CN113896784A - 一种胰岛素结晶的制备方法及其产品 - Google Patents
一种胰岛素结晶的制备方法及其产品 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于蛋白质晶体技术领域，涉及一种胰岛素结晶的制备方法及其产品。具体而言，该方法包括以下步骤：1)将胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质和水以及任选的有机溶剂混合，得到结晶液；2)采用pH调节剂调节结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶；其中：胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(4.3～85.6)。该方法具有结晶易形成、结晶条件温和、结晶温度范围大、结晶时间短等优点，通过该方法得到的胰岛素六面体结晶具有沉降体积小、均一稳定、生产效率高等优点，易于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质晶体技术领域，涉及一种胰岛素结晶的制备方法，以及通过该制备方法得到的胰岛素结晶。
背景技术
糖尿病是胰岛素分泌缺陷或作用不足导致的、以高血糖为特征的代谢紊乱。据统计，全球已有4.45亿成人患有糖尿病，中国占1.14亿，意味着全世界超过1/4的糖友都在中国，糖尿病人数占全球第一。糖尿病已经成为一个日趋严峻的全球问题，近年来全球糖尿病患病率持续增长，2019年20-79岁人群的糖尿病患者已经达到4.63亿人，预测到2045年将达到6.29亿人。
糖尿病的危害性仅次于心脑血管疾病和肿瘤。我国约有3/4的糖尿病患者患有并发症，其慢性高血糖状态与长期并发症显著相关，容易导致肾脏、眼、神经、心脏和血管等众多器官的损害、功能障碍和功能衰竭，危害性极大。
普通的胰岛素(insulin)存在作用时间短、吸收变异大、作用峰值明显、低血糖发生率高等诸多问题，正逐渐被胰岛素类似物(insulin analogue)所替代。门冬胰岛素(AspB28-人胰岛素)作为一种速效胰岛素类似物，是利用基因工程DNA重组技术将人胰岛素B链第28位的脯氨酸(Pro)替换为负电荷的门冬氨酸(Asp，又称天门冬氨酸或天冬氨酸)，利用电荷的排斥作用来阻止胰岛素单体或二聚体的自我聚合，使分子间的聚合减少，它不但能很好地模拟人胰岛素的分泌模式，控制血糖效果较好，而且由于其作用持续时间的缩短，不易与下餐前或者夜间胰岛素作用发生叠加，能显著降低低血糖的发生。
另外，从胰岛素的存在形式上讲，无论从贮藏性能还是从后续制剂的配方设计等方面考虑，固态胰岛素中的晶体形式都比液态形式更方便。晶体具有均一稳定的固体分子形式，冻干时间短，样品稳定性高，因此更适合于工业化生产。
中国发明专利CN106117345B公开了一种重组甘精胰岛素(GlyA21ArgB31ArgB32-人胰岛素)结晶的制备方法，其包括：将其中甘精胰岛素的浓度为1～3.5g/L，酚类衍生物(例如苯酚)、含锌物质(例如氯化锌)和有机酸(例如柠檬酸)的质量/体积分数分别为0.01～1.00％、0.005～1.5％和0.01～2.0％的结晶液的pH值调至4.5～7.0，搅拌析晶。
然而，后续研究者指出，应用CN106117345B中的制备方法并不能使胰岛素形成六面体结晶，仍以无定形沉淀形式存在。
发明内容
发明要解决的问题
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种制备结晶状胰岛素的方法，通过该方法能够制备得到六面体胰岛素。
用于解决问题的方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
第一方面，本发明提供了一种胰岛素结晶的制备方法，其包括以下步骤：
1)将胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质和水以及任选的有机溶剂混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶；
其中，在所述结晶液中：胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(4.3～85.6)。
优选的，在所述结晶液中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1279.9):(3.1～123.0):(10.0～85.6)。
更优选的，在所述结晶液中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1279.9):(3.1～123.0):(10.0～64.2)。
或者，更进一步优选的，在所述结晶液中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(24.6～123.0):(21.4～64.2)。
第二方面，本发明提供了另外一种胰岛素结晶的制备方法，其包括以下步骤：
1)将胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质和水以及任选的有机溶剂混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶；
其中，
所述结晶液中，
所述胰岛素的质量浓度为1.0～10.0g/L；
所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.5mol/L；
所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～4.0g/L；
所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(10.0～85.6)。
优选的，所述结晶液中，
所述胰岛素的质量浓度为1.0～10.0g/L；
所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.5mol/L；
所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～4.0g/L；
所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(10.0～64.2)。
优选的，所述结晶液中，
所述结晶液中，
所述胰岛素的质量浓度为1.0～10.0g/L；
所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.5mol/L；
所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～4.0g/L；
所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(21.4～64.2)。
进一步的，在所述结晶液中，所述胰岛素的质量浓度为1.0～10.0g/L。
优选的，在所述结晶液中，所述胰岛素的质量浓度为1.0～5.0g/L。
优选的，在所述结晶液中，所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.5mol/L。
更优选的，在所述结晶液中，所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.3mol/L。
优选的，在所述结晶液中，所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～4.0g/L。
更优选的，在所述结晶液中，所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～2.0g/L。
优选的，在所述结晶液中，所述锌类物质的质量浓度为0.5g/L～20.0g/L。
优选的，在所述结晶液中，所述锌类物质的质量浓度为0.5g/L～10.0g/L。
更优选的，在所述结晶液中，所述锌类物质的质量浓度为1.0g/L～7.5g/L。
优选的，在所述制备方法中，所述结晶液的制备过程包括以下步骤：
将胰岛素和水混合，得到胰岛素溶液；
将酚类物质和水混合，得到酚类物质溶液；
将柠檬酸、胰岛素溶液和酚类物质溶液以及任选的有机溶剂混合，再加入锌类物质，得到结晶液。
进一步的，在所述制备方法中，所述胰岛素选自人胰岛素、猪胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素和重组门冬胰岛素中的至少一种。
优选的，在所述制备方法中，所述胰岛素为重组门冬胰岛素。
进一步的，在所述制备方法中，所述酚类物质选自苯酚、间甲基苯酚和对羟基苯甲酸酯中的至少一种。
优选的，在所述制备方法中，所述酚类物质为苯酚。
进一步的，在所述制备方法中，所述锌类物质选自乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌和硫酸锌中的至少一种。
优选的，所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(4.3～85.6)。
优选的，所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(10.0～85.6)。
优选的，所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(10.0～64.2)。
优选的，所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(21.4～64.2)。
优选的，所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(10.0～42.6)。
优选的，在所述制备方法中，所述锌类物质为氯化锌。
进一步的，在所述制备方法中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的至少一种。
优选的，在所述制备方法中，所述有机溶剂选自乙醇、异丙醇和乙腈中的至少一种。
更进一步的，在所述制备方法中，相对于所述结晶液，所述有机溶剂的体积分数为0％～10％。
优选的，在所述制备方法中，相对于所述结晶液，所述有机溶剂的体积分数为0％～5％。
优选的，在所述制备方法中，相对于所述结晶液，所述有机溶剂的体积分数为0.5％～5％。
进一步的，在所述制备方法中，所述pH调节剂选自氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、盐酸和乙酸中的至少一种。
优选的，在所述制备方法中，所述pH调节剂选自氢氧化钾、氢氧化钠和氨水中的至少一种。
进一步的，在所述制备方法中，所述结晶液的pH值被调节至5.8～6.5。
优选的，在所述制备方法中，所述结晶液的pH值被调节至6.0～6.3。
进一步的，在所述制备方法中，所述析晶时的结晶液温度为4～30℃。
优选的，在所述制备方法中，所述析晶时的结晶液温度为15～26℃。
更优选的，在所述制备方法中，所述析晶时的结晶液温度为18～25℃。
进一步的，在所述制备方法中，所述析晶的时间为3～48小时。
优选的，在所述制备方法中，所述析晶的时间为3～20小时。
优选的，在所述制备方法中，所述析晶的时间为5～15小时。
优选的，在所述制备方法中，所述析晶的时间为3～15小时。
进一步的，在所述制备方法中，所述析晶在搅拌条件下进行。
本发明还提供了一种胰岛素结晶的制备方法，包括以下步骤：
1)依次加入胰岛素溶液、柠檬酸、酚类物质溶液、锌类物质和任选的有机溶剂，混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶。
本发明还提供了一种胰岛素结晶的制备方法，包括以下步骤：
1)依次加入胰岛素溶液、柠檬酸、酚类物质溶液、任选的有机溶剂和锌类物质，混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶。
本发明还提供了一种胰岛素结晶的制备方法，包括以下步骤：
1)依次加入柠檬酸、胰岛素溶液、酚类物质溶液、任选的有机溶剂和锌类物质，混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶。
第三方面，本发明提供了一种胰岛素结晶，其通过第一方面所述的制备方法制得。
优选的，所述胰岛素为人胰岛素、猪胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素和重组门冬胰岛素中的至少一种。
发明的效果
1、本发明的胰岛素结晶的制备方法可以从胰岛素的干燥/冻干固体粉末样品或纯化收集的液体样品中直接制备晶体，样品来源多样、形式灵活，能够更好地与上游工艺衔接；
2、本发明的制备方法具有结晶易形成、结晶条件温和、结晶温度范围大(可在室温条件下结晶)、不需在低温条件下结晶、结晶时间短等优点，同时缩短了产品的冷冻干燥时间，提高了产品的稳定性，通过该方法得到的胰岛素晶体具有沉降体积小、均一稳定、生产效率高等优点，易于工业化生产。
3、本发明的制备方法利用柠檬酸结晶体系对胰岛素进行结晶，得到了六面体形态的结晶，相较于杆状结晶更好收获、收集。
4、本发明的制备方法可以不使用有机溶剂，或者根据工艺流程使用低毒性的有机溶剂(如乙醇、异丙醇等)，相较于使用乙腈的现有结晶方法，本发明的方法对环境的影响较小。
附图说明
图1为实施例1中重组门冬胰岛素结晶在显微镜下400倍放大图。
图2为实施例2中重组门冬胰岛素结晶在显微镜下200倍放大图。
图3为实施例3中重组门冬胰岛素结晶在显微镜下200倍放大图。
图4为实施例4中重组门冬胰岛素结晶在显微镜下200倍放大图。
图5为实施例5中重组门冬胰岛素结晶在显微镜下400倍放大图。
图6为实施例6中重组门冬胰岛素结晶在显微镜下200倍放大图。
图7为实施例7中重组门冬胰岛素结晶在显微镜下400倍放大图。
图8为实施例8中重组门冬胰岛素结晶在显微镜下400倍放大图。
图9为实施例9中重组门冬胰岛素结晶在显微镜下200倍放大图。
图10为实施例10中重组门冬胰岛素结晶在显微镜下400倍放大图。
具体实施方式
[胰岛素结晶及其制备方法]
本发明的胰岛素结晶的制备方法可以包括以下步骤：1)将胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质和水以及任选的有机溶剂混合，得到结晶液；2)采用pH调节剂调节步骤1)中结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶。
在本发明的制备方法中，结晶液中的胰岛素、柠檬酸、酚类物质和锌类物质之间可以具有一定的用量比例关系。
在一项实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比可以为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(4.3～85.6)。
在一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比可以为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(10.0～85.6)。
在一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比可以为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(20.0～85.6)。
在一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比可以为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(21.4～85.6)。
在一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比可以为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(42.8～85.6)。
在一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比可以为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(64.2～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(4.3～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(10.0～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(20.0～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(21.4～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(42.8～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(42.8～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(190.9～1272.9):(3.1～123.0):(4.3～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(190.9～1272.9):(3.1～123.0):(10.0～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(190.9～1272.9):(3.1～123.0):(20.0～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(190.9～1272.9):(3.1～123.0):(21.4～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(190.9～1272.9):(3.1～123.0):(21.4～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(190.9～1272.9):(3.1～123.0):(42.8～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(190.9～1272.9):(3.1～123.0):(64.2～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(190.9～1272.9):(3.1～123.0):(10.0～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(190.9～1272.9):(3.1～123.0):(21.4～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(3.1～123.0):(10.0～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(3.1～123.0):(10.0～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(3.1～123.0):(10.0～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(3.1～123.0):(20.0～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(3.1～123.0):(21.4～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(12.4～123.0):(4.3～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(12.4～123.0):(10.0～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(12.4～123.0):(10.0～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(12.4～123.0):(21.4～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(12.4～123.0):(42.8～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(24.6～123.0):(3.1～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(24.6～123.0):(10.0～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(24.6～123.0):(10.0～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(24.6～123.0):(10.0～42.8)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(24.6～123.0):(10.0～42.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(24.6～123.0):(10.0～21.4)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(255.0～1272.9):(24.6～123.0):(21.4～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(3.1～123.0):(10.0～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(12.4～123.0):(10.0～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(12.4～123.0):(10.0～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(12.4～123.0):(10.0～42.8)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(12.4～123.0):(10.0～21.4)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(12.4～123.0):(21.4～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(24.6～123.0):(3.1～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(24.6～123.0):(10.0～85.6)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(24.6～123.0):(10.0～64.2)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(24.6～123.0):(10.0～21.4)。
在另一项优选的实施方案中，胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(637.4～1272.9):(24.6～123.0):(21.4～64.2)。
在本发明的制备方法中，结晶液中的固体物料(溶质或分散质)可以具有一定的浓度。
在一项实施方案中，以胰岛素为例，相对于结晶液，胰岛素的质量浓度可以为1.0～10.0g/L(即每1L结晶液中包含1.0～10.0g胰岛素)。
在一项优选的实施方案中，相对于结晶液，胰岛素的质量浓度可以为5.0～10.0g/L。
在一项优选的实施方案中，相对于结晶液，胰岛素的质量浓度可以为1.0～5.0g/L。
在一项实施方案中，胰岛素可以为干燥/冻干固体粉末样品。
在另一项实施方案中，胰岛素可以为纯化收集的液体样品。
在一项实施方案中，胰岛素可以选自人胰岛素、猪胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素和重组门冬胰岛素中的至少一种。
在一项优选的实施方案中，胰岛素可以为重组门冬胰岛素。
在一项实施方案中，柠檬酸的摩尔浓度可以为0.2～0.5mol/L。
在一项优选的实施方案中，柠檬酸的摩尔浓度可以为0.3～0.5mol/L。
在一项优选的实施方案中，柠檬酸的摩尔浓度可以为0.2～0.3mol/L。
在本发明的制备方法中，结晶液中是否包含酚类物质以及酚类物质的用量多少是影响胰岛素形成结晶的重要因素。
在一项实施方案中，酚类物质可以选自苯酚、间甲基苯酚和对羟基苯甲酸酯中的至少一种。
在一项优选的实施方案中，所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～4.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述酚类物质的质量浓度为1.0g/L～4.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述酚类物质的质量浓度为2.0g/L～4.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述酚类物质的质量浓度为1.0g/L～2.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～2.0g/L。
在一项优选的实施方案中，酚类物质可以为苯酚。
在本发明的制备方法中，结晶液中是否包含锌类物质(或称锌盐)以及锌类物质的用量多少是影响胰岛素形成结晶的重要因素。
在一项实施方案中，锌类物质可以选自乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌和硫酸锌中的至少一种。
在一项优选的实施方案中，锌类物质可以为氯化锌。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为0.5g/L～10.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为1.0g/L～10.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为2.3g/L～10.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为2.5g/L～10.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为4.7g/L～10.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为5.0g/L～10.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为7.5g/L～10.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为0.5g/L～7.5g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为1.0g/L～7.5g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为2.3g/L～7.5g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为2.5g/L～7.5g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为4.7g/L～7.5g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为5.0g/L～7.5g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为5.0g/L～7.5g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为0.5g/L～5.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为1.0g/L～5.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为2.3g/L～5.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为2.5g/L～5.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为4.7g/L～5.0g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为0.5g/L～4.7g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为1.0g/L～4.7g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为2.3g/L～4.7g/L。
在一项优选的实施方案中，所述锌类物质的质量浓度为2.5g/L～4.7g/L。
在本发明的制备方法中，结晶液中是否包含有机溶剂(或称有机相)以及有机溶剂的用量多少不是影响胰岛素形成结晶的重要因素，可以根据工艺步骤的需要选择是否添加有机溶剂进行结晶。
在一项实施方案中，结晶液中可以不包含有机溶剂。
在另一项实施方案中，结晶液中可以包含有机溶剂。
在一项实施方案中，有机溶剂可以选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的至少一种。
在一项优选的实施方案中，有机溶剂可以选自乙醇、异丙醇和乙腈中的至少一种。
在一项更优选的实施方案中，有机溶剂可以为乙醇。
在另一项更优选的实施方案中，有机溶剂可以为异丙醇。
在再一项更优选的实施方案中，有机溶剂可以为乙腈。
发明人经实验研究发现，当结晶液中包含体积分数为0～10％的有机溶剂时，胰岛素(例如重组门冬胰岛素)可以形成均一稳定的六面体形态结晶。
在一项实施方案中，相对于结晶液，有机溶剂的体积分数可以为0％～10％(即每100mL结晶液中包含0～10mL有机溶剂)。
在一项优选的实施方案中，相对于结晶液，有机溶剂的体积分数可以为0.5％～10％。
在一项优选的实施方案中，相对于结晶液，有机溶剂的体积分数可以为1％～10％。
在一项优选的实施方案中，相对于结晶液，有机溶剂的体积分数可以为0％～5％。
在一项优选的实施方案中，相对于结晶液，有机溶剂的体积分数可以为0.5％～5％。
在一项优选的实施方案中，相对于结晶液，有机溶剂的体积分数可以为1.0％～5％。
在一项优选的实施方案中，相对于结晶液，有机溶剂的体积分数可以为5.0％～10％。
在本发明的制备方法中，用于制备结晶液的各种物料的投料顺序可以根据具体情况进行合理调换。
更进一步的，胰岛素溶液、酚类物质溶液、柠檬酸、锌类物质和有机溶剂的投料顺序可以进行合理调换。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：将胰岛素和水混合，得到胰岛素溶液；将酚类物质和水混合，得到酚类物质溶液；将胰岛素溶液、柠檬酸、酚类物质溶液、锌类物质以及任选的有机溶剂混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入胰岛素溶液、柠檬酸、酚类物质溶液和锌类物质，混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入柠檬酸、胰岛素溶液、酚类物质溶液和锌类物质，混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入酚类物质溶液、柠檬酸、胰岛素溶液和锌类物质，混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入锌类物质、柠檬酸、胰岛素溶液和酚类物质溶液，混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入胰岛素溶液、柠檬酸、酚类物质溶液、锌类物质、任选的有机溶剂，混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入胰岛素溶液、柠檬酸、酚类物质溶液、任选的有机溶剂、锌类物质，混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入柠檬酸、胰岛素溶液、酚类物质溶液、任选的有机溶剂、锌类物质，混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入柠檬酸、胰岛素溶液、任选的有机溶剂、酚类物质溶液、锌类物质，混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入柠檬酸、胰岛素溶液、酚类物质溶液、锌类物质，混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入酚类物质溶液、锌类物质、柠檬酸、胰岛素溶液，混合，得到结晶液。
在一项实施方案中，结晶液的制备过程可以包括以下步骤：依次加入酚类物质溶液、锌类物质、柠檬酸、胰岛素溶液、任选的有机溶剂，混合，得到结晶液。
在本发明的制备方法中，锌类物质的浓度对结晶的形成至关重要。
在一项实施方案中，在加完锌类物质之后，立即采用pH调节剂对结晶液的pH值进行调节，通常可以使用本领域公知的酸和/或碱进行调节。
在一项实施方案中，pH调节剂可以选自氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、盐酸和乙酸中的至少一种。
在一项优选的实施方案中，pH调节剂可以为氢氧化钾。
在另一项优选的实施方案中，pH调节剂可以为氢氧化钠。
在再一项优选的实施方案中，pH调节剂可以为氨水。
在一项实施方案中，结晶液的pH值被pH调节剂调节至5.8～6.5。
在一项优选的实施方案中，结晶液的pH值被pH调节剂调节至6.0～6.5。
在一项优选的实施方案中，结晶液的pH值被pH调节剂调节至6.2～6.5。
在一项优选的实施方案中，结晶液的pH值被pH调节剂调节至6.3～6.5。
在一项优选的实施方案中，结晶液的pH值被pH调节剂调节至6.0～6.3。
在一项实施方案中，析晶时的结晶液温度可以为4～30℃。该温度能够使胰岛素结晶更快形成，且晶型均一、大小适中；而在低温下结晶时，晶体过小；在高温下结晶时，晶体过大，且搅拌时晶体易碎。
在一项优选的实施方案中，析晶时的结晶液温度可以为4～26℃。
在一项优选的实施方案中，析晶时的结晶液温度可以为15～30℃。
在一项优选的实施方案中，析晶时的结晶液温度可以为18～30℃。
在一项优选的实施方案中，析晶时的结晶液温度可以为20～30℃。
在一项优选的实施方案中，析晶时的结晶液温度可以为15～25℃。
在一项优选的实施方案中，析晶时的结晶液温度可以为15～26℃。
在一项更优选的实施方案中，析晶时的结晶液温度可以为18～25℃。
除非另有说明，本发明中使用的术语“室温”指的是15～30℃。
在一项实施方案中，析晶的时间可以为3～48小时。
在一项实施方案中，析晶的时间可以为3～20小时。
在一项优选的实施方案中，析晶的时间可以为5～48小时。
在一项实施方案中，析晶的时间可以为15～20小时。
在一项优选的实施方案中，析晶的时间可以为15～48小时。
在一项优选的实施方案中，析晶的时间可以为3～15小时。
在一项优选的实施方案中，析晶的时间可以为5～15小时。
在本发明的制备方法中，析晶可以在搅拌或不搅拌的条件下进行。
在一项实施方案中，析晶可以在搅拌条件下进行，但要避免使用剪切力大的搅拌方式，以免形成的晶体在搅拌过程中被搅碎。
利用本发明的制备方法可以得到胰岛素的六面体结晶。
下面将结合附图和具体的实施例对本发明中的技术方案进行进一步的阐述。除非另有说明，下列实施例中所使用的材料、试剂、仪器等均可通过常规商业手段获得。
实施例1(对比例)
参照CN106117345B中重组甘精胰岛素的结晶方法进行门冬胰岛素结晶的制备。
250mL结晶液中包含约2.53g/L的重组门冬胰岛素、约0.5g/100mL的柠檬酸、约0.05g/100mL的氯化锌和约0.1g/100mL的固体苯酚，pH＝5.0，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:60.3:24.5:8.6，具体操作如下：称取0.63g的重组门冬胰岛素溶于125mL水中，制成重组门冬胰岛素溶液；再向其中加入0.249g的苯酚、0.126g的氯化锌和1.25g的柠檬酸，加水定容至250mL，制成结晶液。将结晶液置于室温下低速搅拌，用氢氧化钠将pH值调至5.0，搅拌4小时。
取少量混悬液进行镜检，在显微镜下放大400倍观察。结果显示，重组门冬胰岛素为无定形沉淀，如图1所示。
实施例2
实验A：
40mL结晶液中包含约0.2M的柠檬酸、约5g/L的重组门冬胰岛素、约0.2g/100mL的固体苯酚、约与重组门冬胰岛素等重量的氯化锌、约0.1v/v％的乙醇，pH＝6.0，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:255.0:24.6:42.8。
实验B：
结晶液中包含约5v/v％的乙醇，其他成分与实验A一样。
具体操作如下：用水溶解重组门冬胰岛素，制备10g/L的重组门冬胰岛素溶液，另外用水溶解固体苯酚，制备30g/L的苯酚溶液，待用；取两个50mL三角瓶，每个三角瓶内分别加入20mL的重组门冬胰岛素溶液，然后每个三角瓶依次加入1.68g的柠檬酸、2.65mL的苯酚溶液和200mg的氯化锌，搅拌后再分别往两个三角瓶内加入40μL和2mL的乙醇，用5M氢氧化钾溶液调节pH值至6.0，加水定容至40mL，先室温搅拌至结晶形成，再于4℃下结晶15小时。
分别取实验A和实验B中的少量混悬液进行镜检，在显微镜下放大200倍观察。结果显示，实验A和实验B中的重组门冬胰岛素均可形成六面体结晶，分别如图2a和2b所示。
实施例3
实验A：
40mL结晶液中包含约0.2M的柠檬酸、约5g/L的重组门冬胰岛素、约0.2g/100mL的固体苯酚、约与重组门冬胰岛素等重量的氯化锌，pH＝6.2，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:255.0:24.6:42.8。
实验B：
结晶液中还包含约5v/v％的异丙醇，其他成分与实验A一样。
具体操作如下：用水溶解重组门冬胰岛素，制备10g/L的重组门冬胰岛素溶液，另外用水溶解固体苯酚，制备30g/L的苯酚溶液，待用；取两个50mL三角瓶，每个三角瓶内加入20mL的重组门冬胰岛素溶液，然后每个三角瓶依次加入1.68g的柠檬酸、2.65mL的苯酚溶液和200mg的氯化锌，搅拌后，再往实验B的三角瓶内加入2mL的异丙醇，用5M氢氧化钠溶液调节pH值至6.2，加水定容至40mL，于20℃下搅拌结晶15小时。
分别取实验A和实验B中的少量混悬液进行镜检，在显微镜下放大200倍观察。结果显示，实验A和实验B中的重组门冬胰岛素均可形成大小均一的六面体结晶，实验A的晶体粒径大多为20～50μm左右，实验B的晶体粒径大多为20～70μm左右，分别如图3a和3b所示。通过液相色谱法检测结晶上清液，以峰面积计算结晶回收率，实验A大于95％，实验B为85％。
实施例4
实验A：
40mL结晶液中包含约0.2M的柠檬酸、约5g/L的重组门冬胰岛素、约0.2g/100mL的固体苯酚、约为重组门冬胰岛素0.1倍重量的氯化锌和约0.5v/v％的乙醇，pH＝6.5，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:255.0:24.6:4.3。
实验B：
结晶液中包含约为重组门冬胰岛素0.5倍重量的氯化锌，其他成分与实验A一样，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:255.0:24.6:21.4。
实验C：
结晶液中包含约与重组门冬胰岛素等重量的氯化锌，其他成分与实验A一样，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:255.0:24.6:42.8。
实验D：
结晶液中包含约为重组门冬胰岛素1.5倍重量的氯化锌，其他成分与实验A一样，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:255.0:24.6:64.2。
实验E：
结晶液中包含约为重组门冬胰岛素2倍重量的氯化锌，其他成分与实验A一样，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:255.0:24.6:85.6。
具体操作如下：用水溶解重组门冬胰岛素，制备10g/L的重组门冬胰岛素溶液，另外用水溶解固体苯酚，制备30g/L的苯酚溶液，待用；取五个50mL三角瓶，每个三角瓶内加入20mL的重组门冬胰岛素溶液，然后每个三角瓶依次加入1.68g的柠檬酸、2.65mL的苯酚溶液和0.2mL的乙醇，搅拌后再分别往五个三角瓶内加入20mg、100mg、200mg、300mg、400mg的氯化锌，用5M氢氧化钠溶液调节pH值至6.5，加水定容至40mL，室温搅拌结晶15小时。
分别取实验A至E中的少量混悬液进行镜检，在显微镜下放大200倍观察。结果显示，实验B、C和D中的重组门冬胰岛素均可形成大小均一的六面体结晶，晶体粒径大多为20～50μm左右，实验A中的重组门冬胰岛素为无定形沉淀，实验E中的重组门冬胰岛素形成的晶体较小且均一性差，分别如图4a、4b、4c、4d和4e所示。通过液相色谱法检测结晶上清液，以峰面积计算结晶回收率，均大于95％。
实施例5
实验A：
40mL结晶液中包含约0.2M的柠檬酸、约5g/L的重组门冬胰岛素、约0.2g/100mL的固体苯酚、约为重组门冬胰岛素0.5倍重量的氯化锌和约0.5v/v％的乙醇，pH＝6.0，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:255.0:24.6:21.4。
实验B：
结晶液中包含约0.5M的柠檬酸，其他成分与实验A一样，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:637.4:24.6:21.4。
具体操作如下：用水溶解重组门冬胰岛素，制备10g/L的重组门冬胰岛素溶液，另外用水溶解固体苯酚，制备30g/L的苯酚溶液，待用；取两个50mL三角瓶，每个三角瓶内分别加入1.68g和4.20g的柠檬酸，然后每个三角瓶依次加入20mL的重组门冬胰岛素溶液、2.65mL的苯酚溶液和0.2mL的乙醇，搅拌后再分别往两个三角瓶内加入100mg的氯化锌，用5M氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，加水定容至40mL，室温搅拌结晶15小时。
分别取实验A和实验B中的少量混悬液进行镜检，在显微镜下放大400倍观察。结果显示，实验A和实验B中的重组门冬胰岛素均可形成六面体结晶，实验A的晶体粒径大多为20～100μm左右，实验B的晶体粒径大多在10μm以下，分别如图5a和5b所示。通过液相色谱法检测结晶上清液，以峰面积计算结晶回收率，均大于95％。
实施例6
40mL结晶液中包含约0.2M的柠檬酸、约5g/L的重组门冬胰岛素、约0.1g/100mL的固体苯酚、约与重组门冬胰岛素等重量的氯化锌和约0.5v/v％的乙醇，pH＝6.0，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:255.0:12.4:42.8。
具体操作如下：用水溶解重组门冬胰岛素，制备10g/L的重组门冬胰岛素溶液，另外用水溶解固体苯酚，制备30g/L的苯酚溶液，待用；取50mL三角瓶，依次加入1.68g的柠檬酸、20mL的重组门冬胰岛素溶液、1.33mL的苯酚溶液和0.2mL的乙醇，搅拌后再往三角瓶内加入200mg的氯化锌，用5M氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，加水定容至40mL，于18℃下搅拌结晶5小时。
取少量混悬液进行镜检，在显微镜下放大200倍观察。结果显示，可形成六面体结晶，如图6所示。
实施例7
40mL结晶液中包含约0.2M的柠檬酸、约1g/L的重组门冬胰岛素、约0.2g/100mL的固体苯酚、约与重组门冬胰岛素等重量的氯化锌和约1v/v％的异丙醇，pH＝6.3，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:1272.9:123.0:42.6。
具体操作如下：用水溶解重组门冬胰岛素，制备10g/L的重组门冬胰岛素溶液，另外用水溶解固体苯酚，制备30g/L的苯酚溶液，待用；取50mL三角瓶，依次加入1.68g的柠檬酸、4mL的重组门冬胰岛素溶液、2.65mL的苯酚溶液和0.4mL的异丙醇，搅拌后再往三角瓶内加入40mg的氯化锌，用5M氢氧化钠溶液调节pH值至6.3，加水定容至40mL，于25℃下搅拌结晶15小时。
取少量混悬液进行镜检，在显微镜下放大400倍观察。结果显示，可形成均匀的六面体结晶，晶体粒径大多为20～70μm，如图7所示。通过液相色谱法检测结晶上清液，以峰面积计算结晶回收率，大于95％。
实施例8
40mL结晶液中包含约0.2M的柠檬酸、约10g/L的重组门冬胰岛素、约0.05g/100mL的固体苯酚、约为重组门冬胰岛素0.25倍重量的氯化锌、约10v/v％的乙腈，pH＝5.8，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:127.3:3.1:10.0。
具体操作如下：用水溶解重组门冬胰岛素，制备20g/L的重组门冬胰岛素溶液，另外用水溶解固体苯酚，制备30g/L的苯酚溶液，待用；取50mL三角瓶，依次加入1.68g的柠檬酸、20mL的重组门冬胰岛素溶液、4.0mL的乙腈和0.67mL的苯酚溶液，搅拌后再往三角瓶内加入93.6mg的氯化锌，用5M氢氧化钠调节pH值至5.8，加水定容至40mL，于20℃下搅拌结晶3小时。
取少量混悬液进行镜检，在显微镜下放大400倍观察。结果显示，可形成均匀的六面体结晶，如图8所示。
实施例9
实验A：40mL结晶液中包含约0.3M的柠檬酸、约10g/L的重组门冬胰岛素、约0.4g/100mL的固体苯酚、约为重组门冬胰岛素0.5倍重量的氯化锌，pH＝6.5，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:190.9:24.9:20.0。
实验B：40mL结晶液中包含约0.3M的柠檬酸、约10g/L的重组门冬胰岛素、约0.4g/100mL的固体苯酚、约为重组门冬胰岛素0.5倍重量的氯化锌，pH＝7.0，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:190.9:24.9:20.0。
具体操作如下：用水溶解重组门冬胰岛素，制备20g/L的重组门冬胰岛素溶液，另外用水溶解固体苯酚，制备30g/L的苯酚溶液，待用；取2个50mL三角瓶，每个三角瓶依次加入2.52g的柠檬酸、20mL的重组门冬胰岛素溶液、5.36mL的苯酚溶液，搅拌后再往每个三角瓶内加入187.2mg的氯化锌，分别用质量浓度10％的浓氨水调节pH值至6.5和7.0，加水定容至40mL，实验A于30℃下搅拌结晶48小时，实验B于30℃下搅拌48小时。
分别取实验A和实验B中的少量混悬液进行镜检，在显微镜下放大200倍观察。结果显示，实验A可形成六面体结晶；实验B形成的结晶不是六面体，分别如图9a和9b所示。
实施例10
40mL结晶液中包含约0.2M的柠檬酸、约10g/L的重组门冬胰岛素、约0.2g/100mL的固体苯酚、约为重组门冬胰岛素2倍重量的氯化锌、约0.5v/v％的乙醇，pH＝6.2，其中：重组门冬胰岛素、柠檬酸、苯酚、氯化锌之间的摩尔比约为1:127.7:12.4:85.6。
具体操作如下：用水溶解重组门冬胰岛素，制备30g/L的重组门冬胰岛素溶液，另外用水溶解固体苯酚，制备30g/L的苯酚溶液，待用；取1个50mL三角瓶，依次加入1.68g的柠檬酸、13.3mL的重组门冬胰岛素溶液、2.67mL的苯酚溶液、0.2mL乙醇，搅拌后往三角瓶内加入800mg的氯化锌，用5M氢氧化钠调节pH值至6.2，加水定容至40mL，于25℃下搅拌结晶20小时。
取少量混悬液进行镜检，在显微镜下放大400倍观察。结果显示，可形成六面体结晶，如图10所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (25)
1.一种胰岛素结晶的制备方法，其包括以下步骤：
1)将胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质和水以及任选的有机溶剂混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶；
其中，所述结晶液中，
胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质之间的摩尔比为1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(4.3～85.6)，优选1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(10.0～85.6)，优选1:(127.3～1272.9):(3.1～123.0):(10.0～64.2)，优选1:(255.0～1272.9):(24.6～123.0):(21.4～64.2)。
2.一种胰岛素结晶的制备方法，其包括以下步骤：
1)将胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质和水以及任选的有机溶剂混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶；
其中，
所述结晶液中，
所述胰岛素的质量浓度为1.0～10.0g/L；
所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.5mol/L；
所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～4.0g/L；
所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(10.0～85.6)；
或
所述结晶液中，
所述胰岛素的质量浓度为1.0～10.0g/L；
所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.5mol/L；
所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～4.0g/L；
所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(10.0～64.2)；
或
所述结晶液中，
所述胰岛素的质量浓度为1.0～10.0g/L；
所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.5mol/L；
所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～4.0g/L；
所述胰岛素与锌类物质的摩尔比为1:(21.4～64.2)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其包括以下步骤：
1)将胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质和水以及任选的有机溶剂混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶；
其中，所述结晶液中，
所述胰岛素的质量浓度为1.0～10.0g/L；
所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.5mol/L；
所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～4.0g/L；
所述锌类物质的质量浓度为0.5g/L～20.0g/L。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其包括以下步骤：
1)将胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质和水以及任选的有机溶剂混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶；
其中，所述结晶液中，
所述胰岛素的质量浓度为1.0～10.0g/L；
所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.5mol/L；
所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～4.0g/L；
所述锌类物质的质量浓度为0.5g/L～10.0g/L。
5.根据权利要求2的所述制备方法，其包括以下步骤：
1)将胰岛素、柠檬酸、酚类物质、锌类物质和水以及任选的有机溶剂混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶；
其中，所述结晶液中，
所述胰岛素的质量浓度为1.0～5.0g/L；
所述柠檬酸的摩尔浓度为0.2～0.3mol/L；
所述酚类物质的质量浓度为0.5g/L～2.0g/L；
所述锌类物质的质量浓度为1.0g/L～7.5g/L。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述胰岛素选自人胰岛素、猪胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素和重组门冬胰岛素中的至少一种。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述酚类物质选自苯酚、间甲基苯酚和对羟基苯甲酸酯中的至少一种。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述锌类物质选自乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌和硫酸锌中的至少一种。
9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的至少一种。
10.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
相对于所述结晶液，所述有机溶剂的体积分数为0％～10％。
11.根据权利要求1或2或10所述的制备方法，其特征在于，
相对于所述结晶液，所述有机溶剂的体积分数为0％～5％。
12.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述pH调节剂选自氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、盐酸和乙酸中的至少一种。
13.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述结晶液的pH值被调节至5.8～6.5。
14.根据权利要求1或2或13所述的制备方法，其特征在于，
所述结晶液的pH值被调节至6.0～6.5。
15.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述析晶时的结晶液温度为4～30℃。
16.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述析晶时的结晶液温度为15～26℃。
17.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述析晶时的结晶液温度为18～25℃。
18.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述析晶的时间为3～48小时。
19.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述析晶的时间为3～20小时，优选3～15小时。
20.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述析晶在搅拌条件下进行。
21.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)依次加入胰岛素溶液、柠檬酸、酚类物质溶液、锌类物质和任选的有机溶剂，混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶。
22.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)依次加入胰岛素溶液、柠檬酸、酚类物质溶液、任选的有机溶剂和锌类物质，混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶。
23.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)依次加入柠檬酸、胰岛素溶液、酚类物质溶液、任选的有机溶剂和锌类物质，混合，得到结晶液；
2)采用pH调节剂调节步骤1)中所述结晶液的pH值，析晶，得到胰岛素结晶。
24.一种胰岛素结晶，其通过根据权利要求1至23中任一项所述的制备方法制得。
25.根据权利要求24所述的胰岛素结晶，其特征在于，
所述胰岛素为人胰岛素、猪胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素和重组门冬胰岛素中的至少一种。
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|---|---|---|---|---|
| CN114933647A (zh) * | 2022-06-01 | 2022-08-23 | 重庆宸安生物制药有限公司 | 一种胰岛素结晶的制备方法及产品 |
| CN114933647B (zh) * | 2022-06-01 | 2023-06-06 | 重庆宸安生物制药有限公司 | 一种胰岛素结晶的制备方法及产品 |
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| CN113896784B (zh) | 2024-04-16 |
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