CZ320999A3 - Krastaly insulinu neobsahující zinek, způsob jejich přípravy, therapeutický přípravek a jeho použití pro inhalační theraphii - Google Patents

Abstract

Krystaly inzulínu, neobsahující zinek, o průměrumenšímnež 10 pm. Tyto krystaly nemají tendenci ve formě prášku vytvářet agregáty.

Description

Navrhovaný vynález popisuje krystaly inzulínu, které neobsahují zinek a které mají průměr menší než 10 pm a práškovou formu použitelnou pro inhalační therapii obsahující tyto inzulínové krystaly.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Diabetes je termín používaný u lidí pro poruchu způsobující nadměrné vytváření moči jako je diabetes mellitus a diabetes insipidus. Diabetes mellitus je metabolická porucha která způsobuje částečnou nebo naprostou ztrátu schopnosti využívat přijatou glukózu. Přibližně 2 % lidí v populaci trpí některou z forem diabetů.

Od roku 1920 kdy bylo započato s podáváním inzulínu therapeutické metody léčby diabetů mellitu značně pokročily. Aby bylo zabráněno vysokým hladinám glykémie, pacienti trpící diabetem dostávali několik injekcí denně, přičemž inzulín byl podáván s každým jídlem.

Inzulín je obvykle podáván pomocí s.c. nebo i.m. injekcí. Protože aplikace pomocí injekcí je značně nepohodlná, bylo věnováno značné úsilí pro vývoj alternativních cest podávání, jako jsou cesty nasální a pulmonární (viz. Danielsen et al.). Nové cesty a způsoby podávání inzulínu byly popsány v “Childhood and Adolescent Diabetes (Ed. Kelnar), Chapman & Halí Medical, London 1994, pp. 571 až 584.

Aby bylo možno vyhnout se injekcím, podávání inzulínu inhalační cestou může být vhodným způsobem, jak zajistit vstřebáváním inzulínu hormonální profil, který bude maskovat nedostatek endogenního inzulínu, bez potřeby aplikovat inzulín pomocí injekcí.

Podání inzulínu inhalační metodou může proběhnout buď ve formě vodného roztoku, nebo pomocí připraveného prášku. Popis detailů je uveden v celé řadě referencí z nichž jedna z nejnovějších je Niven, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys, 12(2&3), 151 až 231 (1995). Jedním z aspektů popisovaných uvedenou referencí je stabilita zavedeného proteinu, přičemž vodný roztok je méně stabilnější než prášková forma. Dále, všechny uvedené práškové formy jsou popisovány jako více méně amorfní.

Přehled použitelných látek usnadňujících přechod a transmukózní absorpci je uveden v Sayani et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys, 13( 1&2), 85 až 184 (1996).

Patton et al., Inhale Therapeutic Systems, PCT WO 95/24183, nárokuje způsob podání dávek inzulínu pomocí aerosolu ve formě suchého prášku unášeného proudem plynu tak aby vznikl aerosol a jeho zachycení v nádobě pro následnou inhalaci.

Bylo zjištěno, že pokud je inzulín kombinován s vhodnou látkou zlepšující absorpci a je zaveden do spodních cest dýchacích ve formě prášku s patřičnou velikostí částic, vstupuje do systémové cirkulace pomocí absorpce skrz vrstvu epiteliálních buněk pokrývajících spodní cesty dýchací, jak je popisováno v US patent No. 5,506,203. Proces výroby je popsán v řečeném patentu a představuje rozpuštění inzulínu při kyselém pH a následném upravení pH na 7,4 a přidáním taurocholátu sodného před tím, než je roztok vysušen pomocí vakuového koncentrátoru, nebo vyschnutím, sprejovým vysoušením nebo mrazovým vysoušením, což vede ke vzniku prášku obsahujícího lidský inzulín a látku zlepšující absorpci. Prášek je popisován jako z větší části amorfní , což bylo stanoveno pomocí polarizační světelné mikroskopie. Požadované velikosti částic bylo dosaženo pomocí vhodného mlýnku, jako je tryskový mlýnek, přičemž složky mohou být smíchány jak před tak po mletí. Biologický efekt prášku vyrobeného podle výše uvedeného patentuje pozorovatelný pouze v přítomností značného množství látky zlepšující absorpci.

Platz et al., Inhale Therapeutic Systems, PCT WO 96/32149, popisuje sprejové vysoušení inzulínu se zinkem z roztoku obsahujícího manitol a citrátový pufr, pH 6,7. Vstupní teplota je od 120 do 122 °C, výstupní pak 80 - 81 °C. Hmotnostní medián aerodynamického průměru, MMAd, získaných inzulínových částic byl stanoven na 1,3 až 1,5 pm.

V publikaci „Insulin Crystals“ Munksgaard Publisher 1958, p. 54 až 55, autor Schlichtkrull popisuje krystalizaci za nepřítomnosti zinku, kdy rekrystalizoval vepřový inzulín z roztoku obsahujícího 0,01 M octanu sodného, 0,7 % ~ 0,12 M chloridu sodného a 0,1 % methylparahydroxybenzoátu při pH 7,0. Vznikly rhombické dodecahedrální krystaly bez birefrigence o průměru 10 až 50 pm.

Jackson US Patent No. 3,719,655 popisuje způsob purifikace surového vepřového a hovězího inzulínu pomocí krystalizace. Krystaly inzulínu neobsahující zinek byly získány krystalizaci při pH 8,2 (v rozmezí 7,2 až 10) v přítomnosti 0,5 M (rozmezí 0,2 Μ - 1 M) sodné, draselné, lithné nebo amonné soli. Krystalizace je dosaženo přidáváním 1 N hydroxidu alkalického kovu nebo 1 N amoniaku k roztoku syrového inzulínu v 0,5 N kyselině octové až je dosaženo pH je 8,2. Další možností je krystalizace ve vodném roztoku surového inzulínu při pH 8,2 přidáním pevného chloridu sodného až do koncentrace sodných iontů 0,45 M. Krystaly vznikají v octadecahedrální nebo dodecahedrální formě, tzn. že krystaly patří ke kubickému krystalovému systému.

Baker et al., Lilly, EP 0 709 395 A2 (podáno v říjnu, 1994) popisuje krystalizační proces v nepřítomnosti zinku pro Lys^-Pro^⁹ lidský inzulín charakteristický nastavením pH silně • · pufrovaného kyselého roztoku obsahujícího kationty kovů nebo amonné ionty a chránících látek typu kovových hydroxidů nebo amoniaku na hodnotu mezi 8,5 a 9,5.

Známé způsoby přípravy částic inzulínu o požadované velikosti určené pro inhalační podávání jsou nešikovné, neboť vznikají problémy s inzulínovým prachem a investice do vybavení jsou 'vysoké. Navíc inzulín je vystaven podmínkám, při nichž může být částečně denaturován. Tedy WO 96/32149 popisující sprejové vysoušení při teplotě v rozsahu od 50 °C do 100 °C, následované mletím tak aby byl získány částice o požadované velikosti.

Navíc, známé způsoby přípravy prášků určených pro inhalační podávání, které byly popisovány jako amorfní mají tendenci vytvářet ve formě suchého prášku agregáty.

PODSTATA VYNÁLEZU

Definice:

Výraz „látka zlepšující absorpci“ tak jak je zde používán popisuje látky zlepšující absorpci inzulínu, analogu inzulínu nebo derivátu inzulínu skrz vrstvu epiteliálních buněk pokrývajících plicní sklípky do přilehlé pulmonámí vaskulatury, tzn. množství inzulínu absorbované v kombinaci s látkou zlepšující absorpci je vyšší než v její nepřítomnosti.

Výraz „prášek“ jak je používán v kontextu tohoto vynálezu, popisuje soubor suchých částic, tzn. obsah vody je nižší než 10 % váhy, lépe pak méně než 6 % váhy a nejlépe pak pod 4 % váhy. Průměr krystalů je definován jako Martinův průměr. Je měřen jako délka čáry, rovnoběžné s okulární osou, která dělí náhodně orientované krystaly na dvě stejné plochy.

Předmětem navrhovaného vynálezu je popsat inzulínový prášek vhodný pro inhalační aplikaci, se sníženou tendencí k vytváření agregátů ve formě suchého prášku oproti částicím inzulínu používaným pro tuto therapii v současném stavu techniky.

Navrhovaný vynález popisuje krystaly inzulínu bez obsahu zinku s průměrem do 10 pm.

Krystaly podle navrhovaného vynálezu navíc vykazují lepší profil stability než prášek o v podstatě stejném složení připravený pomocí sprejového vysoušení, mrazového vysoušení, vakuového vysoušení a vysychání. Je to způsobeno pravděpodobně amorfní struktuře prášku připraveného výše uvedenými metodami. Tímto způsobem je možné skladovat práškovou formu založenou na krystalech podle navrhovaného vynálezu při pokojové teplotě narozdíl od lidského inzulínu v přípravcích určených pro injikaci a některých amorfních inzulínových práškových forem bez stabilizačního agens, které musejí být skladovány mezi 2 °C a 8 °C.

Navíc therapeutická prášková forma obsahující inzulínové krystaly podle navrhovaného vynálezu vykazuje lepší prostupnost než odpovídající amorfní práškové formy.

• · · · · · • · · · · • · · · *

Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle navrhovaného vynálezu jsou obvykle připravovány v kubické krystalové soustavě, zejména jako octadecahedrální nebo dodecahedrální krystalové formy, jelikož tyto krystalické formy jsou dobře rozpustné a vykazují dobrou prostupnost.

Průměr inzulínových krystalů je s výhodou udržován v rozsahu 0,2 až 5 pm, lépe pak v rozmezí 0,2 až 2 pm, nejlépe pak v rozmezí 0,5 až 1 pm, tak aby byla zajištěna vysoká biologická -dostupnost a vhodný profil akce, viz. PCT č. WO 95/24138 a PCT č. WO 96/32149.

V preferované variantě je použitý inzulín buď lidský, hovězí nebo vepřový inzulín, lépe pak lidský inzulín.

V jiné preferované variantě je inzulín buď rychle působící inzulín, nejlépe des(B30) lidský inzulín, Asp^B28 lidský inzulín nebo Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín. V další preferované variantě je použitý inzulín derivát inzulínu, zejména pak B29-N^!;-myristoyl-des(B30) lidský inzulín, B29N*-palmitoyl“des(B30) lidský inzulín, B29-N^E-myristoyl lidský inzulín, N^s-palmitoyl lidský inzulín, B28-N*-myristoyl Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín, B28-N^í:-palmitoyl Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín, B30-N^£-myristoyl Thr^B29Lys^B3° lidský inzulín, B30-N®- palmitoyl Thr^B29Lys^B3° lidský inzulín, B29-N^E-(N-palmitoyl-y-glutamyl)-des(B30) lidský inzulín, B29-N®-(N-lithocholyl-yglutamyl)-des(B30) lidský inzulín, B29-N^ť-(ro-karboxyheptadecanoyl) lidský inzulín, lépe pak 8Lys^B29(Nc-acylovaný) des(B30) lidský inzulín.

Tyto deriváty inzulínu mají opožděný počátek účinku a mohou tedy kompenzovat velmi rapidní nárůst plasmatického inzulínu, který je obvyklý po inhalační aplikaci. Opatrnou volbou inzulínu je možné pomocí navrhovaného vynálezu přesně nastavit načasování a dosáhnout tak požadované biologické reakce v daném časovém úseku.

Aby nedošlo k podráždění plic a aby bylo zabráněni imunitní reakci jsou použité inzulíny přečišťovány chromatograficky, jako jsou inzulíny MC inzulín (Novo), Single Peak inzulín (E.Lilly) a Rl inzulín (Nordisk).

V preferované variantě krystaly inzulínu neobsahující zinek podle navrhovaného vynálezu obsahují také stabilizační množství fenolické složky, zejména m-krezol nebo fenol, nebo směs těchto látek.

Navrhovaný vynález dále popisuje therapeutické práškové formy vhodné pro inhalační podávání, které obsahují výše popisované krystaly inzulínu bez obsahu zinku.

V preferované variantě tato therapeutická forma obsahuje také látku zlepšující absorpci inzulínu v dolních cestách dýchacích.

Touto látkou je většinou povrchově aktivní látka, zejména pak soli mastných kyselin, žlučové soli nebo fosfolipidy, lépe pak žlučové soli.

• · · · · ·

Preferované soli mastných kyselin jsou soli Cio-w mastných kyselin, jako jsou kaprát sodný, laurát sodný a myristát sodný.

Lisofosfatidylcholín je preferovaným fosfolipidem.

Nejvhodnější žlučové soli jsou ursodeoxycholát, taurocholát, glycocholát a taurodihydrofusidát. Nejvýhodnější jsou však práškové formy podle navrhovaného vynálezu kde látkou pro zlepšení absorpce inzulínu je sůl taurocholátu, zejména pak taurocholát sodný.

Molární poměr inzulínu k látce zlepšující absorpci je 9:1 až 1:9, lépe pak mezi 5:1 až 1:5 a nejlépe pak od 3:1 do 1:3.

Práškové formy podle navrhovaného vynálezu mohou být eventuelně kombinovány s nosičem, nebo excipíentem obecně používaným pro inhalační podávání. Důvodem pro přidávání nosiče nebo excipientu může být zvýšení objemu, stabilizace nebo zlepšení absorpce.

Vhodnými nosiči jsou například 1) uhlovodíky, např. monosacharidy jako je fruktóza, galaktóza, glukóza, sorbóza a podobně, 2) disacharidy, jako je laktóza, trehalóza a podobně, 3) polysacharidy, jako je rafinóza, maltodextriny, dextrany a podobně, 4) alditoly jako je manitol, xylitol a podobně, 5) anorganické soli, jako je chlorid sodný a podobně, 6) organické soli, jako je citrát sodný, askorbát sodný, a podobně. Preferovanou skupinu nosičů tvoří trehalóza, rafinóza, manitol, sorbitol, xylitol, inositol, sacharóza, chlorid sodný a citrát sodný.

Krystaly podle navrhovaného vynálezu jsou připravovány podle následujícího protokolu:

a) příprava roztoku inzulínu s pH mezi 7,0 až 9,5.

b) smíchání řečeného roztoku s roztokem soli alkalického kovu, nebo amonnou solí a

c) odebrání vzniklých krystalů.

Soli alkalických kovů, nebo amonné soli jsou zejména hydrochlorid nebo octan sodný, draselné, lithné nebo amonné soli nebo jejich směsi, nejlépe pak octan sodný.

Pro potlačení rozpustnosti vzniklých krystalů, obsahuje roztok inzulínu a/nebo roztok soli alkalického kovu nebo amonné soli s vodou mísitelné organické rozpouštědlo v množství odpovídajícím 5 až 25 % (v/v) roztoku po smíchání.

S vodou mísitelné organické rozpouštědlo může být ethanol, methanol, aceton a 2-propanol, lépe pak ethanol.

Vyšší uniformity distribuce velikosti krystalu a krystalové struktury je dosaženo pokud jsou oba roztoky smíchány během méně než 2 hodin, lépe pak méně než 1 hodiny, ještě lépe pak méně než 15 minut a nejlépe méně než 5 minut.

Krystalizační proces během něhož vzniknou krystaly o jednotné velikosti, rozměru, bez obsahu zinku a přímo, bez použití mletí, mikronizace, drcení a jiných postupů vytvářejících prášek, je • · · · · · nej lepším postupem v současném stavu techniky pro výrobu inzulínového prášky pro inhalační podávání.

Koncentrace inzulínu po smíchání je zejména mezi 0,5 % a 10 %, lépe pak mezi 0,5 % až 5 % a nejlépe pak mezi 0,5 % až 2 %.

Koncentrace soli po smíchání je mezi 0,2 M až 2 M, lépe pak okolo 1 M.

Způsob podle navrhovaného vynálezu může dále obsahovat další krok promývání, během něhož jsou získané krystaly promyty v roztoku obsahujícím pomocné složky, které mají být přidány k výslednému prášku, zejména pak látky zlepšující absorpci a/nebo uhlovodík a ideálně obsahující 5 až 25 % alkoholu, nejlépe ethanolu, 5 až 50 mM ochranné látky, např. fenolu, a 0,1 až 2 M sůl jako je octan sodný.

Navrhovaný vynález je dále popisován pomocí příkladů, které však nemohou být brány jako limity vynálezu.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

PŘÍKLAD 1. Krystalizace v 1 M octanu sodném

2g vysoce přečištěného lidského inzulínu jsou rozpuštěny v 100 ml 10 mM tris pufru, pH 8,0 v 20 % (v/v) ethanolu ve vodě. K tomuto roztoku je přidáno 100 ml 2 M octanu sodného za stálého míchání. Okamžitě vzniká sraženina. Po 2 dnech při pokojové teplotě jsou na mikroskopu patrné malé krystaly o průměru mezi 0,5 až 1 pm. Krystaly jsou odděleny centrifugací při -10 °C, jednou promyty v 20 ml ledového 10 % ethanolu (v/v) ve vodě, opět odděleny centrifugací a vysušeny v lyofilizátoru. Získané krystaly jsou na Obr. 1.

PŘÍKLAD 2. Krystalizace v přítomnosti taurocholátu sodného lOg vysoce přečištěného lidského inzulínu a 5 mg taurocholátu sodného jsou rozpuštěny v 500 ml 10 mM tris pufru, pH 8,0 v 20 % (v/v) ethanolu ve vodě. K tomuto roztoku je přidáno 100 ml 2 M octanu sodného. Pomocí mikroskopie je po 1 hodině i po 24 hodinách zjištěna přítomnost krystalů, zejména pak uniformních krystalů s průměrem mezi 0,5 -1 pm. Krystaly byly promyty třikrát ve 100 pl 10 % (v/v) ethanolu ve vodě při 10 °C a vysušeny ve vakuu. Pomocí HPLC bylo zjištěno, že promytím byl odstraněn taurocholát sodný inzulínových krystalů.

PŘÍKLAD 3. Krystalizace v přítomnosti Tweenu 80, bis(2-ethylhexyl)sulfosukcinátu sodného, chitosanu, L-a-lysofosfatidylcholin myristoilu a polyoxyethylen sorbitan monolaurátu. Krystalizace probíhala stejně jako v Příkladu 2, pouze taurocholát sodný byl nahrazen 0,6 % (v/v) Tweenu 80, 0,56 % (h/v) bis(2-ethylhexyl)sulfosukcinátu sodného, 0,32 % (h/v) chitosanu,

0,52 % (h/v) L-a-lysofosfatidylcholin myristoilu a 1 % (h/v) polyoxyethylen sorbitan monolaurátu. Všech pět příkladů vedlo ke vzniku uniformních krystalů o průměru mezi 0,5 až 1 pm.

PŘÍKLAD 4. Krystalizace v přítomnosti 10 % (v/v) ethanolu.

.Krystalizace probíhala v 10 % (v/v) ethanolu jak je popisováno v Příkladu 1, za použití čtyř kombinací pH a koncentrací octanu sodného:

4.1 : pH 7,5 a 1 M octan sodný

4.2 : pH 7,5 a 1,5 M octan sodný

4.3 : pH 9,0 a 1 M octan sodný

4.1 : pH 6,0 a 1,5 M octan sodný

Všechny čtyři varianty vedly ke vzniku uniformních krystalů o průměru mezi 0,5 až 1 pm.

PŘÍKLAD 5. Krystalizace v přítomnosti 15 % (v/v) ethanolu.

Krystalizace probíhala v 15 % (v/v) ethanolu jak je popisováno v Příkladu 1, za použití šesti kombinací pH a koncentrací octanu sodného:

5.1 : pH 7,5 a 1 M octan sodný

5.2 : pH 7,5 a 1,5 M octan sodný

5.3 : pH 7,5 a 2 M octan sodný

5.4 : pH 9,0 a 1 M octan sodný

5.5 : pH 6,0 a 1,5 M octan sodný

5.6 : pH 9,0 a 2 M octan sodný

Všech šest variant vedlo ke vzniku uniformních krystalů o průměru mezi 0,5 až 1 pm.

PŘÍKLAD 6. Krystalizace v přítomnosti 20 % (v/v) ethanolu.

Krystalizace probíhala v 20 % (v/v) ethanolu jak je popisováno v Příkladu 1, za použití čtyř kombinací pH a koncentrací octanu sodného:

6.1 : pH 7,5 a 1 M octan sodný

6.2 : pH 7,5 a 1,5 M octan sodný

6.3 : pH 9,0 a 1 M octan sodný

6.1 : pH 6,0 a 1,5 M octan sodný

Všechny čtyři varianty vedly ke vzniku uniformních krystalů o průměru mezi 0,5 až 1 pm.

PŘÍKLAD 7. Krystalizace při pH 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 v přítomnosti 20 % (v/v) ethanolu za pomalého přidávání octanu sodného.

Krystalizace probíhá za použití roztoků jak byly popsány v Příkladu 1, kromě kroku kdy je 2 M octan sodný rozpouštěn v 20 % (v/v) ethanolu ve vodě. Roztok inzulínu měl pH 7,5, 8,0, 8,5 a 9,0. Roztok octanu sodného byl přidáván ve 12 alikvotech během 2 hodin při 10 minutovém intervalu mezi alikvoty. Všechny čtyři varianty vedly ke vzniku uniformních krystalů o průměru mezi 0,5 až 1 pm.

PŘÍKLAD 7. Krystalizace Lys^B29(Ns-acylovaný) des(B30) lidského inzulínu v přítomnosti taurocholátu sodného.

lOg Lys^B29(Nc-acylovaný) des(B30) lidského inzulínu a 5 mg taurocholátu sodného jsou rozpuštěny v 500 ml 10 mM tris pufru, pH 8,0 v 20 % (v/v) ethanolu ve vodě. K tomuto roztoku je přidáno 100 ml 2 M octanu sodného. Pomocí mikroskopie je po 1 hodině i po 24 hodinách zjištěna přítomnost krystalů, zejména pak uniformních krystalů s průměrem mezi 0,5 -1 pm. Krystaly byly promyty třikrát ve 300 pl 10 % (v/v) ethanolu ve vodě pň 10 °C a vysušeny ve vakuu. Pomocí HPLC bylo zjištěno, že promytím byl odstraněn taurocholát sodný z krystalů Lys^B29(Ns-acylovaný) des(B30) lidského inzulínu.

• · • ·

·· · ♦·· ·· · ?V 2loq-qj

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Krystaly inzulínu neobsahující zinek o průměru menším než 10 pm.
2. 2. Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jejich krystalová struktura spadá do kubického krystalového systému.
3. 3. Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle nároku 2, vyznačující se tím, že jejich krystaly mají octadecahedrální nebo dodecahedrální krystalickou strukturu.
4. 4. Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle libovolného předchozího nároku, vyznačující se tím, že jejich průměr je v rozmezí 0,2 až 5 pm, lépe pak v rozmezí 0,2 až 2 pm, nejlépe pak 0,5 až 1 pm.
5. 5. Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle libovolného předchozího nároku, vyznačující se tím, že inzulín je buď lidský inzulín, hovězí inzulín nebo prasečí inzulín.
6. 6. Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahují lidský inzulín.
7. 7. Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že použitý inzulín je rychle působící inzulín, nejlépe des(B30) lidský inzulín, Asp^B28 lidský inzulín nebo Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín.
8. 8. Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že použitý inzulín je derivát inzulínu, zejména pak BŽO-bf-myristoyl-desíBSO) lidský inzulín, B29-N^Epalmitoyl-des(B30) lidský inzulín, B29-N®-myristoyl lidský inzulín, bT-palmitoyl lidský inzulín, B28-N^e-myristoyI Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín, B28-N^R-palmitoyl Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín, B30-N^e-myristoyl Thr^B29Lys^B3° lidský inzulín, B30-hř- palmitoyl Thr^B29Lys^B3° lidský inzulín, B29-N^£-(N-palmitoyl-y-glutamyl)-des(B30) lidský inzulín, B29-N^£-(N-lithocholyl-yglutamyl)-des(B30) lidský inzulín, B29-N^<!-(G>-karboxyheptadecanoyl)-des(B30) lidský inzulín a Β29-Ν^£-(ω-karboxyheptadecanoyl).
9. 9. Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle nároku 8, vyznačující se tím, že použitý inzulín je 8- Lys^B29(Ne-acylovaný) des(B30) lidský inzulín.
10. 10. Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle libovolného předchozího nároku, vyznačující se tím, že obsahují dále stabilizační množství fenolické složky.

    i

    4 ·
11. 11. Krystaly inzulínu neobsahující zinek podle nároku 10, vyznačující se tím, že obsahují mkrezol, fenol, nebo jejich směs.
12. 12. Therapeutické prášková forma, vhodná pro inhalační therapii, vyznačující se tím, že obsahuje krystaly inzulínu neobsahující zinek podle libovolného předchozího nároku.
13. 13. Therapeutické prášková forma podle nároku 12, vyznačující se tím, že obsahuje látku zlepšující absorpci inzulínu v dolních cestách dýchacích.
14. 14. Therapeutické prášková forma podle nároku 13, vyznačující se tím, že látka zlepšující absorpci inzulínu je povrchově aktivní látka.
15. 15. Therapeutické prášková forma podle nároku 14, vyznačující se tím, že povrchově aktivní látka je sůl mastné kyseliny, žlučová sůl nebo fosfolipid, lépe však žlučová sůl.
16. 16. Therapeutické prášková forma podle nároku 15, vyznačující se tím, že povrchově aktivní látka je sůl taurocholátu, zejména taurocholát sodný.
17. 17. Therapeutické prášková forma podle nároků 12 až 15, vyznačující se tím, že obsahuje nosič patřící do skupiny kterou tvoří trehalóza, rafinóza, manitol, sorbitol, xylitol, inositol, sacharóza, chlorid sodný a citrát sodný.
18. 18. Způsob přípravy inzulínových krystalů neobsahujících zinek podle nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že obsahuje kroky :

    a) příprava roztoku inzulínu s pH mezi 7,0 až 9,5.

    b) smíchání řečeného roztoku s roztokem soli alkalického kovu, nebo amonnou solí a

    c) odebrání vzniklých krystalů.
19. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že sůl alkalických kovů, nebo amonná sůl je buď hydrochlorid, octan sodný, draselný, lithný nebo amonný, nebo jejich směsi, lépe pak octan sodný.
20. 20. Způsob podle nároku 18 nebo 19, vyznačující se tím, že roztok inzulínu a/nebo roztok soli alkalického kovu nebo amonné soli obsahuje s vodou mísitelné organické rozpouštědlo v množství odpovídajícím 5 až 25 % (v/v) roztoku po smíchání.
21. 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že s vodou mísitelné organické rozpouštědlo je ethanol, methanol, aceton a 2-propanol, lépe pak ethanol.

    • · · » · · > · · · • · · · · «
22. 22. Způsob podle nároku 18 až 21, vyznačující se tím, že oba roztoky jsou smíchány během méně než 2 hodin, lépe pak méně než 1 hodiny, ještě lépe pak méně než 15 minut a nejlépe méně než 5 minut.
23. 23. Způsob podle nároku 18 až 22, vyznačující se tím, že koncentrace inzulínu po smíchání je mezi 0,5 % a 10 %, lépe pak mezi 0,5 % až 5 % a nejlépe pak mezi 0,5 % až 2 %.
24. 24. Způsob podle nároku 18 až 23, vyznačující se tím, že koncentrace soli po smíchání je mezi 02 až 2 M, lépe pak okolo 1 M.
25. 25. Způsob podle nároku 18 až 24, vyznačující se tím, že obsahuje další krok promývání, během něhož jsou získané krystaly promyty v roztoku obsahujícím pomocné složky, které mají být přidány k výslednému prášku, zejména pak látky zlepšující absorpci a/nebo uhlovodík, a ideálně obsahujícím 5-25 % alkoholu, nejlépe ethanolu, 5-50 mM ochranné látky fenolu, a 0,1-2 M sůl jako je octan sodný.
26. 26. Použití krystalů inzulínu neobsahující zinek podle nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že jsou použity pro přípravu therapeutické práškové formy vhodné pro inhalační aplikaci při léčbě diabetů mellitu.
27. 27. Způsob léčby diabetů mellitu, vyznačující se tím, že představuje podání efektivního množství therapeutické práškové formy podle nároků 12 až 17 osobě, která tuto léčbu potřebuje.
28. 28. Způsob léčby diabetů mellitu, vyznačující se tím, že osobě, která tuto léčbu potřebuje, je inhalačně podáváno efektivní množství derivátu inzulínu s opožděným počátkem účinku zejména pak B29-N^£-myristoyl-des(B30) lidský inzulín, B29-N^£-palmitoyl-des(B30) lidský inzulín, B29-N^£-myristoyl lidský inzulín, bT-palmitoyl lidský inzulín, B28-N^£-myristoyl Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín, B28-N^E-palmitoyl Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín, B30-N®-myristoyl Thr^B29Lys^B3° lidský inzulín, B30-N⁶- palmitoyl Thr^B29Lys^B3° lidský inzulín, Β29-Ν^ε-(Νpalmitoyl-y-glutamyl)-des(B30) lidský inzulín, B29-N^€-(N-lithocholyl-y-glutamyl)-des(B30) lidský inzulín, B29-N^E-(co-karboxyheptadecanoyl)-des(B30) lidský inzulín a Β29-Ν*-(ωkarboxyheptadecanoyl).