用纸浆助滤，将滤液过滤至澄清，加入体积的1倍量(V／V)95％乙醇沉淀过夜，虹吸上清液弃除，抽滤或者布袋吊滤干后，加入95％乙醇洗2-3次抽干，60-80℃真空干燥箱内干燥，得肝素粗品。接下工序按照酶解工艺5-10条办法进行操作。

本发明能够工业化生产中利用酸化后去除酸性杂蛋白再经过的二次过氧化氢氧化技术所获肝素产品经××××药品测试：产品的单位效价始终保持在每毫克170国际单位以上，而中国药典、欧洲药典等都表达在每毫克150国际单位以上。精制的肝素溶解度、澄清度及在紫外光中的吸收度均达到国内外优级产品技术指标；在波长280nm，OD值规定为0．20以下，而本发明的产品在0．060-0．080，在波长260nm，OD值规定为0．15以下，而本发明产品在0．040-0．050，本发明的操作过程中，(不受外因干扰)产品全部达到无菌、无热原。特别是近年来，国外客商要求产品中的硫酸皮肤素含量必须小于3％以下，而本发明生产的肝素，其硫酸皮肤素含量仅在0．5％左右。

实施例1：

一、粗制工段：

2500千克新鲜肠粘膜投入反应锅内，在不断搅拌中加入猪胰酶粉12．5千克，用30-40％氢氧化钠调pH8．0-8．5，升温至45℃，保温2-3小时。加入125千克食盐，升温至90℃用6N盐酸调pH6．5±停止搅拌，保温20分钟，以布袋过滤，得清液约3000升，清液用6N氢氧化钠调pH7．0，LKTY120千克D-254树脂搅拌，吸附5小时，弃除液体，收集吸附后树脂，用自来水漂洗清，树脂用2M氯化钠搅拌洗涤15分钟，再用1．2M氯化钠洗涤2次。洗脱改用5M氯化钠65知搅拌洗脱1小时，收集洗脱液，再用5M氯化钠40知洗脱半小时，收集滤液与搅拌洗脱1小时，收集洗脱液，再用1．2M氯化钠洗涤2次。洗脱改用5M氯化钠65升搅拌洗脱1小时，收集洗脱液，再用5M氯化钠40升洗脱半小时，收集滤液与第一次合并约为100升，用布氏漏斗清后加入90升95％乙醇沉淀过夜，次日虹吸上清废乙醇，沉淀物滤干后用95％乙醇洗1-2遍，进入真空干燥箱60-80℃干燥24小时，得粗品肝素1050克，每毫克效价为102单位。总效价为1．07亿单位。

二、精制工段

1050克粗品加入含1％氯化钠溶液12升搅拌至充分溶解后，用6N盐酸调pH1．9，板框压滤收集清液11．5L，调pH9．0-11．0后加入230ml过氧化氢，25℃保温24小时用0．2μ微孔滤膜滤后0．8倍量95％乙醇沉淀6小时后虹出废滤，沉淀物加入10升无热原水(含1％氧化钠)溶解后，再用0．2μ微孔滤膜滤过，调pH9-11，升温25℃加入115毫升过氧化氢保温24小时后，过0．2μ微孔滤膜0．65倍95％乙醇沉淀，沉淀物进行二次溶解过0．2μ微孔滤膜后，0．7倍95乙醇沉淀，静置过夜，次日滤干沉淀物，用95％乙醇洗涤1-2次后进入60-80℃真空干燥箱内干燥36小时，进行球磨粉碎后，得精品肝素581克，测效价173iu／毫克，总效价1．005亿u。

实施例2

一、粗制工段

2500千克新鲜肠粘膜中，加入82．5千克食用盐，用氢氧化钠调pH8．8-9．0，逐步升温至50-55℃保温2小时。继续升温至95℃，维持10分钟，冷却到60℃以下，用双层纱布过滤收集滤液约2600ml。然后加入D-254树脂125千克，搅拌吸附6小时，停止搅拌，弃除废液，收集树脂，用水漂洗清；加入1．3N氯化钠溶液190升搅拌洗涤1小时；滤干后用1．4N氯化钠溶液190升搅拌洗涤，搅拌洗涤1小时后，滤干树脂，加入190升3N氯化钠搅拌洗脱5小时，收集滤液，树脂再加入120升3N氯化钠搅拌2小时，合并2次滤液310升后，加入95％乙醇310升搅拌10分钟后，静置过夜；次日虹吸上清液废乙醇，沉淀物滤干后用95％乙醇洗1-2遍，进入真空干燥箱60-80℃干燥24小时得粗品938克，单位效价105单位／毫克，总效价为0．985亿单位。

二、精制工段

精制工段操作同实实施例(1)粉碎后得精品肝素529克，测效价为176iu／mg，总效价为0．931追加单位。

本发明简化了传统生产技术，本发明所获得的肝素质量达到单位效价高，无菌、无热原、无杂质、透光率、收集率均达到国际国内领先水平，且操作简单，并适合于工业化生产，为生产肝素的一种新颖技术。

Claims

1、一种肝素及其制备方法，肝素提取大多数可从牛肺；哺乳动物的肝脏，胸腺和牛、羊、猪的肠粘膜中提取，通过酶水解，或者盐水解，用强碱性阴离子交换树脂分离后得到肝素粗品，酶解生产肝素粗品按以下次序工艺流程进行：

肠粘膜在pH8．5-9．0条件下加入胰酶和氯化钠升温至40℃-50℃，保温2-3小时后升温到90℃，用6N氢氧化钠调pH6．5，布袋过滤得清液，加入3-5％的D254树脂搅拌吸附5小时，树脂经过洗涤后，洗脱出含肝素的粗品液用1：0．9倍量95％乙醇沉淀后，真空干燥得粗品肝素。盐解生产肝素粗品按以下次序工艺流程进行：肠粘膜加入3．3％食用盐、氢氧化钠调pH8．8-9．0逐步升温至50-55℃，保温2小时，继续升温至95％，维持10分钟冷却至60℃，以下用30目双层纱布过滤，收集滤液，再加入3-5％的D254树脂搅拌吸附6小时，弃除废液，树脂用水漂洗后，经过洗涤、洗脱，得含肝素液体，加入1倍量95％乙醇沉淀过夜，虹吸上清(弃除)，抽滤或布袋吊滤干后，加95％乙醇洗2-3次，进60℃-80℃真空干燥箱内干燥得肝素粗品，粗品肝素再进行精制和纯化，其特征在于：

精制纯化经过二次过氧化氢的氧化及有机溶媒的分级沉淀，其精制的工艺流程为：粗品溶解于10-15倍量1％盐水中加入6N盐酸调pH1．0-2．0，在5℃-10℃条件下过滤出清液，调pH9．0-11．0加入0．5-1．5％H₂O₂升温25℃并保温24小时后，用0．2μ的微孔滤膜过滤后，0．8倍量95％酒精沉淀6小时后，虹吸出上清，沉淀物用1％氯化钠盐水溶解后再调pH9．0-11．0再加入1．5％H₂O₂升温25℃，并保温24小时后，用0．2μ的微孔滤膜过滤后，0．7倍量95％酒精沉淀6小时后，虹吸出上清，沉淀溶解于粗品重量6-10倍的1％无热原氯化钠溶解中，冷至10℃以下，用0．2μ微孔滤膜再将液体滤至澄清，清液加入0．7倍量95％酒精沉淀静止过夜，次日吸出上清液，沉淀滤干后，95％乙醇洗涤1-2次后进60℃-80℃真空干燥箱，干燥24-36小时后，球磨后得精品肝素。

2、根据权利要求1所述的肝素制备方法，其特征在于所述的肝素酸化，用6N盐酸调pH1．7-2．0，最佳pH为1．9，以此来去除大量酸性蛋白。

3、根据权利要求1所述的肝素制备方法，其特征在于所述的肝素二次氧化，均采用过氧化氢方法，及控制的乙醇分级沉淀中掌握用量为0．8倍、0．7倍、0．7倍量，最好在第三次酒精加量为0．65倍量。

4、根据权利要求1所述肝素制备方法，其特征在于所述的粗品肝素的酶解工艺品中所用酶包含胰酶，胰脏，蛋白酶及肝素专用酶等，其粗品的质量控制在80u／mg-100u／mg之间。

5、一种由上述权利要求肝素制备方法所获得的肝素，其特征在于单位效价≥160iu／mg，可在160-180iu／mg之间；硫酸皮肤素检出量≤0．5％，透光率280nm在≤0．08，260nm在≤0．06，400nm在≤0．018，420nm在≤0．015，470nm在≤0．010，产品为无菌、无热原产品。