CN111057115B

CN111057115B - 一种从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素及其制备方法和应用

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Publication number: CN111057115B
Application number: CN201911300480.2A
Authority: CN
Inventors: 钟赛意; 杜振兴; 陈菁; 周斯仪; 贾学静; 陈建平; 刘晓菲; 曹笑皇; 洪鹏志
Original assignee: Guangdong Ocean University; Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University; Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN111057115A

Abstract

本发明公开了一种从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素及其制备方法和应用，特点是该肝素四糖结构式如（I）所示，其制备方法包括取贵妃蚌肉粉末加入蒸馏水溶解样品后调节pH到7.8～8.2后，加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解得到酶解液灭酶，离心取上清液的步骤；将上清液转移至大孔离子交换树脂且已经平衡的层析柱中，柱中溶剂为蒸馏水，合并收集1.5M的NaCl溶液的洗脱组分的步骤；将收集的洗脱组分浓缩后加入乙醇静置离心取沉淀后，交替用丙酮和乙醇洗涤沉淀用水溶解沉淀离心除去不溶物，重复操作3～4次的步骤；最后透析、冷冻干燥，即得到从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素产品的步骤；优点是出血副作用低、抗凝血作用缓和以及纤溶作用强。

Description

一种从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种抗血栓类肝素，尤其是涉及一种从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素及其制备方法和应用。

背景技术

血栓性疾病严重威胁人类的生命健康，其发病率高居各种疾病之首。尽管引进了肝素等抗血栓药物之后，血栓性疾病发病率得到了降低，但是与恶性肿瘤相比，血栓性疾病仍然是导致死亡重要原因，且近年来还有渐增之势，是当代医学研究的重点和热点之一。

肝素是存在于动物体内的一种糖胺聚糖，具有多样的生物活性，在临床上运用广泛，特别是作为抗凝剂的使用，目前还没有一种能够完全代替它的产品。所以用于治疗血栓性疾病的肝素主要依赖其强大的抗凝血作用。而目前临床所用肝素多来源于猪小肠和牛肺，但来源于猪小肠和牛肺的肝素抗凝血作用太强，不可避免的造成出血效应、血小板减少等副作用。针对用于治疗血栓性疾病的肝素会造成出血副作用的问题，亟需开发一种不依赖抗凝血作用而发挥抗血栓功能的肝素或类肝素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种出血副作用低、抗凝血作用缓和纤溶作用强的从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素，该肝素四糖结构式如下（I）所示：

其中R₁为SO₃ ^-或者H，R₂为SO₃ ^-且R₃为SO₃ ^-，或者R₂为H且R₃为HAC。

2、上述抗血栓类肝素的制备方法，包括以下步骤：

（1）原料处理：将贵妃蚌原料洗净，去壳后，将贝肉匀浆，冷冻干燥成粉末；

（2）酶解：取干燥的贵妃蚌肉粉末，按料液质量比1:6-1:10的比例加入蒸馏水溶解样品后，加入NaOH调节pH到7.8～8.2后，加入贵妃蚌肉粉末质量0.4%～0.7%%的碱性蛋白酶和0.4%～0.7%%的木瓜蛋白酶，在45～55℃下酶解20～25 h，得到酶解液；

（3）灭酶离心：将酶解液置于沸水中灭酶5-15 min，离心取上清液；

（4）上样：将上清液转移至装有AMBERLITE FPA98 CI大孔离子交换树脂，且已经平衡的层析柱中，柱中溶剂为蒸馏水，上样流速为5-40ml/min；

（5）洗脱：依次用0M，1.0M，1.5M，3.5M的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为5-15mL/min，合并收集1.5M的NaCl溶液的洗脱组分；

（6）浓缩、醇沉：将收集的洗脱组分浓缩后加入0.4倍浓缩液体积的乙醇，置于0.5～7.5℃下静置20～28 h后，于6000～8000 rpm下离心10～20 min取沉淀；

（7）复溶：交替用丙酮和乙醇洗涤沉淀2～3次，用水溶解沉淀，离心除去不溶物，重复操作3～4次；

（8）除盐：将复溶后的提取液置于透析袋中透析48～96 h；

（9）干燥：将透析液进行冷冻干燥，即可得到从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素。

上述抗血栓类肝素在制备低出血副作用的抗血栓产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素及其制备方法和应用，其从贵妃蚌中分离出较高纯度的类肝素，抗凝血实验表明该类肝素具有缓和的抗凝血作用；体内及体外纤溶实验表明该类肝素具有显著的纤溶活性，约为哺乳动物源商业肝素纤溶活性的3.8倍；小鼠断尾实验表明该类肝素出血副作用微弱在制备低出血副作用的类肝素或其他具有抗血栓功能的医药用品和保健品中具有市场应用价值。

附图说明

图1为贵妃蚌肝素紫外光谱图；

图2为贵妃蚌类肝素醋酸纤维电泳图；其中HP为肝素标准品、CS为硫酸软骨素标准品、DS为硫酸皮肤素标准品；

图3为贵妃蚌类肝素高效液相凝胶色谱图；

图4为贵妃蚌类肝素单糖组成图；注：图中各编号代表：1，PMP；2，甘露糖；3，鼠李糖；4，葡萄糖胺；5，葡萄糖醛酸；6，艾杜糖醛酸；7，N-乙酰葡萄糖胺；8，葡萄糖；9，半乳糖；10，阿拉伯糖，11，岩藻糖；

图5为贵妃蚌类肝素红外光谱图；

图6为贵妃蚌类肝素核磁共振光谱图；图中a为¹H NMR、b为¹³C NMR、c为¹H-¹H COSY、d为¹H-¹³C HSQC、e为¹H-¹H TOCSY、f为¹H-¹H NOESY；

图7为贵妃蚌类肝素浓度与活化部分凝血活酶时间（APTT值）的线性关系示意图；

图8为贵妃蚌类肝素浓度与凝血酶原时间（PT值）的线性关系示意图；

图9为贵妃蚌类肝素浓度与凝血酶时间（TT值）的线性关系示意图；

图10为贵妃蚌类肝素出血副作用图；

图11为贵妃蚌类肝素体外纤溶活性图。注：（A）尿激酶在不同浓度下产生的溶出环面积，以及根据尿激酶浓度和溶圈大小所制得的标准曲线；（B）样品和HP在12mg/ml的浓度下产生的溶圈面积。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素的制备方法，包括以下步骤：

1. 原料处理：将贵妃蚌原料洗净，去壳后，将贝肉匀浆，冷冻干燥成粉末；

2. 酶解：取100g贵妃蚌干燥粉末加入8L蒸馏水溶解，加入NaOH调节pH到8.0得到原料液，加入贵妃蚌干燥粉末质量0.5%的2709碱性蛋白酶和0.5%的木瓜蛋白酶，在50℃下酶解20h，得到酶解液；

3. 灭酶离心：将酶解液置于沸水中灭酶10 min，在8000 rpm下离心20 min，得到上清液；

4. 上样：将上清液转移至装有AMBERLITE FPA98 CI大孔离子交换树脂，且已经平衡的层析柱中，柱中溶剂为蒸馏水，上样流速为5-40ml/min；

5. 洗脱：依次用0M，1.0M，1.5M，3.5M的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为5-15mL/min，合并收集1.5M的组分；

6. 浓缩、醇沉：将1.5M组分洗脱液浓缩后加入0.4倍浓缩液体积的乙醇，置于0.5～7.5℃下静置20～28 h，离心取沉淀；

7. 复溶：交替用丙酮和乙醇洗涤沉淀2～3次，用水溶解沉淀，离心除去不溶物，重复操作3～4次；

8. 除盐：将复溶后的提取液置于透析袋中透析48～96 h；

9. 干燥：将透析液进行冷冻干燥，即可得到从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素。

除上述具体实施例外，加入蒸馏水的料液比还可以为1:6、1:10或者1:6~1:10内的任一值；pH值可以为7.8、8.2或者7.8～8.2内任一值；碱性蛋白酶的添加量可以为0.4%、0.7%或者0.4%～0.7%内的任一值；木瓜蛋白酶的添加量可以为0.4%、0.7%或者0.4%～0.7%内的任一值；酶解温度为45℃、55℃或者45～55℃内的任一值，酶解时间可以为20h、25 h或者20～25h内的任一值；离心速度可以为：6000rpm～8000 rpm或者6000～8000 rpm内的任一值；离心时间为10min、20 min或者10～20 min内的任一值。

具体实施例二

贵妃蚌类肝素的结构表征

1、贵妃蚌肝素紫外光谱扫描

将具体实施例一中制备得到的贵妃蚌肝素用蒸馏水配成1-3 mg/ml的溶液，以蒸馏水为调零管，在紫外可见分光光度计上对样品进行紫外光谱扫描。如图1所示，紫外光谱扫描图表明贵妃蚌肝素纯度较高，不含蛋白质和核酸。

2、贵妃蚌类肝素醋酸纤维电泳分析

取具体实施例一中制备得到的贵妃蚌类肝素3 mg，用蒸馏水配置成 3 mg/mL。将醋酸纤维素膜（8×2 cm）浸泡在 0.1mol/L吡啶—0.47 mol/L甲酸（pH3.0）电泳缓冲溶液中，30 min 后取出，用干净的的滤纸吸去多余的缓冲液；在醋酸纤维素薄膜无光泽一面的距离阴极端1.5 cm处点样；将点样的薄膜置于电泳槽支架上，光面朝上，在7 mA电流下电泳20 min，电泳结束后，将薄膜置于0.5%阿利新蓝染色液（2%醋酸溶液为溶剂）染色30 min，最后用2%醋酸水溶液脱色30 min。如图2所示，醋酸纤维电泳图表明贵妃蚌类肝素的电泳迁移率与肝素相似。

3、贵妃蚌类肝素分子量测定

采用高效凝胶色谱（HPGPC）测定贵妃蚌类肝素的纯度和分子量：色谱柱：WatersUltrahydrogel Column 500 （7.8 mm× 300 mm）；柱温：35 ℃；流动相：0.2 mol/L 硫酸钠；流速：0.6 mL/min；检测器为 agilent 1200 示差检测器；进样体积：10 µL。

不同分子量肝素标准品（3500，5000，8000，15000and 30000 Da）和样品分别用0.2mol/L硫酸钠配置成5 mg/mL的溶液，经0.22 µm的针式滤膜过滤后进养样。记录标准品和样品的保留时间进行数据处理。结果如图3所示，贵妃蚌类肝素高效液相凝胶色谱图呈现出一个单一的峰，说明该化合物纯度较高，测得该化合物分子量为30.99kDa。

4、贵妃蚌类肝素单糖组成分析

称取具体实例一中制备得到样品3.0 mg于15 ml样品瓶中，加入1.5 mol/L的三氟乙酸9ml，置于110℃烘箱中水解 4-8h，水解液用氮气吹干，蒸干物用超纯水溶解，并于-20℃下保存备用。处理后的样品和单糖标准品采用 PMP 衍生-高效液相反向色谱法测定。

高效液相色谱的色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18分离柱（4.6 × 250nm，5 μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 6.74）/乙腈（V：V=83：17）；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：245 nm，紫外检测器；进样体积：10 μL。结果如图4所示，贵妃类蚌肝素主要由氨基葡萄糖，葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸组成，符合肝素的主要单糖组成特点。

5、贵妃蚌类肝素红外光谱分析

将具体实施例一制备的贝类肝素和肝素标准品与溴化钾以1：100混合研细后，以溴化钾为空白，在4000～400 cm-1范围内进行红外光谱扫描。结果如图5所示，红外光谱图中贵妃蚌类肝素主要由羟基、氨基、酰胺基、羧基和硫酸基组成，在1240 cm^-1处呈现O-S键伸缩振动的强吸收峰，在890 cm^-1、940 cm^-1处表现出肝素的特征吸收，在800～850 cm^-1处表现出氨基己糖上硫酸基团的C-O-S系统伸缩振动吸收谱带，符合肝素的红外吸收特征和官能团特征。

6、贵妃蚌类肝素核磁光谱分析

取具体实施例一制备的贵妃蚌类肝素样品50mg溶于1ml 重水D₂O中，冷冻干燥处理3次后，用Ascend 700M核磁光谱仪在25℃下测定其一维核磁光谱（¹H、¹³C）和二维核磁光谱（¹H-¹H COSY、¹H-¹³C HSQC、¹H-¹H TOCSY和¹H-¹H NOESY）。结果如图6所示，

解析核磁光谱图可知，贵妃蚌类肝素主要由→4)-α-IdoA2S-(1→4)-α-GlcNS6S-(1→, →4)-α-IdoA2S-(1→4)-α-GlcNS3S6S-(1→, →4)-β-GlcA-(1→4)-α-GlcNS6S-(1→和→4)-β-GlcA-(1→4)-α-GlcNAc(1→的重复二糖组成，它们的比例为：1.03：0.48：0.76：0.02。其四糖结构为：→4)-α-IdoA2S -(1→4)-α-GlcNS3S6S(or GlcNS6S)-(1→4)-β-GlcA-(1→4)-α-GlcNS6S(or GlcNAC)-(1→，该四糖结构目前尚未有报道。具体如下结构式（I）所示：

（I），其中R₁为SO₃ ^-或者H，R₂为SO₃ ^-且R₃为SO₃ ^-，或者R₂为H且R₃为HAC。

具体实施例三

贵妃蚌类肝素的抗凝血活性

具体实施例一制备的贵妃蚌类肝素对血浆凝血三项指标（APTT、PT、TT）影响

用生理盐水溶解贵妃蚌类肝素和肝素标准品，分别配制成10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml,80ug/ml,500 ug/mL，以生理盐水为阴性对照，肝素标准溶液为阳性对照，根据试剂盒说明分别测定APTT，PT和TT。

1、活化部分凝血活酶时间（APTT值）测定：在试管中加入试样20uL、绵羊血浆0.1mL和APTT试剂各0.1 mL，混匀，置于37℃水浴锅中温浴3min；轻轻振摇；加入0.025 mol/L氯化钙溶液0.1 mL，立即摇匀并开始计时，并置于水域锅中不断的振摇；约30 s时，不时缓慢倾斜试管，观察试管流动状态，当液体不流动停止计时，记录时间。结果如图7所示，由图7可知，贵妃蚌类肝素浓度对血浆APTT的延长作用弱于哺乳动物肝素。

2、凝血酶原时间（PT值）测定：将PT试剂、绵羊血浆置于37℃水浴锅中预温3 min，取0.1 mL血浆和20 uL试样加入到预热好的试管内，再加入PT试剂0.2 mL，混匀并开动秒表；8 s后，不时取出试管观察血浆的流动状态，当流动停止时，记录秒数，即为PT值。结果如图8所示，由图8可知，在低浓度时，贵妃蚌类肝素与哺乳动物肝素对血浆PT的延长作用并无明显差异。

3、凝血酶时间（TT值）测定：将TT试剂、绵羊血浆置于37℃水浴锅中预温3 min，取0.1 mL血浆20 uL试样加入到预热好的试管内，再加入TT试剂0.2 mL，混匀并开动秒表，不时取出试管观察血浆的流动状态，当流动停止时，记录秒数，即为TT值。结果如图9所示，由图9可知，贵妃蚌类肝素对血浆TT的延长作用略低于哺乳动物肝素。

综上所述，贵妃蚌类肝素主要通过延长血浆APTT和TT发挥抗凝血作用，与哺乳动物源肝素相比，贵妃蚌类肝素延长血浆APTT和TT的作用更微弱。而在高浓度（500ug/ml）时，贵妃蚌类肝素对PT的延长作用要略强。综合凝血三项指标分析，本发明从贵妃蚌中提取出的类肝素与哺乳动物肝素相比，抗凝血作用更缓和。

具体实施例四

贵妃蚌类肝素的出血副作用

制备的贵妃蚌类肝素对小鼠断尾出血时间影响：将小鼠分成7组，每组5只小鼠，空白组注射10ml/kg的生理盐水，对照组注射10ml/kg肝素标准品（中国食品药品检定研究所）溶液（20mg/kg），样品组分别注射5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg的10ml/kg样品溶液，注射方式均为尾静脉注射。给药30min后，在小鼠尾端距离尾尖3mm处切断小鼠尾部，记录小鼠出血时间。贵妃蚌类肝素出血副作用分析见图10，经测试本发明从贵妃蚌中提取出的类肝素出血副作用远低于哺乳动物肝素。

具体实施例五

具体实施例一制备的贵妃蚌类肝素纤溶作用能力

1、体外纤溶活性测定：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法测定贵妃蚌类肝素的体外纤溶活性。将0.3g琼脂糖与20ml，0.01M的PBS于锥形瓶中混合，在微波下加热溶解。待冷却到55-60℃后，快速向瓶中加入10ml纤维蛋白原溶液（0.15%）和1ml凝血酶溶液（10U/ml），混匀，然后转移到9cm培养皿中。室温放置一小时，在已凝固的平板上用打孔器打直径为3mm的孔。在小孔中加入20ul生理盐水、尿激酶溶液（200U/ml）和不同浓度（1mg/ml、6mg/ml、12mg/ml）的样品溶液和肝素标准品溶液。培养皿放置在37℃恒温培养箱中培育18h，用考马斯亮蓝染色液（0.25%考马斯亮蓝R-250，5%醋酸，4.5%甲醇）染色，用脱色液（45%甲醇，45%蒸馏水，10%醋酸）脱色，并用游标卡尺测量溶圈直径。通过不同活性的尿激酶（5，10，20，40，80，160U/ml）产生的溶圈面积绘制标准曲线，并根据标准曲线和样品的溶圈面积定量计算样品纤溶活性。贵妃蚌类肝素体外纤溶活性如图11所示。经测定，贵妃蚌类肝素体外纤溶活性为1.96 ± 0.11 IU/mg，哺乳动物肝素纤溶活性为0.51 ± 0.02 IU/mg。贵妃蚌类肝素体外纤溶活性为哺乳动物肝素的3.85倍。

2、体内纤溶活性测定：将SD大鼠（220-250g）随机分成7组（每组6只），实验前禁食24h。通过腹腔注射的方式向大鼠注射水合氯醛（0.15ml/100g）。大鼠麻醉后，通过股静脉注射生理盐水、肝素标准品（1mg/kg、6mg/kg、12mg/kg）和贵妃蚌类肝素（1mg/kg、6mg/kg、12mg/kg），注射量为（0.1ml/100g）。给药2h后将大鼠仰卧位固定，解剖大鼠，使用真空采血管腹主动脉取血。根据试剂盒说明测定大鼠血液中的（组织型纤溶酶原激活物）t-PA、（尿激酶型纤溶酶原激活物）u-PA、（纤溶酶原激活剂抑制物-1）PAI-1的含量，并计算t-PA与PAI-1的比值。

表1 贵妃蚌类肝素对大鼠体内纤溶系统的影响

以上结果表明，贵妃蚌类肝素能显著促进大鼠体内释放t-PA和u-PA，同时能抑制PAI-1的释放。且通过t-PA/PAI-1可知，贵妃蚌类肝素对大鼠体内纤溶系统的促进作用远大于哺乳动物肝素。因此，本发明在制备低副作用的具有抗血栓的肝素或其他具有强效抗血栓功能的医药产品中具有良好的潜在应用价值。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素，其特征在于其制备方法包括以下步骤：

（8）除盐：将复溶后的提取液置于透析袋中透析48～96 h；

（9）干燥：将透析液进行冷冻干燥，即可得到从贵妃蚌中提取的抗血栓类肝素，所述肝素含有式（I）所示的四糖结构：

2.一种权利要求1所述的抗血栓类肝素在制备低出血副作用的抗血栓产品中的应用。