CN109438589A - 一种具有缓和抗凝血作用的贝类肝素及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有缓和抗凝血作用的贝类肝素及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有缓和抗凝血作用的贝类肝素及其制备方法和应用。所述制备方法为：原料处理；自溶；酶解：加入NaOH调节pH到7.8～8.2，加入胰蛋白酶，在32～42℃下酶解3.5～6.5 h，再加入HCl调节pH到6.8～7.2，加入木瓜蛋白酶，在62～68℃下酶解4.5～5.5 h，得到酶解液；灭酶、离心；浓缩、醇沉；复溶、脱蛋白；除盐；干燥。本发明首次以海蚌、象拔蚌、钝缀锦蛤、泥蚶、沙白贝为来源制备得到具有抗凝血作用的贝类肝素，该肝素来自海洋贝类，安全性高、作用缓和，不仅拓宽了肝素的来源，而且制备方法简单，产品质量稳定，在制备低副作用的肝素或其他具有缓和抗凝血功效的产品中具有良好的应用价值。

Description

一种具有缓和抗凝血作用的贝类肝素及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种具有缓和抗凝血作用的贝类肝素及其制备方法和应用。
背景技术
肝素是存在于动物体内的一种糖胺聚糖，具有多样的生物活性，在临床上运用广泛，特别是作为抗凝剂的使用，目前还没有一种能够完全代替它的产品。临床所用肝素多来源于猪小肠和牛肺，但来源于猪小肠和牛肺的肝素抗凝血作用太强，容易造成出血效应、血小板较减少等副作用。针对猪源和牛源肝素抗凝活性过强、副作用太大的问题，需要开发出具有缓和抗凝血作用的肝素。海洋源肝素具有与人体细胞兼容性好、副作用小、良好的组织结构和缓和的抗凝血活性的特点。因此，开发一种不以猪小肠和牛肺为来源的、具有缓和的抗凝血作用的海洋源肝素变得越来越重要。
贝类，即软体动物门。是三胚层、两侧对称，具有了真体腔的动物。我国是世界贝类养殖大国，海水贝类养殖产量占海水养殖总产量的80％，是海水养殖业的重要组成部分。这些海洋贝类富含活性物质，具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒，提高免疫力，降低血糖、血脂、血压等多种生物学活性。因其很高的营养价值和保健功效，已成为目前全球研究和开发的热点。海蚌、钝缀锦蛤、象拔蚌、泥蚶和沙白贝都属于贝类。但是，迄今为止尚未有从海蚌、钝缀锦蛤、象拔蚌、泥蚶和沙白贝等贝类中提取肝素的相关报道，更没有关于这5种贝类肝素的抗凝血活性的报道。而且，现有的肝素的提取生产周期长、能耗高，产品活性损失大。
海蚌，海产双壳贝类，福建、江苏、浙江俗称海蚌，广东、香港称贵妃蚌，属软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、蛤蜊科。营养丰富，富含优质蛋白质和氨基酸，甘脆嫩滑。具有能滋阴补虚，清热凉肝的功效。
钝缀锦蛤，属软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、帘蛤科的海洋贝类动物。主要分布于西南太平洋，栖息于潮间带中、低潮区至潮下带及浅海3～15cm的沙泥至泥沙底质中。在中国常见于东海、南海海域及台湾岛沿岸，肉味鲜美，为沿海常见的食用贝类。
象拔蚌，生物名称是太平洋潜泥蛤，又名皇帝蚌、女神蛤，两扇壳一样大，薄且脆，前端有锯齿、副壳、水管(也称为触须)。富含蛋白质，具有维持钾钠平衡、消除水肿、提高免疫力、调低血压，缓冲贫血的功效。
泥蚶，属软体动物门，双壳纲，列齿目，蚶科，蚶属。泥蚶血液中含有血红素，呈红色，因而又称血蚶。泥蚶中富含特有的血红蛋白和维生素B12，具有补血、温中、健胃的功效。
沙白贝，属于双壳纲、帘蛤目、帘蛤科的贝类，又称为沙白、白贝，是中国文蛤的一种。身体呈扁圆形，体色一般为白色，壳光亮，广泛分布于中国湛江、海南近海。贝肉肥美、鲜甜，营养价值非常高，具有清热利湿、化痰、散结的功效，对肝癌有明显的抑制作用，对哮喘、慢性气管炎、甲状腺肿大、淋巴结核等病也有明显疗效。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供了一种简单有效的、具有缓和的抗凝血作用的贝类肝素的制备方法。
本发明的另一目的是提供由上述制备方法得到的贝类肝素。
本发明的另一目的是提供上述贝类肝素在制备具有缓和的抗凝血作用的产品中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种贝类肝素的制备方法，包括如下步骤：
S1.原料处理：将贝类洗净去壳后加水匀浆，得到匀浆液；
S2.自溶：将匀浆液于38～62℃水浴条件下自溶3～7h；
S3.酶解：加入NaOH调节pH到7.8～8.2，加入胰蛋白酶，在32～42℃下酶解3.5～6.5h，再加入HCl调节pH到6.8～7.2，加入木瓜蛋白酶，在62～68℃下酶解4.5～5.5h，得到酶解液；
S4.灭酶、离心：将酶解液置于沸水中灭酶5～15min，离心，取上清液；
S5.浓缩、醇沉：将上清液浓缩后加入乙醇，置于0.5～7.5℃下静置20～28h，离心取沉淀；
S6.复溶、脱蛋白：交替用丙酮和乙醇洗涤沉淀2～3次，用水溶解沉淀，离心除去不溶物；于上清液中加入正丁醇-氯仿混合液，充分振摇10～30min，静置5～15min，取上清液，重复操作3～4次；
S7.除盐：将脱蛋白后的提取液置于透析袋中透析48～96h；
S8.干燥：将透析液进行冷冻干燥，即可得到所述的贝类肝素。
本发明首次以海蚌、钝缀锦蛤、象拔蚌、泥蚶或沙白贝等贝类为来源，制备得到具有缓和的抗凝血作用的贝类肝素，该肝素来自海洋贝类，安全性高、作用缓和，在紫外扫描中，185～220nm波长之间具有特征吸收峰；在红外光谱扫描中，在1240cm-1处呈现O-S键伸缩振动的强吸收峰，在890、940cm-1处表现出肝素的特征吸收，在800～850cm-1处表现出氨基己糖上硫酸基团的C-O-S系统伸缩振动吸收谱带；在单糖组成中，含有氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸。
优选地，所述贝类选自海蚌、钝缀锦蛤、象拔蚌、泥蚶或沙白贝。
优选地，步骤S1所述匀浆的料液比为1：1.5～4.5。
更优选地，步骤S1所述匀浆的料液比为1：3。
作为一种优选方案，步骤S2所述自溶包括以下步骤：将匀浆液于50℃水浴条件下自溶5h。
作为一种优选方案，步骤S3所述酶解包括以下步骤：加入NaOH调节pH到8，加入胰蛋白酶，在37℃下酶解5h，再加入HCl调节pH到7.0，加入木瓜蛋白酶，在65℃下酶解5h，得到酶解液。
优选地，步骤S3所述胰蛋白酶的添加量为0.3％～0.7％；木瓜蛋白酶加酶量的添加量为0.3％～0.7％。
更优选地，步骤S3所述胰蛋白酶的添加量为0.5％；木瓜蛋白酶加酶量的添加量为0.5％。
优选地，步骤S4所述离心的条件为：6000～8000rpm下离心10～20min。
更优选地，步骤S4所述离心的条件为：8000rpm下离心20min。
优选地，步骤S4所述灭酶的时间为10min。
优选地，步骤S5所述乙醇的加入量为浓缩液体积的0.3～0.6倍。
更优选地，步骤S5所述乙醇的加入量为浓缩液体积的0.4倍。
优选地，步骤S5加入乙醇后，置于4℃下静置24h。
优选地，步骤S6所述正丁醇-氯仿混合液中正丁醇与氯仿的体积比为1：4～5；所述正丁醇-氯仿混合液与上清液的体积比为1：4～5。
更优选地，步骤S6所述正丁醇-氯仿混合液中正丁醇与氯仿的体积比为1：4；所述正丁醇-氯仿混合液与上清液的体积比为1：5。
优选地，步骤S7中透析72h。
优选地，步骤S1中，还进行脱脂处理；所述脱脂处理为：将贝肉置于2～6℃的丙酮中浸泡20～28h，室温抽滤除去丙酮，用水冲洗3～5次。
本发明还提供了由上述制备方法得到的贝类肝素，所述贝类肝素在紫外扫描中，185～220nm波长之间具有特征吸收峰；在红外光谱扫描中，在1240cm-1处呈现O-S键伸缩振动的强吸收峰，在890、940cm-1处表现出肝素的特征吸收，在800～850cm-1处表现出氨基己糖上硫酸基团的C-O-S系统伸缩振动吸收谱带；在单糖组成中，含有氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸。
所述贝类肝素在制备具有缓和的抗凝血作用的产品中的应用，也在本发明的保护范围之内。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次以海蚌、钝缀锦蛤、象拔蚌、泥蚶或沙白贝等贝类为来源，制备得到具有缓和的抗凝血作用的贝类肝素，该肝素来自海洋贝类，安全性高、作用缓和，在紫外扫描中，185～220nm波长之间具有特征吸收峰；在红外光谱扫描中，在1240cm-1处呈现O-S键伸缩振动的强吸收峰，在890、940cm-1处表现出肝素的特征吸收，在800～850cm-1处表现出氨基己糖上硫酸基团的C-O-S系统伸缩振动吸收谱带；在单糖组成中，含有氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸。
本发明不仅拓宽了肝素的来源，而且制备方法简单，产品质量稳定，在制备低副作用的肝素或其他具有缓和抗凝血功效的医药产品和食品中具有潜在的应用价值，对血栓性疾病的预防与治疗具有重大意义。
附图说明
图1为本发明贝类肝素的紫外光谱图。
图2为本发明贝类肝素的红外光谱图。
图3为本发明贝类肝素的单糖组成图。
图4为本发明贝类肝素的抗凝血活性分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1贝类肝素的制备
1、贝类肝素的制备方法，包括以下步骤：
S1.原料处理：将贝类原料洗净，去壳后，将贝肉置于2℃的丙酮中浸泡20h，室温抽滤除去丙酮，用蒸馏水冲洗3～5次后，加入蒸馏水(料液比＝1：3)进行匀浆，得到匀浆液；其中，贝类选自海蚌、象拔蚌、泥蚶、钝缀锦蛤或沙白贝中的任一种。
S2.自溶：将匀浆液于50℃水浴条件下自溶5h；
S3.酶解：加入NaOH调节pH到8.0，先加入0.5％的胰蛋白酶，在37℃下酶解5h，再加入HCl调节pH到7.0，后加入0.5％的木瓜蛋白酶，在65℃下酶解5h，得到酶解液；
S4.灭酶、离心：将酶解液置于沸水中灭酶10min，在8000rpm下离心20min；
S5.浓缩、醇沉：取上清液浓缩后，加入0.4倍体积的乙醇，置于4℃下静置24h，离心取沉淀；
S6.复溶、脱蛋白：交替用丙酮和乙醇洗涤沉淀3次，用蒸馏水溶解沉淀，离心除去不溶物；于上清液中，加入上清液1/5体积的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇与氯仿的体积比为1：4)，充分振摇30min，静置10min，取上清液，重复操作4次；
S7.除盐：将脱蛋白后的提取液置于透析袋中透析72h；
S8.干燥：将透析液进行冷冻干燥，即可得到贝类肝素。
实施例2贝类肝素的制备
1、贝类肝素的制备方法，包括以下步骤：
S1.原料处理：将贝类原料洗净，去壳后，加入蒸馏水(料液比＝1：1.5)进行匀浆，得到匀浆液；
S2.自溶：将匀浆液于38℃水浴条件下自溶7h；
S3.酶解：加入NaOH调节pH到7.8，先加入0.3％的胰蛋白酶，在32℃下酶解6.5h，再加入HCl调节pH到6.8，后加入0.3％的木瓜蛋白酶，在62℃下酶解5.5h，得到酶解液；
S4.灭酶、离心：将酶解液置于沸水中灭酶5min，在8000rpm下离心10min；
S5.浓缩、醇沉：取上清液浓缩后，加入0.3倍体积的乙醇，置于0.5℃下静置20h，离心取沉淀；
S6.复溶、脱蛋白：交替用丙酮和乙醇洗涤沉淀3次，用蒸馏水溶解沉淀，离心除去不溶物；于上清液中，加入上清液1/4.5体积的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇与氯仿的体积比为1：4)，充分振摇20min，静置10min，取上清液，重复操作4次；
S7.除盐：将脱蛋白后的提取液置于透析袋中透析48h；
S8.干燥：将透析液进行冷冻干燥，即可得到贝类肝素。
实施例3贝类肝素的制备
1、贝类肝素的制备方法，包括以下步骤：
S1.原料处理：将贝类原料洗净，去壳后，将贝肉置于6℃的丙酮中浸泡28h，室温抽滤除去丙酮，用蒸馏水冲洗3～5次后，加入蒸馏水(料液比＝1：4.5)进行匀浆，得到匀浆液；
S2.自溶：将匀浆液于62℃水浴条件下自溶3h；
S3.酶解：加入NaOH调节pH到8.2，先加入0.7％的胰蛋白酶，在42℃下酶解3.5h，再加入HCl调节pH到7.2，后加入0.7％的木瓜蛋白酶，在68℃下酶解4.5h，得到酶解液；
S4.灭酶、离心：将酶解液置于沸水中灭酶15min，在6000rpm下离心20min；
S5.浓缩、醇沉：取上清液浓缩后，加入0.5倍体积的乙醇，置于7.5℃下静置28h，离心取沉淀；
S6.复溶、脱蛋白：交替用丙酮和乙醇洗涤沉淀3次，用蒸馏水溶解沉淀，离心除去不溶物；于上清液中，加入上清液1/5体积的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇与氯仿的体积比为1：4.5)，充分振摇10min，静置5min，取上清液，重复操作4次；
S7.除盐：将脱蛋白后的提取液置于透析袋中透析96h；
S8.干燥：将透析液进行冷冻干燥，即可得到贝类肝素。
表1实施例1～3制备的贝类肝素性质
实施例4贝类肝素结构鉴定
1、将实施例1～3制备的贝类肝素分别与肝素标准品配成1mg/L的溶液，在190～400nm范围内进行紫外光谱扫描。
紫外光谱(图1)中，肝素标准品在198nm处具有特征吸收峰，海蚌、象拔蚌、泥蚶和钝缀锦蛤粗肝素的吸收峰在198nm处，沙白贝肝素在194nm和198nm处具有吸收峰，均符合肝素的紫外特征吸收。
2、将实施例1～3制备的贝类肝素和肝素标准品与溴化钾以1：100混合研细后，以溴化钾为空白，在4000～400cm-1范围内进行红外光谱扫描。
红外光谱图(图2)中，贝类肝素主要由羟基、氨基、酰胺基、羧基和硫酸基组成，在1240cm-1处呈现O-S键伸缩振动的强吸收峰，在890cm-1、940cm-1处表现出肝素的特征吸收，在800～850cm-1处表现出氨基己糖上硫酸基团的C-O-S系统伸缩振动吸收谱带，符合肝素的红外吸收特征和官能团特征。
3、采用PMP-柱前衍生化高效液相色谱法对实施例1～3制备的贝类肝素进行单糖组成分析。
(1)高效液相色谱的色谱条件：
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18分离柱(4.6×250nm，5μm)；
流动相：磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH 6.74)/乙腈(V：V＝83：17)；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：245nm，紫外检测器；
进样体积：10μL。
(2)结果如图3所示，单糖组成中，海蚌、泥蚶、沙白贝肝素均由Man、GlcN、GlcA、IdoA、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fuc 9种单糖组成，象拔蚌和钝缀锦蛤肝素则由Man、GlcN、GlcA、IdoA、Glc、Gal和Ara 6种单糖组成，均具有IdoA、GlcA和GlcN，符合肝素的主要单糖组成。
实施例5贝类肝素的抗凝血活性
1、采用天青A比色法测定标准品肝素的效价：
(1)分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL肝素钠标准溶液(2U/mL)于试管中，加蒸馏水至2.0mL；
(2)再加入2.0mL巴比妥钠缓冲液(pH 8.6)和0.5mL天青A染色液，混匀，静置5min，以蒸馏水为空白组，于505nm处测定紫外吸光度；
(3)以肝素效价为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线，建立回归方程；
采用同样的方法测定实施例1制备的贝类肝素的吸光度，根据回归方程计算贝类肝素的效价。得到回归方程为：Y＝0.0676x+0.0005，R2＝0.9979；Y为吸光度，X为肝素效价(U/mg)。
表2海蚌、钝缀锦蛤、象拔蚌、泥蚶和沙白贝肝素的效价
2、实施例1～3制备的贝类肝素对血浆凝血三项指标(APTT、PT、TT)影响
(1)活化部分凝血活酶时间(APTT值)测定
在试管中加入绵羊血浆和APTT试剂各0.1mL，混匀，置于37℃水浴锅中温浴3min；轻轻振摇；加入0.025mol/L氯化钙溶液0.1mL，立即摇匀并开始计时，并置于水域锅中不断的振摇；约30s时，不时缓慢倾斜试管，观察试管流动状态，当液体不流动停止计时，记录时间。
(2)凝血酶原时间(PT值)测定
将PT试剂、绵羊血浆置于37℃水浴锅中预温3min，取0.1mL血浆加入到预热好的试管内，再加入PT试剂0.2mL，混匀并开动秒表；8s后，不时取出试管观察血浆的流动状态，当流动停止时，记录秒数，即为PT值。
(3)凝血酶时间(TT值)测定
将TT试剂、绵羊血浆置于37℃水浴锅中预温3min，取0.2mL血浆加入到预热好的试管内，再加入TT试剂0.2mL，混匀并开动秒表，不时取出试管观察血浆的流动状态，当流动停止时，记录秒数，即为TT值。
抗凝血作用分析见图4，经测试，本发明从海蚌、钝缀锦蛤、象拔蚌、泥蚶和沙白贝中提取出的肝素具有缓和的抗凝血活性，因此，本发明在制备低副作用的肝素或其他具有缓和抗凝血功效的医药产品中具有良好的潜在应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种贝类肝素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 原料处理：将贝类洗净去壳后加水匀浆，得到匀浆液；
S2. 自溶：将匀浆液于38～62℃水浴条件下自溶3～7 h；
S3. 酶解：加入NaOH调节pH到7.8～8.2，加入胰蛋白酶，在32～42℃下酶解3.5～6.5h，再加入HCl调节pH到6.8～7.2，加入木瓜蛋白酶，在62～68℃下酶解4.5～5.5 h，得到酶解液；
S4. 灭酶、离心：将酶解液置于沸水中灭酶5～15 min，离心，取上清液；
S5. 浓缩、醇沉：将上清液浓缩后加入乙醇，置于0.5～7.5℃下静置20～28 h，离心取沉淀；
S6. 复溶、脱蛋白：交替用丙酮和乙醇洗涤沉淀2～3次，用水溶解沉淀，离心除去不溶物；于上清液中加入正丁醇-氯仿混合液，充分振摇10~30 min，静置5～15 min，取上清液，重复操作3～4次；
S7. 除盐：将脱蛋白后的提取液置于透析袋中透析48～96 h；
S8. 干燥：将透析液进行冷冻干燥，即可得到所述的贝类肝素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述贝类选自海蚌、钝缀锦蛤、象拔蚌、泥蚶或沙白贝。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述匀浆的料液比为1：1.5～4.5。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述胰蛋白酶的添加量为0.3%～0.7%；木瓜蛋白酶加酶量的添加量为0.3%～0.7%。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5所述乙醇的加入量为浓缩液体积的0.3～0.6倍。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S6所述正丁醇-氯仿混合液中正丁醇与氯仿的体积比为1：4～5；所述正丁醇-氯仿混合液与上清液的体积比为1：4～5。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述离心的条件为：6000～8000 rpm下离心10～20 min。
8.根据权利1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，还进行脱脂处理；所述脱脂处理为：将贝肉置于2～6℃的丙酮中浸泡20～28 h，室温抽滤除去丙酮，用水冲洗3～5次。
9.权利要求1～8任一所述制备方法得到的贝类肝素，其特征在于，在紫外扫描中，185～220 nm波长之间具有特征吸收峰；在红外光谱扫描中，在1240 cm-1处呈现O-S键伸缩振动的强吸收峰，在890、940 cm-1处表现出肝素的特征吸收，在800～850 cm-1处表现出氨基己糖上硫酸基团的C-O-S系统伸缩振动吸收谱带；在单糖组成中，含有氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸。
10.权利要求9所述贝类肝素在制备具有缓和的抗凝血作用的产品中的应用。
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