CN112521523A - 一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，该方法为：将烘干的桦褐孔菌粉碎后加乙醇或者丙酮浸泡，离心或抽滤后减压烘干后超微粉碎，用乙酸乙酯处理，用乙醇水溶液水浴回流后，将沉淀物质干燥得到得到处理后的桦褐孔菌，然后经过脱纤维素粗多糖提取、木瓜蛋白酶脱蛋白、醇沉、脱色和纯化，得到桦褐孔菌多糖。本发明桦褐孔菌子实体多糖的得率高，并且能够有效地去除蛋白和色素，适合产业化生产桦褐孔菌多糖。
Description
技术领域
本发明属于桦褐孔菌多糖提取纯化技术领域，具体涉及一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法。
背景技术
桦褐孔菌多糖具有增强免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖及抗病毒等多种药理活性。但目前对桦褐孔菌多糖的分离纯化的研究报道相对较少。由于多糖的组成复杂性，多糖粗提物的分子量分布较广，多糖种类也很多，提取后的桦褐孔菌粗多糖中含有一定量的蛋白和色素，影响多糖的化学结构和生物活性研究，但去除粗多糖中的蛋白和色素，一直是多糖分离纯化中的一大难题，传统的去蛋白Sevage法，方法操作繁琐，效率低，只能除去少量蛋白质，效率不高，须反复多次，多糖有损失；活性炭法去除色素效果较好，但后期的活性炭粉末不易去除，过氧化氢法因为较强的抗氧化活性去除色素效果很好，但对多糖的活性影响较大，因此急需探索一种新的精制方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，该方法桦褐孔菌子实体多糖的得率高，并且能够有效地去除蛋白和色素，适合产业化生产桦褐孔菌多糖。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，该方法为:
S1、初步处理：从白桦树上采集桦褐孔菌子实体，在温度为40℃～50℃的条件减压烘干至水分含量为10％～12％，得到烘干的桦褐孔菌；
或者将桦褐孔菌菌种经发酵后得到桦褐孔菌菌丝体，烘干、粉碎后，加入2倍质量的石油醚脱脂后抽滤，在温度为40℃～50℃的条件减压烘干至水分含量为10％～12％，得到烘干的桦褐孔菌；
将烘干的桦褐孔菌粉碎后过40目筛，加入2倍质量的乙醇或者1.5倍质量的丙酮浸泡6h～8h后，离心或抽滤后得到固形物a，在温度为50℃～60℃的条件下减压烘干至水分含量为8％～10％，超微粉碎，过200目筛，得到待处理粉体，加入乙酸乙酯，离心或者抽滤后得到固形物b，然后加入质量分数为90％的乙醇水溶液，在温度为70℃的条件下水浴回流2h后，离心后得到沉淀物质a，将所述沉淀物质a在温度为50℃的条件下干燥12h，得到处理后的桦褐孔菌；
S2、脱纤维素粗多糖提取：向S1中得到的处理后的桦褐孔菌中加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液a，升温至55℃，超声15min，然后加入纤维素酶，得到初混液，在温度为55℃的条件下酶解2h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，然后加入蒸馏水，在温度为70℃、超声功率为400W、频率为40kHz的条件下超声30min，然后在转速为4000rpm的条件下离心20min，收集滤液a，将剩余的沉淀物质重复S2步骤中的上述操作，收集得到滤液b,合并滤液a和滤液b，得到脱纤维素粗多糖提取液；
S3、木瓜蛋白酶脱蛋白：将S2中得到的脱纤维素粗多糖提取液中加入木瓜蛋白酶，得到混合液，在温度为45℃的条件下酶解1h～2h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液b，然后在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，取上清液a，加入浓度为0.025mol/L的三氯乙酸水溶液，静置1h，振荡后，在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，将上清液过截留分子量为100KD的陶瓷透析膜脱大分子后，过截留分子量为100Da～200Da的聚酰胺膜脱盐，得到脱纤维素脱蛋白多糖提取液；
S4、醇沉：将S3中得到的脱纤维素脱蛋白多糖提取液进行旋转蒸发后，得到多糖一次浓缩液，然后加入无水乙醇a，离心后，得到沉淀物质b，向所述沉淀物质b加入蒸馏水a，然后再进行旋转蒸发后，得到多糖二次浓缩液，然后加入无水乙醇b，离心后，得到沉淀物质c，将所述沉淀物质c依次用质量分数为75％的乙醇水溶液清洗2次，用无水乙醇清洗2次，用丙酮进行清洗2次后，加入蒸馏水b，得到多糖提取液；
S5、脱色：将S4中得到的多糖提取液放入聚酰胺树脂柱中，用质量分数为5％的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱，洗脱至透过的溶液为透明无色时止，得到浓度为0.5g/L的脱色后的多糖提取液；
S6、纯化：向S5中得到的脱色后的多糖提取液中加入湿法装柱的AB-8树脂，在室温的条件下以1BV/h的流速进行吸附，然后用质量分数为3％～8％的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗杂，再用质量分数为30％的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱后，收集多糖纯化液，在温度为15℃～30℃的条件下减压蒸馏1h～2h后，经冻干或者减压烘干后，得到桦褐孔菌多糖。
优选地，S1中所述待处理粉体和乙酸乙酯的用量比为1g:5mL。
优选地，S1中所述固形物b和质量分数为90％的乙醇水溶液的用量比为1g：10mL。
优选地，S2中处理后的桦褐孔菌和磷酸盐缓冲液a的用量比为1g:10mL；所述初混液中纤维素酶的质量分数为4‰；所述初混液和蒸馏水的体积比为1:10。
优选地，S3中所述混合液中木瓜蛋白酶的质量分数为6‰；所述混合液、磷酸盐缓冲液b和三氯乙酸水溶液的体积比为4:4:1。
优选地，S4中所述多糖一次浓缩液和无水乙醇a的体积比为1:20；所述多糖二次浓缩液和无水乙醇b的体积比为1:20；所述沉淀物质b和蒸馏水a的用量比为1g:40mL；所述沉淀物质c和蒸馏水b的用量比为1g:40mL。
优选地，S6中脱色后的多糖提取液和AB-8树脂的用量比为30mL:1g。
优选地，S6中吸附的时间为5h；洗杂的时间为3h；洗脱的时间为4h。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明桦褐孔菌多糖的得率高，并且能够有效地去除蛋白和色素，适合产业化生产桦褐孔菌多糖。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
本实施例的桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，该方法为:
S1、初步处理：从白桦树上采集桦褐孔菌子实体，在温度为40℃的条件减压烘干至水分含量为10％，得到烘干的桦褐孔菌；
将烘干的桦褐孔菌粉碎后过40目筛，加入2倍质量的乙醇浸泡6h后，离心后得到固形物a，在温度为50℃的条件下减压烘干至水分含量为8％，超微粉碎，过200目筛，得到待处理粉体，加入乙酸乙酯，离心后得到固形物b，然后加入质量分数为90％的乙醇水溶液，在温度为70℃的条件下水浴回流2h后，离心后得到沉淀物质a，将所述沉淀物质a在温度为50℃的条件下干燥12h，得到处理后的桦褐孔菌；所述待处理粉体和乙酸乙酯的用量比为1g:5mL；所述固形物b和质量分数为90％的乙醇水溶液的用量比为1g：10mL；
S2、脱纤维素粗多糖提取：向S1中得到的处理后的桦褐孔菌中加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液a，升温至55℃，超声15min，然后加入纤维素酶，得到初混液，在温度为55℃的条件下酶解2h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，然后加入蒸馏水，在温度为70℃、超声功率为400W、频率为40kHz的条件下超声30min，然后在转速为4000rpm的条件下离心20min，收集滤液a，将剩余的沉淀物质重复S2步骤中的上述操作，收集得到滤液b,合并滤液a和滤液b，得到脱纤维素粗多糖提取液；处理后的桦褐孔菌和磷酸盐缓冲液a的用量比为1g:10mL；所述初混液中纤维素酶的质量分数为4‰；所述初混液和蒸馏水的体积比为1:10；
S3、木瓜蛋白酶脱蛋白：将S2中得到的脱纤维素粗多糖提取液中加入木瓜蛋白酶，得到混合液，在温度为45℃的条件下酶解1h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液b，然后在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，取上清液a，加入浓度为0.025mol/L的三氯乙酸水溶液，静置1h，振荡后，在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，将上清液过截留分子量为100KD的陶瓷透析膜脱大分子后，过截留分子量为100Da的聚酰胺膜脱盐，得到脱纤维素脱蛋白多糖提取液；所述混合液中木瓜蛋白酶的质量分数为6‰；所述混合液、磷酸盐缓冲液b和三氯乙酸水溶液的体积比为4:4:1；
S4、醇沉：将S3中得到的脱纤维素脱蛋白多糖提取液进行旋转蒸发后，得到多糖一次浓缩液，然后加入无水乙醇a，离心后，得到沉淀物质b，向所述沉淀物质b加入蒸馏水a，然后再进行旋转蒸发后，得到多糖二次浓缩液，然后加入无水乙醇b，离心后，得到沉淀物质c，将所述沉淀物质c依次用质量分数为75％的乙醇水溶液清洗2次，用无水乙醇清洗2次，用丙酮进行清洗2次后，加入蒸馏水b，得到多糖提取液；所述多糖一次浓缩液和无水乙醇a的体积比为1:20；所述多糖二次浓缩液和无水乙醇b的体积比为1:20；所述沉淀物质b和蒸馏水a的用量比为1g:40mL；所述沉淀物质c和蒸馏水b的用量比为1g:40mL；
S5、脱色：将S4中得到的多糖提取液放入聚酰胺树脂柱中，用质量分数为5％的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱，洗脱至透过的溶液为透明无色时止，得到浓度为0.5g/L的脱色后的多糖提取液；
S6、纯化：向S5中得到的脱色后的多糖提取液中加入湿法装柱的AB-8树脂，在室温的条件下以1BV/h的流速吸附5h，然后用质量分数为3％的乙醇水溶液以2BV/h的流速洗杂3h，再用质量分数为30％的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱4h后，收集多糖纯化液，在温度为15℃的条件下减压蒸馏1h后，经冻干或者减压烘干后，得到桦褐孔菌多糖；脱色后的多糖提取液和AB-8树脂的用量比为30mL:1g。
桦褐孔菌多糖的得率为85.1％，蛋白脱除率为81.2％，色素脱除率为81.6％，多糖收率为90％，多糖含量为43％。
实施例2
本实施例的桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，该方法为:
S1、初步处理：从白桦树上采集桦褐孔菌子实体，在温度为50℃的条件减压烘干至水分含量为12％，得到烘干的桦褐孔菌；
将烘干的桦褐孔菌粉碎后过40目筛，加入2倍质量的乙醇浸泡8h后，抽滤后得到固形物a，在温度为60℃的条件下减压烘干至水分含量为10％，超微粉碎，过200目筛，得到待处理粉体，加入乙酸乙酯，抽滤后得到固形物b，然后加入质量分数为90％的乙醇水溶液，在温度为70℃的条件下水浴回流2h后，离心后得到沉淀物质a，将所述沉淀物质a在温度为50℃的条件下干燥12h，得到处理后的桦褐孔菌；所述待处理粉体和乙酸乙酯的用量比为1g:5mL；所述固形物b和质量分数为90％的乙醇水溶液的用量比为1g：10mL；
S2、脱纤维素粗多糖提取：向S1中得到的处理后的桦褐孔菌中加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液a，升温至55℃，超声15min，然后加入纤维素酶，得到初混液，在温度为55℃的条件下酶解2h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，然后加入蒸馏水，在温度为70℃、超声功率为400W、频率为40kHz的条件下超声30min，然后在转速为4000rpm的条件下离心20min，收集滤液a，将剩余的沉淀物质重复S2步骤中的上述操作，收集得到滤液b,合并滤液a和滤液b，得到脱纤维素粗多糖提取液；处理后的桦褐孔菌和磷酸盐缓冲液a的用量比为1g:10mL；所述初混液中纤维素酶的质量分数为4‰；所述初混液和蒸馏水的体积比为1:10；
S3、木瓜蛋白酶脱蛋白：将S2中得到的脱纤维素粗多糖提取液中加入木瓜蛋白酶，得到混合液，在温度为45℃的条件下酶解2h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液b，然后在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，取上清液a，加入浓度为0.025mol/L的三氯乙酸水溶液，静置1h，振荡后，在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，将上清液过截留分子量为100KD的陶瓷透析膜脱大分子后，过截留分子量为200Da的聚酰胺膜脱盐，得到脱纤维素脱蛋白多糖提取液；所述混合液中木瓜蛋白酶的质量分数为6‰；所述混合液、磷酸盐缓冲液b和三氯乙酸水溶液的体积比为4:4:1；
S4、醇沉：将S3中得到的脱纤维素脱蛋白多糖提取液进行旋转蒸发后，得到多糖一次浓缩液，然后加入无水乙醇a，离心后，得到沉淀物质b，向所述沉淀物质b加入蒸馏水a，然后再进行旋转蒸发后，得到多糖二次浓缩液，然后加入无水乙醇b，离心后，得到沉淀物质c，将所述沉淀物质c依次用质量分数为75％的乙醇水溶液清洗2次，用无水乙醇清洗2次，用丙酮进行清洗2次后，加入蒸馏水b，得到多糖提取液；所述多糖一次浓缩液和无水乙醇a的体积比为1:20；所述多糖二次浓缩液和无水乙醇b的体积比为1:20；所述沉淀物质b和蒸馏水a的用量比为1g:40mL；所述沉淀物质c和蒸馏水b的用量比为1g:40mL；
S5、脱色：将S4中得到的多糖提取液放入聚酰胺树脂柱中，用质量分数为5％的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱，洗脱至透过的溶液为透明无色时止，得到浓度为0.5g/L的脱色后的多糖提取液；
S6、纯化：向S5中得到的脱色后的多糖提取液中加入湿法装柱的AB-8树脂，在室温的条件下以1BV/h的流速吸附5h，然后用质量分数为8％的乙醇水溶液以2BV/h的流速洗杂3h，再用质量分数为30％的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱4h后，收集多糖纯化液，在温度为30℃的条件下减压蒸馏2h后，经冻干或者减压烘干后，得到桦褐孔菌多糖；脱色后的多糖提取液和AB-8树脂的用量比为30mL:1g。
桦褐孔菌多糖的得率为84.3％，蛋白脱除率为81.5％，色素脱除率为80.6％，多糖收率为88％，多糖含量为43％。
实施例3
本实施例的桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，该方法为:
S1、初步处理：将桦褐孔菌菌种(菌株编号为KXHHKJ-025-2)经发酵后得到桦褐孔菌菌丝体，烘干、粉碎后，加入2倍质量的石油醚脱脂后抽滤，在温度为40℃的条件减压烘干至水分含量为10％，得到烘干的桦褐孔菌；
将烘干的桦褐孔菌粉碎后过40目筛，加入1.5倍质量的丙酮浸泡6h后，离心后得到固形物a，在温度为50℃的条件下减压烘干至水分含量为8％，超微粉碎，过200目筛，得到待处理粉体，加入乙酸乙酯，离心后得到固形物b，然后加入质量分数为90％的乙醇水溶液，在温度为70℃的条件下水浴回流2h后，离心后得到沉淀物质a，将所述沉淀物质a在温度为50℃的条件下干燥12h，得到处理后的桦褐孔菌；所述待处理粉体和乙酸乙酯的用量比为1g:5mL；所述固形物b和质量分数为90％的乙醇水溶液的用量比为1g：10mL；
S2、脱纤维素粗多糖提取：向S1中得到的处理后的桦褐孔菌中加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液a，升温至55℃，超声15min，然后加入纤维素酶，得到初混液，在温度为55℃的条件下酶解2h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，然后加入蒸馏水，在温度为70℃、超声功率为400W、频率为40kHz的条件下超声30min，然后在转速为4000rpm的条件下离心20min，收集滤液a，将剩余的沉淀物质重复S2步骤中的上述操作，收集得到滤液b,合并滤液a和滤液b，得到脱纤维素粗多糖提取液；处理后的桦褐孔菌和磷酸盐缓冲液a的用量比为1g:10mL；所述初混液中纤维素酶的质量分数为4‰；所述初混液和蒸馏水的体积比为1:10；
S3、木瓜蛋白酶脱蛋白：将S2中得到的脱纤维素粗多糖提取液中加入木瓜蛋白酶，得到混合液，在温度为45℃的条件下酶解1h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液b，然后在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，取上清液a，加入浓度为0.025mol/L的三氯乙酸水溶液，静置1h，振荡后，在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，将上清液过截留分子量为100KD的陶瓷透析膜脱大分子后，过截留分子量为100Da的聚酰胺膜脱盐，得到脱纤维素脱蛋白多糖提取液；所述混合液中木瓜蛋白酶的质量分数为6‰；所述混合液、磷酸盐缓冲液b和三氯乙酸水溶液的体积比为4:4:1；
S4、醇沉：将S3中得到的脱纤维素脱蛋白多糖提取液进行旋转蒸发后，得到多糖一次浓缩液，然后加入无水乙醇a，离心后，得到沉淀物质b，向所述沉淀物质b加入蒸馏水a，然后再进行旋转蒸发后，得到多糖二次浓缩液，然后加入无水乙醇b，离心后，得到沉淀物质c，将所述沉淀物质c依次用质量分数为75％的乙醇水溶液清洗2次，用无水乙醇清洗2次，用丙酮进行清洗2次后，加入蒸馏水b，得到多糖提取液；所述多糖一次浓缩液和无水乙醇a的体积比为1:20；所述多糖二次浓缩液和无水乙醇b的体积比为1:20；所述沉淀物质b和蒸馏水a的用量比为1g:40mL；所述沉淀物质c和蒸馏水b的用量比为1g:40mL；
S5、脱色：将S4中得到的多糖提取液放入聚酰胺树脂柱中，用质量分数为5％的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱，洗脱至透过的溶液为透明无色时止，得到浓度为0.5g/L的脱色后的多糖提取液；
S6、纯化：向S5中得到的脱色后的多糖提取液中加入湿法装柱的AB-8树脂，在室温的条件下以1BV/h的流速吸附5h，然后用质量分数为3％的乙醇水溶液以2BV/h的流速洗杂3h，再用质量分数为30％的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱4h后，收集多糖纯化液，在温度为15℃的条件下减压蒸馏1h后，经冻干或者减压烘干后，得到桦褐孔菌多糖；脱色后的多糖提取液和AB-8树脂的用量比为30mL:1g。
桦褐孔菌多糖的得率为83.2％，蛋白脱除率为81.7％，色素脱除率为80.1％，多糖收率为91％，多糖含量为46％。
实施例4
本实施例的桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，该方法为:
S1、初步处理：将桦褐孔菌菌种(菌株编号为KXHHKJ-025-2)经发酵后得到桦褐孔菌菌丝体，烘干、粉碎后，加入2倍质量的石油醚脱脂后抽滤，在温度为50℃的条件减压烘干至水分含量为12％，得到烘干的桦褐孔菌；
将烘干的桦褐孔菌粉碎后过40目筛，加入1.5倍质量的丙酮浸泡8h后，抽滤后得到固形物a，在温度为60℃的条件下减压烘干至水分含量为10％，超微粉碎，过200目筛，得到待处理粉体，加入乙酸乙酯，抽滤后得到固形物b，然后加入质量分数为90％的乙醇水溶液，在温度为70℃的条件下水浴回流2h后，离心后得到沉淀物质a，将所述沉淀物质a在温度为50℃的条件下干燥12h，得到处理后的桦褐孔菌；所述待处理粉体和乙酸乙酯的用量比为1g:5mL；所述固形物b和质量分数为90％的乙醇水溶液的用量比为1g：10mL；
S2、脱纤维素粗多糖提取：向S1中得到的处理后的桦褐孔菌中加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液a，升温至55℃，超声15min，然后加入纤维素酶，得到初混液，在温度为55℃的条件下酶解2h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，然后加入蒸馏水，在温度为70℃、超声功率为400W、频率为40kHz的条件下超声30min，然后在转速为4000rpm的条件下离心20min，收集滤液a，将剩余的沉淀物质重复S2步骤中的上述操作，收集得到滤液b,合并滤液a和滤液b，得到脱纤维素粗多糖提取液；处理后的桦褐孔菌和磷酸盐缓冲液a的用量比为1g:10mL；所述初混液中纤维素酶的质量分数为4‰；所述初混液和蒸馏水的体积比为1:10；
S3、木瓜蛋白酶脱蛋白：将S2中得到的脱纤维素粗多糖提取液中加入木瓜蛋白酶，得到混合液，在温度为45℃的条件下酶解2h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液b，然后在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，取上清液a，加入浓度为0.025mol/L的三氯乙酸水溶液，静置1h，振荡后，在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，将上清液过截留分子量为100KD的陶瓷透析膜脱大分子后，过截留分子量为200Da的聚酰胺膜脱盐，得到脱纤维素脱蛋白多糖提取液；所述混合液中木瓜蛋白酶的质量分数为6‰；所述混合液、磷酸盐缓冲液b和三氯乙酸水溶液的体积比为4:4:1；
S4、醇沉：将S3中得到的脱纤维素脱蛋白多糖提取液进行旋转蒸发后，得到多糖一次浓缩液，然后加入无水乙醇a，离心后，得到沉淀物质b，向所述沉淀物质b加入蒸馏水a，然后再进行旋转蒸发后，得到多糖二次浓缩液，然后加入无水乙醇b，离心后，得到沉淀物质c，将所述沉淀物质c依次用质量分数为75％的乙醇水溶液清洗2次，用无水乙醇清洗2次，用丙酮进行清洗2次后，加入蒸馏水b，得到多糖提取液；所述多糖一次浓缩液和无水乙醇a的体积比为1:20；所述多糖二次浓缩液和无水乙醇b的体积比为1:20；所述沉淀物质b和蒸馏水a的用量比为1g:40mL；所述沉淀物质c和蒸馏水b的用量比为1g:40mL；
S5、脱色：将S4中得到的多糖提取液放入聚酰胺树脂柱中，用质量分数为5％的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱，洗脱至透过的溶液为透明无色时止，得到浓度为0.5g/L的脱色后的多糖提取液；
S6、纯化：向S5中得到的脱色后的多糖提取液中加入湿法装柱的AB-8树脂，在室温的条件下以1BV/h的流速吸附5h，然后用质量分数为8％的乙醇水溶液以2BV/h的流速洗杂3h，再用质量分数为30％的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱4h后，收集多糖纯化液，在温度为30℃的条件下减压蒸馏2h后，经冻干或者减压烘干后，得到桦褐孔菌多糖；脱色后的多糖提取液和AB-8树脂的用量比为30mL:1g。
桦褐孔菌多糖的得率为83.9％，蛋白脱除率为82.4％，色素脱除率为82.3％，多糖收率为92％，多糖含量为45％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (8)
1.一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，其特征在于，该方法为:
S1、初步处理：从白桦树上采集桦褐孔菌子实体，在温度为40℃～50℃的条件减压烘干至水分含量为10％～12％，得到烘干的桦褐孔菌；
或者将桦褐孔菌菌种经发酵后得到桦褐孔菌菌丝体，烘干、粉碎后，加入2倍质量的石油醚脱脂后抽滤，在温度为40℃～50℃的条件减压烘干至水分含量为10％～12％，得到烘干的桦褐孔菌；
将烘干的桦褐孔菌粉碎后过40目筛，加入2倍质量的乙醇或者1.5倍质量的丙酮浸泡6h～8h后，离心或抽滤后得到固形物a，在温度为50℃～60℃的条件下减压烘干至水分含量为8％～10％，超微粉碎，过200目筛，得到待处理粉体，加入乙酸乙酯，离心或者抽滤后得到固形物b，然后加入质量分数为90％的乙醇水溶液，在温度为70℃的条件下水浴回流2h后，离心后得到沉淀物质a，将所述沉淀物质a在温度为50℃的条件下干燥12h，得到处理后的桦褐孔菌；
S2、脱纤维素粗多糖提取：向S1中得到的处理后的桦褐孔菌中加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液a，升温至55℃，超声15min，然后加入纤维素酶，得到初混液，在温度为55℃的条件下酶解2h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，然后加入蒸馏水，在温度为70℃、超声功率为400W、频率为40kHz的条件下超声30min，然后在转速为4000rpm的条件下离心20min，收集滤液a，将剩余的沉淀物质重复S2步骤中的上述操作，收集得到滤液b,合并滤液a和滤液b，得到脱纤维素粗多糖提取液；
S3、木瓜蛋白酶脱蛋白：将S2中得到的脱纤维素粗多糖提取液中加入木瓜蛋白酶，得到混合液，在温度为45℃的条件下酶解1h～2h后，在温度为90℃的条件下灭酶10min，加入pH值为5.0的磷酸盐缓冲液b，然后在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，取上清液a，加入浓度为0.025mol/L的三氯乙酸水溶液，静置1h，振荡后，在温度为50℃、转速为3500r/min的条件下离心10min，将上清液过截留分子量为100KD的陶瓷透析膜脱大分子后，过截留分子量为100Da～200Da的聚酰胺膜脱盐，得到脱纤维素脱蛋白多糖提取液；
S4、醇沉：将S3中得到的脱纤维素脱蛋白多糖提取液进行旋转蒸发后，得到多糖一次浓缩液，然后加入无水乙醇a，离心后，得到沉淀物质b，向所述沉淀物质b加入蒸馏水a，然后再进行旋转蒸发后，得到多糖二次浓缩液，然后加入无水乙醇b，离心后，得到沉淀物质c，将所述沉淀物质c依次用质量分数为75％的乙醇水溶液清洗2次，用无水乙醇清洗2次，用丙酮进行清洗2次后，加入蒸馏水b，得到多糖提取液；
S5、脱色：将S4中得到的多糖提取液放入聚酰胺树脂柱中，用质量分数为5％的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗脱，洗脱至透过的溶液为透明无色时止，得到浓度为0.5g/L的脱色后的多糖提取液；
S6、纯化：向S5中得到的脱色后的多糖提取液中加入湿法装柱的AB-8树脂，在室温的条件下以1BV/h的流速进行吸附，然后用质量分数为3％～8％的乙醇水溶液以2BV/h的流速进行洗杂，再用质量分数为30％的乙醇水溶液以0.5BV/h的流速洗脱后，收集多糖纯化液，在温度为15℃～30℃的条件下减压蒸馏1h～2h后，经冻干或者减压烘干后，得到桦褐孔菌多糖。
2.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，其特征在于，S1中所述待处理粉体和乙酸乙酯的用量比为1g:5mL。
3.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，其特征在于，S1中所述固形物b和质量分数为90％的乙醇水溶液的用量比为1g：10mL。
4.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，其特征在于，S2中处理后的桦褐孔菌和磷酸盐缓冲液a的用量比为1g:10mL；所述初混液中纤维素酶的质量分数为4‰；所述初混液和蒸馏水的体积比为1:10。
5.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，其特征在于，S3中所述混合液中木瓜蛋白酶的质量分数为6‰；所述混合液、磷酸盐缓冲液b和三氯乙酸水溶液的体积比为4:4:1。
6.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，其特征在于，S4中所述多糖一次浓缩液和无水乙醇a的体积比为1:20；所述多糖二次浓缩液和无水乙醇b的体积比为1:20；所述沉淀物质b和蒸馏水a的用量比为1g:40mL；所述沉淀物质c和蒸馏水b的用量比为1g:40mL。
7.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，其特征在于，S6中脱色后的多糖提取液和AB-8树脂的用量比为30mL:1g。
8.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，其特征在于，S6中吸附的时间为5h；洗杂的时间为3h；洗脱的时间为4h。
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