CN114478832A - 从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法，通过将肝素钠副产物经分级沉淀、过氧化氢氧化、超滤、冻干等步骤分别得到硫酸软骨素、硫酸皮肤素、类肝素和舒洛地特四种多糖类产品。本发明确定了室温条件下乙醇沉淀的最佳条件，避免了低温沉淀和高温沉淀造成的能源消耗，并且四种多糖类产品收率提高约10％；通过进一步优化氧化工艺，摸索出在35～40℃下氧化3～10h，有效去除色素和蛋白质、核酸杂质，比目前30℃过氧化氢氧化6～24h的氧化技术节约50％时间，提高生产效率；本发明工艺过程绿色环保，分离成本低且效果佳，容易放大。

Description

从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法
技术领域
本发明属于黏多糖生物制药技术领域，具体涉及一种从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是一种天然酸性粘多糖，属于高分子化合物，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D氨基半乳糖组成，旋光-25～-32°。CS具有促进冠状动脉循环、降血脂、抗凝血、抗肿瘤和防止血管硬化等活性，主要治疗风湿和类风湿疾病，对冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗塞等心血管疾病的防治有一定疗效。
硫酸皮肤素(Dermatan sulfate，DS)主要有2-乙酰氨基-4-硫酸-D半乳糖胺和L-艾杜糖醛酸组成。旋光-55～-63°，抗凝效价≤10USPU/mg，活化肝素辅酶因子II，且无出血副作用，是良好的抗血栓药物，同时还有抗水肿、促进皮肤更新，滋润皮肤，保持水分的作用。
类肝素(Heparinoid)是肝素的类似物质，在化学结构上与肝素类似，多数以钠盐形式存在，具有抗凝血活性。类肝素能有效地控制发炎病症，改善患处之血液循环，治愈水肿及浮肿。一般用于外用软膏的原料，化妆品的添加剂。
舒洛地特(Sulodexide)：商品名为“伟素”，药物中同时含有的80.00％硫酸乙酰肝素和20.00％硫酸皮肤素，是1973年意大利的Alfa Wassermann公司上市的一种低分子肝素类药物。硫酸乙酰肝素是肝素的亚成分，其分子量较小，乙酰化程度高，硫酸基含量较少，活化ATIII；硫酸皮肤素是由重复的2-乙酰氨基-4-硫酸-D半乳糖胺和L-艾杜糖醛酸二塘单位组成的粘多糖，活化肝素辅酶因子II，且无出血副作用；两者可以协同发挥作用。舒洛地特可以口服的特点使其适合抗血栓的长期治疗，通过抗凝作用、纤溶作用、血液流变学作用、抗增殖作用及维持膜通透选择性作用发挥其药理作用。
在肝素钠生产过程中产生大量的肝素副产物，其主要成分有硫酸软骨素、硫酸皮肤素、类肝素等的多糖类物质。目前工艺只从副产物中提纯1种或2种多糖类物质，剩余有效成分未得到充分利用。CN109762079A公开了一种采用高温沉淀、过氧化氢-臭氧体系氧化沉淀、干燥的方法，制得舒洛地特；从肝素副产物中提纯硫酸皮肤素，CN106188341A公开了一种采用低温分级沉淀，过氧化氢氧化沉淀得到硫酸皮肤素粗品，进而通过亚硝酸盐降解在进行分级沉淀，氧化沉淀得到纯度98％的硫酸皮肤素。CN100384884C公开了一种采用乙醇分级沉淀，通过亚硝酸盐降解再进行分级沉淀分离得到硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素。但目前为止没有一种较好地从肝素钠副产物中分离提纯硫酸软骨素、硫酸皮肤素、类肝素和舒洛地特等四种多糖类产品的方法，造成肝素副产物有效成分的浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种绿色环保、分离成本低且效果好的从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法。
本发明采用如下技术方案：
一种从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法，其包括以下步骤：
(一)肝素副产物干品的预处理
将肝素副产物干品加纯化水溶解，按浓度5-15％溶解，用阴离子树脂吸附、洗涤、洗脱得到去除蛋白质、核酸的肝素副产物；
(二)硫酸软骨素提纯
2-a、将肝素副产物加纯化水溶解，使药液浓度2～10％，加3～10％氯化钠，调整pH，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为45～55％时，停止加乙醇，室温沉淀8～16h，沉淀为硫酸多糖混合物，上清为硫酸软骨素溶液；
2-b、将上述沉淀溶解重复步骤2-a一次；
2-c、将2次沉淀收集的硫酸软骨素上清混匀，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为60～70％时，停止加乙醇，室温沉淀8～16h，收集沉淀物，得硫酸软骨素粗品；
2-d、将硫酸软骨素粗品加纯化水溶解至硫酸软骨素粗品湿重浓度为10～40％w/v，调整pH，加入溶液体积0.5～2％过氧化氢氧化，35～40℃下搅拌反应3～10h；
2-e、氧化结束后，调整药液pH为5.0～8.0，经微孔滤膜过滤，收集滤液，超滤、冻干得硫酸软骨素；
(三)硫酸皮肤素提纯
3-a、将步骤2-b中收集的硫酸多糖沉淀，加纯化水溶解至湿重浓度为10～40％w/v，加3～10％的氯化钠，调整pH，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为30～40％时，停止加乙醇，室温沉淀3～12h，收集沉淀和上清；
3-b、将步骤3-a中收集的上清继续补加乙醇，当药液中乙醇浓度为40～50％时，停止加乙醇，室温沉淀3～12h，沉淀为硫酸皮肤素粗品；收集上清，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为60～70％时，停止加乙醇，室温沉淀8～16h，收集沉淀和步骤3-a得到的沉淀混合得类肝素粗品；
3-c、将步骤3-b得到的硫酸皮肤素粗品加纯化水溶解至硫酸皮肤素粗品湿重浓度为10～40％w/v，调整pH，加入药液体积0.1～0.3％亚硝酸钠，在室温下搅拌16～24h后，调整药液pH 5.0～8.0，3000D超滤膜超滤，去除降解后的低分子肝素类物质，收集超滤液；
3-d、超滤液调整pH后，加入溶液体积0.5～2％过氧化氢氧化，35～40℃搅拌反应3～10h；
3-e、氧化结束后，调整药液pH 5.0～8.0，经微孔滤膜过滤，收集滤液，超滤、冻干得到硫酸皮肤素；
(四)类肝素提纯
4-a、将步骤3-b硫酸皮肤素制备过程中收集的类肝素粗品加纯化水溶解至类肝素粗品湿重浓度为5～30％w/v，将药液按体积平分为类肝素粗品溶液A和类肝素粗品溶液B；肝素粗品溶液A调整pH后，加入溶液体积0.5～2％过氧化氢氧化，35～40℃下搅拌反应3～10h；
4-b、氧化结束后，调整药液pH 5.0～8.0，经微孔滤膜过滤，收集滤液，超滤、冻干得到类肝素；
(五)舒洛地特提纯
5-a、取类肝素粗品溶液B，加3～10％氯化钠溶解，调整pH，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为30～35％时，停止加乙醇，室温沉淀3～12h，收集上清液；
5-b、将步骤5-a收集的上清液，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为40～50％时，停止加乙醇，室温沉淀3～12h，收集舒洛地特粗品沉淀；
5-c、将舒洛地特粗品加纯化水溶解至舒洛地特粗品湿重浓度为10～40％w/v，调整pH，加入溶液体积0.5～2％过氧化氢氧化，35～40℃下搅拌反应3～10h；
5-d、氧化结束后，调整药液pH值5.0～8.0，经微孔滤膜过滤，收集滤液，超滤、冻干得到舒洛地特。
上述方法中，所述肝素副产物干品的预处理具体包括如下步骤：
1-a、将肝素副产物干品1～3kg，加纯化水溶解定容至20L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为7.7～8.3，加入10～30L阴离子树脂，搅拌吸附8～16h，收集树脂；
1-b、将收集的树脂用2～4％氯化钠溶液洗涤，洗涤至A260nm＝0.226～0.246；
1-c、将去除蛋白的树脂用8～10％氯化钠溶液，进行洗脱，直至洗脱液用乙醇监测无沉淀，洗脱结束，收集洗脱液30～70L，用盐酸溶液调整药液pH为5.9-6.1；
1-d、加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为63～68％，停止加乙醇，室温沉淀8～16h，分离上清液，收集沉淀。
上述方法中，步骤2-a、步骤3-a以及步骤5-a中调整pH为5～8。
上述方法中，步骤2-d、步骤3-d、步骤4-a以及步骤5-c中调整pH为10～12。
上述方法中，步骤3-c中调整pH为2-4。
上述方法中，所述微孔滤膜过滤时采用0.2μm微孔滤膜。
上述方法中，所述步骤2-e、步骤3-e、步骤4-b以及步骤5-d中超滤时采用1000D的超滤膜。
本发明的有益效果在于：与现有技术比较，本发明经深入研究确定了室温条件下乙醇沉淀的最佳条件，避免了低温沉淀和高温沉淀造成的能源消耗，并且四种多糖类产品收率提高约10％。本发明进一步优化氧化工艺，摸索出在35～40℃下氧化3～10h，有效去除色素和蛋白质、核酸杂质，比目前30℃过氧化氢氧化6～24h的氧化技术节约50％时间，提高生产效率。本发明从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品，符合企业内控标准，使肝素副产物有效成分得到充分利用，为公司创造更大的收益；采用超滤技术去除杂质，操作简便，保护环境；工艺过程绿色环保，分离成本低且效果佳，容易放大。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图1及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1、肝素副产物干品预处理
a、将肝素副产物干品1kg，加纯化水溶解定容至20L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为7.7，加入10L阴离子树脂，搅拌吸附8h，收集树脂。
b、将收集的树脂用2％氯化钠溶液洗涤，洗涤至A260nm＝0.226。
c、将去除蛋白的树脂用8％氯化钠溶液，进行洗脱，直至洗脱液用乙醇监测无沉淀，洗脱结束，收集洗脱液30L，用盐酸溶液调整药液pH为6.0。
d、加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为63％，停止加乙醇，室温沉淀16h，分离上清液，收集沉淀。
2、硫酸软骨素提纯
e、将上述预处理收集的沉淀加纯化水溶解，定容至35L，加2.8kg氯化钠，用盐酸溶液调整药液pH为5.2，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为48.6％时，停止加乙醇，室温沉淀16h，分别收集沉淀2.2kg和上清液。
f、将步骤e收集的沉淀2.2kg，加纯化水溶解，定容至35L，加2.8kg氯化钠，用盐酸溶液调整药液pH为5.3，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为48.6％时，停止加乙醇，室温沉淀16h，分别收集沉淀2.1kg和上清液。
g、将步骤e和步骤f收集的上清，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为68％时，停止加乙醇，室温沉淀16h，收集沉淀物0.210kg。
h、将收集的沉淀0.210kg，加纯化水溶解，定容至2L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为10.5，加10ml30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应4h。
i、氧化结束，用盐酸溶液调整药液pH为6.0，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液。补加纯化水至3L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至600ml。
j、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻6h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度13Pa，冻干16h后得到硫酸软骨素0.085kg。
3、硫酸皮肤素提纯
a、将硫酸软骨素的制备过程中收集的沉淀2.1kg加纯化水溶解，定容至20L，加1.6kg的氯化钠，用盐酸溶液调整药液pH为5.3，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为37.5％时，停止加乙醇，室温沉淀12h，分别收集沉淀物1.0kg和上清。
b、收集上清，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为42.8％时，停止加乙醇，室温沉淀12h，分别收集沉淀物0.650kg和上清。
c、将上述收集的上清继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度达到68％时，停止加乙醇，室温沉淀16h，收集沉淀物0.28kg，将收集的沉淀和步骤a收集的1.0kg沉淀混合为类肝素粗品1.28kg。
d、将步骤b中得到的硫酸皮肤素粗品0.650kg加纯化水溶解，定容至6.5L，用盐酸溶液调整药液pH为2.7，加入6.5g亚硝酸钠，在室温下搅拌16h，用氢氧化钠溶液调整药液pH为5.8，补纯化水至9L，用3000D的超滤膜超滤，体积浓缩至2L。
e、收集浓缩液，用氢氧化钠溶液调整药液pH为10.5，加10ml 30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应4h。
f、氧化结束，用盐酸溶液调整药液pH为5.7，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液。补纯化水至9L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至2L。
g、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻6h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度12Pa，冻干16h后等得到硫酸皮肤素0.260kg。
4、类肝素提纯
a、将硫酸皮肤素制备过程中收集的类肝素粗品沉淀1.28kg加纯化水溶解，定容至15L，将药液平均分成两份A和B，药液A用氢氧化钠溶液调整药液pH值10.5，加37.5ml30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应4h。
b、氧化结束后，用盐酸溶液调整药液pH为5.9，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液，补纯化水至10L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至2L。
c、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻7h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度14Pa，冻干16h后得到类肝素精品0.270kg。
5、舒洛地特制备
a、取类肝素粗品溶液B，加0.6kg氯化钠溶解，用盐酸溶液调整药液pH为5.4，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为34.5％时，停止加乙醇，室温沉淀12h，收集上清液。
b、将上述收集的上清液，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为47.8％时，停止加乙醇，室温沉淀12h，收集沉淀。
c、将上述收集的沉淀0.400kg，加纯化水溶解，定容至4L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为10.5，加20ml30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应4h。
d、氧化结束后，用盐酸溶液调整药液pH为5.8，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液，补加纯化水至5L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至1.2L。
e、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻6h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度13Pa，冻干16h后得到舒洛地特0.150kg。
实施例2
1、肝素副产物干品预处理
a、将肝素副产物干品2kg，加纯化水溶解定容至20L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为8.1，加入20L阴离子树脂，搅拌吸附12h，收集树脂。
b、将收集的树脂用3％氯化钠溶液洗涤，洗涤至A260nm＝0.235。
c、将去除蛋白的树脂用9％氯化钠溶液，进行洗脱，直至洗脱液用乙醇监测无沉淀，洗脱结束，收集洗脱液50L，用盐酸溶液调整药液pH为6.1。
d、加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为65％，停止加乙醇，室温沉淀12h，分离上清液，收集沉淀。
2、硫酸软骨素提纯
e、将预处理收集的沉淀加纯化水溶解，定容至35L，加1.75kg氯化钠，用盐酸溶液调整药液pH为6.0，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为48.0％时，停止加乙醇，室温沉淀12h，分别收集沉淀4.35kg和上清液。
f、将上述收集的沉淀4.35kg，加纯化水溶解，定容至35L，加1.75kg氯化钠，用盐酸溶液调整药液pH为6.1，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为48.0％时，停止加乙醇，室温沉淀12h，分别收集沉淀4.15kg和上清液。
g、将步骤e和步骤f收集的上清，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为65％时，停止加乙醇，室温沉淀12h，收集沉淀物0.410kg。
h、将上述收集的沉淀0.410kg，加纯化水溶解，定容至2L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为11.0，加入20ml 30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应6h。
i、氧化结束后，用盐酸溶液调整药液pH为6.4，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液。补加纯化水至6L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至1.2L。
j、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻7h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度15Pa，冻干20h后得到硫酸软骨素0.168kg。
3、硫酸皮肤素提纯
a、将硫酸软骨素的制备过程中收集的沉淀4.15kg加纯化水溶解，定容至20L，加1.0kg的氯化钠，用盐酸溶液调整药液pH为6.0，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为36.6％时，停止加乙醇，室温沉淀8h，分别收集沉淀物2.05kg和上清。
b、收集上清，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为41.7％时，停止加乙醇，室温沉淀8h，分别收集硫酸皮肤素沉淀物1.35kg和上清。
c、将上述收集的上清继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度达到65％时，停止加乙醇，室温沉淀12h，收集沉淀物0.55kg，将收集的沉淀和上述步骤a收集的沉淀2.05kg混合为类肝素粗品2.6kg。
d、将上述步骤b中得到的硫酸皮肤素粗品1.35kg加纯化水溶解，定容至6.5L，用盐酸溶液调整药液pH为2.8，加入13g亚硝酸钠，在室温下搅拌20h，用氢氧化钠溶液调整药液pH为5.8，补纯化水至18L，用3000D的超滤膜超滤，体积浓缩至4L。
e、收集浓缩液，用氢氧化钠溶液调整药液pH为11.0，加入40ml 30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应6h。
f、氧化结束，用盐酸溶液调整药液pH为6.3，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液。补纯化水至18L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至4L。
g、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻6h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度13Pa，冻干20h后得到硫酸皮肤素0.530kg。
4、类肝素提纯
a、将硫酸皮肤素制备步骤中收集的类肝素粗品沉淀2.6kg加纯化水溶解，定容至15L，将药液平均分成两份A和B，药液A用氢氧化钠溶液调整药液pH值11.0，加入75ml30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应6h。
b、氧化结束后，用盐酸溶液调整药液pH值6.3，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液，补加纯化水至20L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至4L。
c、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻6h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度14Pa，冻干20h后得到类肝素精品0.520kg。
5、舒洛地特提纯
a、取类肝素粗品溶液B，加0.375kg氯化钠溶解，用盐酸溶液调整药液pH为6.2，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为33.7％时，停止加乙醇，室温沉淀8h，收集上清液。
b、将上述收集的上清液，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为46.5％时，停止加乙醇，室温沉淀8h，收集沉淀。
c、将上述收集的沉淀0.810kg，加纯化水溶解，定容至4L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为11.0，加入40ml 30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应6h。
d、氧化结束后，用盐酸溶液调整药液pH为6.4，过0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液，补加纯化水至10L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至2.5L。
e、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻8h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度13Pa，冻干20h后得到舒洛地特0.310kg。
实施例3
1、肝素副产物干品预处理
a、将肝素副产物干品3kg，加纯化水溶解定容至20L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为8.3，加入30L阴离子树脂，搅拌吸附16h，收集树脂。
b、将收集的树脂用4％氯化钠溶液洗涤，洗涤至A260nm＝0.246。
c、将去除蛋白的树脂用10％氯化钠溶液，进行洗脱，直至洗脱液用乙醇监测无沉淀，洗脱结束，收集洗脱液70L，用盐酸溶液调整药液pH为5.9。
d、加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为68％，停止加乙醇，室温沉淀8h，分离上清液，收集沉淀。
2、硫酸软骨素提纯
e、将预处理收集的沉淀加纯化水溶解，定容至35L，加1.05kg氯化钠，用氢氧化钠溶液调整药液pH为6.8，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为47.3％时，停止加乙醇，室温沉淀8h，分别收集沉淀6.55kg和上清液。
f、将上述收集的沉淀6.55kg，加纯化水溶解，定容至35L，加1.05kg氯化钠，用氢氧化钠溶液调整药液pH为6.7，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为47.3％时，停止加乙醇，室温沉淀8h，分别收集沉淀6.15kg和上清液。
g、将步骤e和步骤f收集的上清，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为63％时，停止加乙醇，室温沉淀8h，收集沉淀物0.624kg。
h、将上述收集的沉淀0.624kg，加纯化水溶解后，定容至2L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为11.5，加入30ml 30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应8h。
i、氧化结束，用盐酸溶液调整药液pH为7.0，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液。补加纯化水至9L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至体积1.8L。
j、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻7h，转移至冻干机中，-50℃，持续抽真空，真空度12Pa，冻干24h后得到硫酸软骨素0.260kg。
3、硫酸皮肤素提纯
a、将硫酸软骨素的制备过程中收集的沉淀6.15kg加纯化水溶解，定容至20L，加0.6kg的氯化钠，用氢氧化钠溶液调整药液pH为6.7，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为34.8％时，停止加乙醇，室温沉淀4h，分别收集沉淀物3.03kg和上清。
b、收集上清，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为40.8％时，停止加乙醇，室温沉淀4h，分别收集沉淀物1.93kg和上清。
c、将上述收集的上清补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度达到63％时，停止加乙醇，室温沉淀8h，收集沉淀物0.84kg，将收集的沉淀和步骤a收集的沉淀3.03kg混合为类肝素粗品3.87kg。
d、将上述步骤b中得到的硫酸皮肤素粗品1.93kg加纯化水溶解，定容至6.5L，用盐酸溶液调整药液pH为2.9，加入19.5g亚硝酸钠，在室温下搅拌24h，用氢氧化钠溶液调整药液pH为5.8，补纯化水至27L，用3000D的超滤膜超滤，体积浓缩至6L。
e、收集浓缩液，用氢氧化钠溶液调药液pH为11.5，加入90ml 30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应8h。
f、氧化结束，用盐酸溶液调整药液pH为6.6，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液。补纯化水至27L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至6L。
g、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻6h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度13Pa，冻干24h后等得到硫酸皮肤素0.760kg。
4、类肝素提纯
a、将硫酸皮肤素制备收集的类肝素粗品沉淀3.87kg加纯化水溶解，定容至15L，将药液平均分成两份A和B，药液A用氢氧化钠溶液调整药液pH为11.4，加入112.5ml 30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应8h。
b、氧化结束后，用盐酸溶液调整药液pH为6.5，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液，加纯化水至30L，用1000Da的超滤膜超滤，体积浓缩至6L。
c、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻8h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度13Pa，冻干24h后等得到类肝素精品0.770kg。
5、舒洛地特制备
a、取类肝素粗品溶液B，加0.225kg氯化钠溶解，用氢氧化钠溶液调整药液pH为6.7，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为32.5％时，停止加乙醇，室温沉淀4h，收集上清液。
b、将上述收集的上清液，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为45.7％时，停止加乙醇，室温沉淀4h，收集沉淀。
c、将上述收集的沉淀1.170kg，加纯化水溶解，定容至4L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为11.5，加入60ml 30％过氧化氢，在35～40℃下，搅拌反应8h。
d、氧化结束后，用盐酸溶液调整药液pH为6.8，经0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液，补加纯化水至15L，用1000D的超滤膜超滤，体积浓缩至3.5L。
e、将浓缩的药液在-80℃冰箱中预冻8h，转移至冻干机中，-45℃，持续抽真空，真空度11Pa，冻干24h后等得到舒洛地特0.460kg。
取上述实施例1、实施例2、实施例3制得的硫酸软骨素、硫酸皮肤素、类肝素、舒洛地特样品分别进行理化性质检测及电泳分析，结果表明四个样品检测结果均符合企业内控质量标准，检测结果见下表1、表2、表3、表4。
表1硫酸软骨素检测结果
Figure BDA0003504183230000131
表2硫酸皮肤素检测结果
Figure BDA0003504183230000132
Figure BDA0003504183230000141
表3类肝素检测结果
Figure BDA0003504183230000142
表4舒洛地特检测结果
Figure BDA0003504183230000151
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(一)肝素副产物干品的预处理
将肝素副产物干品加纯化水溶解，按浓度5-15％溶解，用阴离子树脂吸附、洗涤、洗脱得到去除蛋白质、核酸的肝素副产物；
(二)硫酸软骨素提纯
2-a、将肝素副产物加纯化水溶解，使药液浓度2～10％，加3～10％氯化钠，调整pH，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为45～55％时，停止加乙醇，室温沉淀8～16h，沉淀为硫酸多糖混合物，上清为硫酸软骨素溶液；
2-b、将上述沉淀溶解重复步骤2-a一次；
2-c、将2次沉淀收集的硫酸软骨素上清混匀，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为60～70％时，停止加乙醇，室温沉淀8～16h，收集沉淀物，得硫酸软骨素粗品；
2-d、将硫酸软骨素粗品加纯化水溶解至硫酸软骨素粗品湿重浓度为10～40％w/v，调整pH，加入溶液体积0.5～2％过氧化氢氧化，35～40℃下搅拌反应3～10h；
2-e、氧化结束后，调整药液pH为5.0～8.0，经微孔滤膜过滤，收集滤液，超滤、冻干得硫酸软骨素；
(三)硫酸皮肤素提纯
3-a、将步骤2-b中收集的硫酸多糖沉淀，加纯化水溶解至湿重浓度为10～40％w/v，加3～10％的氯化钠，调整pH，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为30～40％时，停止加乙醇，室温沉淀3～12h，收集沉淀和上清；
3-b、将步骤3-a中收集的上清继续补加乙醇，当药液中乙醇浓度为40～50％时，停止加乙醇，室温沉淀3～12h，沉淀为硫酸皮肤素粗品；收集上清，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为60～70％时，停止加乙醇，室温沉淀8～16h，收集沉淀和步骤3-a得到的沉淀混合得类肝素粗品；
3-c、将步骤3-b得到的硫酸皮肤素粗品加纯化水溶解至硫酸皮肤素粗品湿重浓度为10～40％w/v，调整pH，加入药液体积0.1～0.3％亚硝酸钠，在室温下搅拌16～24h后，调整药液pH 5.0～8.0，3000D超滤膜超滤，去除降解后的低分子肝素类物质，收集超滤液；
3-d、超滤液调整pH后，加入溶液体积0.5～2％过氧化氢氧化，35～40℃搅拌反应3～10h；
3-e、氧化结束后，调整药液pH 5.0～8.0，经微孔滤膜过滤，收集滤液，超滤、冻干得到硫酸皮肤素；
(四)类肝素提纯
4-a、将步骤3-b硫酸皮肤素制备过程中收集的类肝素粗品加纯化水溶解至类肝素粗品湿重浓度为5～30％w/v，将药液按体积平分为类肝素粗品溶液A和类肝素粗品溶液B；肝素粗品溶液A调整pH后，加入溶液体积0.5～2％过氧化氢氧化，35～40℃下搅拌反应3～10h；
4-b、氧化结束后，调整药液pH 5.0～8.0，经微孔滤膜过滤，收集滤液，超滤、冻干得到类肝素；
(五)舒洛地特提纯
5-a、取类肝素粗品溶液B，加3～10％氯化钠溶解，调整pH，加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为30～35％时，停止加乙醇，室温沉淀3～12h，收集上清液；
5-b、将步骤5-a收集的上清液，继续补加乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为40～50％时，停止加乙醇，室温沉淀3～12h，收集舒洛地特粗品沉淀；
5-c、将舒洛地特粗品加纯化水溶解至舒洛地特粗品湿重浓度为10～40％w/v，调整pH，加入溶液体积0.5～2％过氧化氢氧化，35～40℃下搅拌反应3～10h；
5-d、氧化结束后，调整药液pH值5.0～8.0，经微孔滤膜过滤，收集滤液，超滤、冻干得到舒洛地特。
2.根据权利要求1所述的从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法，其特征在于，所述肝素副产物干品的预处理具体包括如下步骤：
1-a、将肝素副产物干品1～3kg，加纯化水溶解定容至20L，用氢氧化钠溶液调整药液pH为7.7～8.3，加入10～30L阴离子树脂，搅拌吸附8～16h，收集树脂；
1-b、将收集的树脂用2～4％氯化钠溶液洗涤，洗涤至A260nm＝0.226～0.246；
1-c、将去除蛋白的树脂用8～10％氯化钠溶液，进行洗脱，直至洗脱液用乙醇监测无沉淀，洗脱结束，收集洗脱液30～70L，用盐酸溶液调整药液pH为5.9-6.1；
1-d、加入乙醇沉淀，当药液中乙醇浓度为63～68％，停止加乙醇，室温沉淀8～16h，分离上清液，收集沉淀。
3.根据权利要求2所述的从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法，其特征在于，步骤2-a、步骤3-a以及步骤5-a中调整pH为5～8。
4.根据权利要求2所述的从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法，其特征在于，步骤2-d、步骤3-d、步骤4-a以及步骤5-c中调整pH为10～12。
5.根据权利要求2所述的从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法，其特征在于，步骤3-c中调整pH为2-4。
6.根据权利要求2所述的从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法，其特征在于，所述微孔滤膜过滤时采用0.2μm微孔滤膜。
7.根据权利要求2所述的从肝素钠副产物中提纯四种多糖类产品的方法，其特征在于，所述步骤2-e、步骤3-e、步骤4-b以及步骤5-d中超滤时采用1000D的超滤膜。
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