CN117646055A - 粗毛纤孔菌多肽及其制备方法和在抗牙周炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学生物制药技术领域，具体公开了一种粗毛纤孔菌多肽及其制备方法和在抗牙周炎药物中的应用，用氯化钠溶液提取粗毛纤孔菌子实体；然后用木瓜蛋白酶于60℃条件下酶解40 min；然后于100℃下加热30 min使酶失活，离心收集上清酶解蛋白液，超滤、离心后得到粗毛纤孔菌多肽。与现有技术相比，本发明制备的粗毛纤孔菌多肽为天然药物，没有合成化学品的不良反应和副作用，且疗效确切；粗毛纤孔菌多肽稳定性好，耐酸碱、耐高温，真空干燥处理后药物活性不受影响；使用方便简单，无刺激性，治疗效果显著，对牙龈卟啉单胞菌表现出良好的杀伤能力，能够用于抗牙周炎药物。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物制药技术领域，特别是一种粗毛纤孔菌多肽及其制备方法和在抗牙周炎药物中的应用。
背景技术
粗毛纤孔菌作为一种药用真菌，是我国传统中药材桑黄的正源，具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎、活血化瘀、保肝、增强免疫力和抗氧化等多种药理功效。目前国内外对粗毛纤孔菌的研究多集中在多糖、多酚、甾体类、萜类、色素类、脂肪酸等成分的提取、分离、纯化和药理活性等方面，经检索未见粗毛纤孔菌多肽相关文献报道。
牙周炎是一种由菌斑微生物引起的慢性感染性口腔疾病，菌斑中的致病菌是始动因子，可导致牙龈上皮组织炎症，引起牙龈及牙周膜胶原纤维溶解破坏以及牙槽骨吸收，造成牙齿松动脱落。牙周炎发病率高、危害大、病因复杂、病理过程反复、治愈困难，是成年人牙齿缺失的首要原因。目前治疗牙周炎的主要手段包括机械除菌和药物治疗，药物治疗仍以抗生素类为主，但抗生素的长期使用会造成菌群失调、耐药菌株产生和其他毒副作用，对机体造成损害，使其在临床应用中受到一定限制。抗菌肽的出现为抑菌药物的研究打开了新的方向。
抗菌多肽对细菌、真菌、病毒及肿瘤细胞等均具有强有力的杀伤作用。抗菌多肽由天然生物体产生、不易产生耐药性、来源广泛、对真核细胞影响较小、能够穿过细胞膜等，有望在治疗领域得到广泛应用。随着研究的不断进行，已有多种抗菌肽用于临床抗感染治疗，随着人们对抗菌肽抑菌机制的进一步探索，它的应用领域也将进一步扩大。粗毛纤孔菌作为一种传统的本土药食同源真菌，对其特有的活性成分以及功能功效的研究具有重要的现实意义，其在医学和抑菌抗感染等相关领域中的应用拥有广阔的前景。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种粗毛纤孔菌多肽及其制备方法和在抗牙周炎药物中的应用，制备的粗毛纤孔菌多肽对牙龈卟啉单胞菌具有明显的抗菌活性，能显著抑制牙龈卟啉单胞菌的增殖，并杀死细菌。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种粗毛纤孔菌多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取粗毛纤孔菌子实体洗涤剔除杂质后烘干，粉碎后过40-60目筛，制备得到粗毛纤孔菌子实体粉；
S2、按照料液比1g:10 mL将粗毛纤孔菌子实体粉置于氯化钠溶液中，80℃水浴条件下提取1 h，收集滤液；再加入氯化钠溶液提取1 h，收集滤液，然后合并两次滤液，离心去沉淀，收集上清蛋白液，并测定上清蛋白液中的蛋白含量；
S3、向上清蛋白液中加入蛋白含量2倍质量的木瓜蛋白酶，于60℃条件下酶解40min；然后于100℃下加热30 min使酶失活，离心收集上清酶解蛋白液，过10 kD超滤膜进行超滤后收集膜上物，将膜上物在5000 g离心力离心10分钟后，得到粗毛纤孔菌多肽。
进一步地，所述步骤S1中，氯化钠溶液的浓度为0.8%。
本发明的第二个目的是要提供一种利用上述方法制备的粗毛纤孔菌多肽。
本发明的第三个目的是要提供一种粗毛纤孔菌多肽在制备抗牙周炎药物中的应用。
本发明的第四个目的是要提供一种抗牙周炎药物，包含所述的粗毛纤孔菌多肽。
优选地，所述抗牙周炎药物的制剂包括但不限于喷雾剂、气雾剂、漱口液、凝胶剂、软膏剂。
与现有技术相比，本发明制备的粗毛纤孔菌多肽为天然药物，没有合成化学品的不良反应和副作用，且疗效确切；粗毛纤孔菌多肽稳定性好，耐酸碱，耐高温，真空干燥处理后药物活性不受影响；使用方便简单，无刺激性，治疗效果显著，对牙龈卟啉单胞菌表现出良好的杀伤能力，能够用于缓解牙周炎药物。
附图说明
图1为实施例中粗毛纤孔菌多肽的摩尔质量分布。
图2为最小抑菌浓度实验结果图。
图3为最小杀菌浓度实验结果图。
图4为生长曲线。
图5为大鼠上颌骨的MciroCT 结果、HE染色图、Masson染色图和trap染色图。
图6为大鼠釉牙骨质界-牙槽嵴顶的距离定量。
图7为大鼠心、肝、脾、肺、肾的HE染色图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例展示了一种粗毛纤孔菌多肽的制备方法，具体步骤如下：
1）取粗毛纤孔菌子实体（粗毛纤孔菌子实体（IH）采摘于山东临清，由吉林农业大学李玉教授鉴定）洗涤剔除杂质后烘干，高速粉碎机粉碎，过40-60目筛，制备得到粗毛纤孔菌子实体粉；
2）取10 g粗毛纤孔菌子实体粉置于100 mL浓度为0.8%的氯化钠溶液中，80 ℃水浴条件下提取1 h，收集滤液；再向滤渣中加入100 mL浓度为0.8%的氯化钠溶液提取1 h，收集滤液，合并两次滤液，离心去沉淀，收集上清蛋白液；
3）定蛋白：采用BCA法测定上清蛋白液的蛋白含量；
4）酶解：向上清蛋白液中中加入蛋白含量2倍质量的木瓜蛋白酶，酶解温度60℃，酶解40 min，并于100 ℃下加热30 min使酶失活，离心收集上清酶解蛋白液，过10kD超滤膜进行超滤后收集膜上物，将膜上物在5000g离心力离心10分钟后，即可得到粗毛纤孔菌多肽提取物，4℃下保存使用。
采用凝胶渗透色谱法测粗毛纤孔菌多肽的摩尔质量分布，如图1所示， Mn=2841g/mol，Mw=20625g/mol, Mz=36264134g/mol。
为了验证本发明的粗毛纤孔菌多肽的是否能够用于制备抗牙周炎药物，通过下述实施例对本发明粗毛纤孔菌多肽进行的主要药效学实验。
一、最小抑菌浓度测定实验
将培养20-22h时间内对数生长期的牙龈卟啉单胞菌（ATCC33277）菌液用BHI培养基调整为2×107CFU/mL备用。粗毛纤孔菌多肽提取液用PBS稀释至终浓度为0.25，0.5，1，2，4 mg/mL, 分别取0.1 mL配制好的多肽溶液和0.1 mL菌液加入到无菌96孔板中，37 ℃恒温厌氧培养24 h后，在600 nm处测定吸光度值。MIC被定义为粗毛纤孔菌多肽完全抑制细胞生长的最小浓度，实验组与对照组ΔOD600≤0.05的最低浓度为MIC，如图2所示。
二、最小杀菌浓度测定实验
2）取≥MIC的各组菌液10 μL涂布于BHI血平板上，37℃厌氧培养48h。将观察到菌落数为0的最小浓度即为最小杀菌浓度，如图3所示。
三、生长曲线测定
3）将20mL细菌悬浮液（2×107 CFU/mL）与20 mL 1倍/2倍MIC（处理组）或PBS（对照组）混合，37℃摇床中120rpm厌氧培养。每4小时取出1mL混合物，使用Synergy HT多重检测酶标仪检测其在600nm处的吸光度，绘制生长曲线，如图4所示。
粗毛纤孔菌多肽抗大鼠牙周炎活性探究，具体实验方法如下：
1.1 动物饲养及分组给药
本试验例用于说明本发明的粗毛纤孔菌多肽抗大鼠牙周炎活性作用。准备40只健康8周龄雄性SD大鼠（来源于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号（SCXK[LIAO]2020-0001)，于吉林大学生命科学国家级实验教学中心（许可证号：SYXK（吉）2018-0015）适应性饲养一周（依照GB14925进行，实验动物自由饮水采食。并维持在22-24℃的温度和40-60%相对湿度，12小时的光/暗周期），1周后根据体重分为四组，每组10只，包括空白对照组（CTRL）、牙周炎模型组（PD）、粗毛纤孔菌多肽给药组（IHP）、阳性给药组（PVP-I）。
采用正畸结扎丝结扎法建立大鼠的牙周炎模型。 建模完成后每天早8时和晚20时，空白对照组（CTRL）和牙周炎模型组（PD）每侧口腔冲洗100 μL生理盐水；粗毛纤孔菌多肽给药组（IHP）给予100 μL粗毛纤孔菌多肽冲洗（2 mg/ml）；阳性给药组（PVP-I）给与100 μL聚维酮碘冲洗（10mg/mL）；连续给药4周。
1.2样本的制备方法
末次给药后2 h，沾有生理盐水的无菌口腔拭子采集大鼠口腔唾液，置于无菌冻存管，-80℃保存待用。各组大鼠禁食、不禁水4 h后摘眼球取血，室温静置30 min，3000 r/min离心10 min，取上清，置于-80℃冰箱保存待用。随后将大鼠处死，取其上颌骨及心、肝、脾、肺、肾，-80℃冰箱保存备用。
1.3 Micro-CT扫描观察
结果如图5、图6所示，大鼠上颌骨固定24 h后通过Micro-CT扫描后定量分析上颌骨腭侧近中、中间及远中牙槽骨吸收程度，发现牙周炎模型组（PD）较空白对照组（CTRL）大鼠上颌骨腭侧近中、中间及远中牙槽骨吸收明显，粗毛纤孔菌多肽给药组（IHP）的大鼠的牙槽骨吸收程度较牙周炎模型组（PD）的大鼠明显降低，效果与阳性给药组（PVP-I）相当。
1.3组织学观察
大鼠上颌骨及心、肝、脾、肺、肾在4%多聚甲醛中固定，4℃保存。上颌骨脱钙后，常规石蜡包埋、切片，采用HE染色、Masson染色及Trap染色，心、肝、脾、肺、常规石蜡包埋、切片，采用HE染色，通过光学显微镜观察，进行组织学分析，结果如图5、图7所示。图5、图7显示牙周炎模型组（PD）的大鼠牙周组织炎症反应明显，牙周组织中的胶原纤维较幼稚，破骨细胞反应活跃；粗毛纤孔菌多肽给药组（IHP）与牙周炎模型组（PD）的大鼠牙周组织相比炎症明显减轻，胶原纤维较成熟，破骨细胞明显减少。
因此，利用上述实施例制备的粗毛纤孔菌多肽可以与药物载体形成抗牙周炎药物制剂，所述制剂可以为喷雾剂、气雾剂、漱口液、凝胶剂、软膏剂等多种外用剂型。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种粗毛纤孔菌多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取粗毛纤孔菌子实体洗涤剔除杂质后烘干，粉碎后过40-60目筛，制备得到粗毛纤孔菌子实体粉；
S2、按照料液比1g:10 mL将粗毛纤孔菌子实体粉置于氯化钠溶液中，80℃水浴条件下提取1 h，收集滤液；再加入氯化钠溶液提取1 h，收集滤液，然后合并两次滤液，离心去沉淀，收集上清蛋白液，并测定上清蛋白液中的蛋白含量；
S3、向上清蛋白液中加入蛋白含量2倍质量的木瓜蛋白酶，于60℃条件下酶解40 min；然后于100℃下加热30 min使酶失活，离心收集上清酶解蛋白液，过10 kD超滤膜进行超滤后收集膜上物，将膜上物在5000 g离心力离心10分钟后，得到粗毛纤孔菌多肽。
2.根据权利要求1所述的粗毛纤孔菌多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，氯化钠溶液的浓度为0.8%。
3.一种如权利要求1或2所述的方法制备的粗毛纤孔菌多肽。
4.一种如权利要求3所述的粗毛纤孔菌多肽在制备抗牙周炎药物中的应用。
5.一种抗牙周炎药物，其特征在于，包含如权利要求3所述的粗毛纤孔菌多肽。
6.根据权利要求5所述的抗牙周炎药物，其特征在于：所述抗牙周炎药物的制剂包括但不限于喷雾剂、气雾剂、漱口液、凝胶剂、软膏剂。
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