CN101928682A - 一种l-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌及制备方法和应用，L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ZD2009，CCTCC NO：M209260。包括以下步骤：A、紫外线诱变：取谷氨酸棒杆菌培养，离心，弃去上清液，洗涤，菌种用玻璃珠打散，获得细胞悬液；B、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变：取谷氨酸棒杆菌培养，离心，弃去上清液，洗涤，菌种用玻璃珠打散，洗涤后，用磷酸缓冲液洗涤，加入1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍，诱变，用磷酸缓冲液洗涤，除去1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍终止诱变；C、摇瓶发酵条件；D、发酵培养基及接种量；E、pH值确定；F装液量确定。得到一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌，该菌株产酸量达44g/L，且产酸稳定，遗传稳定性高，降低了生产成本，提高了效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌，同时涉及L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌的制备方法，还涉及L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌在动物饲料中的用途。
背景技术
L-精氨酸是精氨酸生物合成途径的最终产物，是人和动物的半必需碱性氨基酸，是幼小动物的必需氨基酸。L-精氨酸具有广泛用途，在医药工业上，L-精氨酸是生物体尿素循环中的一种重要中间代谢物，也是复方氨基酸输液的主要成分之一，还是配制营养或特殊治疗用品的重要原料，被广泛用于氨中毒性肝昏迷的解毒剂和肝功能的促进剂，对病毒性肝炎疗效显著，对肠道溃疡、血栓形成、神经衰弱和男性无精等症状都有一定的治疗效果，还可使尿素循环活化，降低血氨，使肝昏迷症状缓解。在饲料工业上，由于母乳中的精氨酸量与哺乳仔猪自身的肠道内源合成并不能够满足其最佳的生长需要，因此目前养猪业中精氨基酸不足是限制哺乳仔猪获得最佳生长的一个主要因素，哺乳仔猪生产对于整个养猪生产来说十分重要，哺乳仔猪对精氨酸的需要尤为重要。然而，目前国际上发酵法生产精氨酸产酸水平75g/L，而国内主要依靠水解蛋白来生产，操作环境差、收率低、成本高，不适合大规模生产，并且水解产品品质较差，不符合医药用的标准，是我国药用氨基酸生产的“瓶颈”。国家每年在进口L-精氨酸一个产品上的费用需要40到50亿元人民币。现在国内发酵法生产L-精氨酸的研究仅限于实验室水平，与国际技术差距较大，因此选育L-精氨酸的高产菌株并优化其发酵工艺有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌，该菌种所产L-精氨酸达44g/L，产酸稳定，遗传稳定性好，传代八代以后产酸量依然保持较高水平。
本发明的另一个目的是在于提供了一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌的制备方法，该方法把传统的物理诱变和化学诱变法相结合，提高了诱变率。
本发明的再一个目的是在于提供了一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌所生产的L-精氨酸在断奶仔猪饲料中应用，L-精氨酸可以提高断奶仔猪肌肉中有利于蛋白质翻译的起始因子活性，从而促进断奶仔猪肌肉蛋白质合成，达到促进断奶仔猪生长的营养效果。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
所需材料为：
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)DSM1412(购自德国生物材料资源中心，即the German Resource Centre for Biological Material)；1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)(购自Fluka公司产品)；N-硝基-L-精氨酸甲酯(AE)(购自Sigma公司产品)；葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaCl、琼脂、玉米浆、硫酸胺((NH4)2SO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、尿素、碳酸钙、三水磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)、七水硫酸铁(FeSO4·7H2O)、一水硫酸锰(MnSO4·H2O)、生物素、硫胺素盐酸盐、二乙胺、α-萘酚、无水乙醇、脲、纯溴、氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠NaH2PO4、L-Arg和正丙醇购自上海生物工程有限公司。
用紫外线和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变Corynebacterium glutamicumDSM1412 akhurstii，获得一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌，命名为Corynebacterium glutamicum ZD2009，谷氨酸棒杆菌已保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2009年11月11日，保藏编号：CCTCC NO：M209260，分类命名：Corynebacteriumglutamicum ZD2009。
一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌的制备方法，其步骤是：
(1)紫外线诱变(钱和，郝刚.精氨酸产生菌诱变育种的研究.微生物学通 报.2005，32(3)：46-49)：取谷氨酸棒杆菌培养12h种子液5ml，用高速离心机5000rpm离心5min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤，菌种用玻璃珠打散，得菌悬液，在20w紫外灯下50cm处照射30～40S，将经过诱变的菌液涂布在含浓度为4mg/mLAE的基本培养基平板上，30℃培养7～8d，然后挑选长出的较大菌落为N-硝基-L-精氨酸甲酯(购自Sigma公司产品)的变异菌株。筛选出的菌落再经斜面培养、种子液培养、发酵摇瓶培养，最后用坂口改良法(Rosenberg H.，Ennor AH.，Morrison JF.The estimation of arginine.Journal of Chemistry，1956，63(1)：153-159)测定发酵液中的L-精氨酸含量，判定菌株的产酸水平。
(2)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变(钱和，郝刚.精氨酸产生菌诱变育种的研究.微生物学通报.2005，32(3)：46-49)：取谷氨酸棒杆菌培养12h种子液5ml，用高速离心机5000rpm离心5min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤，菌种用玻璃珠打散，生理盐水洗涤后，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)洗涤2次，加入0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)至6.5ml，然后加入浓度为0.4mg/mL1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍，30℃诱变15min，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)洗涤3次，除去1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍终止诱变。将经过诱变的菌液涂布在含浓度为4mg/mL N-硝基-L-精氨酸甲酯的基本培养基平板上，30℃培养7～8d，然后挑菌落，筛选出的菌落再经斜面培养、种子液培养、发酵摇瓶培养，最后用坂口改良法测定发酵液中的L-精氨酸含量，判定菌株的产酸水平。
(3)摇瓶发酵条件优化
种子培养基(各成分质量分数(％)：葡萄糖3.0，玉米浆2.0，硫酸胺((NH4)2SO4)2.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，尿素0.15，pH 7.0-7.2)的优化：采用三因素三水平L9(33)实验设计(三因素三水平，共九个实验组，记为L9(33))：因素1为葡萄糖，设2％，3％，4％三水平；因素2为玉米浆，设1％，2％，3％三水平；因素3为硫酸铵((NH4)2SO4)，设1％，2％，3％三水平。其他因素(磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1％，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％，尿素0.15％，pH 7.0-7.2)不变。
发酵培养基及接种量的优化：采用七因素三水平L18(37)实验设计(七因素三水平，共十八个实验组，记为L18(37))：因素1为葡萄糖，设9％，12％，15％三水平；因素2为玉米浆，设2％，2.5％，3％三水平；因素3为硫酸铵((NH4)2SO4)， 设3％，4.5％，6％三水平；因素4为磷酸二氢钾(KH2PO4)，设0.05％，0.1％，0.15％三水平，因素5为七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)，设0.03％，0.05％，0.07％三水平，因素6为碳酸钙(CaCO3)，设2％，3％，4％三水平；因素7为接种量设6％，8％，10％三水平。
最佳pH值确定：通过设置5个发酵培养基pH值梯度：6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，测定不同pH对细菌产酸的影响。如图3所示，发酵培养基pH值7.0时，产精氨酸量最高。
最佳装液量确定：通过设置4个梯度的发酵装液量(100mL锥形瓶)：5ml，10ml，15ml，20ml，测定不同装液量对细菌产酸的影响。如图4所示，15％装液量(15mL/100mL)产酸量最高。
最优条件验证：采用优化的种子培养基(各成分质量分数(％)：葡萄糖3.0，玉米浆2.0，硫酸胺((NH4)2SO4)2.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，尿素0.15，pH 7.0)、优化的发酵培养基(各成分质量分数(％)：葡萄糖12，玉米浆2.5，硫酸胺((NH4)2SO4)6.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.05，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，碳酸钙(CaCO3)2.0，pH 7.0)及优化的接种量(10％)，最佳发酵培养基pH值(7.0)和最佳发酵装液量(15％)进行验证试验。如表7所示，平均产酸为44g/L。
谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZD2009相关特性
形态学特性：革兰氏阳性菌，杆状。
培养特性：培养基各成分质量分数(％)：葡萄糖2.0，牛肉膏1.0，蛋白胨1.0，酵母膏0.5，NaCl 0.5，琼脂2.0，pH 7.0，30℃培养。
生理特性：具有精氨酸类似物(N-硝基-L-精氨酸甲酯)抗性，传代后产L-精氨酸酸稳定，在上述培养基和温度条件下即可生长，对生长环境无其他特殊要求。
功能特性：L-精氨酸产生菌，发酵产L-精氨酸，经发酵条件优化后产L-精氨酸达44g/L。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：将物理和化学诱变相结合，通过交叉诱变提高诱变效率，得到一株遗传稳定、L-精氨酸产量高的菌株，将此菌株通过发酵条件的优化，使其产酸量达44g/L，且产酸稳定，遗传稳定性 高。获得诱变菌株的最佳发酵条件为：采用种子培养基各成分质量分数％：葡萄糖3.0，玉米浆2.0，硫酸胺((NH4)2SO4)2.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，尿素0.15，pH 7.0；发酵培养基各成分质量分数％：葡萄糖12，玉米浆2.5，硫酸胺((NH4)2SO4)6.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.05，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，碳酸钙(CaCO3)2.0，发酵培养基pH值7.0和发酵装液量15％，30℃发酵培养96h。降低了生产成本，提高了效率。通过试验得出，日粮中添加0.8％L-精氨酸可以通过提高断奶仔猪肌肉中有利于蛋白质翻译的起始因子活性，从而促进断奶仔猪肌肉蛋白质合成，达到促进断奶仔猪生长的营养效果。
附图说明
图1为一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum DSM1412生长曲线示意图
图2为一种L-精氨酸标准曲线
图3为一种不同梯度pH对细菌产酸的影响
图4为一种不同装液量对细菌产酸的影响
图5为一种发酵液中L-精氨酸的分离提取工艺流程图
图6为一种断奶仔猪日粮中添加L-精氨酸对4E-BP1·eIF4E复合物浓度的影响为
具体实施方式
1、材料：
1.1菌株：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum DSM1412)
1.2培养基：
1.2.1琼脂完全培养基各成分质量分数(％)：葡萄糖2.0，牛肉膏1.0，蛋白胨1.0，酵母膏0.5，氯化钠(NaCl)0.5，琼脂2.0，pH 7.0-7.2，115℃灭菌20min。
1.2.2摇瓶种子培养基各成分质量分数(％)：葡萄糖3.0，玉米浆2.0，硫酸胺((NH4)2SO4)2.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，尿素0.15，pH 7.0，115℃灭菌20min。
1.2.3摇瓶发酵培养基各成分质量分数(％)：葡萄糖12.0，玉米浆2.5，硫酸胺 ((NH4)2SO4)4.5，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，碳酸钙(CaCO3)3.0，pH 7.0，115℃灭菌20min。
1.2.4琼脂基本培养基各成分质量分数(％)：葡萄糖1.0，硫酸胺((NH4)2SO4)0.3，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，三水磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.2，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，七水硫酸铁(FeSO4·7H2O)0.002，一水硫酸锰(MnSO4·H2O)0.002，生物素50μg/L，硫胺素盐酸盐200μg/L，琼脂2.0，pH 7.0，115℃灭菌20min。
1.2.5选择性培养基：在基本培养基的基础上补加各种不同质量分数的精氨酸结构类似物磺胺胍。
1.3溶液的配制
生理盐水：0.9g氯化钠+100ml蒸馏水，121灭菌20min。
0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH6.0)：1L缓冲液为123mL 0.1mol/L的Na2HPO4+877mL 0.1mol/L的NaH2PO4。
1.4精氨酸标准曲线的绘制
精确称取L-精氨酸标准品0.3333g，加少量蒸馏水溶解后定容至100ml，为3.3333μg/μL的精氨酸标准母液。分别吸1、2、3、4、5、6、7、5、9、10μl定容至1ml，所得溶液即为不同浓度的L-精氨酸标准溶液，分别为10、20、30、40、50、60、70、50、90、100μg/3mL，用以绘制标准曲线。所标准曲线见附图2。
1.5发酵液L-精氨酸含量的测定与计算
将发酵液5000rpm离心，沉淀菌体等固形物。上清液用蒸馏水适度稀释，使稀释液每3ml的L-精氨酸含量控制在可测线性范围10～100μg内，最好在测定误差较小的20～90μg之间。取稀释液3ml，对照管为蒸馏水3ml，依次加入0.5ml14％NaOH、1.5ml 4％标准显色液、1.0ml正丙醇，混合均匀后，40℃水浴10min，使显色反应进行完全。用自来水冷却后于室温25min测OD530值。
计算公式为：X＝A×n/(r×3×1000)
X，发酵液L-精氨酸浓度(mg/ml)；A，吸光度(OD530)；n，发酵液稀释倍数；r，回归系数。
2.一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZD2009的制备方法，其步骤是：
A、菌种种子生长曲线及最佳细胞悬液浓度的确定：
从完全平板培养基上接种菌种于装有40ml种子液的500ml三角瓶中，在培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h时，取0.1ml种子培养液，加入10mL的试管，用蒸馏水定溶，摇匀，用ND-1000分光光度计，光程562nm测OD值。如图1所示，培养4-14h为谷氨酸棒杆菌对数生长期。
取培养至对数后期培养12h的菌液10ml，离心弃去上清液，加入等体积的无菌生理盐水，充分震荡，然后对菌悬液进行梯度稀释，分别为100～10-9，将不同稀释度的菌悬液涂布在琼脂基本培养基平板(0.1ml/个皿)，每个稀释度3个，30℃培养48～72h观察菌落生长情况。选择菌液浓度为108～109个/mL培养菌液进行诱变。试验结果表明，最佳菌悬液浓度为10-6。
B、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变剂量确定：
用0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL不同剂量的1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍处理谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌。取6支1.5ml离心管。分别取经种子培养11h的种子培养液0.5mL至离心管中离心，弃去上清液，菌体用灭菌的磷酸缓冲液离心洗涤3次，然后各试管依次加入灭菌的磷酸缓冲液1、0.95、0.9、0.8、0.7、0.6mL，再依次加入1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍溶液0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mL，震荡摇匀，30℃保温10分钟。无菌水离心洗涤三次以终止诱变剂的作用。最后加入无菌水至0.5mL，震荡摇匀。每支离心管的菌悬液都作梯度稀释，到10-6，选择10-5、10-6涂布基础培养基平板，0.2mL/个皿，每个浓度3个。30℃培养72h，观察菌落，选择致死率{致死率＝(诱变前菌落数-诱变后菌落数)/诱变前菌落数)×100％}达到80％的1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍浓度为实验诱变剂量。表1所示，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变最佳剂量为0.4mg/mL。
表1不同诱变剂量1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌的致死率
| 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍浓度(mg/mL) | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 |
| 致死率(％) | 47.0 | 53.0 | 75.9 | 94.0 | 96.6 |
C、紫外诱变时间的确定：
取种子培养11h的菌液涂布于基础培养基(各成分质量分数(％)：葡萄糖1.0，硫酸胺((NH4)2SO4)0.3，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，三水磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.2，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，七水硫酸铁(FeSO4·7H2O)0.002，一水硫酸 锰(MnSO4·H2O)0.002，生物素50μg/L，硫胺素盐酸盐200μg/L，琼脂2.0，pH 7.0)上(0.1ml/个皿)，编号为1、2、3、4、5、6，分别在20W紫外灯下30cm处照射0s、5s、10s、20s、30s、40s、50s，于30℃培养2～3d，观察菌落生长情况，选择致死率为80％的时间为诱变时间。如表2所示，紫外诱变最佳时间为30～40S。
表2不同紫外诱变时间对对谷氨酸棒杆菌的致死率
| UV处理时间 | 5S | 10S | 20S | 30S | 40S | 50S | 60S |
| 致死率(％) | 20.8 | 45.8 | 54.2 | 83.3 | 83.3 | 87.5 | 95.8 |
D、谷氨酸棒杆菌对N-硝基-L-精氨酸甲酯的最低耐受浓度：
配制琼脂基本培养基(各成分质量分数(％)：葡萄糖1.0，硫酸胺((NH4)2SO4)0.3，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，三水磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.2，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，七水硫酸铁(FeSO4·7H2O)0.002，一水硫酸锰(MnSO4·H2O)0.002，生物素50μg/L，硫胺素盐酸盐200μg/L，琼脂2.0，pH 7.0，115℃灭菌20min)500ml，分装于6个100mL的小三角瓶中，每个三角瓶装50mL，编号为1、2、3、4、5、6，在1、2、3、4、5、6中依次加入0g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g N-硝基-L-精氨酸甲酯，混合均匀后倒板，制成含0.2％、0.4％、0.6％、0.8％N-硝基-L-精氨酸甲酯的梯度平板。将稀释至合适浓度的菌悬液涂布平板(0.1ml/个培养皿)，30℃培养72h后观察菌落的生长，刚好没长菌的AE浓度为结构类似物最低浓度。表3所示，谷氨酸棒杆菌对N-硝基-L-精氨酸甲酯的耐受力为0.4％。
表3谷氨酸棒杆菌对N-硝基-L-精氨酸甲酯的耐受力
| AE(mg/mL) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 |
| DSM1412 | ++ | +- | -- | -- | -- |
E、紫外线和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变：
(1)紫外线诱变(钱和，郝刚.精氨酸产生菌诱变育种的研究.微生物学通报.2005，32(3)：46-49)：取谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)DSM1412培养12h种子液5ml，用高速离心机5000rpm离心5min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤，菌种用玻璃珠打散，获得细胞悬液，在20w紫外灯下50cm处照射30～40S，将经过诱变的菌液涂布在含浓度为4mg/mLAE的基本培养基平板上，30℃培养7～8d，然后挑选长出的较大菌落为N-硝基-L-精氨酸甲酯(购自Sigma公司产品)的变异菌株。筛选出的菌落再经斜面培养、种子液培养、发酵摇瓶培 养，最后用坂口改良法(Rosenberg H，Ennor AH，Morrison JF.The estimation ofarginine.Journal of Chemistry，1956，63(1)：153-159)测定发酵液中的L-精氨酸含量，判定菌株的产酸水平。
(2)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变(钱和，郝刚.精氨酸产生菌诱变育种的研究.微生物学通报.2005，32(3)：46-49)：取谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicumDSM1412培养12h种子液5ml，用高速离心机5000rpm离心5min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤，菌种用玻璃珠打散，生理盐水洗涤后，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)洗涤2次，加入pH6.0的0.1mol/L磷酸缓冲液至6.5ml，然后加入浓度为0.4mg/mL1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍，30℃诱变15min，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)洗涤3次，除去1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍终止诱变。将经过诱变的菌液涂布在含浓度为4mg/mL N-硝基-L-精氨酸甲酯的基本培养基平板上，30℃培养7～8d，然后挑选长出的较大菌落为AE的变异菌株。筛选出的菌落再经斜面培养、种子液培养、发酵摇瓶培养，最后用坂口改良法测定发酵液中的L-精氨酸含量，判定菌株的产酸水平。
以Corynebacterium glutamicum DSM1412为出发菌株，经过8次紫外和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变，最后获得L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZD2009。其产酸量为31g/L。谷氨酸棒杆菌已保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2009年11月11日，保藏编号：CCTCC NO：M209260，分类命名：Corynebacterium glutamicum ZD2009。
F、遗传稳定性试验：
将L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZD2009连续接种八代，摇瓶发酵考察产酸稳定性。如表4所示，遗传稳定性较好。
表4Corynebacterium glutamicum ZD2009遗传稳定性
| 传代次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 产酸量(g/mL) | 29 | 32 | 31 | 28 | 30 | 32 | 31 | 29 |
G、摇瓶发酵条件的优化：
1、种子培养基优化及结果：
种子培养基各成分质量分数(％)：葡萄糖3.0，玉米浆2.0，硫酸胺 ((NH4)2SO4)2.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，尿素0.15，pH 7.0。
采用三因素三水平L9(33)实验设计(三因素三水平，共九个实验组，记为L9(33))：因素A为葡萄糖，设2％，3％，4％三水平；因素B为玉米浆，设1％，2％，3％三水平；因素C为硫酸胺((NH4)2SO4)，设1％，2％，3％三水平。其他因素(磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1％，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％，尿素0.15％，pH 7.0)保持不变。如表5所示，种子优化培养基各成分质量分数(％)：葡萄糖4.0，玉米浆2.0，硫酸胺((NH4)2SO4)3.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，尿素0.15，pH 7.0。
表5种子培养基优化实验结果
| 实验号 | A | B | C | L-Arg(g/L) |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 27.3 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 30.3 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 28.7 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 29.3 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 29.0 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 30.0 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 32.0 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 24.0 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 31.0 |
| K1 | 28.8 | 29.5 | 27.1 | |
| K2 | 29.4 | 27.8 | 30.2 | |
| K3 | 29.0 | 29.9 | 29.9 | |
| R | 0.6 | 2.1 | 3.1 |
2、发酵培养基及接种量的优化：
摇瓶发酵培养基各成分质量分数(％)：葡萄糖12.0，玉米浆2.5，硫酸胺((NH4)2SO4)4.5，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，碳酸钙(CaCO3)3.0，pH 7.0。
采用七因素三水平L18(37)实验设计(七因素三水平，共十八个实验组，记为 L18(37))：因素A为葡萄糖，设9％，12％，15％三水平；因素B为玉米浆，设2％，2.5％，3％三水平；因素C为硫酸胺((NH4)2SO4)，设3％，4.5％，6％三水平；因素D为磷酸二氢钾(KH2PO4)，设0.05％，0.1％，0.15％三水平，因素E为七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)，设0.03％，0.05％，0.07％三水平，因素F为碳酸钙(CaCO3)，设2％，3％，4％三水平；因素G为接种量设6％，8％，10％三水平。如表6所示，优化发酵培养基各成分质量分数(％)：葡萄糖12，玉米浆2.5，硫酸胺((NH4)2SO4)6.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.05，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，碳酸钙(CaCO3)2.0，pH 7.0。优化的接种量为10％。
表6发酵培养基及接种量的优化实验结果
| 实验号 | A | B | C | D | E | F | G | L-Arg(g/L) |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 26.7 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 13.3 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 30.7 |
| 4 | 2 | 1 | 1 | 2 | 2 | 3 | 3 | 16.0 |
| 5 | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | 1 | 1 | 20.0 |
| 6 | 2 | 3 | 3 | 1 | 1 | 2 | 2 | 28.3 |
| 7 | 3 | 1 | 2 | 1 | 3 | 2 | 3 | 14.3 |
| 8 | 3 | 2 | 3 | 2 | 1 | 3 | 1 | 23.3 |
| 9 | 3 | 3 | 1 | 3 | 2 | 1 | 2 | 24.0 |
| 10 | 1 | 1 | 3 | 3 | 2 | 2 | 1 | 22.0 |
| 11 | 1 | 2 | 1 | 1 | 3 | 3 | 2 | 25.0 |
| 12 | 1 | 3 | 2 | 2 | 1 | 1 | 3 | 25.0 |
| 13 | 2 | 1 | 2 | 3 | 1 | 3 | 2 | 19.0 |
| 14 | 2 | 2 | 3 | 1 | 2 | 1 | 3 | 31.7 |
| 15 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 2 | 1 | 23.0 |
| 16 | 3 | 1 | 3 | 2 | 3 | 1 | 2 | 15.3 |
| 17 | 3 | 2 | 1 | 3 | 1 | 2 | 3 | 13.7 |
| 18 | 3 | 3 | 2 | 1 | 2 | 3 | 1 | 19.3 |
| K1 | 24.0 | 18.9 | 21.4 | 24.2 | 22.7 | 23.8 | 22.4 |
[0083]
| K2 | 23.0 | 21.2 | 18.5 | 19.3 | 21.1 | 19.1 | 20.8 | |
| K3 | 18.3 | 25.2 | 25.4 | 21.7 | 21.6 | 22.4 | 22.1 | |
| R | 5.7 | 6.3 | 6.9 | 4.9 | 1.6 | 4.7 | 1.6 |
3、最佳pH值确定：
通过设置5个发酵培养基pH值梯度：6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，测定不同pH对细菌产酸的影响。如图3所示，发酵培养基pH值7.0时，产精氨酸量最高。
4、最佳装液量确定：
通过设置4个梯度的发酵装液量(100mL锥形瓶)：5ml，10ml，15ml，20ml，测定不同装液量对细菌产酸的影响。如图4所示，15％装液量(15mL/100mL)产酸量最高。
5、最优条件验证：
采用优化的种子培养基(各成分质量分数(％)：葡萄糖3.0，玉米浆2.0，硫酸胺((NH4)2SO4)2.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，尿素0.15，pH 7.0)、优化的发酵培养基(各成分质量分数(％)：葡萄糖12，玉米浆2.5，硫酸胺((NH4)2SO4)6.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.05，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，碳酸钙(CaCO3)2.0，pH 7.0)及优化的接种量(10％)，最佳发酵培养基pH值(7.0)和最佳发酵装液量(15％)进行验证试验。如表7所示，平均产酸为44g/L。
表7最优条件验证试验结果
| 实验组 | L-Arg(g/L) |
| 1 | 45.7 |
| 2 | 44.3 |
| 3 | 43.0 |
| 4 | 44.7 |
| 5 | 42.3 |
一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZD2009具体应用过程是：
1、发酵液中L-精氨酸的分离：
根据附图5所示分离流程对发酵液中L-精氨酸进行分离。具体过程如下：
a.絮凝法发酵液预处理
在发酵液中加入过量草酸以沉淀Ca2+，在60℃下加热10min沉淀蛋白质，静置。取调好pH值的发酵液50mL，在快速搅拌下缓慢加入絮凝剂，使其完全混合均匀，然后慢速搅拌，絮凝反应结束后移至50mL量筒中，静置并观察菌体沉降过程，1h后取上清液，用分光光度计以蒸馏水作空白于650nm处测定吸光度值，算出絮凝率RF值(flocculation ratio)。RF值定义如下：RF＝(OD絮凝前-OD絮凝后)/OD絮凝前×100％(RF值越大，说明絮凝效果越好)。
732#离子交换树脂树脂预处理：树脂→去离子水浸泡搅拌洗涤2到3次(洗去大量泡沫)→乙醇浸泡以除去吸附的少量有机物质→2mol/L氢氧化钠(NaOH)浸泡→水洗至中性→2mol/L盐酸(HCl)浸泡→水洗至中性→2mol/L氢氧化钠(NaOH)浸泡→水洗至中性→2mol/L盐酸(HCl)浸泡→水洗至中性→1mol/L氨水浸泡→水洗至中性，最后浸泡于去离子水中备用。
b.固定床离子交换
先将一定的去离子水装于玻璃柱中(与柱顶齐平)，将管底夹子打开，排除气泡后，树脂悬浮液由柱顶部慢慢加入。装柱时要防止“节”和气泡的产生。“节”是指柱内产生明显的分界线，这是由于装柱不均匀造成树脂时松时紧。要做到均匀装柱，柱内要有一定高度的水面，树脂要与水混合倾入，借助水的浮力使树脂自然沉降，操作尽可能均匀连续。
将已经过预处理的发酵液，调pH值至2.0，用恒流泵控制一定的流速用正上柱的方式输送到柱子中，同时用分部收集器对流出液分部收集测定其中的L-精氨酸含量。
上柱完毕后，以1～2倍上柱液体积的水洗柱，以除去不吸附的大量杂质。配制一定浓度的洗脱剂，以一定的流速输送到柱子中，使吸附在树脂上的氨基酸按一定的顺序洗脱下来，对洗脱液进行分部收集。
c活性炭脱色
往调好pH值的待脱色液中加入10g/L的活性炭，在80℃下，搅拌脱色60min，过滤，测定滤液的吸光度值，计算出脱色率。采用分光光度计，以蒸馏水为空白液，在400nm下测定脱色前后溶液的吸光度值。脱色率(％)＝(OD脱色前-OD脱色后)/OD脱色前×100％(脱色率越大，脱色效果越好)。
2、L-精氨酸在断奶仔猪上的应用：
购买60头21日龄的健康二元杂交(长白×大约克)断奶去势仔猪(5.42±0.59kg)，按处理随机分为4组，每个处理15头，单栏饲养(一栏一头，南北两列均匀分布)。试验采用单因素完全随机分组试验设计，分为4个处理：0％精氨酸，0.4％精氨酸，0.6％精氨酸，0.8％精氨酸，试期为21天。如表8表明，日粮中添加0.8％L-精氨酸能提高断奶仔猪平均日增重和平均日采食量，降低料肉比。如图5表明，日粮中添加0.8％L-精氨酸可以通过提高断奶仔猪肌肉中有利于蛋白质翻译的起始因子活性，从而促进断奶仔猪肌肉蛋白质合成，达到促进断奶仔猪生长的营养效果。
表8精氨酸对21日断奶仔猪生产性能的影响
| 0％精氨酸 | 0.4％精氨酸 | 0.6％精氨酸 | 0.8％精氨酸 | SEM | P | |
| 初重(kg) | 5.39a | 5.42a | 5.44a | 5.38a | 0.15 | 0.993 |
| 末重(kg) | 10.3b | 10.5b | 11.5a | 11.6a | 0.28 | 0.002 |
| 平均日 增重(g) | 233b | 239b | 289a | 292a | 10.0 | ＜0.001 |
| 平均日采 食量(g) | 428b | 416b | 499a | 506a | 14.5 | ＜0.001 |
| 料肉比F/G | 1.85a | 1.75a | 1.74a | 1.72a | 0.04 | 0.214 |
Claims (3)
1.一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌，其特征在于：L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ZD2009，CCTCC NO：M209260。
2.权利要求1所述的一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌的制备方法，其步骤是：
(1)紫外线诱变：取谷氨酸棒杆菌培养12h种子液5ml，用高速离心机5000rpm离心5min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤，菌种用玻璃珠打散，得菌悬液，在20w紫外灯下50cm处照射30～40s，将经过诱变的菌液涂布在含浓度为4mg/mLAE的基本培养基平板上，30℃培养7～8d，挑选长出的菌落为N-硝基-L-精氨酸甲酯的变异菌株，筛选出的菌落再经斜面培养、种子液培养、发酵摇瓶培养，最后用坂口改良法测定发酵液中的L-精氨酸含量；
(2)1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变：取谷氨酸棒杆菌培养12h种子液5ml，用高速离心机5000rpm离心5min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤，菌种用玻璃珠打散，生理盐水洗涤后，用0.1mol/L磷酸缓冲液pH 6.0洗涤2次，加入0.1mol/L磷酸缓冲液pH 6.0至6.5ml，加入浓度为0.4mg/mL1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍，30℃诱变15min，用0.1mol/L磷酸缓冲液pH 6.0洗涤3次，除去1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍终止诱变，将经过诱变的菌液涂布在含浓度为4mg/mL AE的基本培养基平板上，30℃培养7～8d，挑菌落，筛选出的菌落再经斜面培养、种子液培养、发酵摇瓶培养，用坂口改良法测定发酵液中的L-精氨酸含量；
(3)摇瓶发酵条件：种子培养基各成分质量分数％：葡萄糖3.0，玉米浆2.0，硫酸胺((NH4)2SO4)2.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，尿素0.15，pH 7.0，采用三因素三水平L9(33)实验设计，三因素三水平，共九个实验组，记为L9(33)：因素1为葡萄糖，设2％，3％，4％三水平；因素2为玉米浆，设1％，2％，3％三水平；因素3为硫酸胺((NH4)2SO4)，设1％，2％，3％三水平，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1％，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％，尿素0.15％，pH 7.0-7.2不变；
(4)发酵培养基及接种量：采用七因素三水平L18(37)实验设计，七因素三水平，共十八个实验组，记为L18(37)：因素1为葡萄糖，设9％，12％，15％三水平；因素2为玉米浆，设2％，2.5％，3％三水平；因素3为硫酸铵((NH4)2SO4)，设3％，4.5％，6％三水平；因素4为磷酸二氢钾(KH2PO4)，设0.05％，0.1％，0.15％三水平，因素5为七水硫酸镁(MgSO4.7H2O)，设0.03％，0.05％，0.07％三水平，因素6为碳酸钙(CaCO3)，设2％，3％，4％三水平；因素7为接种量设6％，8％，10％三水平；
(5)pH值确定：通过设置5个发酵培养基pH值梯度：6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，测定不同pH对细菌产酸的影响；
(6)装液量确定：通过设置4个梯度的发酵装液量，100mL锥形瓶：5ml，10ml，15ml，20ml，测定不同装液量对细菌产酸的影响；
(7)条件验证：采用种子培养基各成分质量分数％：葡萄糖3.0，玉米浆2.0，硫酸胺((NH4)2SO4)2.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，尿素0.15，pH 7.0；发酵培养基各成分质量分数％：葡萄糖12，玉米浆2.5，硫酸胺((NH4)2SO4)6.0，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.05，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05，碳酸钙(CaCO3)2.0，发酵培养基pH值7.0和发酵装液量15％进行验证试验。
3.权利要求1所述的一种L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌产生的L-精氨酸在断奶仔猪饲料中的应用。
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