CN104193819A - 胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法 - Google Patents

胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法，它涉及一种胰岛素合成和保存方法。本发明要解决现有胰岛素二聚体的制取方法复杂、产率低、产物不稳定，保存时间短的技术问题。本发明合成以胰岛素六聚体为原料，与二肽在催化剂的作用下反应，再在由精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、2-N-吗啉乙磺酸、苯酚丙醇溶液配置的结晶液中进行结晶。保存方法：将胰岛素二聚体晶体放在pH为6～6.8的结晶液中，在3～10℃下密闭的避光玻璃容器中保存。本发明制备的胰岛素二聚体为自然结构，无基因工程成分，副作用小，适用于对胰岛素类似物过敏者，保存时间可达一年以上。

Description

胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法
技术领域
本发明涉及一种胰岛素合成和保存方法。
背景技术
胰岛素作为一种重要的蛋白质，对其研究至今已有近一百年的历史。胰岛素本质为一种具有生物活性的蛋白质，通常以较为稳定的六聚体形式存在，被广泛用于糖尿病的治疗。
目前的胰岛素制剂按作用时间可分为五大类，其中起效最为迅速的一类胰岛素属门冬胰岛素和赖脯胰岛素，起效时间15分钟左右。缺点是此类胰岛素药物均为胰岛素类似物，其结构与天然胰岛素存在差别，是用相应氨基酸取代原有氨基酸来达到快速起效的目的，不适用于对对应氨基酸或胰岛素类似物过敏的糖尿病患者，且人工合成的胰岛素类似物存在潜在副作用。
具有自然结构的胰岛素作用时间(最快)也不低于半小时，相对起效速度较慢，影响糖尿病重患的最佳抢救时间。因在实际治疗过程中，胰岛素以六聚体形式保存在溶液中，以注射方式进入人体，但胰岛素六聚体在人体中首先被分解成二聚或三聚体，最后分解至单体才能发挥治疗作用。若病人血糖已处于危险水平而对上述胰岛素类似物过敏，则传统胰岛素起效慢易造成生命危险。
可迅速起效的胰岛素二聚体发现已久，因结构具有高度不稳定性使其制取和保存都相对困难，至今未有成熟药品见于市场。
目前，胰岛素二聚体主要处于研究阶段，而且现有实验室制取方法过于复杂，产率较低(现有的产率一般是20～30％)，产物因极度不稳定而无法保存较长时间。
发明内容
本发明要解决现有胰岛素二聚体存在制取方法复杂、产率低、产物不稳定，且保存时间短的技术问题；而提供了胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法。
本发明中胰岛素二聚体晶体的合成方法是按下述步骤进行的：
步骤一、将精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硫酸钠、2-N-吗啉乙磺酸(MES)、苯酚丙酮溶液加入去离子水中配置反应液，调节pH值5.2～7.3；
步骤二、将所配置反应液在12～15℃下搅拌1.5～2h，加胰岛素六聚体水溶液，充分混匀后加入二肽水溶液，继续搅拌2h，再加入催化剂，再在12～15℃条件下继续搅拌反应8～12小时，反应过程中搅拌速度始终保持在400～600r/min，获得胰岛素二聚体溶液；
步骤三、将精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠、2-N-吗啉乙磺酸(MES)、苯酚丙醇溶液加入去离子水中配置结晶液，调节pH值5.2～7.3，然后搅拌30min，按1:1体积比加入胰岛素二聚体溶液后室温下进行结晶，或者采用悬滴法结晶，获得胰岛素二聚体晶体。
步骤一所述的反应液中精氨酸的浓度为0.1～0.2mol/L，谷氨酸的浓度为0.05mol/L，L-谷氨酰胺的浓度为0.05～0.08mol/L，甲硫氨酸的浓度为0.04mol/L，L-谷胱甘肽的浓度为0.03mol/L，醋酸锌的浓度为8mmol/L，柠檬酸钠的浓度为0.035mol/L，三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为0.63～1.10mol/L，硫酸钠的浓度为0.6mol/L，2-N-吗啉乙磺酸(MES)的浓度为0.1～0.28mol/L，苯酚丙酮溶液苯酚丙酮溶液占反应液体积的7.3～7.5％，苯酚丙酮溶液的质量百分浓度为0.06％。
pH值小于5.2时酸性过强，与人体pH偏差过大，且产率低，无实用价值；在pH值在6.2～6.5处产率达到峰值，随pH继续增大(大于6.5后)产率会降低，pH值大于7.3产率低，pH过高时Zn离子会继续与胰岛素配合，使溶液中胰岛素构型发生变化更倾向于六聚。pH的调节可用MES及Tris的生物缓冲液调节，当pH值偏差过大时可用NaOH或者HCl溶液进行调节。
步骤二中所述的胰岛素六聚体为R6态的胰岛素六聚体和/或T3R3态的胰岛素六聚体，构型稳定，适合作原料；当胰岛素六聚体为组合物时，按任意比组合。
步骤二中胰岛素六聚体水溶液的浓度为32g/L，反应液与胰岛素六聚体水溶液的体积比为2.5:1。
所述二肽水溶液浓度为0.1mol/L，反应液与二肽的体积比为10：1。二肽可由苯丙氨酸与甘氨酸缩合反应制成的(按现有方法制备即可)。
步骤二中催化剂催化剂由精氨酸、脯氨酸和水组成，催化剂中精氨酸的浓度为5mol/L，脯氨酸的浓度为5mol/L，催化剂与二肽溶液体积比为1:2，加入催化剂目的是稳定并防止蛋白质凝结。
步骤三所述的结晶液中精氨酸的浓度为0.27～0.45mol/L、谷氨酸的浓度为0.4mol/L，L-谷氨酰胺的浓度为0.5mol/L，甲硫氨酸的浓度为0.4～0.53mol/L，L-谷胱甘肽的浓度为0.37～0.45mol/L，醋酸锌的浓度为1mol/L，柠檬酸钠的浓度为1mol/L，三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为0.63～1.10mol/L，氯化钠的浓度为5mol/L，2-N-吗啉乙磺酸(MES的浓度为)0.1～0.28mol/L，苯酚丙醇溶液的质量百分比浓度为5％，苯酚丙酮溶液占结晶液体积的7.3～7.5％，苯酚丙酮溶液的质量百分浓度为0.06％。
本发明胰岛素二聚体晶体的保存方法：将胰岛素二聚体晶体放在pH为6～6.8上述的结晶液中，在3～10℃下密闭的避光玻璃容器中保存。
本专利发明了以六聚体胰岛素及相应氨基酸溶液为原料制取并保存稳定二聚体胰岛素结晶的技术，为其应用于快速胰岛素市场迈出了重要一步，并填补了具有天然结构的胰岛素见效慢这一空白。此方法为工业制取二聚胰岛素奠定了基础。本专利涉及的二聚体胰岛素制备及保存技术未来可作为一种新型快速类天然胰岛素药物应用于市场，且产物胰岛素二聚体为自然结构(参见图1)，无基因工程成分，副作用小，适用于对胰岛素类似物过敏者。本发明方法制备的胰岛素二聚体是无色颗粒状晶体，颗粒极细小，显微镜下侧呈立方晶体。
胰岛素二聚体制剂给药方式是注射。
本发明方法获得的胰岛素二聚体纯度较高，且保存方法稳定易行，货架期长，在一年以上，有利于药品的存放及使用。本发明方法制备条件稳定，工艺简单，能制备出稳定的二聚体胰岛素，产率较高，所用各类药品环保、无对人体有害物质。
附图说明
图1是二聚体胰岛素分子模型。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式中胰岛素二聚体晶体的合成方法是按下述步骤进行的：
步骤一、将精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硫酸钠、2-N-吗啉乙磺酸(MES)、苯酚丙酮溶液加入去离子水中配置反应液，调节pH值；
步骤二、将200ml所配置反应液在12℃下搅拌2h，加80mL浓度为32g/L的R6态的胰岛素六聚体水溶液(用去离子水配制)，充分混匀后加入20ml浓度为0.1mol/L二肽，继续搅拌2h，再加入10ml催化剂，再在12℃条件下继续搅拌反应12小时，反应过程中搅拌速度始终保持在300r/min(采用磁力搅拌器搅拌)，获得胰岛素二聚体溶液；
所述催化剂由催化剂催化剂由精氨酸、脯氨酸和水组成，催化剂中精氨酸的浓度为5mol/L，脯氨酸的浓度为5mol/L，催化剂与二肽溶液体积比为1:2。
步骤三、将精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠、2-N-吗啉乙磺酸(MES)、苯酚丙醇溶液加入去离子水中配置结晶液，调节pH值，然后用600r/min转速磁力搅拌器搅拌30min，按1:1体积比加入胰岛素二聚体溶液后20℃下结晶，结晶过程需要10～14天，获得胰岛素二聚体晶体。
步骤一所述的反应液中精氨酸的浓度为0.1mol/L，谷氨酸的浓度为0.05mol/L，L-谷氨酰胺的浓度为0.05mol/L，甲硫氨酸的浓度为0.04mol/L，L-谷胱甘肽的浓度为0.03mol/L，醋酸锌的浓度为8mmol/L，柠檬酸钠的浓度为0.035mol/L，三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为0.63mol/L，硫酸钠的浓度为0.6mol/L，2-N-吗啉乙磺酸(MES)的浓度为0.1mol/L，苯酚丙酮溶液质量百分浓度0.06％，苯酚丙酮溶液与反应液的体积比为1:1.35。
二肽合成方法为：苯丙氨酸与甘氨酸缩合反应制成的二肽；双线合成，其一为苯丙氨酸(Phe)，其二为甘氨酸(Gly)。左线为Phe在碱性条件下加入Boc保护，Gly酸性条件下加入甲醇保护，二者保护后在DCC存在下混合反应形成肽键(DCC为有机氧化剂)。
步骤三所述的结晶液中精氨酸的浓度为0.27mol/L、谷氨酸的浓度为0.4mol/L，L-谷氨酰胺的浓度为0.5mol/L，甲硫氨酸的浓度为0.4mol/L，L-谷胱甘肽的浓度为0.37mol/L，醋酸锌的浓度为1mol/L，柠檬酸钠的浓度为1mol/L，三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为0.63mol/L，氯化钠的浓度为5mol/L，2-N苯酚丙酮溶液与反应液的体积比为1:1.35(MES的浓度为)0.1mol/L，苯酚丙醇溶液的质量百分比浓度为5％，苯酚丙酮溶液与结晶液的体积比为1:1.35。
产率的计算方法：所得结晶质量除以步骤二所加胰岛素质量，不同pH值下产品产率如表1：
表1：
步骤一的pH值 步骤三的pH值 产率 存放时间
4.2 3.9 15.37％ -
5.1 5.4 68.82％ 约一年
6.2 6.2 86.70％ 多于一年
6.5 6.8 83.43％ 多于一年
7.3 7.5 55.64％ 多于一年
8.0 8.2 23.60％ -
保存：若需长时间保存所得二聚体胰岛素，可将步骤2所得(结晶前)溶液调节于pH6～6.8，置于密封且透光性低的容器中，于略低于室温的温度保存。保存时间可达一年以上。
所得晶体以X射线单晶衍射晶体分析后所得数据如表4。另取一组pH＝4.8，一组pH＝7.5的六聚体形式作为对比。在分析时所得晶体直接投入液氮中快速冷却，用于X射线单晶衍射分析，采用Coot及CCP4用于建模及分析所得数据，结果见表2。
表2：X射线衍射数据对比表
能通过表2证明本实施方式获得产品为胰岛素二聚体，产品纯度高。所得二聚体胰岛素分子模型如图1。其中不同颜色代表不同种类氨基酸，由图1可知产物胰岛素二聚体为自然结构。本实施方式方法制备的胰岛素二聚体是无色颗粒状晶体，颗粒极细小，显微镜下呈立方晶形。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中结晶液pH调为6～6.8，其他反应不变，产品在3～10℃下密闭的避光玻璃容器中保存。
胰岛素二聚体保存时间长达1年以上。
具体实施方式三：本实施方式中胰岛素二聚体晶体的合成方法是按下述步骤进行的：
本实施方式中胰岛素二聚体晶体的合成方法是按下述步骤进行的：
步骤一、将精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硫酸钠、2-N-吗啉乙磺酸(MES)、苯酚丙酮溶液加入去离子水中配置反应液，调节pH值；
步骤二、将200ml所配置反应液在14℃下搅拌1.5h，加80mL浓度为32g/L的T3R3态的胰岛素六聚体水溶液，充分混匀后加入20ml浓度为0.1mol/L二肽，继续搅拌2h，再加入10ml催化剂，再在14℃条件下继续搅拌反应12小时，反应过程中搅拌速度始终保持在600r/min(采用磁力搅拌)，获得胰岛素二聚体溶液；
所述催化剂由精氨酸、脯氨酸和水组成，催化剂中精氨酸的浓度为5mol/L，脯氨酸的浓度为5mol/L，催化剂与二肽溶液体积比为1：2。
步骤三、将精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠、2-N-吗啉乙磺酸(MES)、苯酚丙醇溶液加入去离子水中配置结晶液，调节pH值，然后采用磁力搅拌器，转速750rpm搅拌30min，按1:1体积比加入胰岛素二聚体溶液后25℃下结晶，结晶过程需10～14天，获得胰岛素二聚体晶体。
步骤一所述的反应液中精氨酸的浓度为0.2mol/L，谷氨酸的浓度为0.05mol/L，L-谷氨酰胺的浓度为0.08mol/L，甲硫氨酸的浓度为0.04mol/L，L-谷胱甘肽的浓度为0.03mol/L，醋酸锌的浓度为8mmol/L，柠檬酸钠的浓度为0.035mol/L，三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为1.10mol/L，硫酸钠的浓度为0.6mol/L，2-N-吗啉乙磺酸(MES)的浓度为0.28mol/L、苯酚丙酮溶液的质量百分浓度为0.06％，苯酚丙酮溶液与反应液的体积比为1:1.35。
步骤二中所述的胰岛素六聚体为R6态的胰岛素六聚体和/或T3R3态的胰岛素六聚体。
步骤三所述的结晶液中精氨酸的浓度为0.45mol/L、谷氨酸的浓度为0.4mol/L，L-谷氨酰胺的浓度为0.5mol/L，甲硫氨酸的浓度为0.53mol/L，L-谷胱甘肽的浓度为0.45mol/L，醋酸锌的浓度为1mol/L，柠檬酸钠的浓度为1mol/L，三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为1.10mol/L，氯化钠的浓度为5mol/L，2-N-吗啉乙磺酸(MES)的浓度为0.28mol/L，苯酚丙醇溶液的质量百分比浓度为5％，苯酚丙酮溶液与结晶液的体积比为1:1.35。
本实施方式中产物胰岛素二聚体为自然结构。本实施方式方法制备的胰岛素二聚体是无色颗粒状晶体，颗粒极细小，显微镜下呈立方晶形,保存时间可达一年以上。

Claims (10)

1.胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于胰岛素二聚体晶体的合成方法是按下述步骤进行的：
步骤一、将精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷、硫酸钠、2-N-吗啉乙磺酸、苯酚丙酮溶液加入去离子水中配置反应液，调节pH值5.2～7.3；
步骤二、将步骤一的反应液在12～15℃下搅拌1.5～2h，加胰岛素六聚体水溶液，充分混匀后加入二肽水溶液，继续搅拌2h，再加入催化剂，再在12～15℃条件下继续搅拌反应8～12小时，反应过程中搅拌速度始终保持在400～600r/min，获得胰岛素二聚体溶液；
步骤三、将精氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、L甲硫氨酸、L-谷胱甘肽、醋酸锌、柠檬酸钠三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、2-N-吗啉乙磺酸、苯酚丙醇溶液加入去离子水中配置结晶液，调节pH值5.2～7.3，然后以600～750r/min转速搅拌30nin，按1:1体积比加入胰岛素二聚体溶液后室温下进行结晶，获得胰岛素二聚体晶体。
2.根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤一所述的反应液中精氨酸的浓度为0.1～0.2mol/L，谷氨酸的浓度为0.05mol/L，L-谷氨酰胺的浓度为0.05～0.08mol/L，甲硫氨酸的浓度为0.04mol/L，L-谷胱甘肽的浓度为0.03mol/L，醋酸锌的浓度为8mmol/L，柠檬酸钠的浓度为0.035mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.63～1.10mol/L，硫酸钠的浓度为0.6mol/L，2-N-吗啉乙磺酸的浓度为0.1～0.28mol/L，苯酚丙酮溶液占反应液体积的7.3～7.5％，苯酚丙酮溶液的质量百分浓度为0.06％。
3.根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤一调节pH值为6.2～6.5。
4.根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤二中所述的胰岛素六聚体为R6态的胰岛素六聚体和/或T3R3态的胰岛素六聚体。
5.根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤二中胰岛素六聚体水溶液的浓度为32g/L，反应液与胰岛素六聚体水溶液的体积比为2.5:1。
6.根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于二肽水溶液的浓度为0.1mol/L，反应液与二肽水溶液的体积比为10：1。
7.根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤二中催化剂由精氨酸、脯氨酸和水组成，催化剂中精氨酸的浓度为5mol/L，脯氨酸的浓度为5mol/L，催化剂与二肽溶液体积比为1:2。
8.根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤三所述的结晶液中精氨酸的浓度为0.27～0.45mol/L，谷氨酸的浓度为0.4mol/L，L-谷氨酰胺的浓度为0.5mol/L，甲硫氨酸的浓度为0.4～0.53mol/L，L-谷胱甘肽的浓度为0.37～0.45mol/L，醋酸锌的浓度为1mol/L，柠檬酸钠的浓度为1mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.63～1.10mol/L，氯化钠的浓度为5mol/L，2-N-吗啉乙磺酸的浓度为0.1～0.28mol/L，苯酚丙醇溶液的质量百分比浓度为5％，苯酚丙酮溶液占结晶液体积的7.3～7.5％，苯酚丙酮溶液的质量百分浓度为0.06％。
9.根据权利要求1所述胰岛素二聚体晶体的合成方法，其特征在于步骤三采用悬滴法结晶。
10.胰岛素二聚体晶体的保存方法，其特征在于将胰岛素二聚体晶体放在pH为6～6.8的权利要求1或8所述的结晶液中，在3～10℃下密闭的避光玻璃容器中保存。
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