CN103848921A - 一种黑果枸杞碱提多糖及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及黑果枸杞碱提多糖及其制备方法，以及这种黑果枸杞碱提多糖在制备免疫调节药物或保健品中的应用。黑果枸杞果实经热水完全提取，剩余残渣用碱液浸泡提取，提取液分别经乙醇沉淀，除蛋白，脱色，超滤，冷冻干燥后得黑果枸杞碱提多糖，鼠李糖含量为4.2%，阿拉伯糖为35.8%，木糖为14.1%，甘露糖为4.6%，葡萄糖为28.9%，半乳糖为12.4%。动物实验显示，黑果枸杞碱提多糖可以提高免疫抑制小鼠的非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫功能，有效拮抗环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制作用，可用于制备免疫调节药物和保健品。

Description

一种黑果枸杞碱提多糖及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种黑果枸杞碱提多糖及其制备方法，以及这种黑果枸杞碱提多糖在制备免疫调节药物或保健品中的应用，属于食品保健和医药领域。

背景技术

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr)系茄科(Solanaceae)枸杞属(LyciumL.)，是我国西北荒漠地区一种特有的的野生植物，分布于宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏等省。黑果枸杞果实味甜多汁，含丰富的维生素、有机酸及糖类；黑果枸杞也具有医疗保健功能，藏医用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症。多糖广泛存在于中药材中，现代药理学研究证明，多糖是中草药发挥独特疗效的重要物质基础。多糖可通过激活免疫细胞，促进细胞因子生成及表达，对免疫系统发挥多方面的免疫调节作用。近年来国内外对于黑果枸杞多糖的研究多集中在水提多糖上，发现黑果枸杞水提多糖具有降血糖和抗疲劳的活性功能，但水提取后的剩余物一般作废弃处理。实际上药用植物含有不同类型的多糖，用一种提取方法很难将其完全抽提出来，因此有必要分步用不同的溶剂进行浸提，这样既可使多糖获得初步分级,又能提高多糖得率。本发明以黑果枸杞水提后的残渣为材料，首次制备出黑果枸杞碱提多糖，动物实验证实其具有良好的免疫调节功效，可用于制备免疫调节保健品及药品。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术提取的黑果枸杞多糖得率低、多糖功效不明确，提供一种具有药用价值的黑果枸杞碱提多糖，简称ALRP（Alkaline extraction Lycium ruthenicum polysaccharide），并提供了提取上述物质的制备方法，适用于工业化生产，进一步提供了以黑果枸杞碱提多糖为活性成分在制备免疫调节药物或保健品中的应用，为临床提供适合免疫功能低下患者及亚健康人群服用的药品或保健品。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明涉及一种从黑果枸杞果实水提后的残渣中制备黑果枸杞多糖的方法，包括以下步骤：

（1）碱液提取：将黑果枸杞水提取后的残渣烘干，加入5~15倍体积的0.5~3.0mol/L NaOH溶液，温度25~50℃，提取1~8h，将提取液过滤，收集滤液。

（2）醇沉：提取液40℃真空浓缩后，加乙醇调浓度至75~85%，静置12h后过滤得多糖沉淀。

（3）脱蛋白：将多糖沉淀加水溶解后，加三氯乙酸至浓度2~6%，搅拌15~60min后离心，保留上清糖液。

（4）脱色：将脱蛋白后的多糖液用氨水调pH值至8~9，30~60℃、时间15~60min、H₂O₂用量为2%~10%。

（5）超滤：将多糖液经过1~3万分子量的膜，冷冻干燥得黑果枸杞碱提多糖（ALRP）。

所得的黑果枸杞碱提多糖具有如下特征：

（1）物理性状：白色粉末，易溶于水，不溶于有机溶剂。

（2）组成分析：糖含量为91.2%，蛋白含量为8.8%。经酸水解后，乙酰化处理，进行气相色谱分析，其单糖组成为鼠李糖（4.2%），阿拉伯糖（35.8%），木糖（14.1%），甘露糖（4.6%），葡萄糖（28.9%），半乳糖（12.4%）。

（3）结构特征：紫外光谱证明本提取物为糖蛋白复合物，糖肽键为O连接类型，红外光谱具有多糖的特征吸收峰，存在β-D-型葡萄吡喃糖和β-D-型半乳吡喃糖，阿拉伯糖以呋喃型糖环存在。

所述黑果枸杞碱提多糖可提高免疫抑制小鼠的非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫等功能。

所述黑果枸杞碱提多糖与药物学上可接受的药物/保健品辅料混合形成各种形式的散剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂或注射剂。在使用时可采取口吸取、皮下、静脉注射或肛肠给药；注射液的使用可以任意选用生理盐水、葡萄糖、稳定剂、悬浮剂或乳化剂等。

本发明具有如下优点：

1本发明采用的提取的温度较低，可以避免多糖结构的破坏，完好的保存了多糖分子上的糖链部分。

2提取方法中三氯乙酸法脱蛋白操作简单，工艺步骤少，多糖损失小。采用过氧化氢法脱色法可使色素完全去除，并通过膜分离技术首次制备出黑果枸杞碱提多糖。

3本发明表明黑果枸杞碱提多糖具有免疫调节活性，纯天然，无副作用，可开发成免疫调节保健品和药品。

4根据实施例4：实验证明黑果枸杞多糖可明显提高免疫抑制小鼠脾及胸腺指数、提高免疫抑制小鼠淋巴细胞水平；增强免疫抑制小鼠的细胞免疫功能如提高迟发超敏反应能力；增强免疫抑制小鼠的体液免疫功能如提高抗体分泌水平。因此，黑果枸杞多糖具有较强的免疫调节活性，有望为临床提供一种非常适合免疫功能低下人群服用的药品。

附图说明

图1为黑果枸杞碱提多糖的糖醇乙酸酯衍生物的的气相色谱图。

图2为黑果枸杞碱提多糖的紫外吸收光谱。

图3为黑果枸杞碱提多糖的红外光谱。

具体实施方式

黑果枸杞热水完全提取过程为:黑果枸杞果实加4倍体积的水用组织捣碎机打碎至均匀状态，加热超声法（提取条件：温度70℃，超声波频率40KHz，功率50W）提取2h，将提取液离心（6000r/min，10min），残渣用2倍体积的水再次加热超声提取1h，离心后，上清液为黑果枸杞果实热水完全提取液，得到的剩余残渣用于碱提取多糖。

实施例1一种黑果枸杞碱提多糖的制备方法，包括以下步骤：

（1）碱液提取：将水提后的黑果枸杞残渣于50℃烘干，称取100g烘干后的黑果枸杞残渣于室温下用1000mL 1mol/L NaOH溶液室温浸提2h，过滤后的残渣再次用500mL 1mol/L NaOH室温提取2小时，过滤，合并两次提取的滤液，离心去杂质后收集上清提取液。

（2）醇沉：提取液40℃真空浓缩后，加乙醇调浓度至80%，静置12h后过滤得多糖沉淀。

（3）脱蛋白：将沉淀加入质量浓度3%的三氯乙酸溶液中，搅拌30min后离心，保留上清糖液；三氯乙酸溶液用量为1：50(g:mL),保留上清糖液。

（4）脱色：将脱蛋白后的多糖液用氨水调pH值至9、45℃、时间30min、H₂O₂用量为5%。

（5）超滤：将多糖液经过1万分子量的膜，冷冻干燥得黑果枸杞碱提多糖（ALRP）。

实施例2黑果枸杞碱提多糖的单糖组成检测

黑果枸杞碱提多糖（ALRP）2mg，加入2mL 2mol/L TFA，密闭，充氮气，121℃水解2h，减压抽干。水解后的样品加入1mL水溶解，加入100μL 0.5mol/L Na₂CO₃调pH至9左右，于30℃水浴保温60min。加入0.5mL NaBH₄溶液室温还原2h。加入冰醋酸中和至无气泡，过阳离子交换柱（H⁺型），将洗脱液旋转蒸发至干，加甲醇蒸干以除去硼酸盐。85℃真空加热2h，残渣溶于1mL吡啶中，加入1mL正丙胺，密封，55℃加热30min。旋转蒸发抽干溶剂，加入吡啶和乙酸酐各2mL，振荡后室温过夜。减压抽干后，用氯仿溶解并用水萃取3次，氯仿层进行气相色谱分析。色谱柱为rtx-50柱（30.0m×0.25mm×0.25μm）。程序升温条件为：180℃(2min)－6℃/min，210℃－0.3℃/min，215℃－6℃/min，240℃(30min)。

经检测如图1所示，黑果枸杞碱提多糖的单糖组成为鼠李糖（4.2%），阿拉伯糖（35.8%），木糖（14.1%），甘露糖（4.6%），葡萄糖（28.9%），半乳糖（12.4%）。

实施例3黑果枸杞碱提多糖的光谱分析

将样品配制为1.0mg/mL的水溶液，于200nm至500nm波长范围内进行紫外扫描。采用KBr压片法进行红外光谱的测定。

黑果枸杞碱提多糖的紫外吸收光谱图如图2所示。由于蛋白质在280nm处有特征吸收，糖类物质在200nm附近有特征吸收，因此可以通过紫外扫描可初步判定糖类和蛋白质的存在。紫外扫描显示，在200nm左右有强烈吸收，而在280nm处有较弱吸收，说明黑果枸杞碱提多糖为糖蛋白复合物。

如图3所示，红外光谱中，有多糖特征吸收峰，3600～3200cm^-1处的吸收峰为O-H的伸缩振动；2925cm^-1处有中强吸收，表示有糖类-CH₂或-CH₃的C-H伸缩振动；877cm^-1处有弱吸收，表明有β-D-型葡萄吡喃糖与β-D-型半乳吡喃糖存在；未显示有羧基的存在，这与气相色谱的结果一致。

实施例4动物实验评价黑果枸杞碱提多糖的免疫活性

（1）受试样品：黑果枸杞碱提多糖，按照实验施例1所述的方法制备。

（2）实验动物：雌性昆明小鼠，清洁级动物，6～8周龄，20±2g，由大连医科大学实验动物中心提供，批准号为SCXK（辽）2008-0002，清洁级动物房饲养，温度20±1℃，湿度40%～50%，光照12h，颗粒饲料喂养，自由饮水。

（3）检测项目：小鼠体重、脾脏和胸腺重；血象检测；细胞免疫功能检测，采用足趾肿法测定迟发型变态反应；体液免疫功能检测，测定血清半数溶血值。

（4）实验方法：将小鼠随机分为4组（空白对照组、免疫抑制模型组、多糖低剂量组、多糖高剂量组），每组10只（n=10），除对照组外，其余各组采取连续5d皮下注射环磷酰胺80mg/kg的方法制造免疫功能低下模型，模型制备成功后，多糖低剂量组（10mg·kg^-1·d^-1）和多糖高剂量组（30mg·kg^-1·d^-1）采取腹腔注射的方式给药，空白对照组和免疫抑制模型组用生理盐水给药，注射量按0.1mL/10g体重计，连续给药10d。按照中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》进行上述项目的检测。

实验各组小鼠给药10d后，采血抗凝后用血细胞计数仪检测小鼠血象。末次给药前12h，动物禁食，不禁水，停药24h后各组动物处死后，取脾脏、胸腺，称湿重并按公式计算脾和胸腺指数。

脾指数=脾重量（mg）／体重（g）胸腺指数=胸腺重量（mg）／体重（g）

各组小鼠在给药第3d，用2%绵羊红细胞腹腔注射，每只小鼠注射0.2mL致敏，5d后测量右后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20%绵羊红细胞，每只小鼠20μL，24h后测量右后足跖部厚度，测量三次取平均值，计算足跖增加厚度（mm），以足跖增加厚度表示DTH程度。

各组小鼠于给药第3d，腹腔注射2%SRBC 0.2mL致敏。末次给药后24h，处死动物，小鼠摘眼球取血，分离血清，用生理盐水将血清稀释200倍，将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10%的绵羊红细胞0.5mL，补体1mL（用生理盐水按1：10稀释），另设不加血清的对照管（以生理盐水代替）。置37℃恒温水浴锅中保温15min，冰浴中终止反应，2000r/min离心10min。取上清夜1mL、生理盐水3mL于试管内，同时取10%的SRBC0.25mL于另一支试管内，充分混匀，放置10min后，于540nm处分别测定各管的光密度值。

半数溶血值HC₅₀=（样品OD值/SRBC半数溶血时OD值）×稀释倍数

（5）结果：

黑果枸杞碱提多糖对小鼠免疫器官重量的影响：从表1看出，与模型组比较，多糖低剂量组和高剂量组均明显提高免疫抑制小鼠的脾指数和胸腺指数。

表1黑果枸杞多糖对小鼠脏器指数的影响

组别	剂量/mg.kg	脾指数	胸腺指数
				对照组	--	4.46±0.78	3.37±0.81
模型组	--	2.44±0.54##	0.73±0.36##
				低剂量组	10	3.81±0.68**	2.65±0.25**
高剂量组	30	4.02±0.39**	2.98±0.68**

注：^##与对照组比较，P<0.01；^**与模型组比较，P<0.01

黑果枸杞碱提多糖对小鼠血象的影响：由表2可以看出：免疫抑制小鼠给药后，小鼠LY水平、Mon水平、WBC水平与免疫抑制模型组相比有所提高，可以使免疫抑制小鼠血中LY、Mon、WBC水平恢复到正常水平。

表2黑果枸杞多糖对小鼠血象的影响

组别	白细胞数	淋巴细胞	单核细胞	中性粒细胞
					对照组	2.40±0.14	1.60±0.42	0.05±0.07	0.75±0.49
模型组	0.60±0.28##	0.55±0.21##	0.00##	0.05±0.07##
					低剂量组	1.82±0.18**	1.15±0.34**	0.11±0.09**	0.54±0.48**
高剂量组	2.36±0.57**	2.53±0.41**	0.15±0.11**	0.98±0.34**

注：^##与对照组比较，P<0.01；^**与模型组比较，P<0.01

白细胞正常值(1.8-10.7)×10⁹;淋巴细胞正常值(1.0-9.8)×10⁹；

单核细胞正常值(0.0-1.1)×10⁹;中性粒细胞正常值(0.1-4.1)×10⁹。

黑果枸杞碱提多糖对小鼠体液免疫功能的影响：由表3可见，多糖给药后能够使免疫抑制小鼠外周血中抗体含量恢复到正常水平。

表3黑果枸杞多糖对小鼠血清溶血素的影响

组别	剂量/mg.kg	溶血素相对值
			对照组	--	361.36±40.29
模型组	--	214.23±57.94##
			低剂量组	10	309.19±34.85**
高剂量组	30	333.29±39.38**

注：^##与对照组比较，P<0.01；^**与模型组比较，P<0.01

黑果枸杞碱提多糖对小鼠细胞免疫功能的影响：由表4可知，免疫抑制小鼠给药后，其迟发型超敏反应能力均显著高于免疫抑制组，高剂量可使免疫抑制小鼠的迟发超敏反应能力恢复到正常水平。

表4黑果枸杞多糖对小鼠迟发超敏反应的影响

组别	剂量/mg.kg	足垫厚度差/mm
			对照组	--	2.98±0.14
模型组	--	2.21±0.22##
			低剂量组	10	2.64±0.35**
高剂量组	30	2.86±0.28**

注：^##与对照组比较，P<0.01；^**与模型组比较，P<0.01

本发明在动物实验发现，黑果枸杞多糖可明显提高免疫抑制小鼠脾及胸腺指数、提高免疫抑制小鼠淋巴细胞水平；增强免疫抑制小鼠的细胞免疫功能如提高迟发超敏反应能力；增强免疫抑制小鼠的体液免疫功能如提

高抗体分泌水平。综上结果显示黑果枸杞多糖具有免疫调节作用。

Claims (9)

1.一种黑果枸杞碱提多糖，其特征在于:鼠李糖含量为4.2％，阿拉伯糖为35.8％，木糖为14.1％，甘露糖为4.6％，葡萄糖为28.9％，半乳糖为12.4％。

2.一种权利要求1所述黑果枸杞碱提多糖的制备方法，其特征在于：黑果枸杞果实经热水完全提取后，得到的剩余残渣用氢氧化钠溶液浸泡提取，离心去除固体物质后收集提取液，提取液分别经乙醇沉淀，收集的沉淀用三氯乙酸法除蛋白，离心后上清糖液过氧化氢法脱色，超滤，滤液干燥后得黑果枸杞碱提多糖（ALRP）。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

热水完全提取过程为:黑果枸杞果实加4倍体积的水用组织捣碎机打碎至均匀状态，加热超声法（提取条件：温度70℃，超声波频率40KHz，功率50W）提取2h，将提取液离心（6000r/min，10min），残渣用2倍体积的水再次加热超声提取1h，离心后，上清液为黑果枸杞果实热水完全提取液，得到的剩余残渣用于碱提取多糖。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述的浸泡提取工艺条件为：黑果枸杞水提后残渣加5-15倍体积的氢氧化钠溶液；氢氧化钠溶液浓度0.5-3.0mol/L,提取温度25-50℃，提取时间1-8h。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

醇沉过程于提取液加乙醇调体系中乙醇质量浓度至75-85％，静置24h，离心得多糖沉淀。

6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述的三氯乙酸法脱蛋白条件为：将沉淀加入质量浓度2-6％的三氯乙酸溶液中，搅拌15-60min后离心，保留上清糖液；三氯乙酸溶液用量为1：50(g:mL)。

7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述的过氧化氢法脱色条件为温度30-60℃、时间15-60min、用氨水调体系pH 8-9后脱色、质量分数为30％的H₂O₂溶液的体积用量为上清糖液体积的2％-10％。

8.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：将多糖液经过1-3万截流分子量的膜超滤。

9.一种权利要求1所述的黑果枸杞碱提多糖在制备免疫调节药物或保健品中的应用。

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