CN113004389A - 一种猪胰岛素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪胰岛素的制备方法，本发明将经猪胰腺提取的猪胰岛素，经离子交换及反相层析纯化可以制备得到纯度99％以上的猪胰岛素，再经结晶洗涤干燥过程获得猪胰岛素成品；本发明中经离子交换层析纯化的猪胰岛素再经反相层析纯化得到的纯度可达99％收率达92％，结晶洗涤干燥后得到的成品的纯度达到99％；本发明进一步提高了猪胰岛素的纯度，降低了相关杂质蛋白的含量，同时涉及的有机溶剂仅为廉价易得的工业乙醇，降低了生产成本，提高产品的品质。
Description
技术领域
本发明涉及药物合成及化工领域，特别涉及一种猪胰岛素的制备方法。
背景技术
糖尿病是一种常见的代谢内分泌疾病，其已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病。糖尿病常常伴有多种并发症，容易引起多种器官损害、功能性障碍和衰竭，危害很大。目前，中国已成为世界上糖尿病患者人数最多的国家。
胰岛素为最有效的糖尿病治疗药物之一，而猪胰岛素来自猪胰腺的提取，方便易得，同时价格较其他胰岛素便宜，能够满足部分贫困地区的需求。市售猪胰岛素纯度偏低，同时生产过程涉及有机溶剂受限。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种猪胰岛素制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种猪胰岛素制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将经猪胰腺提取的胰岛素进行离子交换，锌盐沉析离心并收集蛋白沉淀；
步骤2，将步骤1获得的蛋白沉淀复溶，经反相层析纯化，锌盐沉析离心并收集蛋白沉淀；
步骤3，将步骤2获得的蛋白沉淀复溶，并对复溶液进行结晶得结晶溶液；
步骤4，将步骤3所述结晶溶液离心得猪胰岛素结晶，对结晶进行洗涤；
步骤5，将结晶置于不锈钢盘碾碎并于真空箱中干燥，制得胰岛素成品。
本发明步骤1提取胰岛素的方法、离子交换的方法可以为本领域的常规方法。
本发明步骤1和2中锌盐沉析离心并收集蛋白沉淀可以采用本领域的常规方法。
优选地，所述步骤2中，步骤1获得的蛋白沉淀按蛋白质量与溶液体积比1:8～12(g/ml)复溶，优选1:10(g/ml)复溶；pH优选为3～4，更优选为3.5；复溶所用的溶液优选为注射用水。
优选地，步骤2中，反相层析采用的填料为UniPS 10-300，所采用的层析系统为Relianx高压层析系统。
优选地，所述步骤2中，反相层析通过洗脱液洗脱获得目标产物；所述洗脱液由洗脱缓冲液A与洗脱缓冲液B组合使用；
所述缓冲液A，B为乙酸铵缓冲液、氯化钠缓冲液、乙酸钠冲液中任意一种，所述缓冲液A，B中还可以包括：有机相；所述有机相优选为乙醇；
优选地，所述缓冲液A为体积分数为5～15％的乙醇和0.01-0.5mol/L氯化钠形成的缓冲液；所述缓冲液B为质量分数为40～60％的乙醇和0.01-0.5mol/L氯化钠形成的缓冲液。
优选地，缓冲液A和缓冲液B中所述氯化钠浓度为0.01-0.2mol/L，最优为0.1mol/L；缓冲液A中乙醇的质量分数为10％，缓冲液B中乙醇的质量分数为50％。
优选地，所述步骤2中，缓冲液A和缓冲液B的pH为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，最优为3.0。
优选地，所述步骤2中，反相层析的载量为5-20mg/ml，优选为5-15mg/ml，最优选为10mg/ml。
优选地，所述步骤2中，缓冲梯度为0-60％B 1CV，60-80％B 15CV，线流速为152cm/h。检测波长为280nm。
步骤4，将步骤3所述结晶溶液离心得猪胰岛素结晶，对结晶进行洗涤；
步骤5，将结晶置于不锈钢盘碾碎并于真空箱中干燥，制得胰岛素成品。
优选地，所述步骤3中，以蛋白沉淀最终溶解浓度15～20mg/ml计算结晶前溶液体积。所述结晶前溶液各组分优选为55～65％(体积百分比)的注射用水，2～5％(体积百分比)的50％柠檬酸及33～40％(体积百分比)的有机溶剂，有机溶剂选自为丙酮，乙醚或乙醇中的一种，优选为乙醇；所述步骤3具体为，将步骤2获得的蛋白沉淀用结晶前溶液中的注射用水和柠檬酸复溶形成复溶液，然后加入结晶前溶液中的有机溶剂并调节pH至6.0-6.1对复溶液进行结晶得结晶溶液，结晶温度为18～22℃。pH调节可以采用本领域的常规方法，例如采用HCl进行调节。
优选地，所述步骤4中：结晶溶液经离心去除母液得猪胰岛素晶体，对晶体进行洗涤的具体方法为：先用5～7倍晶体体积的注射用水洗涤一次并离心去上清，再用7～9倍晶体体积的有机溶剂洗涤，有机溶剂可选丙酮，乙醚或乙醇，优选乙醇洗两次。
本发明将经猪胰腺提取的猪胰岛素，经离子交换及反相层析纯化可以制备得到纯度99％以上的猪胰岛素，再经结晶洗涤干燥过程获得猪胰岛素成品；本发明中经离子交换层析纯化的猪胰岛素再经反相层析纯化得到的纯度可达99％收率达92％，结晶洗涤干燥后得到的成品的纯度达到99％；本发明进一步提高了猪胰岛素的纯度，降低了相关杂质蛋白的含量，同时涉及的有机溶剂仅为廉价易得的工业乙醇，降低了生产成本，提高产品的品质。相对于现有技术，本发明的优点如下，
(1)本发明中离子交换层析后，再多一步反相层析，使用国产填料降低杂质，产品纯度，优于当前市售产品；反相层析的有机溶剂为简单易得的工业乙醇，可回收再利用降低成本。
(2)本发明中结晶溶液使用工业乙醇替代传统丙酮，乙醇获取不受管制，便于生产且经济。
(3)洗涤过程使用工业乙醇洗两遍，替代丙酮及乙醚的组合，可重复利用，安全且经济。
(4)本发明制备的猪胰岛素较市售纯度提高，同时制备过程更加优化。
附图说明
图1为实施例1-3不同pH缓冲液反相层析纯化前和纯化后HPLC检测图谱；
图2为实施例6-7猪胰岛素经不同有机溶剂洗涤后终产品HPLC检测图谱。
具体实施方式
以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所涉及试剂和材料，如无特殊说明，均为商业途径的市售产品。
本发明中，经猪胰腺提取的猪胰岛素经离子交换层析纯化后锌沉离心得蛋白沉淀，即为实施例1-3中待反相层析纯化的样品；反相层析纯化后的样品经锌沉离心的蛋白沉淀即为例4-5中结晶的样品；结晶溶液离心所得结晶即为例6-7中清洗的样品。
具体步骤为：
(1)离子交换层析纯化结束后所得样品加锌调沉，离心得蛋白沉淀即为待反相层析纯化样品。所述沉淀蛋白溶解按蛋白质量与溶液体积比1:10(g/ml)复溶，pH＝3.5。所述缓冲液A为质量分数为10％的乙醇和100mmol/L氯化钠形成的pH＝4.0的缓冲液；所述缓冲液B为质量分数为50％的乙醇和100mmol/L氯化钠形成的pH＝4.0的缓冲液。缓冲梯度为0-60％B 1CV，60-80％B 15CV，线流速为152cm/h。
(2)反相层析纯化得到的样品加锌调沉，离心得蛋白沉淀即为待结晶样品。以蛋白沉淀溶解后猪胰岛素浓度18mg/ml计结晶液体积，各组分为结晶体积60％的注射用水，3％的50％柠檬酸及37％的无水乙醇。
(3)所述结晶溶液离心去上清所得晶体即为待清洗样品。用6倍猪胰岛素晶体体积的注射用水洗涤晶体一次并离心去上清，再用8倍晶体体积的无水乙醇清洗两遍并离心去上清。
步骤(1)中反相层析降低了杂质，样品纯度可达99％，收率可达92.1％；反相层析缓冲液中的氯化钠为常见工业产品，有机溶剂为简单易得的工业乙醇，可回收再利用降低成本。
步骤(2)中结晶溶液中的有机溶剂使用工业乙醇替代传统丙酮，获取不受管制，便于生产且经济。
步骤(3)中清洗涉及的有机溶剂仅为工业乙醇，可重复利用，且替代丙酮及乙醚，安全经济。
实施例1：
反相层析
上样样品为经离子交换层析后所得的加锌调沉蛋白沉淀。所述沉淀蛋白按蛋白质量与溶液体积比1:10(g/ml)复溶，pH＝3.5。
反相交换层析采用UniPS 10-300填料在Relianx高压层析系统上进行。所述缓冲液A为质量分数为10％的乙醇和100mmol/L氯化钠形成的缓冲液；所述缓冲液B为质量分数为50％的乙醇和100mmol/L氯化钠形成的缓冲液，所有溶液均用盐酸调pH至3.0。层析柱柱体积为20ml。缓冲梯度为0-60％B 1CV，60-80％B 15CV，线流速为152cm/h。检测波长为280nm。
具体步骤为：
(1)缓冲液A液平衡填料2CV(CV是Column Volumn的缩写，为纯化柱柱床体积)
(2)取约200mg样品上样，上样后继续用缓冲液A液平衡2CV
(3)采用缓冲液A液和B按一定梯度例形成洗脱液，洗脱液洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
样品的上样量约10g/L柱床体积。实验结果为上样前目的蛋白纯度约96.5％，含量约193mg；洗脱液洗脱收集目的蛋白纯度约98.95％，含量约187mg。
说明根据实施例1的方法，纯化后猪胰岛素纯度仅达到98.95％(图1)。
实施例2：
上样样品同实施例1中样品。
反相交换层析采用UniPS 10-300填料在Relianx高压层析系统上进行。所述缓冲液A为质量分数为10％的乙醇和100mmol/L氯化钠形成的缓冲液；所述缓冲液B为质量分数为50％的乙醇和100mmol/L氯化钠形成的缓冲液，所有溶液均用盐酸调pH至3.5。层析柱柱体积为20ml。缓冲梯度为0-60％B 1CV，60-80％B 15CV，线流速为152cm/h。检测波长为280nm。
具体步骤为：
(1)缓冲液A液平衡填料2CV(CV是Column Volumn的缩写，为纯化柱柱床体积)
(2)取约200mg样品上样，上样后继续用缓冲液A液平衡2CV
(3)采用缓冲液A液和B按一定梯度例形成洗脱液，洗脱液洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
样品的上样量约10g/L柱床体积。实验结果为上样前目的蛋白纯度约96.4％，含量约191mg；洗脱液洗脱收集目的蛋白纯度约99.1％，含量约165mg。
说明根据实施例2的方法，纯化后猪胰岛素纯度达到99.1％，收率为86％(图1)。
实施例3：
上样样品同实施例1中样品。
反相交换层析采用UniPS 10-300填料在Relianx高压层析系统上进行。所述缓冲液A为质量分数为10％的乙醇和100mmol/L氯化钠形成的缓冲液；所述缓冲液B为质量分数为50％的乙醇和100mmol/L氯化钠形成的缓冲液，所有溶液均用盐酸调pH至4.0。层析柱柱体积为20ml。缓冲梯度为0-60％B 1CV，60-80％B 15CV，线流速为152cm/h。检测波长为280nm。
具体步骤为：
(1)缓冲液A液平衡填料2CV(CV是Column Volumn的缩写，为纯化柱柱床体积)
(2)取约200mg样品上样，上样后继续用缓冲液A液平衡2CV
(3)采用缓冲液A液和B按一定梯度形成洗脱液，洗脱液洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
样品的上样量约10g/L柱床体积。实验结果为上样前目的蛋白纯度约96.9％，含量约190mg；洗脱液洗脱收集目的蛋白纯度约99.07％，含量约175mg。
说明根据实施例3的方法，纯化后猪胰岛素纯度达到99.07％,收率为92.1％(图1)。
实施例1-3中：
所述缓冲液A，B中包括：有机相，所述有机相为乙醇；缓冲液A，B为乙酸铵缓冲液、二水合磷酸二氢钠缓冲液、乙酸钠缓冲液中任意一种，最优选氯化钠缓冲液；
所述缓冲液A，B的钠盐浓度为0.01-0.5mol/L，优选为0.01-0.2mol/L，最优为0.1mol/L。
所述缓冲液A和缓冲液B的pH为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，最优为3.0。
所述反相层析的载量为5-20mg/ml，最优选为10mg/ml。
实施例4：
反相层析纯化得到的样品加锌调沉，离心得蛋白沉淀即为待结晶样品。以蛋白沉淀溶解后猪胰岛素浓度18mg/ml计结晶液体积，各组分为结晶体积60％的注射用水，3％的50％柠檬酸及37％的有机溶剂，结晶温度为20℃，HCl调pH至6.0-6.1。
结晶溶液的有机相为丙酮。
实施例5：
结晶样品及操作与例4同。
结晶溶液的有机相为乙醇。
实例4-5中：
不同有机溶剂的结晶体系都能成功得到晶体，但乙醇相比较丙酮更加易得和经济。
实施例6：
所述结晶溶液离心去上清所得晶体即为待清洗样品。
用6倍猪胰岛素晶体体积的注射用水清洗晶体一次并离心去上清，再用8倍猪胰岛素结晶体积的有机溶剂清洗并离心去上清，充分挥发上一步骤残留有机溶剂，用不锈钢盘碾碎后置于真空干燥箱中干燥。
用有机溶剂丙酮及乙醚清洗。
实施例7：
结晶样品及操作与例6同。
用有机溶剂乙醇清洗两次。
实例6-7中：
不同有机溶剂清洗结晶，充分挥发有机溶剂经干燥后纯度在99.07％，干燥失重都在0.5％内。乙醇溶剂更加经济便利。
Claims (10)
1.一种猪胰岛素制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将经猪胰腺提取的胰岛素进行离子交换，锌盐沉析离心并收集蛋白沉淀；
步骤2，将步骤1获得的蛋白沉淀复溶，经反相层析纯化，锌盐沉析离心并收集蛋白沉淀；
步骤3，将步骤2获得的蛋白沉淀复溶，并对复溶液进行结晶得结晶溶液；
步骤4，将步骤3所述结晶溶液离心得猪胰岛素结晶，对结晶进行洗涤；
步骤5，将结晶置于不锈钢盘碾碎并于真空箱中干燥，制得胰岛素成品。
2.根据权利要求1所述的猪胰岛素制备方法，其特征在于，步骤2中，步骤1获得的蛋白沉淀按蛋白质量与溶液体积比1:8～12(g/ml)复溶，优选1:10(g/ml)复溶；pH优选为3～4，更优选为3.5；复溶所用的溶液优选为注射用水。
3.根据权利要求1所述的猪胰岛素制备方法，其特征在于，步骤2中，反相层析采用的填料为UniPS 10-300，所采用的层析系统为Relianx高压层析系统。
4.根据权利要求1所述的猪胰岛素制备方法，其特征在于，所述步骤2中，反相层析通过洗脱液洗脱获得目标产物；所述洗脱液由洗脱缓冲液A与洗脱缓冲液B组合使用；所述缓冲液A，B为乙酸铵缓冲液、氯化钠缓冲液、乙酸钠冲液中任意一种；优选的，所述缓冲液A为质量分数为5～15％的乙醇和0.01-0.5mol/L氯化钠形成的缓冲液；所述缓冲液B为质量分数为40～60％的乙醇和0.01-0.5mol/L氯化钠形成的缓冲液；更优选的，缓冲液A和缓冲液B中所述氯化钠浓度为0.01-0.2mol/L，最优为0.1mol/L；缓冲液A中乙醇的质量分数为10％，缓冲液B中乙醇的质量分数为50％。
5.根据权利要求1所述的猪胰岛素制备方法，其特征在于，步骤2中，缓冲液A和缓冲液B的pH为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，最优为3.0。
6.根据权利要求1所述的猪胰岛素制备方法，其特征在于，步骤2中，反相层析的载量为5-20mg/ml，优选为5-15mg/ml，最优选为10mg/ml。
7.根据权利要求1所述的猪胰岛素制备方法，其特征在于，步骤2中，缓冲梯度为0-60％B1CV，60-80％B 15CV，线流速为152cm/h。检测波长为280nm。
8.根据权利要求1所述的猪胰岛素制备方法，其特征在于，所述步骤3中，以蛋白沉淀溶解浓度15～20mg/ml计结晶溶液体积
9.根据权利要求1所述的猪胰岛素制备方法，其特征在于，所述步骤3中以蛋白沉淀最终溶解浓度15～20mg/ml计算结晶前溶液体积，所述结晶前溶液各组分优选为体积百分比55～65％的注射用水，体积百分比2～5％的50％柠檬酸及体积百分比33～40％的有机溶剂，有机溶剂选自为丙酮，乙醚或乙醇中的一种，优选为乙醇；所述步骤3具体为，将步骤2获得的蛋白沉淀用结晶前溶液中的注射用水和柠檬酸复溶形成复溶液，然后加入结晶前溶液中的有机溶剂并调节pH至6.0-6.1对复溶液进行结晶得结晶溶液，结晶温度为18～22℃。
10.根据权利要求1所述的猪胰岛素制备方法，其特征在于，所述步骤4中对晶体进行洗涤的具体方法为：先用5～7倍晶体体积的注射用水洗涤一次并离心去上清，再用7～9倍晶体体积的有机溶剂洗涤，有机溶剂选自丙酮，乙醚或乙醇，优选乙醇洗两次。
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