CN107759712A - 羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用 - Google Patents

羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了羊来源的低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠。上述羊源的低分子肝素都有着共同的种源特征，在化学结构上，其主要二糖ΔUA2S‑GlcNS6S（ΔⅠS）含量在66%‑74%之间。羊低分子肝素与猪来源的低分子肝素，理化性质相似，生物学活性相近，拓展了低分子肝素类药物的来源。本发明介绍的羊低分子肝素制备方法，简单易行，工艺稳定，所得产品经过精制，可完全可符合各药典对现行低分子肝素的要求。羊低分子肝素还具有猪来源低分子肝素所不具有的清真性，在广大穆斯林人群、国家和地区，有着巨大的市场，可应用于抗凝、抗栓、抗炎、抗癌及清真药物。

Description

羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及羊来源的低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，其具有清真性，属于医药生物技术领域。
背景技术
低分子肝素(Low Molecular Weight Heparin，LWMH)，是目前临床上应用最广泛最重要的抗凝抗栓药物，一些低分子肝素还被广泛应用于抗炎和抗癌等临床治疗。低分子肝素经天然大分子肝素解聚制备，目前医用低分子肝素的来源，几乎均是猪肠粘膜肝素。
不同动物或器官来源的肝素，化学结构上存在着一定的差异。肝素的分子结构均由氨基葡萄糖和两种糖醛酸(90％艾杜糖醛酸、10％葡萄糖醛酸)中的一种组成二糖重复单元，可以用一个四糖单元表示，如下中的a和b，而c则显示与抗凝血酶结合的五糖结构，是维持抗凝活性所必需的核心结构。
备注：a有序“规则区”结构规整的三硫酸化二糖重复单元——ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)，在分子链中占主要；b无序“不规则区”硫酸化程度低，结构变化多样，在分子链中出现的频率较小；c与抗凝血酶结合的五糖结构，粗体表示的是维持抗凝活性所必需的，如除去则抗凝活性下降95％，斜体表示的也很重要，脱去后抗凝活性将下降25-50％。
本发明人在之前的专利申请(申请公布号：CN 105131153 A)中，除了公布一种抗凝 抗栓的羊依诺肝素钠外，还详细描述了羊肝素和猪肝素等在分子结构、二糖组成、理化性质和生物学活性等方面的异同。羊肝素中，主要二糖ΔⅠS的含量在66％-74％之间，次要二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)和ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)的含量分别是8％-10％和4％-6％，而ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS在猪肠粘膜肝素中则分别是58％-66％、9.5％-11.5％和5.8％-7.8％，羊肝素和猪肝素的糖链显著不同，在理化性质和生物学活性上也呈现出差异。
目前市场和临床上，没有羊来源肝素制备的低分子肝素。羊肝素和猪肝素明显不同，由其制备出的羊低分子肝素也将于猪肝素不同。另外，清真，是穆斯林在中国流行的专用名称，穆斯林教义对食品和药品等有着明确的要求，哺乳动物中只允许食用牛羊等反刍动物产品，禁食猪和狗等不反刍动物产品。全球穆斯林人口2013年突破16亿，占全球69亿人口的23％。在一些由穆斯林人口占多数的国家，如印度尼西亚、巴基斯坦、伊朗等等，符合穆斯林教义的清真药品有着无可比拟的优势。清真世界广泛缺乏清真药物，猪来源的肝素类药物不具有清真性，而羊源肝素则具有清真性，因此，开发清真的羊低分子肝素，有着极为重要的经济和社会价值。
发明内容
本发明的目的在于提供几种羊来源的低分子肝素——羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，包括它们的制备方法及在抗凝抗栓抗癌和清真药物中的应用。
本发明的目的，将通过以下技术方案得以实现：
几种羊低分子肝素——羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，是以羊肝素制备得到的。
上述羊低分子肝素制备所用的原料——羊肝素，其制备和预处理包括如下步骤：采用市售粗品羊肝素钠，提纯采取本行业所熟知的工艺，即以水溶解后保温盐解碱解，再加蛋白酶水解，水解液调pH后以阴离子交换树脂吸附并洗脱，以醇沉沉淀回收；回收后的羊肝素，采用质量浓度为1％-3％的氯化钠水溶液溶解至质量浓度5％-10％，优选以终体积浓度为0.1％-5％双氧水进行脱色0.5小时以上，反应液精过滤后优选以乙醇或其他有机溶剂沉淀回收，所用乙醇体积优选为反应液的1-3倍。
优选地，所述经预处理得到的羊肝素，抗凝活性全绵羊血浆法折干后不少于150单位 每毫克；且3.3％质量浓度的水溶液澄清且色度不深于5号标准色；所述色度不达标的羊肝素，可再进行一次或多次脱色处理，直至色度合格。
优选地，所述羊肝素与猪肝素的差异，主要体现在分子量分布、二糖组成、活性对比和核磁图谱显示的结构差异上。
优选地，所述羊肝素与猪肝素在分子量分布与分子量，猪肝素在15000Da-19000Da之间，而羊肝素则在13000Da-17000Da之间，分子量要小一些；
优选地，所述羊肝素与猪肝素的二糖组成与差异，参照USP分析方法，猪肝素中的主要的二糖单元(ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS)分别在58％-66％、9.5％-11.5％和5.8％-7.8％之间，而羊肝素则在66％-74％、8％-10％和4％-6％之间，有显著的差异；而与抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性至关重要的核心五糖中3-位硫酸化的四糖峰——ΔⅡA-ⅡSglu，猪肝素在2.1％-2.5％之间，而羊肝素是1.7％-2.1％；另外，整体的二糖组成情况看，高硫酸化组份(ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS)羊肝素是在80％以上，而猪肝素则最低于78％，羊肝素中硫酸化的程度更高。
优选地，所述羊肝素与猪肝素在抗凝活性的差别，全绵羊血浆法抗凝、抗Ⅹa和抗Ⅱa三项上，羊肝素与猪肝素相近，但羊肝素要稍低一下；羊肝素与猪肝素的抗Ⅹa/抗Ⅱa比值上一致，均在0.95-1.05之间。
优选地，所述羊肝素与猪肝素在结构上的差别，核磁氢谱上，羊肝素与猪肝素主体一致，但在一些细节结构上相互间有一定的差异，在δ2.04ppm处的氮-乙酰基的甲基峰，羊肝素积分比猪肝素小，反映出羊肝素其中的N-乙酰基修饰较少，对应地，N-磺酸根的修饰比例则更高。
达肝素钠，现行各药典规定为猪来源，是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法包括亚硝酸解聚、硼氢化钠还原和分子量分级三个步骤。
优选地，羊达肝素钠的制备方法，参照猪达肝素钠的制备方法，但相关工艺参数不同，具体包括如下步骤，
S11、亚硝酸解聚，是将上述预处理后的羊肝素溶解，调节溶液pH至酸性，然后加入亚硝酸钠，搅拌反应，得到解聚液；
S12、硼氢化钠还原，是将S11中解聚液的pH调至中性后，加入硼氢化钠，低温下继续搅拌反应，加酸中和多余的硼氢化钠，再加盐和醇沉并干燥得到羊达肝素钠粗品；
S13、羊达肝素钠的成品制得，是将S12中得到的羊达肝素钠粗品配制成溶液，以阴离 子交换层析(或超滤)进行分子量分级，一种分级方法是采用阴离子交换树脂，是将羊达肝素钠粗品溶液低盐浓度上样，以稍高的盐浓度洗杂，最后以更高的浓度分部收集洗脱，各部分的洗脱产品再以醇沉回收并干燥，均进行分子量及分子量分布分析，经计算后合并适当的组分，纯化水复溶后，0.22μm除菌过滤并冷冻干燥，收获产品；另一种分级方法是将羊达肝素钠粗品溶液以3KDa的超滤膜进行至少两个轮次以上的超滤，超滤浓缩液经0.22μm除菌过滤后直接冷冻干燥回收，也可以醇沉回收后干燥。
优选地，所述S11中羊肝素的水溶液在5％-15％质量浓度之间，更优选在10％；所述pH调节在2-5之间，更优选pH在2.9-3.3；所述亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为1:20-50，更优选在1:35；所述解聚时间1小时-6小时之间；相对应地，羊达肝素钠制备所用的解聚强度，要比猪达肝素钠制备稍弱一些，以上优选的亚硝酸钠数量更少，pH值更高，解聚时间更短。
优选地，所述S12中硼氢化钠还原的温度不能过高，范围在0℃-40℃之间，更优地是在2℃-15℃之间。
优选地，所述S12中硼氢化钠的用量与所述S11中羊肝素重量比为1:5-15，更优选为1:10；所述还原时间不低于0.5小时。
优选地，所述S13中羊达肝素钠的阴离子交换层析分级时，上样浓度在10-100毫克每毫升，上样时盐浓度控制在300毫摩尔每升以下，上样载量5-50毫克羊达肝素每毫升树脂之内。
优选地，所述S13中的稍高盐洗杂，是不高于450毫摩尔每升的盐溶液清洗和平衡已吸附羊达肝素的树脂；
优选地，所述S13中的更高盐洗脱，是用1摩尔每升以上的高浓度盐溶液洗脱出羊达肝素钠，洗脱液按先后分部收集。
优选地，所述S13中分部收集的羊达肝素钠洗脱液，分别醇沉回收，所述醇沉，指充分搅拌下向洗脱液中缓慢加入2-4倍体积并精过滤后的甲醇，产生羊达肝素钠沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收并干燥。
优选地，所述S13中分部收集并回收的羊达肝素钠，经分子量及分子量分布分析，计算并按比例合并适当的组分，使分子量及分子量分布符合USP39对达肝素的要求，将合并后的组分以纯化水复溶，0.22微米除菌过滤后干燥回收，所述干燥优选冷冻干燥。
优选地，所述S13中超滤分级，是将羊达肝素钠粗品的水溶液，以超滤膜进行至少两个轮次以上的超滤，分析超滤浓缩液的分子量及分子量分布，符合USP39对达肝素的要求后，将超滤浓缩液精过滤除菌，直接冷冻干燥回收，也可以调节盐浓度醇沉回收后干燥。
优选地，所述S13中羊达肝素钠成品的重均分子量在5600-6400之间，其中分子量<3000部分的比例不高于13.0％，分子量>8000部分的比例在15.0％-25.0％之间，符合USP39等规定的达肝素钠放行指标
优选地，所述S13中羊达肝素钠成品，抗-Ⅹa活性折干后在100-180单位每毫克之间，抗-Ⅱa活性折干后在30-90单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.6-3.0之间，与USP39等规定的达肝素钠放行指标不同。
优选地，所述羊达肝素钠，可以再经过分子量分级的精制，筛选出抗-Ⅹa活性与抗-Ⅱa活力及比例合适的区段，使产品符合USP39等规定的达肝素钠放行指标。
优选地，所述S13中羊达肝素钠成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊达肝素钠与来自猪肠粘膜的达肝素钠，主体结构一致，但也存在一定的差异，如在δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上羊达肝素钠要更少一些，说明羊达肝素糖链中N-乙酰基修饰相对要少。
那曲肝素钙，EP8.0规定为猪来源，是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法与达肝素钠类似包括亚硝酸解聚、硼氢化钠还原、阴离子树脂交换并钙盐化这制备几个步骤。
优选地，羊那曲肝素钙的制备方法，参照猪那曲肝素钙的制备方法，具体包括如下步骤，
S21、亚硝酸解聚，如羊达肝素钠的制备方法中的S11所述，但解聚的强度不同；
S22、硼氢化钠还原，如羊达肝素钠的制备方法中的S12所述，但得到的是那曲肝素粗品；
S23、羊那曲肝素钙的成品制得，是将S22中得到的羊那曲肝素粗品配制成溶液后，以阴离子交换树脂吸附，并以氯化钙溶液进行低浓度到高浓度的梯度洗脱，洗脱液醇沉回收，沉淀物再以纯化水溶解，加入双氧水氧化脱色，脱色液深层过滤，加氯化钙并调节pH至中性，无菌过滤，醇沉回收和干燥，得到羊那曲肝素钙成品。
优选地，所述S21中羊肝素的水溶液在5％-15％质量浓度之间，更优选在10％；所述pH调节在2-4之间，更优选pH在2.9-3.3；所述亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为 1:10-30，更优选在1:20；所述解聚时间1小时-4小时之间。
优选地，所述S22中硼氢化钠的用量与所述S11中羊肝素重量比为1:5-15，更优选为1:10；所述还原时间不低于0.5小时。
优选地，所述S23中羊那曲肝素的阴离子交换层析分级时，上样浓度在10-100毫克每毫升，上样载量5-50毫克羊那曲肝素每毫升树脂之内。
优选地，所述S23中的以氯化钙溶液进行低浓度到高浓度的梯度洗脱，是指以不超过400毫摩尔每升的氯化钙溶液清洗和平衡已吸附羊那曲肝素的树脂，再以1摩尔每升以上的高浓度氯化钙溶液洗脱出羊那曲肝素钙，洗脱液按先后分部收集。
优选地，所述S23中分部收集的羊那曲肝素钙洗脱液，分别醇沉回收，所述醇沉，指充分搅拌下向洗脱液中缓慢加入2-4倍体积并精过滤后的甲醇，产生羊那曲肝素钙沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收并干燥。
优选地，所述S23中分部收集并回收的羊那曲肝素钙，经分子量及分子量分布分析，计算并按比例合并适当的组分，使分子量及分子量分布符合EP8.0对那曲肝素钙的要求，将合并后的组分以纯化水复溶，0.22微米除菌过滤后干燥回收，所述干燥优选冷冻干燥。
优选地，所述S23中羊那曲肝素钙成品的重均分子量在3600-5000之间，其中分子量<2000部分的比例不高于15.0％，分子量2000-8000部分的比例在75.0％-95.0％之间，分子量2000-4000部分的比例在35％-55％之间，符合EP8.0等规定的那曲肝素钙放行指标。
优选地，所述S23中羊那曲肝素钙成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊那曲肝素钙与来自猪肠粘膜的那曲肝素钙，主体结构一致，但δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上更少一些，体现出羊那曲肝素钙中因羊源更少的N-乙酰基修饰，相应地就有更多的N-磺酸基修饰。
优选地，所述S24中羊那曲肝素钙成品，抗-Ⅹa活性折干后在90-125单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在2.0-3.5之间，不同于EP8.0所规定的猪来源的那曲肝素钙。
优选地，所述羊那曲肝素钙，可以经过分子量分级等精制，筛选出抗-Ⅹa活性与抗-Ⅱa活力及比例合适的区段，使产品符合EP8.0等规定的那曲肝素钙放行指标。
亭扎肝素钠，EP8.0规定为猪来源，是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法以肝素酶Ⅰ解聚，然后精制回收。
优选地，羊亭扎肝素钠的制备方法，参照猪亭扎肝素钠的制备方法，具体包括如下步骤，
S31、肝素酶Ⅰ解聚，是将预处理后的羊肝素溶解，调节溶液pH至中性，然后加入肝素酶Ⅰ，搅拌反应，监控酶解反应直至反应液的232nm吸光度增加值增加至预定范围内，得到羊肝素的酶解聚液；
S32、羊亭扎肝素钠的成品制得，是将S31中得到的羊肝素的酶解聚液，90℃处理5分钟，过滤除去酶蛋白，反应液再加入氯化钠，调pH至中性，精过滤后醇沉回收和干燥，得到羊亭扎肝素钠成品。
优选地，所述S31中羊肝素的水溶液在1％-10％质量浓度之间，更优选5％；pH调节在5-9之间，更优选6-8；肝素酶Ⅰ的用量(活性)与所述羊肝素重量比为1-100：1(单位：质量/克)，更优选10：1；解聚时间1小时-24小时之间；酶解温度优选10℃-40℃之间。
优选地，所述S31中羊肝素的酶解聚液，232nm的吸光度增加值根据不同反应液浓度来控制，更优选5％羊肝素质量浓度的反应液，吸光度增加值在50-70之间。
优选地，所述S32中羊亭扎肝素钠的成品制得，将S31中得到的羊肝素的酶解聚液快速升温，使肝素酶Ⅰ变性沉淀出来再过滤除去，更优选升温至90℃处理5分钟。
优选地，所述S32中羊亭扎肝素钠的精过滤和醇沉，是向S31中除酶过滤后的溶液中加入质量浓度为5％-15％的氯化钠，更优选10％；调pH中性范围为5-9之间，pH更优选5.8-7.0；加盐和调pH后进行精过滤，优选0.22微米过滤；所述醇沉，指充分搅拌下向溶液中缓慢加入2-4倍体积并精过滤后的甲醇，产生羊亭扎肝素钠沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收并干燥。
优选地，所述S32中羊亭扎肝素钠成品的重均分子量在5500-7500之间，其中分子量<2000部分的比例不高于10.0％，分子量2000-8000部分的比例在60.0％-72.0％之间，分子量>8000部分的比例在22.0％-36.0％之间，符合EP8.0等规定的亭扎肝素钠放行指标。
优选地，所述S32中羊亭扎肝素钠成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊亭扎肝素钠与来自猪肠粘膜的亭扎肝素钠，主体结构一致。6.0ppm有特征氢峰，反映的是肝素酶Ⅰ解聚时在新生成羊亭扎肝素钠分子的非还原端特征的4,5-不饱和糖醛酸。此外，但δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上更少一些，体现出羊亭扎肝素钠中因羊源更少的N-乙酰基修饰，相应地就有更多的N-磺酸基 修饰。
优选地，所述S32中羊亭扎肝素钠成品，抗-Ⅹa活性折干后在60-120单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间，不同于EP8.0所规定的猪来源的亭扎肝素钠。
优选地，所述羊亭扎肝素钠，可以经过分级精制，收获出抗-Ⅹa活性与抗-Ⅱa活力及比例合适的区段，使产品符合EP8.0等规定的亭扎肝素钠放行指标。
帕肝素钠，EP8.0规定为猪肠粘膜或牛肠粘膜来源，通常是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法包括铜过氧化物解聚、螯合和阳离子树脂交换去铜、然后精制醇沉回收等步骤。
优选地，羊帕肝素钠的制备方法，参照猪帕肝素钠的制备方法，具体包括如下步骤，S41、铜过氧化物解聚，是将预处理后的羊肝素溶解，调节溶液pH至中性，然后分别加入乙酸铜溶液和过氧化氢溶液进行解聚，期间控制pH和温度；
S42、羊帕肝素钠粗品的回收和精制，是将S41中得到的羊肝素解聚液，调节pH至9-10，加入乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌反应，再调节pH至中性，加盐并过滤后进行醇沉回收得到羊帕肝素沉淀物，沉淀物再以纯化水溶解，以强阳离子交换树脂处理，收集未结合的羊帕肝素流穿液，加入氯化钠并醇沉回收，得到羊帕肝素钠粗品。
S43、羊帕肝素钠的成品制得，是将S42中得到的羊帕肝素钠粗品，以水复溶，加入双氧水脱色，脱色液调节pH至中性，加入氯化钠，除菌过滤后醇沉回收，干燥得到羊帕肝素钠成品。
优选地，所述S41中铜过氧化物解聚，羊肝素质量浓度在1％-15％之间，更优选5％-10％；所述乙酸铜、过氧化氢与羊肝素的质量比例在0.1-1：1-3：1，更优选0.4：2：1；解聚温度控制在30℃-70℃之间，更优选50℃-55℃；解聚时pH控制在6-9之间，更优选7-8；解聚时间优选2-48小时，更优选18小时。
优选地，所述S42中乙二胺四乙酸二钠与羊肝素的质量比例在0.5-5：1，更优选1：1；所述加盐指加入终质量浓度为5％-15％的氯化钠，更优选质量浓度为10％。
优选地，所述S42中羊帕肝素沉淀物以水复溶后，质量浓度在1％-20％之间，更优选为10％；所述强阳离子交换树脂为食品级树脂。
优选地，所述S42中未结合流穿液中羊帕肝素的加盐醇沉回收，是向溶液中加入氯化钠至终质量浓度为5％-15％，更优选10％，所述醇沉指充分搅拌下向溶液中缓慢加入2-4倍 体积并精过滤后的甲醇，产生羊帕肝素钠沉淀，以过滤或离心方式回收羊帕肝素钠粗品。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠粗品以水溶解至质量浓度在1％-15％之间，优选10％；双氧水脱色温度在15℃-40℃之间，更优选25℃；双氧水在溶液中的终体积浓度在0.1％-5％之间，更优选1％-2％；双氧水脱色时间10分钟以上，直至反应液颜色浅至Y5以下。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠溶液在脱色结束至醇沉淀前，依次用稀盐酸调pH至中性，精过滤，滤液加氯化钠至8-12％浓度，调pH至5.0-7.0，再精过滤。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠钠成品制得，所述醇沉淀，指充分搅拌下向反应液中缓慢加入2-4倍反应溶液体积并精过滤后的甲醇，产生羊帕肝素钠钠沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收，并干燥。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠成品的重均分子量在4000-6000之间。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠成品，抗-Ⅹa活性折干后在75-110单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间，符合EP8.0所规定的帕肝素钠标准。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠钠成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊帕肝素钠与来自猪肠粘膜的帕肝素钠，主体结构一致，但δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上更少一些，体现出羊帕肝素钠中因羊源更少的N-乙酰基修饰，相应地就有更多的N-磺酸基修饰。
贝米肝素钠，临床上药物均是猪来源的，是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法包括制备羊肝素季铵盐和有机碱解聚后精制回收等步骤。
优选地，羊贝米肝素钠的制备方法，参照猪贝米肝素钠的制备方法，具体包括如下步骤，
S51、羊肝素季铵盐的制备，是将羊肝素钠溶解配制成水溶液，并与苯扎氯铵水溶液进行混合，分离、洗涤和干燥，制得羊肝素季铵盐；
S52、羊贝米肝素钠粗品的制备，是将S51中干燥得到的羊肝素季铵盐按比例溶于二氯甲烷或其他有机溶剂，加入苄基三甲基氢氧化铵(Triton-B)，搅拌使羊肝素解聚，解聚反应结束后，滴加醋酸钠甲醇溶液，制得羊贝米肝素钠粗品沉淀；
S53、羊贝米肝素钠成品制得，是将S52中的羊贝米肝素钠粗品进行过滤、甲醇洗涤和再进行多次的复溶加盐醇沉、产物精制、干燥，得到羊贝米肝素钠成品。
优选地，所述S51羊肝素季铵盐的制备中，羊肝素水溶液在5％-15％质量浓度之间，苯扎氯铵水溶液在10％-30％质量浓度之间，其中苯扎氯铵固体与所述羊肝素钠固体的重量比为2-5:1。
优选地，所述S52中解聚反应时，羊肝素季铵盐、二氯甲烷、Triton-B的质量比为1:3-10:0.2-0.4，更优选比例为1:5:0.25。
优选地，所述S52中溶剂可以是二氯甲烷，也可以是二甲基甲酰胺或其他有机溶剂。
优选地，所述S52中有机碱解聚时，反应温度在20℃-45℃之间，更优选30℃；反应时间在8小时-40小时，更优选16小时。
优选地，所述S52中解聚反应结束时，滴加醋酸钠甲醇溶液使羊贝米肝素钠析出，所述醋酸钠的重量是羊肝素季铵盐的0.8倍，所述醋酸钠甲醇溶液的浓度为10％。
优选地，所述S53中羊贝米肝素钠粗品沉淀经分离后，以甲醇洗涤一次或数次；洗涤后的沉淀物添加8％-12％的氯化钠水溶液进行复溶，所述氯化钠水溶液与所述羊肝素季铵盐重量比为0.5-2:1，复溶的溶液再以2-5倍体积的甲醇进行醇沉结晶；所述复溶醇沉可以再重复多次，直至复溶后的羊贝米肝素钠溶液澄清无混浊。
优选地，所述S53中羊贝米肝素钠成品的重均分子量在3000-4200之间。
优选地，所述S54中羊贝米肝素钠成品，抗-Ⅹa活性折干后在75-110单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间，与目前的医用猪来源的贝米肝素钠在抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例上不同。
优选地，所述羊贝米肝素钠，可以经过分级精制，收获出抗-Ⅹa活性与抗-Ⅱa活力及比例合适的区段，使产品符合目前医用的贝米肝素钠对活性的要求。
优选地，所述S53中羊贝米肝素钠成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊贝米肝素钠与来自猪肠粘膜的贝米肝素钠，主体结构一致，在
但δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上更少一些，体现出羊帕肝素钠中因羊源更少的N-乙酰基修饰，相应地就有更多的N-磺酸基修饰。
优选地，所述S53中羊贝米肝素钠成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊贝米肝素钠与来自猪肠粘膜的贝米肝素钠，主体结构一致。6.0ppm有特征氢峰，反映的是有机碱的β-消除反应解聚时，在新生成羊贝米肝素钠分子的非还原端形成特征的4,5-不饱和糖醛酸。此外，δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上更少一些，体现出羊贝米肝素钠中因羊源更少的N-乙酰基修饰，相应地就有更多的N-磺酸基修饰。
本申请中涉及的醇沉以甲醇作为有机溶剂，除无特殊说明外，还可以用乙醇、异丙醇或丙酮代替甲醇。
本申请中涉及的干燥均可以采用自然烘干、真空烘干或冷冻干燥以及其他干燥方式，所述干燥过程中，可进行翻料、研磨打粉等，以提高干燥效果。
几种羊低分子肝素，二糖组成分析遵照USP32附录<207>“依诺肝素钠的1,6-酐衍生物检查”进行酶解和SAX-HPLC分析，羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠的主要二糖，ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)的含量为66％-74％，次要二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)和ΔUA2S-GlcNS因解聚工艺的不同，含量有所差异。ΔⅠS的含量呈现出羊源的特征，在猪源低分子肝素中ΔⅠS的含量在58％-66％之间。
优选地，所述几种羊低分子肝素的抗凝作用，体外试验以人血考察。将人血液分离血浆后，按自动凝血仪和试剂盒方法，考察各低分子肝素等对血凝常规的影响，包括但不限于APTT、TT和PT等。
优选地，所述几种羊低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，在体外抗凝试验，均表现出极强的抗凝效果。
优选地，所述羊低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，在防治与抗凝和抗栓有关疾病中的应用，以及开发为清真抗凝抗栓药物。
本发明突出效果为：提供了几种羊低分子肝素——羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，并采用实用、稳定的方法制得。除了由种源特征带来的分子结构(二糖组成)外，几种羊低分子肝素均与猪来源的低分子肝素理化性质相近，分子量分布等完全符合EP8.0或原研的放行指标。几种羊低分子肝素均有强力的抗凝活性，它们的抗-Ⅹa活性和抗-Ⅱa活性与猪源的类似，在人血液的体外试验中，具有类似的延长APTT和TT等抗凝生物学活性。本发明填补了羊源肝素在低分子肝素制备上的空白，可开发为清真药物。原料羊肝素钠简便易得，质量可控，可极大丰富市场中低分子肝素和清真药物的来源和产量，还可以促进羊养殖和屠宰废料(肠粘膜)的有效利用，经济潜力 巨大。
以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
附图说明
图1为几种羊低分子肝素样品的分子量分布比较示意图，其中(1)为羊达肝素钠，(2)为羊那曲肝素钙，(3)为羊亭扎肝素钠，(4)为羊帕肝素钠，(5)为羊贝米肝素钠，(6)为五种低分子肝素叠加比较；
图2为实施例8中几种羊低分子肝素样品的二糖谱比较示意图；
图3为实施例9中几种羊低分子肝素1H-NMR分析对比示意图，其中(7)-(11)依次为羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠。
具体实施方式
本发明实施例描述了几种羊低分子肝素——羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
原料羊肝素钠的制备与预处理
粗品羊肝素钠(厂家：山东绅联生物科技有限公司，批号：20150326)，样品送检RT-PCR以检测其中猪与羊DNA含量，结果猪DNA含量小于0.1皮克每微升，羊DNA含量大于1×105皮克每微升，且根据原厂家初始肠粘膜的来源，确定为粗品羊肝素钠，且基本不含猪肝素成分。此外，该样品送检全绵羊血浆法抗凝活性为67.0单位每毫克。
粗品羊肝素钠的提纯采取本行业所熟知的工艺，即以水溶解后盐解碱解，再加蛋白酶水解，水解液调pH后以阴离子交换树脂吸附并洗脱，以醇沉沉淀得到用于制备羊低分子肝素的原料羊肝素。收获的该原料羊肝素的全绵羊血浆法抗凝活性为134.2单位每毫克。
准确称取上述原料羊肝素5.0千克，倒入100升釜内，加入45升含2％氯化钠和1％碳酸钠的混合溶液，50±5℃搅拌1小时以上，取小样检查以确保溶解完全。加入终浓度2％的双氧水，搅拌均匀后静置，50±5℃保温5小时，然后自然冷却至室温，并保持过夜。 将脱色液过滤至醇沉罐，加入95％酒精至乙醇的终浓度在42％，静置4小时。弃上清，肝素沉淀以2％氯化钠溶液复溶，加入95％酒精至乙醇的终浓度在40％，静置6小时。弃上清，肝素沉淀以2％氯化钠溶液复溶，加入95％酒精至乙醇的终浓度在38％，静置过夜。弃上清，肝素沉淀以95％酒精脱水。脱水后的羊肝素再以鼓风干燥脱去残余水份或溶剂。经预处理过的羊肝素，称重3.1千克，经全绵羊血浆法抗凝活性折干后为176.3单位每毫克，按USP37规定的精品肝素钠抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性测定方法，抗-Ⅹa活性为185.1单位每毫克，抗-Ⅱa活性为181.5单位每毫克，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例为1.02。
实施例2
羊达肝素钠的制备
称取实施例一中预处理过的羊肝素50.0克，加入500毫升纯化水，搅拌使肝素溶清。水浴控室温，继续搅拌保温30分钟以上。以盐酸调肝素溶液的pH至3.1，加入1.43克亚硝酸钠，继续保温搅拌。然后调pH至中性，加入4.0克硼氢化钠，继续搅拌。再以稀盐酸调节pH至中性，加入氯化钠51.5克，室温下继续搅拌10分钟以上。缓慢加入1250毫升甲醇，搅拌15分钟使反应得到的达肝素粗品沉淀。转移反应液至离心瓶中，离心收集达肝素粗品沉淀，沉淀真空干燥后称重，得到43.5克达肝素钠粗品。
准确称取达肝素钠粗品20.0克，以1％氯化钠溶液配制成20毫克每毫升的达肝素溶液，共1000毫升，上样至已处理好的1000毫升柱体积的DEAE-FF阴离子交换柱。上样结束后，以1％氯化钠溶液平衡柱子6个柱体积，再以6个柱体积的400毫摩尔每升氯化钠溶液洗杂。然后以3个柱体积的1.5摩尔每升氯化钠溶液洗脱，每500毫升收集一份。收集的各洗脱液均加入1250毫升甲醇，搅拌5分钟后静置，最后离心收集沉淀，沉淀甲醇脱水，再烘干。经分子量分布分析及计算后，合并上述所有洗脱液的沉淀，以200毫升纯化水溶解和无菌过滤，冷冻干燥得到羊达肝素钠产品11.2克。
实施例3
羊那曲肝素钙的制备
称取实施例一中预处理过的羊肝素50.0克，加入500毫升纯化水，搅拌使肝素溶清。水浴控室温，继续搅拌保温30分钟以上。以盐酸调肝素溶液的pH至3.0，加入2.5克亚硝酸钠，继续保温搅拌。然后调pH至中性，加入4.5克硼氢化钠，继续搅拌。再以稀盐酸调 节pH至中性，加入52.0克氯化钠，室温下继续搅拌10分钟以上。缓慢加入1250毫升甲醇，搅拌15分钟使反应得到的那曲肝素粗品沉淀。转移反应液至离心瓶中，离心收集那曲肝素粗品沉淀，沉淀真空干燥后称重，得到39.5克那曲肝素粗品。
准确称取那曲肝素粗品20.0克，以1％氯化钠溶液配制成20毫克每毫升的那曲肝素溶液，共1000毫升，上样至已处理好的1000毫升柱体积的DEAE-FF阴离子交换柱。上样结束后，以1％氯化钙溶液平衡柱子6个柱体积，再以6个柱体积的350毫摩尔每升氯化钙溶液洗杂。然后以3个柱体积的1.2摩尔每升氯化钙溶液洗脱，每500毫升收集一份。收集的各洗脱液均加入1250毫升甲醇，搅拌5分钟后静置，最后离心收集沉淀。沉淀再以200毫升纯化水溶解，加入双氧水氧化脱色2小时，加入20克氯化钙，搅拌溶解并调pH中性后除菌过滤，滤液以500毫升甲醇醇沉，沉淀物经真空烘干后，得到羊那曲肝素钙产品12.6克。
实施例4
肝素酶解聚制备羊亭扎肝素钠
称取实施例一中预处理过的羊肝素50.0克，加入500毫升纯化水，搅拌使肝素溶清。水浴控室温，调溶液的pH至中性，加入肝素酶溶液10毫升，继续保温搅拌，至溶液的A232吸光值增加值在60时，将反应液快速升温至95℃，保持5分钟，再快速水冷至室温。精过滤出去析出的酶蛋白沉淀，然后滤液加入50克氯化钠，调pH至中性，室温下继续搅拌10分钟以上，除菌过滤。缓慢加入1200毫升甲醇，搅拌15分钟使反应得到的羊亭扎肝素粗品沉淀。转移反应液至离心瓶中，离心收集达羊亭扎肝素沉淀，沉淀真空干燥后称重，得到17.8克羊亭扎肝素钠。
实施例5
铜过氧化物解聚制备羊帕肝素钠
称取实施例一中预处理过的羊肝素100.0克，加入2000毫升纯化水，搅拌使肝素溶清，保温50℃搅拌。加入40.0克乙酸钠和40.0克乙酸铜，再加入200毫升双氧水，控制反应温度在50℃-55℃，控制pH在6-9之间，搅拌18小时。反应结束后调溶液的pH至9.5，加入100克乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌30分钟。然后调pH至中性，加入250克氯化钠，溶解后以6000毫升乙醇 以沉淀，离心收集沉淀。沉淀物以纯化水溶解，以强阳离子交换树脂处理，收集未结合的肝素流穿液，再加入氯化钠至10％浓度，调pH中性，以2.5倍体积乙醇沉淀，得到羊帕肝素钠粗品。将上述粗品再以1％氯化钠溶液溶解，加入终浓度为2％的过氧化氢，室温脱色1小时。调pH中性，无菌过滤，以3倍体积乙醇沉淀，沉淀经纯水复溶再冻干，得到羊帕肝素钠产品54.2克。
实施例6
羊贝米肝素钠的制备
称取上述实施例一的羊肝素钠100克，溶解于700毫升水中；另将250克苯扎氯铵，溶解于1000毫升水中，配制成澄清的苯扎氯铵水溶液；于充分搅拌下，将苯扎氯铵水溶液滴加至羊肝素水溶液中，30分钟内滴加完毕，继续搅拌2小时。用高速离心机6000转/分钟离心5分钟，沉淀用3000毫升水重悬，继续充分搅拌5分钟，再6000转/分钟离心5分钟。重复一次。沉淀的羊肝素季铵盐湿品，转移冷冻干燥箱干燥48小时，得到羊肝素季铵盐干品265克，干燥失重经测定为0.6％。
取上述干燥后的羊肝素季铵盐200克于2升反应瓶中，加入800克二氯甲烷搅拌溶解，升温至30℃，加入50毫升Triton-B，继续搅拌反应解聚16小时。称量160克醋酸钠，溶解于1600毫升的甲醇中，在上述解聚反应结束后滴加至反应液中，此时产生不溶的羊贝米肝素钠粗品沉淀。
离心收集羊贝米肝素钠粗品沉淀，以1000毫升纯化水复溶，盐酸调pH至中性，加入100克氯化钠，加入2500毫升甲醇沉淀出羊贝米肝素钠。重复上述复溶醇沉两次，最终沉淀干燥后得到羊贝米肝素钠纯品53.2克。
实施例7
羊低分子肝素重均分子量及分子量分布分析
来自于实施例二至实施例六的几种羊低分子肝素，分子量及分子量分布分析参照EP8.0方法进行。
表1：羊达肝素钠的重均分子量及分子量分布
表2：羊那曲肝素钙的重均分子量及分子量分布
表3：羊亭扎肝素钠的重均分子量及分子量分布
表4：羊帕肝素钠的重均分子量及分子量分布
表5：羊贝米肝素钠的重均分子量及分子量分布
结果可以看出，实施例二至实施例六制备的羊低分子肝素，其均重分子量和分子量分布(若有要求)都符合药典EP8.0或原研厂家的技术指标，即羊低分子肝素与猪肠粘膜来 源的低分子肝素在分子量及其分布上是相近的。
实施例8
羊低分子肝素二糖组成分析
来自于实施例二至实施例六几种羊低分子肝素的二糖组成分析，遵照USP32附录<207>“依诺肝素钠的1,6-酐衍生物检查”进行酶解，但不进行还原，再进行SAX-HPLC分析。样品和标准品的二糖组成分析结果见图2。
从图2可以看出，各实施例制备的羊低分子肝素呈现出典型的羊源肝素特征，主要二糖ΔⅠS在样品羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠中的含量，分别高达70.2％、69.2％、68.7％、70.6％和71.2％，比通常猪源低分子肝素的含量要高。
实施例9
羊低分子肝素的核磁氢谱(1H-NMR)分析
几种羊低分子肝素的核磁氢谱分析，设备用苏州大学分析测试中心的400MHz核磁共振谱仪，以3-三甲基硅基丙酸钠-d4(TSP)定零点。
待测样品溶液配制：几种羊低分子肝素(实施例二至实施例六)，各准确各称取20毫克左右，按重以氘水(D2O)溶解成20毫克每毫升左右的浓度，滴加1-2滴TSP，震荡混匀后0.22微米过滤送检，结果如图3所示，其中，δ3.4ppm为甲醇残留的甲基氢峰，δ4.7ppm为水氢峰。
检测结果：几种羊低分子肝素的氢谱结果如附图3所示，因不同的工艺和处理，它们呈现各低分子肝素所独有的图谱，其中，羊达肝素钠和羊那曲肝素钙都是由亚硝酸钠引起的解聚，且都进行了硼氢化钠的还原，因此在化学结构上两者是一致的；羊亭扎肝素钠是因肝素酶的酶解而解聚，在新形成的低分子肝素非还原端是特征的4,5-不饱和糖醛酸，6.0ppm即是此特征氢的反映，同样地，羊贝米肝素钠是有机碱的β-消除反应来解聚，也在非还原端呈现4,5-不饱和糖醛酸结构，与羊亭扎肝素钠类似；此外，羊帕肝素钠是铜过氧化物的解聚，一种因氧化引起的解聚，图谱上体现出结构与上述几种均有差异。共性来看，羊低分子肝素在2.04ppm处反映出的N-乙酰基的甲基氢，积分相似，比猪来源的低分子肝素 如依诺肝素钠要少，反映出羊源低分子肝素中，N-乙酰基修饰较少，相反的，N-上的磺酸基修饰则更多，这也是与二糖分析的结果是一致的。
实施例11
羊低分子肝素的抗-Ⅹa、抗-Ⅱa活力和全绵羊血浆法活力对比分析
抗-Ⅹa和抗-Ⅱa的活性测定遵照EP8.0达肝素钠中的方法进行，全绵羊血浆法遵照本领域所熟知的传统方法进行，来源于实施例二至实施例六的各羊低分子肝素活性对比如下表6。
表6：羊低分子肝素样品的抗凝活力对比
结果显示：羊低分子肝素均具有强力的抗凝活性。全绵羊血浆法测定的活性在40-55单位每毫克不等；抗-Ⅹa活力上，羊达肝素钠样品最高，达143.4单位每毫克，羊帕肝素钠样品最低，也在89.7单位每毫克；抗-Ⅱa活力上，也是羊达肝素钠样品最高，在62.4单位每毫克，同样羊帕肝素钠样品最低，在34.9单位每毫克；而抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例上，几种羊低分子肝素样品在1.7-2.6不等。
实施例12
羊低分子肝素的人血体外抗凝试验
实验方法：每次采用5人份外周静脉血3mL，用3.8％枸橼酸钠抗凝剂1:9抗凝，3000转/分离心5分钟，分离出贫血小板血浆(PPP)。按试剂盒方法，上机(全自动血凝仪，StagoCompact)检测。实验组别如下：羊达肝素钠样品组(实施例二所述)、羊那曲肝素钙样品 组(实施例三所述)、羊亭扎肝素钠样品组(实施例四所述)、羊帕肝素钠样品组(实施例五所述)、羊贝米肝素钠样品组(实施例六所述)和依诺肝素钠标准品组(为临床市售药品，克赛，批号：24459)，所有组别终样品浓度均为～3μg/mL，实验设生理盐水为空白对照。
结果与分析：
1)APTT、PT和TT
实验结果如下表格所示：
表7体外对APTT、PT和TT的影响
组别 APTT PT TT
羊达肝素钠样品 114.1±9.5s 13.2±0.6s 157.3±47.4s
羊那曲肝素钙样品 105.3±12.1s 13.9±0.4s 145.9±43.6s
羊亭扎肝素钠样品 102.5±9.8s 13.4±0.5s 134.4±52.3s
羊帕肝素钠样品 97.3±10.3s 12.8±0.5s 124.6±49.1s
羊贝米肝素钠样品 95.8±9.8s 13.2±0.5s 132.5±44.3s
依诺肝素钠标准品 104.6±10.2s 13.8±0.3s 140.4±54.7s
空白对照 38.1±1.4s 12.7±0.6s 16.6±0.7s
由表7可知，在体外所有样品组别均可以显著延长APTT和TT，但对PT的影响较小；与依诺肝素钠标准品相比，羊低分子肝素对APTT、TT和PT的影响也是比较接近的。
2)纤维蛋白原和复钙时间：
实验结果如下表格所示：
表8体外对纤维蛋白原和复钙时间的影响
组别 纤维蛋白原 复钙时间
羊达肝素钠样品 2.91±0.51g/L 31.00±0.00s*
羊那曲肝素钙样品 2.66±0.43g/L 31.00±0.00s*
羊亭扎肝素钠样品 2.64±0.37g/L 31.00±0.00s*
羊帕肝素钠样品 2.76±0.53g/L 31.00±0.00s*
羊贝米肝素钠样品 2.71±0.72g/L 31.00±0.00s*
依诺肝素钠标准品 2.89±0.44g/L 31.00±0.00s*
空白对照 2.57±0.25g/L 9.95±0.40s
*：均已超出检测范围
由表8可知，与依诺肝素钠标准品相比，几种羊低分子肝素样品对纤维蛋白原并没有 显著的影响，复钙时间均大大延长，超出检测范围。
所有以上数据揭示，羊低分子肝素在体外有着良好的抗凝效果，且与依诺肝素钠标准品作用相近。
综合以上所有测试的结果，羊低分子肝素呈现典型的羊源特征，化学结构(二糖组成和氢谱)与猪源的低分子肝素有一定的差异。经精制制备的羊低分子肝素，分子量分布等指标均可以符合现行药典对猪低分子肝素的要求，生物学抗凝活性相近，可用于抗凝等领域的应用。
本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (32)

1.羊来源的低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，其特征在于，以上低分子肝素由羊肝素制备得到，以上低分子肝素主要二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)的含量为66％-74％。
2.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，所述羊肝素的抗凝活性全绵羊血浆法折干后不少于150单位每毫克，且3.3％质量浓度的水溶液澄清且色度不深于5号标准色。
3.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠抗-Ⅹa活性折干后在100-180单位每毫克之间，抗-Ⅱa活性折干后在30-90单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.6-3.0之间。
4.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠重均分子量在5600-6400之间，其中分子量<3000部分的比例不高于13.0％，分子量>8000部分的比例在15.0％-25.0％之间。
5.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠羊达肝素钠中羊达肝素糖链中N-乙酰基修饰要少于猪肠粘膜达肝素钠。
6.根据权利要求3-5任一项所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法包括如下步骤：
S11、亚硝酸解聚，是将权利要求2中的羊肝素用水溶解，调节溶液pH至酸性，然后加入亚硝酸钠，搅拌反应，得到解聚液；
S12、硼氢化钠还原，是将S11中解聚液的pH调至中性后，加入硼氢化钠，低温下继续搅拌反应，加酸中和多余的硼氢化钠，再加盐和醇沉并干燥得到羊达肝素钠粗品；
S13、羊达肝素钠的成品制得，是将S12中得到的羊达肝素钠粗品配制成溶液，以阴离子交换层析或超滤进行分子量分级，再精制、回收和干燥，得到羊达肝素钠成品。
7.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S11中羊肝素用水溶解后的质量比浓度为5-15％，优选为10％；调节溶液pH在2-5之间，优选为2.9-3.3之间；亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为1:20-50，优选为1:35；搅拌反应的反应时间1-6小时。
8.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S12中低温下继续搅拌反应的反应温度为0℃-40℃，优选为2℃-15℃；硼氢化钠的用量与S11中羊肝素重量比为1:5-15，优选为1:10；硼氢化钠还原的还原时间不低于0.5小时。
9.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S13中阴离子交换层析分级时，上样浓度在10-100毫克每毫升，上样时盐浓度控制在300毫摩尔每升以下，上样载量5-50毫克羊达肝素每毫升树脂之内。
10.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S13中分子量分级方法为采用阴离子交换树脂，是将羊达肝素钠粗品溶液低盐浓度上样，以稍高的盐浓度洗杂，最后以更高的浓度分部收集洗脱，各部分的洗脱产品再以醇沉回收并干燥，均进行分子量及分子量分布分析，经计算后合并适当的组分，纯化水复溶后，0.22μm除菌过滤并冷冻干燥，收获产品；另一种分级方法是将羊达肝素钠粗品溶液以3KDa的超滤膜进行至少两个轮次以上的超滤，超滤浓缩液经0.22μm除菌过滤后直接冷冻干燥回收，也可以醇沉回收后干燥。
11.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S13中采用阴离子交换树脂层析分级时，低盐浓度上样的浓度为300毫摩尔每升以下；以稍高的盐浓度洗杂是不高于450毫摩尔每升的盐溶液清洗和平衡已吸附羊达肝素的树脂；以更高的浓度分部收集洗脱是用1摩尔每升以上的高浓度盐溶液洗脱出羊达肝素钠，洗脱液按先后分部收集。
12.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙重均分子量在3600-5000之间，其中分子量<2000部分的比例不高于15.0％，分子量2000-8000部分的比例在75.0％-95.0％之间，分子量2000-4000部分的比例在35％-55％之间。
13.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙抗-Ⅹa活性折干后在90-125单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在2.0-3.5之间。
14.根据权利要求12或13所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙的制备方法包括如下步骤：
S21、亚硝酸解聚，如权利要求6中的S11所述；
S22、硼氢化钠还原，如权利要求6中的S12所述，但得到的是那曲肝素粗品；
S23、羊那曲肝素钙的成品制得，是将S22中得到的羊那曲肝素粗品配制成溶液后，以阴离子交换树脂吸附，并以氯化钙溶液进行低浓度到高浓度的梯度洗脱，洗脱液醇沉回收，沉淀物再以纯化水溶解，加入双氧水氧化脱色，脱色液深层过滤，加氯化钙并调节pH至中性，无菌过滤，醇沉回收和干燥，得到羊那曲肝素钙成品。
15.根据权利要求14所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙的制备方法S21中羊肝素的水溶液在5％-15％质量浓度之间，更优选在10％；所述pH调节在2-4之间，更优选pH在2.9-3.3；所述亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为1:10-30，更优选在1:20；所述解聚时间1小时-4小时之间。
16.根据权利要求14所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙的制备方法S23中羊那曲肝素的阴离子交换树脂吸附时，上样浓度在10-100毫克每毫升，上样载量5-50毫克羊那曲肝素每毫升树脂之内；以氯化钙溶液进行低浓度到高浓度的梯度洗脱，是指以不超过400毫摩尔每升的氯化钙溶液清洗和平衡已吸附羊那曲肝素的树脂，再以1摩尔每升以上的高浓度氯化钙溶液洗脱出羊那曲肝素钙，洗脱液按先后分部收集。
17.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠抗-Ⅹa活性折干后在60-120单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间。
18.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠重均分子量在5500-7500之间，其中分子量<2000部分的比例不高于10.0％，分子量2000-8000部分的比例在60.0％-72.0％之间，分子量>8000部分的比例在22.0％-36.0％之间。
19.根据权利要求17或18所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠制备方法包括如下步骤：
S31、肝素酶Ⅰ解聚，是将权利要求2所述的羊肝素溶于水中得到水溶液，调节溶液pH至中性，然后加入肝素酶Ⅰ，搅拌反应，监控酶解反应直至反应液的232nm吸光度增加值增加至预定范围内，得到羊肝素的酶解聚液；
S32、羊亭扎肝素钠的成品制得，是将S31中得到的羊肝素的酶解聚液，90℃处理5分钟，过滤除去酶蛋白，反应液再加入氯化钠，调pH至中性，精过滤后醇沉回收和干燥，得到羊亭扎肝素钠成品。
20.根据权利要求19所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠制备方法S31中羊肝素的水溶液在质量比浓度在1％-10％之间，优选为5％；pH调节在5-9之间，优选为6-8；肝素酶Ⅰ的用量与所述羊肝素重量比为1-100：1，优选为10：1；解聚反应时间1小时-24小时之间；酶解温度优选10℃-40℃之间；羊肝素的酶解聚液，232nm的吸光度增加值根据不同反应液浓度来控制，更优选5％羊肝素质量浓度的反应液，吸光度增加值在50-70之间。
21.根据权利要求19所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠制备方法S32中羊亭扎肝素钠的成品制得，将S31中得到的羊肝素的酶解聚液快速升温，使肝素酶Ⅰ变性沉淀出来再过滤除去，更优选升温至90℃处理5分钟；羊亭扎肝素钠的精过滤和醇沉，是向S31中除酶过滤后的溶液中加入质量浓度为5％-15％的氯化钠，更优选10％；调pH中性范围为5-9之间，pH更优选5.8-7.0；加盐和调pH后进行精过滤，优选0.22微米过滤；所述醇沉，指充分搅拌下向溶液中缓慢加入2-4倍体积并精过滤后的甲醇，产生羊亭扎肝素钠沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收并干燥。
22.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊帕肝素钠重均分子量在4000-6000之间；抗-Ⅹa活性折干后在75-110单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间。
23.根据权利要求22所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊帕肝素钠的制备方法包括如下步骤：
S41、铜过氧化物解聚，是将预处理后的羊肝素溶解，调节溶液pH至中性，然后分别加入乙酸铜溶液和过氧化氢溶液进行解聚，期间控制pH和温度；
S42、羊帕肝素钠粗品的回收和精制，是将S41中得到的羊肝素解聚液，调节pH至9-10，加入乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌反应，再调节pH至中性，加盐并过滤后进行醇沉回收得到羊帕肝素沉淀物，沉淀物再以纯化水溶解，以强阳离子交换树脂处理，收集未结合的羊帕肝素流穿液，加入氯化钠并醇沉回收，得到羊帕肝素钠粗品；
S43、羊帕肝素钠的成品制得，是将S42中得到的羊帕肝素钠粗品，以氯化钠水溶液复溶，加入双氧水脱色，脱色液调节pH至中性，加入氯化钠，除菌过滤后醇沉回收，干燥得到羊帕肝素钠成品。
24.根据权利要求23所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊帕肝素钠的制备方法S41中铜过氧化物解聚，羊肝素质量浓度在1％-15％之间，更优选5％-10％；所述乙酸铜、过氧化氢与羊肝素的质量比例在0.1-1：1-3：1，更优选0.4：2：1；解聚温度控制在30℃-70℃之间，更优选50℃-55℃；解聚时pH控制在6-9之间，更优选7-8；解聚时间优选2-48小时，更优选18小时。
25.根据权利要求23所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊帕肝素钠的制备方法S42中乙二胺四乙酸二钠与羊肝素的质量比例在0.5-5：1，更优选1：1；所述加盐指加入终质量浓度为5％-15％的氯化钠，更优选质量浓度为10％；羊帕肝素沉淀物以水复溶后，质量浓度在1％-20％之间，更优选为10％；所述强阳离子交换树脂为食品级树脂；未结合流穿液中羊帕肝素的加盐醇沉回收，是向溶液中加入氯化钠至终质量浓度为5％-15％，更优选10％，所述醇沉指充分搅拌下向溶液中缓慢加入2-4倍体积并精过滤后的甲醇，产生羊帕肝素钠沉淀，以过滤或离心方式回收羊帕肝素钠粗品。
26.根据权利要求23所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊帕肝素钠的制备方法S43中羊帕肝素钠粗品以水溶解至质量浓度在1％-15％之间，优选10％；双氧水脱色温度在15℃-40℃之间，更优选25℃；双氧水在溶液中的终体积浓度在0.1％-5％之间，更优选1％-2％；双氧水脱色时间10分钟以上，直至反应液颜色浅至Y5以下；羊帕肝素钠溶液在脱色结束至醇沉淀前，依次用稀盐酸调pH至中性，精过滤，滤液加氯化钠至8-12％浓度，调pH至5.0-7.0，再精过滤；羊帕肝素钠钠成品制得，所述醇沉淀，指充分搅拌下向反应液中加入2-4倍反应溶液体积并精过滤后的甲醇，产生羊帕肝素钠钠沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收，并干燥。
27.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊贝米肝素钠重均分子量在3000-4200之间；抗-Ⅹa活性折干后在75-110单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间。
28.根据权利要求27所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊贝米肝素钠的制备方法包括如下步骤：
S51、羊肝素季铵盐的制备，是将羊肝素钠溶解配制成水溶液，并与苯扎氯铵水溶液进行混合，分离、洗涤和干燥，制得羊肝素季铵盐；
S52、羊贝米肝素钠粗品的制备，是将S51中干燥得到的羊肝素季铵盐按比例溶于二氯甲烷或其他有机溶剂，加入苄基三甲基氢氧化铵，搅拌使羊肝素解聚，解聚反应结束后，滴加醋酸钠甲醇溶液，制得羊贝米肝素钠粗品沉淀；
S53、羊贝米肝素钠成品制得，是将S52中的羊贝米肝素钠粗品进行过滤、甲醇洗涤和再进行多次的复溶加盐醇沉、产物精制、干燥，得到羊贝米肝素钠成品。
29.根据权利要求28所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊贝米肝素钠的制备方法S51羊肝素季铵盐的制备中，羊肝素水溶液在5％-15％质量浓度之间，苯扎氯铵水溶液在10％-30％质量浓度之间，其中苯扎氯铵固体与所述羊肝素钠固体的重量比为2-5:1。
30.根据权利要求28所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊贝米肝素钠的制备方法S52中解聚反应时，羊肝素季铵盐、二氯甲烷、苄基三甲基氢氧化铵的质量比为1:3-10:0.2-0.4，优选为1:5:0.25；其他有机溶剂为二甲基甲酰胺；解聚反应温度在20℃-45℃之间，优选30℃；反应时间在8小时-40小时，优选16小时；解聚反应结束时，滴加醋酸钠甲醇溶液使羊贝米肝素钠析出，所述醋酸钠的重量是羊肝素季铵盐的0.8倍，所述醋酸钠甲醇溶液的浓度为10％。
31.根据权利要求28所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊贝米肝素钠的制备方法S53中羊贝米肝素钠粗品沉淀经分离后，以甲醇洗涤；洗涤后的沉淀物添加质量比浓度8％-12％的氯化钠水溶液进行复溶，所述氯化钠水溶液与所述羊肝素季铵盐重量比为0.5-2:1，复溶的溶液再以2-5倍体积的甲醇进行醇沉结晶；所述复溶醇沉可以再重复多次，直至复溶后的羊贝米肝素钠溶液澄清无混浊。
32.权利要求1所述的羊来源的低分子肝素包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，在防治与抗凝和抗栓有关疾病中的应用，以及开发为清真抗凝抗栓药物。
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