JPH08225597A - 安定なインシュリンアナログ結晶の製造 - Google Patents
安定なインシュリンアナログ結晶の製造Info
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- JPH08225597A JPH08225597A JP7278739A JP27873995A JPH08225597A JP H08225597 A JPH08225597 A JP H08225597A JP 7278739 A JP7278739 A JP 7278739A JP 27873995 A JP27873995 A JP 27873995A JP H08225597 A JPH08225597 A JP H08225597A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Abstract
(57)【要約】
【課題】 糖尿病の治療に有用なＬｙｓB28ＰｒｏB29−
ヒトインシュリンの精製及び製造に有用な、ＬｙｓB28
ＰｒｏB29−ヒトインシュリンのアルカリ金属の塩又は
アンモニウムの塩の結晶の製造方法の提供。 【解決手段】 ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュリ
ン、薬学的に許容し得る保存剤を含む溶液のｐＨをアル
カリ金属又はアンモニウムの塩基を用いてＬｙｓB28Ｐ
ｒｏB29−ヒトインシュリンの等電点以下から約ｐＨ８.
５から約ｐＨ９.５の間に調整し、結晶化させる。
ヒトインシュリンの精製及び製造に有用な、ＬｙｓB28
ＰｒｏB29−ヒトインシュリンのアルカリ金属の塩又は
アンモニウムの塩の結晶の製造方法の提供。 【解決手段】 ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュリ
ン、薬学的に許容し得る保存剤を含む溶液のｐＨをアル
カリ金属又はアンモニウムの塩基を用いてＬｙｓB28Ｐ
ｒｏB29−ヒトインシュリンの等電点以下から約ｐＨ８.
５から約ｐＨ９.５の間に調整し、結晶化させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトインシュリン
の単量体アナログに関する。特に、本発明はインシュリ
ンアナログ結晶の製造方法に関する。該方法は、Ｌｙｓ
B28ＰｒｏB29−ヒトインシュリンの精製及び製造に有用
である。ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュリンは、糖
尿病の治療に有用である。
の単量体アナログに関する。特に、本発明はインシュリ
ンアナログ結晶の製造方法に関する。該方法は、Ｌｙｓ
B28ＰｒｏB29−ヒトインシュリンの精製及び製造に有用
である。ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュリンは、糖
尿病の治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】１９２０年代にインシュリンが導入され
以来、真性糖尿病の治療の改良ために研究が続けられて
来た。大部分は、インシュリンの純度及び利用性に関す
る進歩である。異なる時間で作用する様々な製剤もまた
開発されてきた。これらの改良にもかかわらず、皮下注
射治療は患者に好都合な調節と正常化された血糖値制御
をもたらすには今だに不十分である。患者の一生にわた
って正常な血糖レベルをしばしば越えることは、高血糖
症又は低血糖症を引き起こし、網膜症、神経障害、腎臓
障害、及び微小血管症及び大血管症を含む長期間の合併
症を引き起こす。
以来、真性糖尿病の治療の改良ために研究が続けられて
来た。大部分は、インシュリンの純度及び利用性に関す
る進歩である。異なる時間で作用する様々な製剤もまた
開発されてきた。これらの改良にもかかわらず、皮下注
射治療は患者に好都合な調節と正常化された血糖値制御
をもたらすには今だに不十分である。患者の一生にわた
って正常な血糖レベルをしばしば越えることは、高血糖
症又は低血糖症を引き起こし、網膜症、神経障害、腎臓
障害、及び微小血管症及び大血管症を含む長期間の合併
症を引き起こす。
【０００３】極端な血糖レベルの回避を助けるために糖
尿病はしばしば、毎回食事とともにインシュリンを投与
して複数の注射による治療を行う。しかし、この治療は
まだ至適化されていない。商業的に入手できる最も速効
性のインシュリンは、注射後のピークがあまりにも遅
く、持続時間が長すぎるため、グルコースレベルを適切
に調節することができない。近年、皮下吸収過程の動力
学を改変するインシュリン製剤及びインシュリンアナロ
グ製剤の開発にかなりの努力が費やされている。
尿病はしばしば、毎回食事とともにインシュリンを投与
して複数の注射による治療を行う。しかし、この治療は
まだ至適化されていない。商業的に入手できる最も速効
性のインシュリンは、注射後のピークがあまりにも遅
く、持続時間が長すぎるため、グルコースレベルを適切
に調節することができない。近年、皮下吸収過程の動力
学を改変するインシュリン製剤及びインシュリンアナロ
グ製剤の開発にかなりの努力が費やされている。
【０００４】市販のインシュリンの医薬製剤はすべて、
インシュリンを自己会合の状態で主に亜鉛−６量体の形
で含むので、皮下注射蓄積から血流へのインシュリン吸
収の律速段階は、自己会合したインシュリン６量体の解
離であると考えられている。この吸収過程を促進するた
めに単量体インシュリンアナログが開発されている。こ
れらの単量体アナログはヒト本来のインシュリンの生物
学的活性を保持しながら、インシュリンに比べ比較的迅
速に開始する活性を有する。それらは迅速な吸収をもた
らし、注射時間及びインシュリンのピークの作用を食事
の応答に関連する食後のグルコース可動域へより近付け
る。
インシュリンを自己会合の状態で主に亜鉛−６量体の形
で含むので、皮下注射蓄積から血流へのインシュリン吸
収の律速段階は、自己会合したインシュリン６量体の解
離であると考えられている。この吸収過程を促進するた
めに単量体インシュリンアナログが開発されている。こ
れらの単量体アナログはヒト本来のインシュリンの生物
学的活性を保持しながら、インシュリンに比べ比較的迅
速に開始する活性を有する。それらは迅速な吸収をもた
らし、注射時間及びインシュリンのピークの作用を食事
の応答に関連する食後のグルコース可動域へより近付け
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
１つの単量体アナログである、ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒ
トインシュリン（ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩ）の結晶の
新規製造法を提供する。ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩは、
米国特許出願第０７／３８８，２０１号（ＥＰＯ公開第
３８３ ４７２号）に開示されている。しかし、米国特
許出願第０７／３８８，２０１号は、ＬｙｓB28Ｐｒｏ
B29−ｈＩ結晶の商業的に実行可能な製造法は開示して
いない。
１つの単量体アナログである、ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒ
トインシュリン（ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩ）の結晶の
新規製造法を提供する。ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩは、
米国特許出願第０７／３８８，２０１号（ＥＰＯ公開第
３８３ ４７２号）に開示されている。しかし、米国特
許出願第０７／３８８，２０１号は、ＬｙｓB28Ｐｒｏ
B29−ｈＩ結晶の商業的に実行可能な製造法は開示して
いない。
【０００６】インシュリンの結晶化は当業者にはよく知
られている。最初の発見は１９２６年にさかのぼり、こ
のときアベル（Abel）がインシュリンを等電的領域にお
いて、ブルシン、ピリジン及び酢酸アンモニウムで緩衝
化した溶液から結晶化した［アベル（Abel）Ｊ.Ｊ.ら，
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンセス・Ｕ.Ｓ.（Proc．Nat'l．Acad．Sci．U.
S.），１２巻，１３２頁，（１９２６年）］。ピーター
ソン（Peterson）らは、米国特許第２，９２０，１０４
号の中でインシュリン結晶及び製剤並びにそれらの製造
方法を記載している。R．L．ジャクソン（Jackson）は
米国特許第３，７１９，６５５号の中で、インシュリン
のアンモニウム及びアルカリ金属塩の製造方法について
開示している。この方法は豚肉又は牛肉インシュリン、
及び０.２molarから１.０molarの濃度の、アルカリ金属
カチオンとアンモニウムカチオンからなる群から選択さ
れたカチオンを含んでなる豚肉又は牛肉インシュリンを
含む溶液の塩基性をアルカリ金属又はアンモニウムの塩
基でｐＨ約７.２からｐＨ約１０.０に調整することを含
んでなる。この方法は、ｐＨ８.２でインシュリン結晶
の収率が最大になる「８.２プロセス」として商業的に
発展した。最も意味深いのは、ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒ
トインシュリンをナトリウム結晶を形成するためにジャ
クソンの文献に記載されたｐＨ８.２の条件に付した場
合、このような結晶化は起こらないということである。
られている。最初の発見は１９２６年にさかのぼり、こ
のときアベル（Abel）がインシュリンを等電的領域にお
いて、ブルシン、ピリジン及び酢酸アンモニウムで緩衝
化した溶液から結晶化した［アベル（Abel）Ｊ.Ｊ.ら，
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンセス・Ｕ.Ｓ.（Proc．Nat'l．Acad．Sci．U.
S.），１２巻，１３２頁，（１９２６年）］。ピーター
ソン（Peterson）らは、米国特許第２，９２０，１０４
号の中でインシュリン結晶及び製剤並びにそれらの製造
方法を記載している。R．L．ジャクソン（Jackson）は
米国特許第３，７１９，６５５号の中で、インシュリン
のアンモニウム及びアルカリ金属塩の製造方法について
開示している。この方法は豚肉又は牛肉インシュリン、
及び０.２molarから１.０molarの濃度の、アルカリ金属
カチオンとアンモニウムカチオンからなる群から選択さ
れたカチオンを含んでなる豚肉又は牛肉インシュリンを
含む溶液の塩基性をアルカリ金属又はアンモニウムの塩
基でｐＨ約７.２からｐＨ約１０.０に調整することを含
んでなる。この方法は、ｐＨ８.２でインシュリン結晶
の収率が最大になる「８.２プロセス」として商業的に
発展した。最も意味深いのは、ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒ
トインシュリンをナトリウム結晶を形成するためにジャ
クソンの文献に記載されたｐＨ８.２の条件に付した場
合、このような結晶化は起こらないということである。
【０００７】本発明は、単量体ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒ
トインシュリンが会合及び結晶化し得るような特異的条
件を提供する。したがって、本発明は、ＬｙｓB28Ｐｒ
ｏB29−ｈＩの結晶化の方法を提供する。この方法は、
高品質、高収率のアルカリ金属又はアンモニウムの塩を
結晶として大規模に製造する。この結晶は安定な、固体
の形の分子となる。結晶固体は特に有利である、なぜな
らばそれらは非晶性の固体よりも、より簡単にキャラク
タライズされ、精製され、そして薬品としてより優美で
あるからである。この方法は商業的な応用にふさわしい
ものである。
トインシュリンが会合及び結晶化し得るような特異的条
件を提供する。したがって、本発明は、ＬｙｓB28Ｐｒ
ｏB29−ｈＩの結晶化の方法を提供する。この方法は、
高品質、高収率のアルカリ金属又はアンモニウムの塩を
結晶として大規模に製造する。この結晶は安定な、固体
の形の分子となる。結晶固体は特に有利である、なぜな
らばそれらは非晶性の固体よりも、より簡単にキャラク
タライズされ、精製され、そして薬品としてより優美で
あるからである。この方法は商業的な応用にふさわしい
ものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＬｙｓB28Ｐ
ｒｏB29−ヒトインシュリンのアルカリ金属の塩又はア
ンモニウムの塩の結晶の製造法を提供し、該方法は溶液
のｐＨを、ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュリンの等
電点以下のｐＨから、ｐＨ約８.５からｐＨ約９.５の間
にアルカリ金属又はアンモニウムの塩基で調整すること
を含んでなり、該溶液は約５ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ
／ｍＬのＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュリン、薬学
的に許容し得る保存剤、及び初濃度 約３０ｍＭから約
１００ｍＭのカチオンを含んでなり、該カチオンはアル
カリ金属又はアンモニウムからなる群から選択されるも
のである。
ｒｏB29−ヒトインシュリンのアルカリ金属の塩又はア
ンモニウムの塩の結晶の製造法を提供し、該方法は溶液
のｐＨを、ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュリンの等
電点以下のｐＨから、ｐＨ約８.５からｐＨ約９.５の間
にアルカリ金属又はアンモニウムの塩基で調整すること
を含んでなり、該溶液は約５ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ
／ｍＬのＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュリン、薬学
的に許容し得る保存剤、及び初濃度 約３０ｍＭから約
１００ｍＭのカチオンを含んでなり、該カチオンはアル
カリ金属又はアンモニウムからなる群から選択されるも
のである。
【０００９】本開示において使用されるすべてのアミノ
酸の略号は、３７連邦法施行規則§１.８２２(ｂ)(２)
で示されるように米国特許商標局によって認められてい
るものである。
酸の略号は、３７連邦法施行規則§１.８２２(ｂ)(２)
で示されるように米国特許商標局によって認められてい
るものである。
【００１０】上記の通り、本発明はＬｙｓB28ＰｒｏB29
−ヒトインシュリンのアルカリ金属の塩又はアンモニウ
ムの塩の結晶の製造法を提供する。「ＬｙｓB28Ｐｒｏ
B29−ヒトインシュリン」又は「ＬｙｓB28ＰｒｏB29−
ｈＩ」なる用語は、２量化又は自己会合しにくい即効性
インシュリンアナログである。本明細書の一部を構成す
る米国特許出願第０７／３８８，２０１号（ＥＰＯ公開
第３８３ ４７２号）に記載されているように、Ｌｙｓ
B28ＰｒｏB29−ｈＩは、Ｂ鎖のＢ28位でプロリンがリジ
ンで置換されており、Ｂ鎖のＢ29位でリジンがプロリン
で置換されているヒトインシュリンである。
−ヒトインシュリンのアルカリ金属の塩又はアンモニウ
ムの塩の結晶の製造法を提供する。「ＬｙｓB28Ｐｒｏ
B29−ヒトインシュリン」又は「ＬｙｓB28ＰｒｏB29−
ｈＩ」なる用語は、２量化又は自己会合しにくい即効性
インシュリンアナログである。本明細書の一部を構成す
る米国特許出願第０７／３８８，２０１号（ＥＰＯ公開
第３８３ ４７２号）に記載されているように、Ｌｙｓ
B28ＰｒｏB29−ｈＩは、Ｂ鎖のＢ28位でプロリンがリジ
ンで置換されており、Ｂ鎖のＢ29位でリジンがプロリン
で置換されているヒトインシュリンである。
【００１１】「等電点」なる用語は、溶液中でＬｙｓ
B28ＰｒｏB29−ｈＩの正味の電荷が０であるｐＨを意味
する。ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの等電点はｐＨ約５.
４である。
B28ＰｒｏB29−ｈＩの正味の電荷が０であるｐＨを意味
する。ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの等電点はｐＨ約５.
４である。
【００１２】「薬学的に許容し得る保存剤」なる用語
は、微生物の増殖を防止するために非経口製剤に普通用
いられる試薬を意味する。薬学的に許容し得る保存剤に
はフェノール、ｍ−クレゾール、レソルシノール、及び
メチルパラベンが含まれる。
は、微生物の増殖を防止するために非経口製剤に普通用
いられる試薬を意味する。薬学的に許容し得る保存剤に
はフェノール、ｍ−クレゾール、レソルシノール、及び
メチルパラベンが含まれる。
【００１３】「アルカリ金属」なる用語は当業者には知
られており、リチウム、ナトリウムカリウム、ルビジウ
ム及びセシウムが含まれる。好ましくは、アルカリ金属
はナトリウム又はカリウムである。
られており、リチウム、ナトリウムカリウム、ルビジウ
ム及びセシウムが含まれる。好ましくは、アルカリ金属
はナトリウム又はカリウムである。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明は、ＬｙｓB28ＰｒｏB29−
ｈＩを保存剤の存在下でアルカリ金属又はアンモニウム
で結晶化させて安定な結晶固体を製造する条件を開示す
る。結晶化の間のＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの濃度は約
５ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬである。好ましく
は、約１８ｍｇ／ｍＬから約２２ｍｇ／ｍＬの間であ
り、最も好ましくは、約２０ｍｇ／ｍＬの濃度である。
ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの溶液は、アナログを水性の
希釈剤中に溶解することによって調製する。酸溶解のよ
うに一般に知られているものによって溶解を助けてもよ
く、すなわち生理的に許容される酸、好ましくは０.５
Ｎから１.０Ｎの酢酸でｐＨを約３.０から３.５に下げ
る。他の生理的に許容される酸にはクエン酸及びリン酸
が含まれる。酸の選択は決定的なものではない。しか
し、酢酸塩、リン酸塩、又はクエン酸塩が緩衝液として
結晶化に必要なｐＨ調整を促進するということは、当業
者は認識するであろう。他の酸は、二塩基リン酸ナトリ
ウム、ＴＲＩＳ、酢酸ナトリウム、又はクエン酸ナトリ
ウムなどの生理的に許容される緩衝液とともに使用し得
る。緩衝液の選択及び濃度は当業者には知られていると
ころである。
ｈＩを保存剤の存在下でアルカリ金属又はアンモニウム
で結晶化させて安定な結晶固体を製造する条件を開示す
る。結晶化の間のＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの濃度は約
５ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬである。好ましく
は、約１８ｍｇ／ｍＬから約２２ｍｇ／ｍＬの間であ
り、最も好ましくは、約２０ｍｇ／ｍＬの濃度である。
ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの溶液は、アナログを水性の
希釈剤中に溶解することによって調製する。酸溶解のよ
うに一般に知られているものによって溶解を助けてもよ
く、すなわち生理的に許容される酸、好ましくは０.５
Ｎから１.０Ｎの酢酸でｐＨを約３.０から３.５に下げ
る。他の生理的に許容される酸にはクエン酸及びリン酸
が含まれる。酸の選択は決定的なものではない。しか
し、酢酸塩、リン酸塩、又はクエン酸塩が緩衝液として
結晶化に必要なｐＨ調整を促進するということは、当業
者は認識するであろう。他の酸は、二塩基リン酸ナトリ
ウム、ＴＲＩＳ、酢酸ナトリウム、又はクエン酸ナトリ
ウムなどの生理的に許容される緩衝液とともに使用し得
る。緩衝液の選択及び濃度は当業者には知られていると
ころである。
【００１５】保存剤は、ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの等
電点より低いｐＨでアナログ溶液に加える。通常、保存
剤の濃度はモル過剰であり、具体的には約０.００５ｍ
Ｍから約０.０５ｍＭである。より好ましくは、保存剤
は０.０２３ｍＭの濃度（体積で０.３％）の液化フェノ
ールである。
電点より低いｐＨでアナログ溶液に加える。通常、保存
剤の濃度はモル過剰であり、具体的には約０.００５ｍ
Ｍから約０.０５ｍＭである。より好ましくは、保存剤
は０.０２３ｍＭの濃度（体積で０.３％）の液化フェノ
ールである。
【００１６】ｐＨ調整前の溶液のカチオン濃度は約３０
ｍＭから約１００ｍＭである（後述のカチオン初濃
度）。好ましくは、カチオン初濃度は３０ｍＭから５０
ｍＭである。最終カチオン濃度はｐＨ調整に用いるアル
カリ金属又はアンモニウムの量によって変更可能であ
る。通常、最終カチオン濃度は約５００ｍＭから８００
ｍＭの間である。カチオンはアルカリ金属又はアンモニ
ウムからなる群から選択される。好ましくは、カチオン
はナトリウムである。
ｍＭから約１００ｍＭである（後述のカチオン初濃
度）。好ましくは、カチオン初濃度は３０ｍＭから５０
ｍＭである。最終カチオン濃度はｐＨ調整に用いるアル
カリ金属又はアンモニウムの量によって変更可能であ
る。通常、最終カチオン濃度は約５００ｍＭから８００
ｍＭの間である。カチオンはアルカリ金属又はアンモニ
ウムからなる群から選択される。好ましくは、カチオン
はナトリウムである。
【００１７】ｐＨをＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュ
リンの等電点以下から約８.５から９.５の間、好ましく
は約８.９から約９.１の間にアルカリ金属又はアンモニ
ウムの塩基で調整する。好ましいアルカリ金属の塩基は
水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、又は水酸化カ
リウムである。最も好ましくは、塩基は水酸化ナトリウ
ムである。
リンの等電点以下から約８.５から９.５の間、好ましく
は約８.９から約９.１の間にアルカリ金属又はアンモニ
ウムの塩基で調整する。好ましいアルカリ金属の塩基は
水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、又は水酸化カ
リウムである。最も好ましくは、塩基は水酸化ナトリウ
ムである。
【００１８】ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩを希釈剤に溶解
する方法、又は保存剤、カチオン、及びＬｙｓB28Ｐｒ
ｏB29−ｈＩを希釈剤に加える順序は、本法については
決定的なものではない。結晶化の温度もまた決定的なも
のではない。許容できる温度範囲は、約４℃から約２６
℃である。好ましくは、約４℃から約６℃である。
する方法、又は保存剤、カチオン、及びＬｙｓB28Ｐｒ
ｏB29−ｈＩを希釈剤に加える順序は、本法については
決定的なものではない。結晶化の温度もまた決定的なも
のではない。許容できる温度範囲は、約４℃から約２６
℃である。好ましくは、約４℃から約６℃である。
【００１９】結晶は撹拌して、又は撹拌せずに生成し、
集め、洗浄し得る。請求の範囲に記載されている方法に
よって調製した結晶は、残留する溶解性タンパクの除去
に用いる洗浄の条件に敏感である。したがって、結晶は
酢酸ナトリウム中で好ましく洗浄して再溶解を防止す
る。好ましくは、結晶化は撹拌しながら行う。
集め、洗浄し得る。請求の範囲に記載されている方法に
よって調製した結晶は、残留する溶解性タンパクの除去
に用いる洗浄の条件に敏感である。したがって、結晶は
酢酸ナトリウム中で好ましく洗浄して再溶解を防止す
る。好ましくは、結晶化は撹拌しながら行う。
【００２０】ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩは必要であれば
濾過を容易にするために再結晶してもよい。結晶は集め
て、慣用の方法により乾燥し得る。本発明にしたがって
製造した結晶は商業的規模において高品質、高収率であ
る。結晶は、充填／仕上げの操作のための取り扱い及び
調剤に適当である安定な固体の形の薬物原材料を提供す
る。本結晶化法によって物質の純度又は凝集動力学が変
化することはない。
濾過を容易にするために再結晶してもよい。結晶は集め
て、慣用の方法により乾燥し得る。本発明にしたがって
製造した結晶は商業的規模において高品質、高収率であ
る。結晶は、充填／仕上げの操作のための取り扱い及び
調剤に適当である安定な固体の形の薬物原材料を提供す
る。本結晶化法によって物質の純度又は凝集動力学が変
化することはない。
【００２１】最も意味深いのは結晶化の条件が保存剤、
塩基及びカチオン濃度の選択に敏感であることであり、
すなわち、製造工程を実施する当業者は明確な結晶に到
達するために本明細書中で定義したパラメーターを調整
するであろう。それぞれの保存剤−カチオン−塩基の組
み合わせのための至適条件は、開示の範囲内で変更す
る。
塩基及びカチオン濃度の選択に敏感であることであり、
すなわち、製造工程を実施する当業者は明確な結晶に到
達するために本明細書中で定義したパラメーターを調整
するであろう。それぞれの保存剤−カチオン−塩基の組
み合わせのための至適条件は、開示の範囲内で変更す
る。
【００２２】豚肉又は牛肉インシュリンの結晶の形成は
広く研究されてきた。ジャクソンの米国特許第３，７１
９，６５５号は牛肉又は豚肉インシュリンのアンモニウ
ム及びアルカリ金属の塩の製造法を開示している。この
方法は豚肉又は牛肉インシュリン及びアルカリ金属カチ
オン又はアンモニウムカチオンからなる群から選択され
る０.２molarから０.１molarの濃度のカチオンを含んで
なる溶液を含む豚肉又は牛肉インシュリンの塩基性を、
ｐＨ約７.２からｐＨ約１０.０にアルカリ金属又はアン
モニウムの塩基を用いて調整することを含んでなる。イ
ンシュリン結晶の最大の収量はｐＨ８.２においてであ
る。ジャクソンはさらに保存剤（フェノール又はメチル
ｐ−ヒドロキシ安息香酸）の存在はインシュリンのナ
トリウム又はアンモニウム結晶化の性質又は収率を変え
ないと開示している。驚くべきことにｐＨ及び保存剤の
存在は請求の範囲に記載した方法に深く影響している。
広く研究されてきた。ジャクソンの米国特許第３，７１
９，６５５号は牛肉又は豚肉インシュリンのアンモニウ
ム及びアルカリ金属の塩の製造法を開示している。この
方法は豚肉又は牛肉インシュリン及びアルカリ金属カチ
オン又はアンモニウムカチオンからなる群から選択され
る０.２molarから０.１molarの濃度のカチオンを含んで
なる溶液を含む豚肉又は牛肉インシュリンの塩基性を、
ｐＨ約７.２からｐＨ約１０.０にアルカリ金属又はアン
モニウムの塩基を用いて調整することを含んでなる。イ
ンシュリン結晶の最大の収量はｐＨ８.２においてであ
る。ジャクソンはさらに保存剤（フェノール又はメチル
ｐ−ヒドロキシ安息香酸）の存在はインシュリンのナ
トリウム又はアンモニウム結晶化の性質又は収率を変え
ないと開示している。驚くべきことにｐＨ及び保存剤の
存在は請求の範囲に記載した方法に深く影響している。
【００２３】表１は、ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの結晶
化に及ぼすｐＨ及び保存剤の影響を示している。この実
験において、カチオンの初濃度を３７.５ｍＭに固定し
た。最終濃度はｐＨの調整に必要なカチオンの量に従っ
て変えた。「結晶生成せず」なる表示は、結晶が得られ
なかったか又は圧倒的に非晶性の生成物が得られたこと
を示している。「結晶生成」なる表示は本製造法により
結晶が生成したことを示している。
化に及ぼすｐＨ及び保存剤の影響を示している。この実
験において、カチオンの初濃度を３７.５ｍＭに固定し
た。最終濃度はｐＨの調整に必要なカチオンの量に従っ
て変えた。「結晶生成せず」なる表示は、結晶が得られ
なかったか又は圧倒的に非晶性の生成物が得られたこと
を示している。「結晶生成」なる表示は本製造法により
結晶が生成したことを示している。
【表１】 表１に開示されたデータは、保存剤が結晶化において必
要な要素であることを示している。データはさらにｐＨ
に対する結晶化の感受性を示している。結晶化はｐＨ約
８.５からｐＨ約９.５で行われる。
要な要素であることを示している。データはさらにｐＨ
に対する結晶化の感受性を示している。結晶化はｐＨ約
８.５からｐＨ約９.５で行われる。
【００２４】最も意外なのは、溶解性ＬｙｓB28Ｐｒｏ
B29−ｈＩは、インシュリン結晶を調製する条件下では
結晶化しないということである。表２はジャクソンの米
国特許第３，７１９，６５５号に記載されている商業的
な８.２法におけるヒトインシュリン、８.２法における
ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩ、及び請求の範囲に記載の方
法におけるＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの比較を表してい
る。
B29−ｈＩは、インシュリン結晶を調製する条件下では
結晶化しないということである。表２はジャクソンの米
国特許第３，７１９，６５５号に記載されている商業的
な８.２法におけるヒトインシュリン、８.２法における
ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩ、及び請求の範囲に記載の方
法におけるＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの比較を表してい
る。
【表２】
【００２５】ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩは古典的な（溶
液）方法、固相法、半合成法、及びより最近の組み替え
ＤＮＡ法を含む、様々な確認されたペプチド合成技術の
いずれかによって製造し得る。例えばチャンス（Chanc
e）らの米国特許出願第０７／３８８，２０１号、ＥＰ
Ｏ公開第３８３ ４７２号はＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒト
インシュリンの製造を開示している。
液）方法、固相法、半合成法、及びより最近の組み替え
ＤＮＡ法を含む、様々な確認されたペプチド合成技術の
いずれかによって製造し得る。例えばチャンス（Chanc
e）らの米国特許出願第０７／３８８，２０１号、ＥＰ
Ｏ公開第３８３ ４７２号はＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒト
インシュリンの製造を開示している。
【００２６】以下の実施例は、単にインシュリンアナロ
グの製造及び本発明のさらなる実例を提供するものであ
る。本発明の範囲は単に以下の実施例からなると解釈さ
れるものではない。以下の実施例においてカチオンの最
終濃度は、初めのカチオン含量をｐＨ調整及びその後の
塩のスパイキング（spiking）の間に加えたカチオンの
総量に加えることによって計算した。このカチオンの総
量を結晶化の最終体積（最初の溶液＋ｐＨ調整の間に加
えた体積）で割り、最終のモル濃度を得る。
グの製造及び本発明のさらなる実例を提供するものであ
る。本発明の範囲は単に以下の実施例からなると解釈さ
れるものではない。以下の実施例においてカチオンの最
終濃度は、初めのカチオン含量をｐＨ調整及びその後の
塩のスパイキング（spiking）の間に加えたカチオンの
総量に加えることによって計算した。このカチオンの総
量を結晶化の最終体積（最初の溶液＋ｐＨ調整の間に加
えた体積）で割り、最終のモル濃度を得る。
【００２７】
【実施例】実施例１ ２５ｍｇ／ｍＬのＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩ溶液 ４ｍ
Ｌと氷酢酸 ０.１ｍＬ、純水 ０.８１ｍＬ、及び２Ｍ
ＮａＣｌ ０.０９４ｍＬを混合してタンパク２０ｍｇ／
ｍＬ、ＮａＣｌ ３７.５ｍＭ、及び酢酸 ０.７５Ｍであ
る溶液にすることにより試料を調製した。液化フェノー
ルを加え、０.３％（体積／体積）の溶液にした（０.０
２３ｍＭ）。次いで１０％ ＮａＯＨ溶液１.４ｍＬでｐ
Ｈをおよそ９.０に上げた。次にこれを穏やかに撹拌し
ながら５℃に２４時間保ち、その後、明確な結晶を観察
した。
Ｌと氷酢酸 ０.１ｍＬ、純水 ０.８１ｍＬ、及び２Ｍ
ＮａＣｌ ０.０９４ｍＬを混合してタンパク２０ｍｇ／
ｍＬ、ＮａＣｌ ３７.５ｍＭ、及び酢酸 ０.７５Ｍであ
る溶液にすることにより試料を調製した。液化フェノー
ルを加え、０.３％（体積／体積）の溶液にした（０.０
２３ｍＭ）。次いで１０％ ＮａＯＨ溶液１.４ｍＬでｐ
Ｈをおよそ９.０に上げた。次にこれを穏やかに撹拌し
ながら５℃に２４時間保ち、その後、明確な結晶を観察
した。
【００２８】実施例２及び３ ２つの試料を実施例１に類似の方法で調製した。各試料
はＮａＣｌを３７.５ｍＭ、酢酸を０.７５Ｍ、及び液化
フェノールを０.３％ 体積／体積含む。しかし、１つの
溶液はＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩ １０ｍｇ／ｍＬを含
み、他方の溶液はＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩを２５ｍｇ
／ｍＬ含む。各溶液のｐＨを１０％ＮａＯＨでおよそ
９.０に調整した。次に両方の試料を穏やかに撹拌しな
がら２４時間５℃に保った後、明確な結晶を観察した。
はＮａＣｌを３７.５ｍＭ、酢酸を０.７５Ｍ、及び液化
フェノールを０.３％ 体積／体積含む。しかし、１つの
溶液はＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩ １０ｍｇ／ｍＬを含
み、他方の溶液はＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩを２５ｍｇ
／ｍＬ含む。各溶液のｐＨを１０％ＮａＯＨでおよそ
９.０に調整した。次に両方の試料を穏やかに撹拌しな
がら２４時間５℃に保った後、明確な結晶を観察した。
【００２９】実施例４及び５ ２つの試料を実施例１に類似の方法で調製した。各試料
はタンパクを２０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌを３７.５ｍＭ
、及び酢酸を０.７５Ｍを含む。しかし、１つの溶液は
液化フェノールを０.１％ 体積／体積含み、他方の溶液
は液化フェノールを０.５％ 体積／体積含む。各溶液の
ｐＨを１０％ ＮａＯＨでおよそ９.０に調整した。次い
で、両方の試料を穏やかに撹拌しながら２４時間５℃に
保った後、明確な結晶を観察した。
はタンパクを２０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌを３７.５ｍＭ
、及び酢酸を０.７５Ｍを含む。しかし、１つの溶液は
液化フェノールを０.１％ 体積／体積含み、他方の溶液
は液化フェノールを０.５％ 体積／体積含む。各溶液の
ｐＨを１０％ ＮａＯＨでおよそ９.０に調整した。次い
で、両方の試料を穏やかに撹拌しながら２４時間５℃に
保った後、明確な結晶を観察した。
【００３０】実施例６、７及び８ 試料を実施例１に類似の方法で調製した。各試料はタン
パクを２０ｍｇ／ｍＬ、酢酸を０.７５Ｍ、及び液化フ
ェノールを０.３％ 体積／体積含む。しかし、１つの溶
液はＮａＣｌを２５ｍＭ含み、１つはＮａＣｌを５０ｍ
Ｍ含み、１つはＮａＣｌを２００ｍＭ含む。各溶液のｐ
Ｈを１０％ ＮａＯＨでおよそ９.０に調整した。試料を
穏やかに撹拌しながら２４時間５℃に保った。この後、
初濃度２５ｍＭのＮａＣｌを含む溶液は結晶も非晶性の
沈殿も存在せず透明のままであった。初濃度５０ｍＭ及
び２００ｍＭのＮａＣｌを含む溶液は明確な結晶を非晶
性の沈殿とともに含んでいた。
パクを２０ｍｇ／ｍＬ、酢酸を０.７５Ｍ、及び液化フ
ェノールを０.３％ 体積／体積含む。しかし、１つの溶
液はＮａＣｌを２５ｍＭ含み、１つはＮａＣｌを５０ｍ
Ｍ含み、１つはＮａＣｌを２００ｍＭ含む。各溶液のｐ
Ｈを１０％ ＮａＯＨでおよそ９.０に調整した。試料を
穏やかに撹拌しながら２４時間５℃に保った。この後、
初濃度２５ｍＭのＮａＣｌを含む溶液は結晶も非晶性の
沈殿も存在せず透明のままであった。初濃度５０ｍＭ及
び２００ｍＭのＮａＣｌを含む溶液は明確な結晶を非晶
性の沈殿とともに含んでいた。
【００３１】実施例９及び１０ ２つの試料を実施例１に類似の方法で調製した。各試料
はタンパクを２０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌを３７.５ｍＭ
、及び液化フェノールを０.３％体積／体積含む。しか
し、１つの溶液は０.５Ｎ 酢酸を含み、他方の溶液は
１.０Ｎ 酢酸を含む。各溶液のｐＨを１０％ ＮａＯＨ
でおよそ９.０に調整した。次いで、両方の試料を穏や
かに撹拌しながら２４時間５℃に保った。０.５Ｎ 酢酸
中で行った結晶化により明確な結晶が生成した。１.０
Ｎ 酢酸中で行った結晶化は小さな結晶と非晶性の沈殿
を含んでいた。
はタンパクを２０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌを３７.５ｍＭ
、及び液化フェノールを０.３％体積／体積含む。しか
し、１つの溶液は０.５Ｎ 酢酸を含み、他方の溶液は
１.０Ｎ 酢酸を含む。各溶液のｐＨを１０％ ＮａＯＨ
でおよそ９.０に調整した。次いで、両方の試料を穏や
かに撹拌しながら２４時間５℃に保った。０.５Ｎ 酢酸
中で行った結晶化により明確な結晶が生成した。１.０
Ｎ 酢酸中で行った結晶化は小さな結晶と非晶性の沈殿
を含んでいた。
【００３２】実施例１１、１２、１３、及び１４ 試料を実施例１に類似の方法で調製した。各試料はタン
パクを２０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌを３７.５ｍＭ、０.７
５Ｎ 酢酸、及び液化フェノールを０.３％体積／体積含
む。各溶液のｐＨを１０％ ＮａＯＨで８.２から１０.
０の範囲の異なるｐＨに調整した。すべての試料を穏や
かに撹拌しながら２４時間５℃に保った。ｐＨおよそ
８.２で行った結晶化は結晶も非晶性の沈殿も生成しな
かった。ｐＨおよそ８.５で行った結晶化は明確でない
結晶と非晶性の沈殿を生成した。ｐＨおよそ９.５で行
った結晶化は明確な結晶を生成した。ｐＨおよそ１０.
０で行った結晶化は結晶も非晶性の沈殿も生成しなかっ
た。
パクを２０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌを３７.５ｍＭ、０.７
５Ｎ 酢酸、及び液化フェノールを０.３％体積／体積含
む。各溶液のｐＨを１０％ ＮａＯＨで８.２から１０.
０の範囲の異なるｐＨに調整した。すべての試料を穏や
かに撹拌しながら２４時間５℃に保った。ｐＨおよそ
８.２で行った結晶化は結晶も非晶性の沈殿も生成しな
かった。ｐＨおよそ８.５で行った結晶化は明確でない
結晶と非晶性の沈殿を生成した。ｐＨおよそ９.５で行
った結晶化は明確な結晶を生成した。ｐＨおよそ１０.
０で行った結晶化は結晶も非晶性の沈殿も生成しなかっ
た。
【００３３】実施例１５ 実施例１に記載された結晶化をおよそ２３℃の温度で繰
り返した。この温度で２４時間穏やかに撹拌すると、明
確な結晶が観察された。
り返した。この温度で２４時間穏やかに撹拌すると、明
確な結晶が観察された。
【００３４】実施例１６ 実施例１に記載された結晶化を保存剤なしで繰り返し
た。２４時間５℃で穏やかに撹拌しても、結晶も非晶性
の沈殿も観察されなかった。
た。２４時間５℃で穏やかに撹拌しても、結晶も非晶性
の沈殿も観察されなかった。
【００３５】実施例１７ 実施例１に記載された結晶化をＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈ
Ｉではなくヒトインシュリンを用いて繰り返した。およ
そｐＨ９.０で溶液は乳白色になり、これは非晶性の沈
殿の存在を示している。これを顕微鏡で確認した。２４
時間５℃で穏やかに撹拌しても、溶液はなお、非晶性の
沈殿のみを含んでいた。
Ｉではなくヒトインシュリンを用いて繰り返した。およ
そｐＨ９.０で溶液は乳白色になり、これは非晶性の沈
殿の存在を示している。これを顕微鏡で確認した。２４
時間５℃で穏やかに撹拌しても、溶液はなお、非晶性の
沈殿のみを含んでいた。
【００３６】実施例１８ 実施例１に記載された結晶化を、保存剤の添加がｐＨを
およそ９.０に調整した後であることを除いて繰り返し
た。２４時間５℃で穏やかに撹拌しても、圧倒的な量の
非晶性の沈殿と単離された結晶が観察された。この物質
はさらなる処理には適さない。
およそ９.０に調整した後であることを除いて繰り返し
た。２４時間５℃で穏やかに撹拌しても、圧倒的な量の
非晶性の沈殿と単離された結晶が観察された。この物質
はさらなる処理には適さない。
【００３７】実施例１９、２０、及び２１ 様々な保存剤を用いて実施例１に記載の結晶化を繰り返
した。各保存剤を０.０２３ｍＭになるように結晶化溶
液に加えた。用いた保存剤はメタ−クレゾール、レソル
シノール、及びメチルパラベンであった。５℃で２４時
間穏やかに撹拌すると各試料中に結晶が観察された。メ
タ−クレゾールの存在下で行った結晶化は双晶挙動を示
す長方形の結晶を生成した。レソルシノールの存在下で
生成した結晶は事実上板状であり、メチルパラベンの存
在下で生成した結晶は八面体であった。
した。各保存剤を０.０２３ｍＭになるように結晶化溶
液に加えた。用いた保存剤はメタ−クレゾール、レソル
シノール、及びメチルパラベンであった。５℃で２４時
間穏やかに撹拌すると各試料中に結晶が観察された。メ
タ−クレゾールの存在下で行った結晶化は双晶挙動を示
す長方形の結晶を生成した。レソルシノールの存在下で
生成した結晶は事実上板状であり、メチルパラベンの存
在下で生成した結晶は八面体であった。
【００３８】実施例２２及び２３ ナトリウム以外のカチオンを用いて実施例１に記載の結
晶化を繰り返した。各試料はタンパクを２０ｍｇ／ｍ
Ｌ、及び０.７５Ｎ 酢酸、液化フェノールを０.３％体
積／体積、及びカリウム又はアンモニウムのいずれかの
カチオンの塩化物の塩を３７.５ｍＭ含む。各溶液のｐ
Ｈを１０％ ＫＯＨ又は濃水酸化アンモニウム溶液を用
いてｐＨをおよそ９.０に調整した。５℃で２４時間穏
やかに撹拌すると各試料中に結晶が観察された。
晶化を繰り返した。各試料はタンパクを２０ｍｇ／ｍ
Ｌ、及び０.７５Ｎ 酢酸、液化フェノールを０.３％体
積／体積、及びカリウム又はアンモニウムのいずれかの
カチオンの塩化物の塩を３７.５ｍＭ含む。各溶液のｐ
Ｈを１０％ ＫＯＨ又は濃水酸化アンモニウム溶液を用
いてｐＨをおよそ９.０に調整した。５℃で２４時間穏
やかに撹拌すると各試料中に結晶が観察された。
【００３９】実施例２４及び２５ ０.５Ｎ 酢酸中のＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩの試料を透
析濾過（diafilter）して緩衝液を０.１Ｍ クエン酸又
は０.１Ｍ リン酸のいずれかに交換した。次いで各溶液
をタンパクが２０ｍｇ／ｍＬ、及びＮａＣｌが３７.５
ｍＭ、液化フェノールが０.３％体積／体積である結晶
化に付した。各溶液のｐＨを１０％ ＮａＯＨを用いて
ｐＨをおよそ９.０に調整した。５℃で２４時間穏やか
に撹拌してもいずれの試料中にも結晶は観察されなかっ
た。さらなるＮａＣｌを溶液（リン酸試料中に４Ｍ Ｎ
ａＣｌを０.４ｍＬ、クエン酸試料中に４Ｍ ＮａＣｌを
０.３ｍＬ）に加えた。溶液を２４時間撹拌した。両方
の溶液中に均一な結晶が観察された。
析濾過（diafilter）して緩衝液を０.１Ｍ クエン酸又
は０.１Ｍ リン酸のいずれかに交換した。次いで各溶液
をタンパクが２０ｍｇ／ｍＬ、及びＮａＣｌが３７.５
ｍＭ、液化フェノールが０.３％体積／体積である結晶
化に付した。各溶液のｐＨを１０％ ＮａＯＨを用いて
ｐＨをおよそ９.０に調整した。５℃で２４時間穏やか
に撹拌してもいずれの試料中にも結晶は観察されなかっ
た。さらなるＮａＣｌを溶液（リン酸試料中に４Ｍ Ｎ
ａＣｌを０.４ｍＬ、クエン酸試料中に４Ｍ ＮａＣｌを
０.３ｍＬ）に加えた。溶液を２４時間撹拌した。両方
の溶液中に均一な結晶が観察された。
【００４０】実施例２６ ジャクソンの米国特許第３，７１９，６５５号に記載
の、ｐＨ８.２の方法を用いて結晶化を行った。０.７５
Ｎ 酢酸中の２０ｍｇ／ｍＬ ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩ
の５ｍＬの試料を調製した。この溶液にエデト酸ナトリ
ウムを８ｇ／Ｌの量で加えた。ＮａＣｌ ０.０５ｇをこ
の溶液に加えた。この溶液のｐＨを１０％ＮａＯＨ溶液
を用いて８.４に調整した。この溶液に液化フェノール
を３.３ｍＬ／Ｌになるように加えた。ＮａＣｌ ０.０
２５ｇをこの溶液にさらに加えた。溶液の最終のｐＨは
８.２２であった。室温で１時間撹拌しても結晶は観察
されず、非晶性の沈殿のみが観察された。
の、ｐＨ８.２の方法を用いて結晶化を行った。０.７５
Ｎ 酢酸中の２０ｍｇ／ｍＬ ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ｈＩ
の５ｍＬの試料を調製した。この溶液にエデト酸ナトリ
ウムを８ｇ／Ｌの量で加えた。ＮａＣｌ ０.０５ｇをこ
の溶液に加えた。この溶液のｐＨを１０％ＮａＯＨ溶液
を用いて８.４に調整した。この溶液に液化フェノール
を３.３ｍＬ／Ｌになるように加えた。ＮａＣｌ ０.０
２５ｇをこの溶液にさらに加えた。溶液の最終のｐＨは
８.２２であった。室温で１時間撹拌しても結晶は観察
されず、非晶性の沈殿のみが観察された。
【００４１】実施例２７ 酢酸緩衝液 ５.６８Ｌ中の、１プロセスで９９.７ベー
スグラム（ｂａｓｅｇｒａｍｓ）のＬｙｓB28ＰｒｏB29
−ヒトインシュリンをガラス容器中、酢酸／塩溶液（水
５Ｌと氷酢酸 ０.２１５Ｌ及び塩化ナトリウム １１ｇ
を混合した溶液１.３２Ｌ）で希釈し、２７６ｎｍでの
吸光度を２０.１とした。この物質を０.２ミクロンのフ
ィルターに通した。液化フェノールをこの溶液に３.３
ｍＬ／Ｌ（合計２２.６ｍＬ）になるように加え、得ら
れた溶液のｐＨを３ 以下と確認した。溶液に水酸化ナ
トリウム（１０％重量／体積の溶液）１.７５ｍＬを加
え、ｐＨを８.９９に調整した。次いで、溶液を２〜８
℃で１５分間撹拌し、撹拌を終了し、得られた結晶を２
４時間沈降させた。結晶が沈降したら、上澄み ６.２Ｌ
を傾斜し、結晶を残りの容積中でスラリーとし、１Ｌ容
の遠心管中、ＤＰＲ６０００遠心分離機を用いて４００
０ｒｐｍ（およそ４０００×Ｇ）で１０〜２０分間遠心
分離した。遠心物は傾斜した。結晶（およそ３５０ｍＬ
の押し固められた堆積物）を１Ｍ 酢酸ナトリウム１.３
Ｌでスラリーにして４０００ｒｐｍで１０〜２０分間再
度遠心分離した。次いで結晶を撹拌しながらおよそ１１
Ｌの冷却したアルコール ＳＤ Ｎｏ.３Ａアブソリュー
ト（２〜８℃）に加え、４０００ｒｐｍで１５分間再度
遠心分離した。アルコール遠心物を傾斜し、アルコール
洗浄をさらに２回繰り返した。アルコールで洗浄された
結晶（湿重量２９２ｇ）を減圧乾燥した。全収率は９０
％以上であった。続く幾つかの方法による分析は、この
結晶化法により物質の純度又は凝集動力学が変化するこ
とはないということを示した。
スグラム（ｂａｓｅｇｒａｍｓ）のＬｙｓB28ＰｒｏB29
−ヒトインシュリンをガラス容器中、酢酸／塩溶液（水
５Ｌと氷酢酸 ０.２１５Ｌ及び塩化ナトリウム １１ｇ
を混合した溶液１.３２Ｌ）で希釈し、２７６ｎｍでの
吸光度を２０.１とした。この物質を０.２ミクロンのフ
ィルターに通した。液化フェノールをこの溶液に３.３
ｍＬ／Ｌ（合計２２.６ｍＬ）になるように加え、得ら
れた溶液のｐＨを３ 以下と確認した。溶液に水酸化ナ
トリウム（１０％重量／体積の溶液）１.７５ｍＬを加
え、ｐＨを８.９９に調整した。次いで、溶液を２〜８
℃で１５分間撹拌し、撹拌を終了し、得られた結晶を２
４時間沈降させた。結晶が沈降したら、上澄み ６.２Ｌ
を傾斜し、結晶を残りの容積中でスラリーとし、１Ｌ容
の遠心管中、ＤＰＲ６０００遠心分離機を用いて４００
０ｒｐｍ（およそ４０００×Ｇ）で１０〜２０分間遠心
分離した。遠心物は傾斜した。結晶（およそ３５０ｍＬ
の押し固められた堆積物）を１Ｍ 酢酸ナトリウム１.３
Ｌでスラリーにして４０００ｒｐｍで１０〜２０分間再
度遠心分離した。次いで結晶を撹拌しながらおよそ１１
Ｌの冷却したアルコール ＳＤ Ｎｏ.３Ａアブソリュー
ト（２〜８℃）に加え、４０００ｒｐｍで１５分間再度
遠心分離した。アルコール遠心物を傾斜し、アルコール
洗浄をさらに２回繰り返した。アルコールで洗浄された
結晶（湿重量２９２ｇ）を減圧乾燥した。全収率は９０
％以上であった。続く幾つかの方法による分析は、この
結晶化法により物質の純度又は凝集動力学が変化するこ
とはないということを示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブラッドリー・マイケル・ロバーツ アメリカ合衆国46143インディアナ州グリ ーンウッド、ランニング・ブルック・コー ト2280番
Claims (4)
- 【請求項１】 ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュリン
のアルカリ金属又はアンモニウムの塩の結晶の製造方法
であって、該方法は溶液のｐＨをＬｙｓB28ＰｒｏB29−
ヒトインシュリンの等電点以下のｐＨからｐＨ約８.５
からｐＨ約９.５の間に、アルカリ金属又はアンモニウ
ムの塩基を用いて調整することを含んでなり、該溶液は
約５ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬのＬｙｓB28Ｐｒ
ｏB29−ヒトインシュリン、薬学的に許容し得る保存
剤、及び初濃度が約３０ｍＭから約１００ｍＭであるカ
チオンを含んでなり、該カチオンはアルカリ金属又はア
ンモニウムからなる群から選択される方法。 - 【請求項２】 ｐＨが８.９から９.１に調整される請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】 溶液が、酢酸塩、リン酸塩又はクエン酸
塩から選択される緩衝液をさらに含んでなる請求項２に
記載の方法。 - 【請求項４】 ＬｙｓB28ＰｒｏB29−ヒトインシュリン
のアルカリ金属又はアンモニウムの塩の結晶の製造方法
であって、溶液のｐＨをｐＨ５.４以下からｐＨ８.９か
ら９.１の間に、ナトリウム、カリウム又はアンモニウ
ムの塩基で調整することを含んでなり、該溶液はＬｙｓ
B28ＰｒｏB29−ヒトインシュリンを１８ｍｇ／ｍＬから
２２ｍｇ／ｍＬ、フェノール、酢酸塩緩衝液及びナトリ
ウム、カリウム又はアンモニウムカチオンを３０ｍＭ〜
１００ｍＭの濃度で含んでなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US332296 | 1994-10-31 | ||
| US08/332,296 US5597893A (en) | 1994-10-31 | 1994-10-31 | Preparation of stable insulin analog crystals |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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