CN105732436A - 从高丰度15n同位素标记l-精氨酸发酵液中提取高丰度l-精氨酸-15n4的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从高丰度15N同位素标记L?精氨酸发酵液中提取高丰度L?精氨酸?15N4的方法，以高丰度15N同位素标记L?精氨酸的发酵液为原料，采用中压制备色谱系统，经二步分离，历时8～12h就可以分离得到纯净的L?精氨酸?15N4单品溶液，再经赶氨浓缩，活性炭脱色，无水乙醇结晶，60℃真空干燥就可以分离提取到产品纯度＞98％的L?精氨酸?15N4产品，总提取收率大于80％。本发明不仅原理简单，操作方便，处理量大而快捷，而且避免了离子交换树脂法提取时间冗长及处理树脂产生大量废酸废碱排放对环境造成的污染。

Description

从高丰度15N同位素标记L-精氨酸发酵液中提取高丰度L-精氨酸-15N4的方法
技术领域
本发明涉及发酵法生产氨基酸的技术领域，尤其是涉及一种从发酵法生产高丰度L-精氨酸-15N4的发酵液中快速分离提取L-精氨酸-15N4的方法。
背景技术
L-精氨酸(L-arginine)化学名为α-氨基-δ-胍基戊酸，分子式为C6H14N402，分子质量为174.2，通常为白色斜方晶系(二水物)晶体或白色结晶性粉末，易溶于水，不溶于乙醚，微溶于乙醇。L-精氨酸是人和动物体内的半必须氨基酸，为目前发现的动物细胞内功能最多的氨基酸，它不仅作为蛋白质合成的重要原料，同时也是机体内肌酸、多胺和一氧化氮(NO)等多钟活性物质的合成前体，具有多种独特的生理和药理作用，是尿素循环的重要中间代谢产物，通过尿素循环解除氨中毒，避免由于氨过量造成的代谢紊乱。在生理活性方面，除了与生长激素、胰岛素、胰高血糖素等激素诱导有关外，近年来又作为血管舒张而引起关注，有望成为营养疗法的新材料，L-精氨酸还可以提高人体生长荷尔蒙(HGH)，延缓衰老，在临床上除作为复方氨基酸输液的主要成分之一外，精氨酸及其盐类还广泛用作氨中毒性肝昏迷的解毒剂和肝功能促进剂，对病毒性肝炎疗效显著，对肠道溃疡、血栓形成、神经衰弱和男性无精病等症都有治疗效果，在医疗和食品工业中具有越来越广泛的用途。L-精氨酸作为一种重要的饲料添加剂，在世界养殖业中有广泛的应用。1998年，诺贝尔医学奖授予了研究一氧化氮(NO)在细胞、组织间信使作用的三位美国科学家，引发了世界性的L-精氨酸研究热潮。
L-精氨酸属于发酵法生产L-氨基酸四大瓶颈之一，主要采用蛋白水解法和发酵法生产，目前，世界上发酵生产L-精氨酸水平较高的有日本味之素、协和发酵、田边制药以及德国Degussa四家公司，其中日本在产量、品质和工艺技术上均居于世界首位。我国自八十年代开始有发酵法生产精氨酸的研究报道，但至今还没有实现工业化生产，现有的生产厂家目前大多仍以从血粉、脚蹄及猪毛水解液中提取，该法操作费时、收率低，工艺稳定性不好且环境污染严重。发酵法克服了蛋白质水解法所存在的工艺复杂和污染严重的缺点，具有广阔的发展前景。
15N标记的L-精氨酸是将其中的氮源(14N)用15N替代从而生产出15N标记的L-精氨酸。15N标记L-精氨酸和其它标记的氨基酸一样，可作为示踪剂而广泛应用于医药工业、食品工业和生命科学等相关研究领域。15N标记的L-精氨酸的示踪作用可以用来实验和研究L-精氨酸在机体内的独特生理作用。由于毛发、血粉等天然蛋白质中的氮源是无法用15N标记的，因而15N标记L-精氨酸的生产只能用发酵法生产而不能用蛋白质水解法生产。
从发酵液中分离提取精氨酸常用离子交换树脂法、电渗析法、特殊沉淀法。
申请号为200410089567的中国专利“15N-L-精氨酸的分离提纯方法”采用的就是离子交换树脂的方法提取L-精氨酸-15N4。目前离子交换树脂分离精氨酸的研究报道很多，其原理简单，易于控制，而且提取收率较高，但提取时间冗长，如在实际操作中洗脱时间很长，得到的洗脱液中精氨酸的含量往往很低，需要大量浓缩，发酵液中常常含有10几种氨基酸及大量色素等杂质，常造成树脂的交换容量下降，发酵液需要用草酸预处理以便除去大部分菌体及发酵液中的钙离子，特别是赖氨酸和精氨酸同为碱性氨基酸，且Rf值非常接近，两者交叉洗脱的重斑较多，不但影响了提取收率而且有可能对最终的产品纯度产生影响，同时处理树脂产生的大量废酸废碱会对环境造成影响。
电渗析法虽然原理简单，但设备复杂，投资较大，生产控制有一定的难度，精氨酸回收率不高，该分离方法的应用不广。
特殊沉淀法是利用沉淀剂(如苯甲醛、五氯酚、十二烷基磺酸钠等)能使精氨酸与其生成溶解度较小的复合物而沉淀，从而达到精氨酸与其他氨基酸分离的目的，特殊沉淀法分离精氨酸虽然操作简单，选择性强，但由于苯甲醛、五氯酚等沉淀剂为有毒化合物，回收困难，提取精氨酸后的废液排放会对环境造成污染。中国专利03132309.x采用十二烷基磺酸钠作沉淀剂来分离精氨酸，十二烷基磺酸钠虽然无毒，但该方法实际操作中剂量不易控制，目标产物精氨酸中可能会残留微量的沉淀剂。L-精氨酸-15N4作为医药、食品行业用的示踪剂，不宜用以上三种沉淀剂从发酵液中分离提取L-精氨酸-15N4。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种快速高效从发酵液中直接分离提取L-精氨酸-15N4的方法。该方法既克服了离子交换树脂方法提取时间冗长，又避免了特殊沉淀法带来的有毒操作问题，特别适合于L-精氨酸-15N4这种高附加值产品的分离提取。本发明采用中压制备色谱分离系统，可以快速高效的从含有L-精氨酸-15N4的发酵中直接分离得到L-精氨酸-15N4产品，不但提取速度快、提取收率高，而且产品纯度高质量好。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
从高丰度15N同位素标记L-精氨酸发酵液中提取高丰度L-精氨酸-15N4的方法，采用以下步骤：
(1)精氨酸的富集除杂
调节L-精氨酸-15N4的发酵液的pH为1～5，离心得到上清液，取色谱柱体积一半的上清液用恒流泵上样，上样速度5～100ml/min，控制流出液不含精氨酸，上样结束后立即用蒸馏水冲洗色谱柱去除部分色素等杂质，在检测器读数不下降时采用0.01～2.0mol/L的氨水洗脱，收集最后一个组分即为精氨酸粗品溶液；
(2)精氨酸的精制
色谱柱用蒸馏水冲洗至中性，将得到的精氨酸粗品溶液在60℃真空浓缩，用盐酸溶液调节pH为1～5，用恒流泵上样，上样结束后立即用蒸馏水冲洗色谱柱，在检测器读数不下降时采用0.01～1.0mol/L氨水洗脱，收集最后一个组分即为L-精氨酸-15N4单品，将该单品赶氨浓缩，活性炭脱色再浓缩，加入无水乙醇结晶，真空干燥结晶得到L-精氨酸-15N4。
步骤(1)中L-精氨酸-15N4的发酵液的pH值调节为2～3，氨水浓度为0.1～1.0mol/L，优选为0.1～0.5mol/L。步骤(2)中L-精氨酸-15N4的发酵液的pH值调节为2～3，氨水浓度为0.01～0.06mol/L，优选为0.02～0.05mol/L。
所述的色谱柱为玻璃柱，柱子的长宽比为15:1～20:1，体积为200～4000ml，色谱柱含有-CH2SO3 -、粒径20～100nm的聚合物填料，具有吸附容量大，再生容易、方便的特点。
与现有技术相比，本发明采用的中压制备色谱系统不仅具有常压色谱上样量大、柱效高的优点，又有制备型高压色谱高效分离的特点，具有经济快捷的优势。
根据不同的色谱柱大小，上样速度可达到5～100ml/min，经过上述的两步分离，历时8～12h就可以分离得到精氨酸的单品，提取收率可达80％以上，水洗、氨洗过程中少量的精氨酸可以浓缩后再上柱，提取收率可以进一步提高，提取收率甚至可以达到90％。和离子交换树脂相比，不仅处理量大、提取时间大为缩短(离子交换树脂从上样到得到精氨酸单斑一般耗时在2周到一个月甚至更长时间)，而且分离得到的精氨酸单品溶液颜色浅、含量高，浓缩赶氨的时间也缩短了，只要加少量的活性炭一次脱色，浓缩后用无水乙醇结晶就可以得到颜色洁白、纯度高的产品，极大的提高了分离效率，降低了能耗和工作强度。色谱柱只要用蒸馏水在线冲洗到中性就可以进行下一批料液的处理，避免了树脂处理再生所产生的大量废酸废碱对环境的污染问题。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
从高丰度15N同位素标记L-精氨酸发酵液中提取高丰度L-精氨酸-15N4的方法，是基于发酵液中各氨基酸组分与流动相和固定相作用力存在差异使得它们的保留时间不同而完成分离，从而从多种氨基酸存在的发酵液中分离出纯净的单组份精氨酸。它主要由恒流泵、色谱柱、检测器、收集器四部分组成。其工艺流程如图1所示，由恒流泵输送移动相，通过进样阀上样，在色谱柱上对样品实行分离后，利用检测器进行检测、记录仪记录，并同时收集各个馏分。
主要提取过程分两步，第一步：发酵液上柱除杂富集得到精氨酸粗品，第二步对粗品精氨酸浓缩再上柱精制得到目标产物精氨酸单斑。分离工艺流程如下：
L-精氨酸-15N4发酵液→调节pH至酸性→离心→上清液→进样→蒸馏水洗脱→0.01～2M氨水洗脱→检测器监测→收集最后一个组分→得到L-精氨酸-15N4粗品→60℃真空浓缩粗品→调pH酸性再上柱→蒸馏水洗脱→0.01～1M氨水洗脱→检测器监测→收集最后一个组分→得到精氨酸单斑→赶氨→脱色→浓缩结晶→产品。
实施例1
L-精氨酸-15N4发酵液100ml，L-Arg-15N4含量1.53％(折合成L-Arg.HCl-15N41.84％)，用2mol/L盐酸调节溶液pH值为3，4000rpm离心沉淀菌丝体，取上清液，通过恒流泵A上样，上样速度5ml/min，色谱柱体积200ml，20分钟上样结束，改用蒸馏水冲洗色谱柱，水洗流速5ml/min，至180分钟，水洗液基本无色，检测器的吸光度Au值基本不下降，改用0.5mol/L氨水洗柱，氨水用恒流泵B送入，通过检测器的指示，收集每一个峰值的馏分，通过纸层析或质谱分析，最后一个峰的馏分为L-Arg-15N4的粗品，其他含有L-Arg-15N4及其它杂酸的馏分浓缩后可以再次上柱进行二次分离，280分钟后粗分结束，色谱柱用蒸馏水冲洗至中性待用。
将以上粗分得到的含有L-Arg-15N4粗品溶液60℃真空浓缩至50ml，用盐酸调节pH值为3，通过恒流泵A上样，上样速度5ml/min，色谱柱体积200ml，10分钟上样结束，改用蒸馏水冲洗色谱柱，水洗流速5ml/min，至200分钟，水洗液基本无色，检测器的吸光度Au值基本不下降，改用0.08mol/L稀氨水洗柱，氨水用恒流泵B送入，通过检测器的指示，收集每一个峰值的馏分，通过纸层析或质谱分析，最后一个峰的馏分为L-Arg-15N4单品，其他含有L-Arg-15N4及其它杂酸的馏分浓缩可以和粗分含有L-Arg-15N4及其它杂酸的部分一起浓缩后再次上柱进行二次分离，350分钟后精制结束，色谱柱用蒸馏水冲洗至中性可以进行下一次分离。
将以上得到的L-Arg-15N4单品溶液赶氨浓缩后，转移至烧杯，体积约150ml，用盐酸调pH5.0，加入活性炭0.1g，80℃脱色30分钟，趁热过滤，得到澄清无色的溶液，真空浓缩后用无水乙醇结晶，真空干燥得到L-Arg.HCl-15N4产品1.49g，产品颜色洁白，纯度98.5％，收率81％。
实施例2
L-精氨酸-15N4发酵液500ml，L-Arg-15N4含量1.47％(折合成L-Arg.HCl-15N41.76％)，用3mol/L盐酸调节溶液pH值为2，5000rpm离心沉淀菌丝体，取上清液，通过恒流泵A上样，上样速度18ml/min，色谱柱体积1000ml，25分钟上样结束，改用蒸馏水冲洗色谱柱，水洗流速20ml/min，至200分钟，水洗液基本无色，检测器的吸光度Au值基本不下降，改用0.8mol/L氨水洗柱，氨水用恒流泵B送入，通过检测器的指示，收集每一个峰值的馏分，通过纸层析或质谱分析，最后一个峰的馏分为L-Arg-15N4的粗品，其他含有L-Arg-15N4及其它杂酸的馏分浓缩后可以再次上柱进行二次分离，300分钟后粗分结束，色谱柱用蒸馏水冲洗至中性待用。
将以上粗分得到的含有L-Arg-15N4粗品溶液60℃真空浓缩至400ml，用盐酸调节pH值为5，通过恒流泵A上样，上样速度20ml/min，色谱柱体积1000ml，25分钟上样结束，改用蒸馏水冲洗色谱柱，水洗流速25ml/min，至210分钟，水洗液基本无色，检测器的吸光度Au值基本不下降，改用0.06mol/L稀氨水洗柱，氨水用恒流泵B送入，通过检测器的指示，收集每一个峰值的馏分，通过纸层析或质谱分析，最后一个峰的馏分为L-Arg-15N4单品，其他含有L-Arg-15N4及其它杂酸的馏分浓缩可以和粗分含有L-Arg-15N4及其它杂酸的部分一起再次上柱进行二次分离，360分钟后精制结束，色谱柱用蒸馏水冲洗至中性可以进行下一次分离。
将以上得到的L-Arg-15N4单品溶液赶氨浓缩后，转移至烧杯，体积约800ml，用盐酸调pH5.0，加入活性炭0.5g，80℃脱色30分钟，趁热过滤，得到澄清无色的溶液，真空浓缩用无水乙醇结晶，真空干燥得到L-Arg.HCl-15N4产品7.23g，产品颜色洁白，纯度98.7％，收率82.19％。
实施例3
L-精氨酸-15N4发酵液500ml，L-Arg-15N4含量1.47％(折合成L-Arg.HCl-15N41.76％)，用4mol/L盐酸调节溶液pH值为4，4000pm离心沉淀菌丝体，取上清液，通过恒流泵A上样，上样速度18ml/min，色谱柱体积1000ml，25分钟上样结束，改用蒸馏水冲洗色谱柱，水洗流速20ml/min，至200分钟，水洗液基本无色，检测器的吸光度Au值基本不下降，改用0.8mol/L氨水洗柱，氨水用恒流泵B送入，通过检测器的指示，收集每一个峰值的馏分，通过纸层析或质谱分析，最后一个峰的馏分为L-Arg-15N4的粗品，其他含有L-Arg-15N4及其它杂酸的馏分浓缩后可以再次上柱进行二次分离，300分钟后粗分结束，色谱柱用蒸馏水冲洗至中性待用。
将含有L-Arg-15N4及其它杂酸的馏分浓缩后再次上柱进行二次粗分，得到L-精氨酸-15N4粗品溶液，和前一次粗分的合并在一起。
将两次粗分得到的含有L-Arg-15N4粗品溶液60℃真空浓缩至500ml，用盐酸调节pH值为4，通过恒流泵A上样，上样速度20ml/min，色谱柱体积1000ml，25分钟上样结束，改用蒸馏水冲洗色谱柱，水洗流速25ml/min，至210分钟，水洗液基本无色，检测器的吸光度Au值基本不下降，改用0.06mol/L稀氨水洗柱，氨水用恒流泵B送入，通过检测器的指示，收集每一个峰值的馏分，通过纸层析或质谱分析，最后一个峰的馏分为L-Arg-15N4单品，360分钟后精制结束，色谱柱用蒸馏水冲洗至中性可以进行下一次分离。
将以上得到的L-Arg-15N4单品溶液赶氨浓缩后，转移至烧杯，体积约800ml，用盐酸调pH5.0，加入活性炭0.55g，80℃脱色30分钟，趁热过滤，得到澄清无色的溶液，真空浓缩用无水乙醇结晶，真空干燥得到L-Arg.HCl-15N4产品7.66g，产品颜色洁白，纯度98.7％，收率87％。
实施例4
L-精氨酸-15N4发酵液2000ml，L-Arg-15N4含量1.57％(折合成L-Arg.HCl-15N41.88％)，用2mol/L盐酸调节溶液pH值为1，4000rpm离心沉淀菌丝体，取上清液，通过恒流泵A上样，上样速度80ml/min，色谱柱体积4000ml，25分钟上样结束，改用蒸馏水冲洗色谱柱，水洗流速80ml/min，至220分钟，水洗液基本无色，检测器的吸光度Au值基本不下降，改用0.4mol/L氨水洗柱，氨水用恒流泵B送入，通过检测器的指示，收集每一个峰值的馏分，通过纸层析或质谱分析，最后一个峰的馏分为L-Arg-15N4的粗品，350分钟后粗分结束，色谱柱用蒸馏水冲洗至中性待用。
将以上粗分得到的含有L-Arg-15N4粗品溶液60℃真空浓缩至1800ml，用盐酸调节pH值为1，通过恒流泵A上样，上样速度100ml/min，色谱柱体积4000ml，18分钟上样结束，改用蒸馏水冲洗色谱柱，水洗流速100ml/min，至230分钟，水洗液基本无色，检测器的吸光度Au值基本不下降，改用0.05mol/L稀氨水洗柱，氨水用恒流泵B送入，通过检测器的指示，收集每一个峰值的馏分，通过纸层析或质谱分析，最后一个峰的馏分为L-Arg-15N4单品，350分钟后精制结束，色谱柱用蒸馏水冲洗至中性可以进行下一次分离。
将以上得到的L-Arg-15N4单品溶液赶氨浓缩后，转移至烧杯，体积约3500ml，用盐酸调pH5.0，加入活性炭1.8g，80℃脱色30分钟，趁热过滤，得到澄清无色的溶液，真空浓缩用无水乙醇结晶，真空干燥得到L-Arg.HCl-15N4产品31.03g，产品颜色洁白，纯度98.6％，收率82.53％。

Claims (7)

1.从高丰度15N同位素标记L-精氨酸发酵液中提取高丰度L-精氨酸-15N4的方法，其特征在于，采用以下步骤：
(1)精氨酸的富集除杂
调节L-精氨酸-15N4的发酵液的pH为1～5，离心得到上清液，取色谱柱体积一半的上清液用恒流泵上样，上样速度5～100ml/min，控制流出液不含精氨酸，上样结束后立即用蒸馏水冲洗色谱柱去除部分色素杂质，在检测器读数不下降时采用0.01～2.0mol/L的氨水洗脱，收集最后一个组分即为精氨酸粗品溶液；
(2)精氨酸的精制
色谱柱用蒸馏水冲洗至中性，将得到的精氨酸粗品溶液在60℃真空浓缩，用盐酸溶液调节pH为1～5，用恒流泵上样，上样结束后立即用蒸馏水冲洗色谱柱，在检测器读数不下降时采用0.01～1.0mol/L氨水洗脱，收集最后一个组分即为L-精氨酸-15N4单品，将该单品赶氨浓缩，活性炭脱色再浓缩，加入无水乙醇结晶，真空干燥结晶得到L-精氨酸-15N4。
2.根据权利要求1所述的从高丰度15N同位素标记L-精氨酸发酵液中提取高丰度L-精氨酸-15N4的方法，其特征在于，步骤(1)中L-精氨酸-15N4的发酵液的pH值调节为2～3。
3.根据权利要求1所述的从高丰度15N同位素标记L-精氨酸发酵液中提取高丰度L-精氨酸-15N4的方法，其特征在于，步骤(1)中氨水浓度为0.1～1.0mol/L，优选为0.1～0.5mol/L。
4.根据权利要求1所述的从高丰度15N同位素标记L-精氨酸发酵液中提取高丰度L-精氨酸-15N4的方法，其特征在于，步骤(2)中L-精氨酸-15N4的发酵液的pH值调节为2～3。
5.根据权利要求1所述的从高丰度15N同位素标记L-精氨酸发酵液中提取高丰度L-精氨酸-15N4的方法，其特征在于，步骤(2)中氨水浓度为0.01～0.06mol/L，优选为0.02～0.05mol/L。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的从高丰度15N同位素标记L-精氨酸发酵液中提取高丰度L-精氨酸-15N4的方法，其特征在于，所述的色谱柱为玻璃柱，柱子的长宽比为，15:1～20:1，体积为200～4000ml。
7.根据权利要求6所述的从高丰度15N同位素标记L-精氨酸发酵液中提取高丰度L-精氨酸-15N4的方法，其特征在于，所述的色谱柱含有-CH2SO3 -、粒径20～100nm的聚合物填料。
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