CN109957518B

CN109957518B - 一株高产l-精氨酸菌株

Info

Publication number: CN109957518B
Application number: CN201711430988.5A
Authority: CN
Inventors: 杨晟; 蒋宇; 董枫
Original assignee: HUZHOU RESEARCH CENTER OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES CHINESE ACADEMY OF SCIENCES; Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: HUZHOU RESEARCH CENTER OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES; Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN109957518A

Abstract

本发明通过基因工程构建和诱变筛选得到了一种L‑精氨酸生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017760。本发明的L‑精氨酸生产菌通过发酵能够实现发酵液中L‑精氨酸的有效积累，L‑精氨酸产量高达10g/L以上，具有工业化前景。

Description

一株高产L-精氨酸菌株

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种高产L-精氨酸的基因工程生产菌。

背景技术

L-精氨酸(L-argnine，简称L-Arg)是人体内所需半必需碱性氨基酸之一，作为一种含有胍基的碱性氨基酸，是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物，具有多种独特的生理和药理作用，对于治疗生理功能、心血管疾病、激励免疫系统、维持婴儿的营养平衡、促进人体解毒等都具有良好的疗效，被专家称为是机体内运输和贮存氨基酸的重要载体，在肌内代谢中极为重要。它是合成胞浆蛋白和核蛋白的必需氨基酸；作为唯一的氨来源参与肌酸的合成；作为尿素循环的重要中间体，在肝脏中扮演着排除多余氨的角色，防止氨过量积累而引起中毒；它还具有调节人体免疫力的功能，可抑制肿瘤生长、促进受伤组织愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。因此，L-精氨酸在医药、食品及化工领域方面具有重要而广泛的应用。比如，在临床上，除作为复方氨基酸输液的主要组分之一外，L-精氨酸及其盐类还广泛用于治疗各类肝昏迷忌用谷氨酸钠者和病毒性肝类谷丙转氨酶异常者，对病毒性肝炎疗效显著。对肠道溃疡、血栓形成和神经衰弱等症都有治疗效果。另外，L-精氨酸是运动营养饮料配方的重要组成部分，也是一种重要的饲料添加剂，还广泛地应用于高端养殖业。据统计，目前全世界L-精氨酸需求量在15000吨以上，并且需求量以每年12％-15％的速度增长。

L-精氨酸的生产方法有两种：一是蛋白质水解提取法，二是微生物发酵法。水解法存在操作费时，收率和产量低，成本高等问题，并且存在严重的污染而不适合大规模的生产。发酵法生产L-精氨酸工艺相对简单，且对环境友好，因此具有很大的发展潜力，成为国内外氨基酸工业的一个重要趋势。国际上著名的氨基酸公司比如日本味之素、协和发酵和德国迪高沙主要采用生物发酵和基因工程技术进行L-精氨酸生产。但是，国内的微生物发酵生产L-精氨酸的产酸水平普遍较低，成本较高，生产水平和产量远远不能满足国内需求，因此提高L-精氨酸发酵水平的研究具有重要的意义。

L-精氨酸的发酵菌种研究得较多的主要有谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等，但目前用来生产L-精氨酸的微生物菌株主要是谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌。基因工程技术对于精氨酸高产菌选育具有重要的推动作用，利用基因工程构建L-精氨酸高产菌株是一种高效率、理性化的育种手段，但构建筛选出适合于工业规模生产的高产重组菌始终是一种迫切的需求。

发明内容

为了克服现有L-精氨酸生产菌株发酵水平低的缺陷，本发明利用基因工程技术来改造谷氨酸棒杆菌，通过增强与L-精氨酸产生相关的基因、弱化分支代谢途径，并进行诱变筛选，获得一株高产L-精氨酸的生产菌株。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种L-精氨酸生产菌。

本发明的第二个目的在于提供所述L-精氨酸生产菌用于生产L-精氨酸的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种生产L-精氨酸的方法。

为了达到上述目的，本发明对于谷氨酸棒杆菌中与L-精氨酸代谢途径相关的基因进行了系统的研究和筛选，并且设计出包括如下步骤的基因工程菌构建和紫外诱变筛选方案：

A.敲除作为原始菌株的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株；

B.对步骤A中所述基因敲除菌株的基因组中argB基因进行改造，获得基因突变菌株；

C.对步骤B中所述基因突变菌株进行紫外诱变，筛选出L-精氨酸表达水平明显提高的L-精氨酸生产菌。

通过上述基因工程构建和紫外诱变，筛选出一种高产L-精氨酸的菌株，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017760。

根据本发明的第二个方面，提供了上述基因工程菌CCTCC NO:M 2017760在L-精氨酸的生产中的应用。

在一种实施方式中，通过对上述L-精氨酸生产菌进行发酵来生产L-精氨酸。

其中，发酵时所用的培养基可以是任何适用于谷氨酸棒杆菌生长发酵的培养基。

根据本发明的优选实施例，发酵培养基组成如下：60g/L葡萄糖，5g/L玉米浆，30g/L(NH₄)₂SO₄，8g/L KCl，2g/L尿素，0.5g/L KH₂PO₄，0.5g/L K₂HPO₄，1g/L MgSO₄·7H₂O，1g/LNaCl，20mg/L FeSO₄·7H₂O，10mg/L MnSO₄·5H₂O，20mg/L尼克酸，20mg/Lβ-丙氨酸，10mg/LVB1，0.2mg/L生物素，30g/L CaCO₃，KOH调PH＝7.7。

在一种优选的实施方式中，上述L-精氨酸生产菌进行发酵时包括种子培养阶段和菌体发酵阶段。这两个阶段分别使用种子培养基和发酵培养基，发酵培养基可以与种子培养基相同，也可以不相同。

优选地，当发酵培养基与种子培养基不相同时，种子培养基组成如下：3g/L NaCl，5g/L酵母提取物，7g/L牛肉浸膏，10g/L蛋白胨，10g/L葡萄糖。

本发明所构建的L-精氨酸生产菌通过发酵能够实现发酵液中L-精氨酸的有效积累，L-精氨酸产量高达10g/L以上，比原始菌株提高了至少37.5倍，具有工业化应用前景。

本发明构建的L-精氨酸高产基因工程菌的拉丁学名是Corynebacteriumglutamicum CIBTS1732，中文名称是谷氨酸棒杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2017年12月04日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017760。

附图说明

图1为质粒pK18mobsacB的示意图，该质粒由中国科学院微生物研究所刘双江馈赠。

图2为本发明构建的重组质粒pK18mobsacB-argR的示意图。

图3为本发明构建的重组质粒pK18mobsacB-argBmut的示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

在本文中，对于本发明，术语“L-精氨酸基因工程生产菌”、“L-精氨酸基因工程菌”、“L-精氨酸生产菌”、“谷氨酸棒杆菌CIBTS1732”、“CIBTS1732菌株”表示相同的意义，都是指L-精氨酸生产菌CCTCC NO:M 2017760。

在本文中，术语“谷氨酸棒杆菌ATCC13032”、“菌株ATCC13032”、“ATCC13032”表示相同的意义，都是指作为基因工程菌的原始菌株ATCC13032，购买自上海工业微生物研究所。

基因argR是一个在细菌中普遍存在的精氨酸操纵子调节基因，在不同的细菌中有不同的功能，发明人研究发现，通过敲除谷氨酸棒杆菌基因组中的这一负调控基因，可一定程度上解除其对精氨酸合成的抑制。

N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamatekinase)催化N-乙酰谷氨酸合成N-乙酰谷氨酰磷酸，并受到终产物L-精氨酸的反馈抑制。发明人研究发现，通过对N-乙酰谷氨酸激酶进行突变，将第26位的丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)、第31位的蛋氨酸(M)突变为缬氨酸(V)，可以有效地提高谷氨酸棒杆菌ATCC13032中L-精氨酸的合成能力。在本文中，将该N-乙酰谷氨酸激酶基因argB的突变基因简写为argBmut或argBmut(A26V M31V)。

本发明在敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因后，获得敲除argR基因菌株，命名为CIBTS1424；然后，CIBTS1424菌株的基因组中argB基因进行改造，获得argB基因突变菌株，命名为CIBTS1426。实验发现，CIBTS1426菌株的L-精氨酸产量高达4.4g/L以上，比原始菌株ATCC13032提高了至少14倍，验证了本发明的基因工程设计思想的正确性。

为了进一步提高CIBTS1426菌株的L-精氨酸生产能力，发明人设计了将基因工程技术与传统菌种改良技术融合在一起的新思路。众所周知，诱变育种是微生物改良常用的和有效的手段，人工诱变改良菌种的方法至今仍不失为选育高产菌的有效手段，目前使用的诱变剂基本上可分为物理诱变因子(如紫外线、X射线、快中子等)、化学诱变剂(如氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍等)和生物诱变因子(如噬菌体)三大类，它们都能够提高生物体突变频率，同时又造成生物体的大量死亡。发明人采用紫外线诱变形式对CIBTS1426菌株进行诱变处理，得到了L-精氨酸产量进一步明显提高的变异菌株，命名为CIBTS1732。

实施例

材料和方法

本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

主要培养基及缓冲液：

LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。

LB固体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂粉。

BHIS液体培养基：37g/L BHI，91g/L山梨醇。

BHIS固体培养基：37g/L BHI，91g/L山梨醇，20g/L琼脂粉。

BHIS-suc固体培养基：37g/LBHI，91g/L山梨醇，200g/L蔗糖，10g/L葡萄糖。

BYG培养基：3g/L NaCl，5g/L酵母提取物，7g/L牛肉浸膏，10g/L蛋白胨，10g/L葡萄糖。

RG2培养基：60g/L葡萄糖，5g/L玉米浆，30g/L(NH₄)₂SO₄，8g/L KCl，2g/L尿素，0.5g/L KH₂PO₄，0.5g/L K₂HPO₄，1g/L MgSO₄·7H₂O，1g/L NaCl，20mg/L FeSO₄·7H₂O，10mg/LMnSO₄·5H₂O，20mg/L尼克酸，20mg/Lβ-丙氨酸，10mg/L VB1，0.2mg/L生物素，30g/L CaCO₃，KOH调PH＝7.7。

CGM基本培养基：10g/L葡萄糖，1g/L蛋白胨，10g/L NH₄(SO₄)₂，1g/L KH₂PO₄，2g/L尿素，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.1mg/L生物素，0.1mg/L VB1，10mg/L FeSO₄·7H₂O，10mg/LMnSO₄·5H₂O，KOH调PH＝7.2。

20X电转母液：80g/L甘氨酸，2％吐温80。

以下实施例中，当使用含卡那霉素的培养基时，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml。

以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示。

表1、引物序列

表1中，名称中的“-F”代表正向；“-R”代表反向。

实施例1：敲除argR基因的菌株ATCC13032(ΔargR)的制备

1.1 ATCC13032基因组抽提：接少量ATCC13032甘油菌(购买自上海工业微生物研究所)到BHIS试管，恒温摇床上30℃，220rpm培养18小时，12000rpm离心收集菌体，使用Axygen细菌基因组小量抽提试剂盒抽提ATCC13032基因组。

1.2敲除质粒pK18mobsacB-argR的构建

1.2.1以步骤1.1中抽提的ATCC13032基因组为模板，使用引物argR-aL-F和argR-aL-R进行PCR扩增argR-aL片段，PCR体系如下(以下PCR试剂购买自东洋纺TOYOBO的KOD系列)：KOD Buffer 5μl，dNTP 5μl，MgSO₄ 4μl，引物argR-aL-F 0.5μl，引物argR-aL-R 0.5μl，KOD Plus Neo 1μl，模板0.4μl，ddH₂O补足50μl。PCR程序为99℃热盖，95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸60s；35个循环，最后68℃延伸10min；16℃降温10min。扩增得到约1Kb片段，胶回收目的片段。

1.2.2以步骤1.1中抽提的ATCC13032基因组为模板，使用引物argR-aR-F和argR-aR-R按照步骤1.2.1相同的PCR条件扩增argR-aR片段，约1Kb，胶回收目的片段。

1.2.3使用Axygen的质粒抽提试剂盒抽提质粒pK18mobsacB(由中国科学院微生物研究所刘双江馈赠，其结构如图1所示)，使用HindIII和EcoRI酶切质粒，胶回收，得到5.7Kb载体片段。

1.2.4 Gibson连接以上片段，转化DH5α感受态细胞(购买自南京诺唯赞生物科技有限公司的商品化感受态细胞)，涂布卡那霉素LB平板，过夜培养。

1.2.5使用引物argR-aL-F和argR-aR-R进行PCR扩增验证转化子，PCR体系如下(以下PCR试剂购买自东洋纺TOYOBO的KOD系列)：KOD Buffer 2μl，dNTP 2μl，MgSO₄ 1.6μl，引物argR-aL-F 0.4μl，引物argR-aR-R 0.4μl，KOD Plus Neo 0.4μl，模板为菌体，ddH₂O补足20μl。PCR程序为99℃热盖，95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸120s；35个循环，最后68℃延伸10min；16℃降温10min。阳性条带约为2Kb。阳性转化子接LB液体试管，使用Axygen的质粒抽提试剂盒抽提质粒测序，得到正确质粒pK18mobsacB-argR，其结构如图2所示。

1.3制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞：

挑取谷氨酸棒状杆菌ATTC13032在BHIS平板上划线，30℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单菌落到BHIS试管培养基中，在30℃，220rpm的过夜培养。接种1ml菌液到100ml的BHIS液体培养基摇瓶中，恒温摇床上30℃，220rpm培养4-6h至OD₆₀₀值达到1.0左右。在超净工作台上，将菌液全部转移至50ml离心管中，4℃，4500×g离心，弃上清，用10％甘油洗涤菌体，使菌体重悬，4℃，4500×g离心，重复洗涤1遍，弃上清。最后加入600μl的10％甘油，使菌体悬浮，分装到1.5ml离心管中，每90μl制备为一支感受态细胞，感受态细胞可放置在-80℃冰箱中保存。

1.4 pK18mobsacB-argR电转化ATCC13032感受态细胞：

选取测序正确的质粒，吸取3μl(1μg以上)到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，在25uF,2.5kV,200Ω的条件下进行电击，电击时间为5.6ms，电击后立即转入900μl 46℃预热的BHIS液体培养基中，并在46℃水浴锅中水浴6min，然后置于恒温摇床中30℃，220rpm培养1h，使菌体复苏。复苏之后取50μl菌体涂布在含卡那霉素的BHIS平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。

1.5SacB蔗糖反筛：

挑取含卡那霉素的BHIS平板上的转化子，接种到无抗性的BHIS试管培养基中，在恒温摇床中30℃，220rpm培养24h，使其发生双交换。将菌体稀释1000倍后涂布在含20％蔗糖的BHIS-suc平板上，倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取BHIS-suc平板转化子，分别点板BHIS平板和含卡那霉素的BHIS平板，倒置在30℃恒温培养箱中培养24小时。使用引物argR-aL-F和argR-aR-R进行PCR扩增验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，PCR扩增条件同步骤1.2.5，argR基因成功敲除的阳性条带约为2Kb，阴性条带为2.5K。挑取阳性转化子到4ml的BHIS试管培养基中，在恒温摇床上30℃，220rpm培养24小时，使用20％甘油保菌。

得到了基因型为ATCC13032(ΔargR)的菌株，命名为CIBTS1424。

实施例2：突变argB基因的菌株ATCC13032(ΔargRargBmut(A26V M31V)的制备

2.1突变质粒pK18mobsacB-argBmut的构建：

2.1.1以步骤1.1中抽提的ATCC13032基因组为模板，使用引物argB-aL-F和argB-aL-R按照步骤1.2.1相同的PCR条件扩增argB-aL片段，约1Kb，胶回收目的片段。

2.1.2以步骤1.1中抽提的ATCC13032基因组为模板，使用引物argB-aR-F和argB-aR-R按照步骤1.2.1相同的PCR条件扩增argB-aR片段，约1Kb，胶回收目的片段。

2.1.3使用Axygen的质粒抽提试剂盒抽提质粒pK18mobsacB(由中国科学院微生物研究所刘双江馈赠，其结构如图1所示)，使用HindIII和EcoRI酶切质粒，胶回收，得到5.7Kb载体片段。

2.1.4Gibson连接以上片段，转化DH5α感受态细胞(购买自南京诺唯赞生物科技有限公司的商品化感受态细胞)，涂布卡那霉素LB平板，过夜培养。

2.1.5使用引物argB-aL-F和argB-aR-R按照步骤1.2.5相同的PCR条件扩增验证转化子，阳性条带约为2Kb。阳性转化子接LB液体试管，抽提质粒测序，得到正确质粒pK18mobsacB-argBmut，其结构如图3所示。

2.2制备谷氨酸棒状杆菌CIBTS1424感受态细胞：

挑取谷氨酸棒状杆菌CIBTS1424在BHIS平板上划线，30℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单菌落到BHIS试管培养基中，在30℃，220rpm的过夜培养。接种1ml菌液到100ml的BHIS液体培养基摇瓶中，恒温摇床上30℃，220rpm培养4-6h至OD₆₀₀值达到1.0左右。在超净工作台上，将菌液全部转移至50ml离心管中，4℃，4500×g离心，弃上清，用10％甘油洗涤菌体，使菌体重悬，4℃，4500×g离心，重复洗涤1遍，弃上清。最后加入600μl的10％甘油，使菌体悬浮，分装到1.5ml离心管中，每90μl制备为一支感受态细胞，感受态细胞可放置在-80℃冰箱中保存。

2.3 pK18mobsacB-argBmut电转化CIBTS1424感受态细胞：

选取测序正确的质粒，吸取3μl(1μg以上)到谷氨酸棒状杆菌CIBTS1424感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，在25uF,2.5kV,200Ω的条件下进行电击，电击时间为5.6ms，电击后立即转入900μl 46℃预热的BHIS液体培养基中，并在46℃水浴锅中水浴6min，然后置于恒温摇床中30℃，220rpm培养1h，使菌体复苏。复苏之后取50μl菌体涂布在含卡那霉素的BHIS平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。

2.4 SacB蔗糖反筛：

挑取含卡那霉素的BHIS平板上的转化子，接种到无抗性的BHIS试管培养基中，在恒温摇床中30℃，220rpm培养24h，使其发生双交换。将菌体稀释1000倍后涂布在含20％蔗糖的BHIS-suc平板上，倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取BHIS-suc平板转化子，分别点板BHIS平板和含卡那霉素的BHIS平板，倒置在30℃恒温培养箱中培养24小时。使用引物argB-aL-F和argB-aR-R进行PCR扩增验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，PCR扩增条件同步骤1.2.5，得到条带约为2Kb，对PCR产物进行测序得到argB成功突变的转化子。挑取阳性转化子到4ml的BHIS试管培养基中，在恒温摇床上30℃，220rpm培养24小时，使用20％甘油保菌。

得到基因型为ATCC13032(ΔargRargBmut(A26V M31V)的菌株，命名为CIBTS1426。

实施例3：紫外诱变和筛选

3.1菌悬液制备：菌种CIBTS1426接CGM摇瓶培养基，恒温摇床上30℃，220rpm培养至对数生长期(OD₆₀₀值约1-2)。震荡分散菌液，得到的菌液用于下面紫外诱变。

3.2紫外诱变(以下操作均需避光)：

3.2.1紫外灯预热20分钟，将菌悬液加入到9cm培养皿中，每个培养皿加入5ml，放在轨道式振荡器上，让菌液充分摇起来。在紫外灯下垂直距离30cm左右照射，照射时间分别为0s，30s，60s，90s，120s，180s。

3.2.2涂布：菌液分别稀释1000倍、10000倍、1000000倍，三个梯度涂CGM板，每个稀释梯度3个平行板，每个平板中加入100μl菌液涂板。

3.2.3培养：涂好后的平板用2-3层黑色垃圾袋包裹，放进纸箱避光30℃培养。

3.2.4致死率：培养后的平板在无菌室进行菌落数计数，计算致死率，保存好平板菌落(用于后续筛选)。结果见表2。

表2、紫外诱变致死率统计

照射时间	30s	60s	90s	120s	180s
						致死率	50％	90％	>99％	>99％	>99％

3.3筛选：选择致死率在90％即紫外照射60s的平板，挑取板上单菌落，发酵筛选高产L-精氨酸的转化子，具体发酵方案和产量测定方法见实施例4。

筛选得到了一株L-精氨酸产量是菌株CIBTS1426两倍多的突变菌株，命名为菌株CIBTS1732。

实施例4：产精氨酸菌株发酵及产量测定

4.1菌株摇瓶发酵

4.1.1活化：从菌种甘油管划线至平板BHIG，30℃度培养2天左右。

4.1.2种子培养：BYG培养基配制混匀后分装10ml/瓶至250ml摇瓶中，用接种环挖取步骤4.1.1中活化的单菌落接种于种瓶中，30℃，220rpm培养24h。

4.1.3摇瓶发酵：RG2培养基配制混匀分装45ml/瓶至500ml单挡板摇瓶(预装有1.5g碳酸钙)中，接种5ml以上的步骤4.1.2中的种子液至RG2摇瓶中，30℃，220rpm培养约48h-72h，直至葡萄糖耗尽。发酵液高速离心，取上清，稀释50倍，HPLC检测精氨酸产量。

4.2高效液相色谱HPLC测定精氨酸含量

4.2.1方法：使用OPA柱前衍生氨基酸分析法来测定发酵液中L-精氨酸含量。一级氨基酸在巯基试剂存在下与邻苯二醛(OPA)反应生成OPA-氨基酸，生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分离后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。

4.2.2衍生剂和流动相配制

硼酸缓冲液：0.4M硼酸缓冲液，准确称取6.183g硼酸，溶于超纯水中，用10N NaOH溶液调至pH 10.2，定容至250ml容量瓶中。

衍生剂：准确称取500mg邻苯二甲醛(OPA)固体，加5ml无水乙醇，加500μl巯基丙酸，用0.4M、pH 10.2的硼酸缓冲液定容至50ml。

流动相A：40mM NaH₂PO₄溶液，准确称取5.5g NaH₂PO₄·H₂O，溶于超纯水，用10NNaOH溶液调至pH 7.8，定容至1L，0.22μm滤膜过滤后备用。

流动相B：ACN:MeOH:H₂O＝45:45:10，定容1L备用，试剂纯度为HPLC级。

4.2.3高效液相色谱测定条件：

色谱柱：ZORBAX Eclipse-AAA4.6x 75mm，3.5μm；流速：1.2ml/min；停止时间：14min；柱温：40度；DAD设置：UV 338nm，10nm(带宽)，参比390nm，20nm(带宽)。

洗脱程序如表3所示。

表3、HPLC洗脱程序

时间(min)	B％	流速(ml/min)
			0	5	1.2
1.0	5	1.2
			9.8	57	1.2
10	100	1.2
			12	100	1.2
12.5	5	1.2
			14	5	1.2

自动进样器分别取0.5μl样品，2.5μl硼酸缓冲液，0.5μl衍生剂，32μl超纯水，混合衍生后进样，精氨酸出峰时间为7.9分钟。根据峰面积对比标样，即可得到样品中L-精氨酸含量。

4.3菌株发酵的L-精氨酸产量：

根据步骤4.1中的发酵方案和步骤4.2中的测定方法，比较各菌株的L-精氨酸发酵产量，每个菌株做3个平行实验，结果如表4所示。

表4、菌株发酵的L-精氨酸水平比较

由表4可见，诱变菌株CIBTS1732的L-精氨酸产量高达10g/L以上，是基因工程菌株CIBTS1426的2.4倍多，更比原始菌株ATCC13032提高了至少37.5倍。基因工程菌CIBTS1426的精氨酸产量比原始菌株ATCC13032提高了约15倍，也验证了本发明的构建思路正确。本发明经构建、并经诱变得到的L-精氨酸生产菌CIBTS1732能够实现发酵液中L-精氨酸的高浓度积累，具有工业化应用前景。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心

<120> 一株高产L-精氨酸菌株

<130> SHPI1711465

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

acaatttcac acaggaaaca gctatgacat gattacggac ttcacaacca caggttcgc 59

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gcgattaaca agccttgaac taggggcgct gtcttacctc ggctggttgg ccag 54

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gtggctgctg gccaaccagc cgaggtaaga cagcgcccct agttcaaggc ttg 53

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagagcac gagacggtcc tcaaccatg 59

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

acaatttcac acaggaaaca gctatgacat gattacggtg acaatggtgc agctgctgc 59

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

cacggtgcgc aagaagacca cgtcggcagc aaaaacagcc ttgagatcat catccac 57

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gatgatgatc tcaaggctgt ttttgctgcc gacgtggtct tcttgcgcac cgtgggc 57

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggtg gcccaacgcg ttgactgcg 59

Claims

1.一种L-精氨酸生产菌，其为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017760。

2.如权利要求1所述L-精氨酸生产菌用于生产L-精氨酸的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过如权利要求1所述L-精氨酸生产菌的发酵来生产L-精氨酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成如下：60g/L葡萄糖，5g/L玉米浆，30g/L(NH₄)₂SO₄，8g/L KCl，2g/L尿素，0.5g/L KH₂PO₄，0.5g/L K₂HPO₄，1g/L MgSO₄·7H₂O，1g/L NaCl，20mg/L FeSO₄·7H₂O，10mg/L MnSO₄·5H₂O，20mg/L尼克酸，20mg/Lβ-丙氨酸，10mg/L VB1，0.2mg/L生物素，30g/L CaCO₃，KOH调PH＝7.7。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，种子培养基组成如下：3g/L NaCl，5g/L酵母提取物，7g/L牛肉浸膏，10g/L蛋白胨，10g/L葡萄糖。